CN115327136A - 一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用 - Google Patents

一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用 Download PDF

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梁家杰
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Abstract

本发明公开了一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用。该方法包括以下步骤：将含有系列浓度标志蛋白的样品于包被了捕获抗体Ab1的孔板中孵育，将所得产物与Ab2‑SA‑biotin‑靶激活DNA、Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针孵育，孵育产物使用激光激发，检测其拉曼信号，识别4ATP的拉曼特征峰并分析其强度，得出标志蛋白浓度与4ATP的拉曼特征峰强度的标准曲线；将含有未知浓度标志蛋白的样品进行同样的分析，依据标准曲线计算样品中的标志蛋白浓度。与现有ELISA方法相比，本发明方法具有更高灵敏度，检测效率更高。

Description

一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及 应用
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，主要涉及一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用。
背景技术
ELISA是目前最为常用的免疫学检测技术之一，在全世界范围内被广泛应用于疾病诊断、食品安全和环境监控领域，它的操作比较简单，显色原理明确，容易控制生产工艺，稳定性良好。但是，对于一些检出限低的物质来说，ELISA的灵敏度是远远达不到要求的。
CRISPR/Cas是近些年兴起的一种用于核酸检测的酶，CRISPR/Cas蛋白与CRISPRRNA(crRNA)结合，crRNA能够识别特异性的核酸序列，Cas蛋白发挥核酸内切酶功能，对靶标核酸分子进行剪切。除了特异性核酸内切酶活性(靶向切割)外，CRISPR类型中的III、V和VIRNA引导的核酸酶(Cas12、Cas13和Cas14)还具有侧链靶向激活的非特异性单链核酸水解酶活性(侧链切割)，其中，Cas12a可在crRNA引导下特异性识别并剪切单链或双链DNA，一旦对靶DNA进行识别并剪切，Cas12a自身的非特异性DNA酶活性被激活，可高效剪切其他单链DNA。Cas12a的这种扩增特性，可用于构建高灵敏的检测方法。与本发明最相近似的实现方案是Nano-CLISA，首先，抗原在96孔板中被包被抗体捕获，加入被抗原适配体和激活序列修饰金纳米(AuNPs)后，适配体与抗原结合，使得AuNPs被捕获；然后加入Cas12a-crRNA以及荧光淬灭探针(FQ-reporter)，Cas12a-crRNA识别AuNPs表面的激活序列并剪切，Cas12a自身的非特异性DNA酶活性被激活，剪切FQ-reporter，FQ-reporter被剪断后荧光基团被释放，从而产生荧光信号实现检测。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种基于SERS和CRISPR/Cas联(CLISA)免疫吸附检测蛋白的方法，解决传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)在蛋白标志物检测中的灵敏度不足的技术问题。
本发明的另一目的在于提供上述基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于SERS和CRISPR/Cas联(CLISA)免疫吸附检测蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)将靶激活DNA连接到待测蛋白的检测抗体上；
(2)将待测蛋白的捕获抗体进行固定，清洗；
(3)在步骤(2)中固定的捕获抗体中加入待测样本，孵育；
(4)在步骤(3)得到的体系中加入步骤(1)中连接了靶激活DNA的检测抗体，孵育后清洗；
(5)在步骤(4)得到的体系中加入Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针，孵育后检测拉曼信号，根据拉曼信号强度检测待测蛋白。
步骤(1)所述的靶激活DNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(5)所述的crRNA互补结合，激活Cas12a的酶活性。
步骤(1)所述的待测蛋白包括至少有两个抗原决定簇的抗原蛋白，优选为前列腺特异抗原(PSA)、SARS-CoV-2N蛋白、γ干扰素(IFN-γ)、癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)、甲胎蛋白(AFP)中的至少一种。
步骤(1)所述的连接为生物素-链霉亲和素连接。
步骤(1)的具体步骤为：
将生物素修饰的靶激活DNA与链霉亲和素修饰的检测抗体共同孵育，得到连接了靶激活DNA的检测抗体。
步骤(2)所述的固定为固定在孔板中；优选固定后使用BSA进行封闭。
步骤(2)所述的捕获抗体的加入量为至少0.01mg；优选为至少0.1mg。
步骤(2)所述的清洗为使用PBST缓冲液清洗；优选为用PBST缓冲液清洗3次。
步骤(3)所述的孵育的条件为35～40℃，至少30min；优选为37℃，孵育1h。
步骤(4)所述的靶激活DNA的检测抗体的加入量为至少0.05μM，优选为至少0.5μM。
步骤(4)所述的孵育的条件为35～40℃，至少20min；优选为37℃，孵育30min。
步骤(4)所述的清洗为使用PBST缓冲液清洗；优选为用PBST缓冲液清洗3次。
步骤(5)所述的孵育的条件为35～40℃，至少10min；优选为37℃，孵育20min。
步骤(5)所述的拉曼探针由表面偶联4-氨基苯硫酚(4ATP)的银纳米颗粒(AgNPs@4ATP)和表面修饰链霉亲和素的磁珠(SA-MBs)构成，两部分之间用生物素修饰的单链DNA(ssDNA)连接。
步骤(5)所述的crRNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(1)所述的靶激活DNA互补结合；所述crRNA可以作为Cas12a蛋白的引导RNA，帮助激活Cas12a蛋白的酶活性；所述crRNA特异性识别靶激活DNA序列后激活Cas12a的酶活性。
步骤(5)所述的检测拉曼信号为785nm激发激光下检测拉曼信号。
上述的检测拉曼信号为识别拉曼特征峰强度，依据标准曲线计算样品中的标志蛋白浓度；优选为识别4ATP的拉曼特征峰(1074cm-1)。
上述基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法在制备检测试剂盒中的应用。
上述的Cas12a蛋白，通过CRISPR RNA(crRNA)识别特异性的核酸序列，激活其非特异性核酸内切酶活性，对样品中的ssDNA进行随意剪切，操作更加稳定、简单。
步骤(1)所述的待测蛋白捕获抗体Ab1为针对待测蛋白上特定抗原表位的抗体，待测蛋白检测抗体Ab2为针对待测蛋白上特定抗原表位的抗体，但与Ab1针对的表位不同。当体系中同时含有待测蛋白、Ab1、Ab2时，三者会形成三明治状的双抗体夹心结构。
上述的Ab2通过生物素和链霉亲和素与靶激活DNA偶联，当样品中含有待测蛋白时，形成Ab1-待测蛋白-Ab2的双抗体夹心结构，被吸附在孔板中，与Ab2相连的靶激活DNA会被crRNA识别，激活Cas12a蛋白的非特异性核酸内切酶活性，对体系中的核酸分子进行剪切。
现有技术的缺点在于：从原理上就可看出，Nano-CLISA的缺点是操作复杂，检测时间长(4h)。造成上述缺点的原因是其使用适配体形成夹心结构，适配体的特异性和敏感度不足，需要用金纳米的大比表面积实现核酸数量的放大；其次，信号探针用的是荧光探针，荧光探针的灵敏度不足，导致需要长时间孵育来弥补。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法，使用双抗体夹心法进行免疫吸附试验，取代适配体，提高灵敏度，此外使用比荧光信号更灵敏的表面增强拉曼信号作为传感信号，这样就可以不需要核酸数量的放大，反应时间也大大缩短了；此外，本发明可直接把激活序列与抗体通过生物素-链霉亲和素系统连接，提高了试剂的稳定性，减少了操作步骤。
附图说明
图1是SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的原理图。
图2是PSA浓度与拉曼信号强度的检测曲线图。
图3是SARS-CoV-2N蛋白浓度与拉曼信号强度的检测曲线图。
图4是IFN-γ浓度与拉曼信号强度的检测曲线图。
图5是对比例中ELISA法测试PSA的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中使用的抗体和抗原均购自Abcam公司，所使用的合成序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
实施例1
本实施例中，以前列腺特异抗原(PSA)作为分析物，对其进行定量分析。
1.拉曼探针的制备
取锥形瓶，称量90mg硝酸银，将90mg硝酸银溶解在500mL超纯水中，并将溶液加热至沸腾。将10mL 1％柠檬酸三钠水溶液逐滴滴加到沸腾的硝酸银溶液中，并用磁力搅拌器进行剧烈搅拌，将混合溶液再煮沸30分钟，产生稳定的灰绿色胶体银。将6μL的10mM 4ATP(4-氨基苯硫酚)与1mL银纳米(即灰绿色胶体银)混合；将溶液在室温下持续搅拌1小时，并在4℃下以6000rpm离心10分钟，弃去上清液。将所得颗粒(AgNPs@4ATP)重悬在1mL超纯水中。
将100μL链霉亲和素磁珠(MBs-SA，Cat.#22307，购于苏州海狸生物医学工程有限公司)用磁力架洗涤3次，并用500μL Buffer1重悬。将30μL 4mMSH-ssDNA-biotin添加到MBs-SA中并孵育30分钟获得MBs-SA-biotin-ssDNA-SH。
将MBs-SA-biotin-ssDNA-SH与AgNPs@4ATP室温孵育30分钟获得拉曼探针。将拉曼探针用磁力架清洗3次，4℃保存备用。
ssDNA的序列为：
biotin-tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt-SH
2.CasLISA的构建
Ab2-SA-biotin-靶激活DNA的制备：将2μM生物素修饰的靶激活DNA(用PBS缓冲液稀释)与0.5μM检测抗体Ab2-SA(Ab2抗体使用链霉亲和素标记试剂盒合成后得到，试剂盒购自Abcam公司，按试剂盒说明书进行制备)在室温下孵育30分钟，4℃备用。
捕获抗体Ab1为：抗PSA的鼠源单克隆抗体；
检测抗体Ab2为：抗PSA的鼠源单克隆抗体(与Ab1针对的表位不一样)；
生物素修饰的靶激活DNA序列为：
biotin-GCTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGC；
3.激活Cas12a的非特异ssDNA酶活性并剪切拉曼探针
将100μL 1mg/mL捕获抗体Ab1(用CBS缓冲液稀释)加入孔板中，在4℃下孵育过夜，用PBST清洗3次，加入100μL 10％BSA溶液，37℃封闭4小时，用PBST清洗3次，甩干，4℃备用。
将不同浓度的PSA样品加入包被了Ab1的孔板中，终浓度为0.1～10000pg/mL，37℃孵育1小时后，加入0.5μM的Ab2-SA-biotin-靶激活DNA，37℃孵育30分钟后，用PBST缓冲液清洗3次，加入50nM LbCas12a、62.5nMcrRNA、40 U RNase Inhibitor和拉曼探针在37℃下孵育20分钟。将孔板用磁力架清洗3次，然后用100μL超纯水重悬。将孔板放置在便携式拉曼读板器中，使用便携式拉曼光谱仪在785nm激发激光下，功率为300mW，累积时间为10秒，对拉曼信号进行一一测量。明显识别出4ATP的拉曼特征峰(1074cm-1)并用于分析。
crRNA序列为：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUCCAGCUCGACC；
上述LbCas12a、crRNA、1×NEBuffer 2.1均购买自New England Biolabs(NEB)公司。
3.实验结果
检测原理如图1所示，图2显示了PSA的检测曲线图，由图可知，检测体系的信号随着PSA分析物的增加而增强，检测灵敏度为10pg/mL。
实施例2
本实施例，以SARS-CoV-2N蛋白作为分析物，对其进行定量分析。
与实施例1的区别在于，用SARS-CoV-2N特异的捕获抗体Ab1代替PSA特异的捕获抗体Ab1，用SARS-CoV-2N特异的检测抗体Ab2代替PSA特异的检测抗体Ab2。
SARS-CoV-2N特异的捕获抗体Ab1为：抗SARS-CoV-2N的鼠源单克隆抗体；
SARS-CoV-2N特异的检测抗体Ab2为：抗SARS-CoV-2N的鼠源单克隆抗体(与Ab1针对的表位不一样)；
图3显示了SARS-CoV-2N蛋白的检测曲线图，由图可知，检测体系的信号随着SARS-CoV-2N蛋白分析物的增加而增强，检测灵敏度为10pg/mL。
实施例3
本实施例，以IFN-γ(γ干扰素)作为分析物，对其进行定量分析。
用IFN-γ特异的捕获抗体Ab1代替PSA特异的捕获抗体Ab1，用IFN-γ特异的检测抗体Ab2代替PSA特异的检测抗体Ab2。
IFN-γ特异的捕获抗体Ab1为：抗IFN-γ的鼠源单克隆抗体；
IFN-γ特异的检测抗体Ab2为：抗IFN-γ的鼠源单克隆抗体(与Ab1针对的表位不一样)；
图4显示了IFN-γ的检测曲线图，由图可知，检测体系的信号随着IFN-γ分析物的增加而增强，检测灵敏度为10pg/mL。
对比例
该对比例中，以前列腺特异抗原(PSA)作为分析物，使用PSA ELISA试剂盒，对其进行定量分析。
PSA ELISA试剂盒购自abcam抗体公司。
图5显示了PSA的ELISA检测曲线图，由图可知，检测体系的信号随着PSA分析物的增加而增强，检测灵敏度为3.125ng/mL。结果表明，我们基于CRISPR的检测的灵敏度高于基于HRP的ELISA。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将靶激活DNA连接到待测蛋白的检测抗体上；
(2)将待测蛋白的捕获抗体进行固定，清洗；
(3)在步骤(2)中固定的捕获抗体中加入待测样本，孵育；
(4)在步骤(3)得到的体系中加入步骤(1)中连接了靶激活DNA的检测抗体，孵育后清洗；
(5)在步骤(4)得到的体系中加入Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针，孵育后检测拉曼信号，根据拉曼信号强度检测待测蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(1)所述的靶激活DNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(5)所述的crRNA互补结合；
步骤(5)所述的crRNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(1)所述的靶激活DNA互补结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述的crRNA特异性识别靶激活DNA序列后，作为Cas12a蛋白的引导RNA激活Cas12a的酶活性。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(1)所述的待测蛋白为至少有两个抗原决定簇的抗原蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(1)所述的待测蛋白包括前列腺特异抗原、SARS-CoV-2N蛋白、γ干扰素、癌胚抗原、鳞状上皮细胞癌抗原、甲胎蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(1)所述的连接为生物素-链霉亲和素连接。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(5)所述的拉曼探针由表面偶联4-氨基苯硫酚的银纳米颗粒和表面修饰链霉亲和素的磁珠构成，两部分之间用生物素修饰的单链DNA连接。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(5)所述的检测拉曼信号为785nm激发激光下检测拉曼信号。
9.权利要求1～8任一所述的基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法在制备检测试剂盒中的应用。
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