JP5171958B2 - カスケード酵素免疫測定法 - Google Patents
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Description
1)分析対象抗原特異的な1次抗体が固定された磁性微細粒子(magnetic microparticles;以下、MMPs)で前記抗原を捕集する工程と、
2)工程1)の捕集された抗原を、カスケード反応開始剤及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子で処理することによりサンドイッチ複合体を形成する工程と、
3)サンドイッチ複合体を、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質で処理する工程、及び、
4)形成信号の変化を測定する工程とを含む抗原の検出方法を提供する。
2)工程1)の捕集された抗原を、カスケード反応開始剤及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子(Silica nanoparticles;以下、SPs)で処理することによりサンドイッチ複合体を形成する工程と、
3)サンドイッチ複合体を、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質で処理する工程、及び、
4)形成信号の変化を測定する工程とを含む抗原の検出方法を提供する。
但し、下記実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。
<1−1>磁性微細粒子(magnetic microparticles;以下、MMPs)に固定(monoAb−MMPs)
トシル−機能性MMPsに単一クローンPSA(Prostate−specific antigen;前立腺特異抗原;Cat.No.MAB1344、R&D、米国)抗体または単一クローンAFP(Alpha Fetoprotein)抗体(バデテックメド、韓国)を1次アミノ基を通じた共有結合で固定した。
N−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)で活性化になったオリゴエチレングリコール表面を有したウェルプレート(NUNC、イギリス)の一ウェル当り10μg/mlの単一クローンPSA抗体または単一クローンAFP抗体をコーティングした。前記抗体が固定されたウェルプレートを3回洗浄した後、300μlの遮断溶液(0.25Mエタノールアミン、pH8.5;Aldrich、米国)を入れて遮断した。
<2−1>多クローン抗体とEK混成体製造(polyAb−EK)
Sulfo−SMCC(スルホスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシラート;PIERCE、米国)を用いて、多クローンAFP抗体(バデテックメド、韓国)にEK(11334115,Roche,スイス)をコンジュゲーションして多クローン抗体とEK混成体を製造した。
アミンカップリング方法でSPsに多クローン性PSA抗体とEKを一緒に固定した。
<1−1>monoAb−ウェルプレートとpolyAb−EKを用いた抗原の捕集
分析緩衝溶液(50mM Tris、150mM NaCl、0.1% BSA、0.2%ツイーン−20、pH7.4)で3回洗浄後、monoAb−ウェルプレートにAFP抗原溶液(Biodesign,米国)を混ぜた後、25℃で1時間反応させた。使用したAFP濃度は、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM及び1aMであり、AFPを入れていない試料を対照群に用いた。ウェルプレートを分析緩衝溶液で5回洗浄した後、polyAb−EK:AFPを加えた後、混合液を25℃で1時間インキュベーションした。分析緩衝溶液で3回洗浄した後、酵素活性を測定した。
実験例1−1で抗原を媒介に修得した混成体及びトリプシノーゲン(Sigma,米国)をpH8.0トリス緩衝溶液に混ぜた混合液(10μM)を37℃で2時間反応させた後、1mM L−BApNA基質(比色基質;N−α−ベンゾイル−L−アルギニン p−ニトロアニリド,ハイドロクロライド;MPBIO,米国)を添加して、410nmで吸光度変化を測定した。また、N−α−ベンゾイル−L−アルギニン 7−アミド−4−メチル−クマリン HCl基質(蛍光基質;Sigma,米国)を添加して、Ex333nm/Em440nmで蛍光を測定した。
<2−1>monoAb−ウェルプレートとpolyAb−EKを用いた抗原の捕集
使用したAFP抗原の濃度が、100nM、10nM、1nM、100pM及び1pMであることを除いて実験例1−1と同一な方法で抗原を捕集した。
分析緩衝溶液で2回洗浄したmonoAb−MMPs(10mg/ml)にAFP抗原溶液を混ぜた後、25℃で2時間反応させた。前記AFP抗原の濃度は、100nM、10nM、1nM、100pMであった。反応終了後、前記monoAb−MMPsとAFP抗原の結合体を分析緩衝溶液で1回洗浄した後、遮断緩衝溶液(50mM Tris、150mM NaCl、1%BSA、0.2%ツイーン−20、pH7.4)に入れて30分間25℃で反応させた。続いて、分析緩衝溶液で2回洗浄した後、polyAb−SPs−EK(10mg/ml)を加えた後、混合液を25℃で2時間反応させた。分析緩衝溶液で5回洗浄した後、酵素活性を測定した。
実験例2−1及び2−2で抗原を媒介に修得したそれぞれの混成体及びトリプシノーゲン(対照群は無添加)をpH8.0トリス緩衝溶液に混ぜた混合液(10μM)を37℃で20時間反応させた後、1mM L−BApNA基質を添加して410nmで吸光度変化を測定した。
<3−1>monoAb−ウェルプレートとpolyAb−EKを用いた抗原の捕集
ASP抗原の代りに使用したPSA抗原(Sigma−Aldrich,米国)の濃度が、5nM、1nM、500pM、100pM、50pM、10pM及び1pMであることを除いて実験例1−1と同一な方法で抗原を捕集した。
ASP抗原の代りに使用したPSA抗原の濃度が10nM、1nM、100pM、10pM及び1pMであることを除いて、実験例2−2と同一な方法で抗原を捕集した。
実験例3−1及び3−2で抗原を媒介に修得したそれぞれの混成体及びトリプシノーゲン(対照群は無添加)をpH8.0トリス緩衝溶液に混ぜた混合液(10μM)を37℃で2時間反応させた後、1mM L−BApNA基質を添加して410nmで吸光度変化を測定した。
Claims (5)
- 1)分析対象抗原に特異的な一次抗体が固定された磁性微細粒子またはウェルプレートで前記抗原を捕集する工程と、
2)工程1)の捕集された抗原を、カスケード反応開始剤としてエンテロキナーゼまたはトリプシン及び前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子で処理することによりサンドイッチ複合体を形成する工程と、
3)サンドイッチ複合体を、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素としてトリプシノーゲンまたはキモトリプシノーゲン及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質で処理する工程、及び
4)形成信号の変化を測定する工程とを含み、
トリプシノーゲンが、カスケード反応開始剤にエンテロキナーゼを用いて活性化してトリプシンになり、キモトリプシノーゲンが、カスケード反応開始剤にトリプシンを用いて活性化して、キモトリプシンになることを特徴とする抗原の検出感度増進方法。 - トリプシンが、L−BApNA基質(N−α−ベンゾイル−L−アルギニンp−ニトロアニリド,ハイドロクロライド)またはN−α−ベンゾイル−L−アルギニン7−アミド−4−メチル−クマリンHCl基質を信号形成用基質に用いて形成信号を生成することを特徴とする請求項1に記載の抗原の検出感度増進方法。
- 形成信号が、発色、蛍光、生物発光及び化学発光からなる群から選択された1種以上の方法によって形成されることを特徴とする請求項1に記載の抗原の検出感度増進方法。
- 分析対象抗原に特異的な一次抗体が固定された磁性微細粒子またはウェルプレート及びカスケード反応開始剤としてエンテロキナーゼまたはトリプシン、前記抗原に特異的な二次抗体が固定されたシリカナノ粒子、前記カスケード反応開始剤によって活性型酵素に変換される前駆体酵素としてトリプシノーゲンまたはキモトリプシノーゲン及び前記活性型酵素に特異的な信号形成用基質を含み、
トリプシノーゲンが、カスケード反応開始剤にエンテロキナーゼを用いて活性化してトリプシンになり、キモトリプシノーゲンが、カスケード反応開始剤にトリプシンを用いて活性化して、キモトリプシンになることを特徴とする抗原の検出感度が増進した抗原検出用キット。 - 抗原、洗浄液、反応緩衝溶液及び遮断緩衝溶液をさらに含む請求項4に記載の抗原の検出感度が増進した抗原検出用キット。
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