CN118006733A - 一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法 - Google Patents

一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及核酸检测技术领域,提供了一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，包括：S1、制备链霉亲和素适配体修饰的磁珠和生物素偶联碱性磷酸酶；S2、将核酸样品和链霉亲和素适配体修饰的磁珠加入Cas12a反应体系形成第一混合溶液，并对第一混合溶液进行磁分离清洗；S3、提供链霉亲和素，将链霉亲和素和生物素偶联碱性磷酸酶加入至磁分离清洗后的第一混合溶液中形成第二混合溶液，并对第二混合溶液进行磁分离清洗；S4、将化学发光底物加入至磁分离清洗后的第二混合溶液中形成第三混合溶液，对第三混合溶液孵育后进行化学发光信号检测，即可获取核酸样品的信息。本发明的核酸化学发光检测方法，其灵敏度高、检测速度快。

Description

一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检 测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法。
背景技术
核酸检测技术是一种以核酸作为检测靶标的检测方法，当前被广泛应用于传染性疾病诊断、疾病筛查等领域。当前已被使用的核酸检测方法最为代表性的是PCR（聚合酶链式反应）技术，其主要通过热稳定的DNA聚合酶和特殊设计的引物对靶核酸进行扩增，再通过荧光信号对扩增产物进行检测，确定待测样本中存在目的核酸，从而实现不同疾病的诊断。PCR技术通过对靶核酸的多重扩增，使得目的核酸数量呈指数级放大，具有较高的灵敏度和良好的准确性。但是由于PCR反应较为耗时且在进行大量样本检测的过程中容易出现核酸污染的问题，因此在进行大规模样本的筛查中不具有优势。
当前出现一种基于核酸杂交捕获进行检测的技术手段，称为杂交捕获法。该方法主要通过固相载体表面偶联的特定核酸序列与样本中的靶核酸通过核苷酸配对实现核酸链杂交，再使用HRP标记的双链DNA抗体对核酸杂交链进行检测。杂交捕获技术主要通过核酸探针对病原体核酸进行链杂交后使用酶标抗体检测杂交链，该过程无需核酸扩增，因此避免了耗时的多重热循环步骤，从而可以弥补PCR在检测速度上的缺陷。
然而，现有问题是杂交捕获技术虽然可以对病人样本中的核酸进行快速检测，但是由于其未使用信号放大体系从而在检测弱阳性样本时灵敏度不够容易产生假阴性结果导致漏检，存在灵敏度和检测速度不能兼备的缺点。
因此，亟需提供一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法解决上述问题。
发明内容
本发明提供一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，旨在解决现有核酸检测技术的灵敏度和检测速度不能兼备的问题。
本发明实施例提供一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，包括以下步骤：
S1、制备链霉亲和素适配体修饰的磁珠和生物素偶联碱性磷酸酶；
S2、提供核酸样品，并将所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠加入Cas12a反应体系形成第一混合溶液，并对所述第一混合溶液进行磁分离清洗；所述Cas12a反应体系用于识别并切割所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠；所述Cas12a反应体系包括具有非特异性单链DNA反式切割活性的Cas12a切口酶、crRNA以及RNase抑制剂，所述crRNA用于激活所述Cas12a切口酶的非特异性单链DNA反式切割活性；
S3、提供链霉亲和素，将所述链霉亲和素和所述生物素偶联碱性磷酸酶加入至磁分离清洗后的所述第一混合溶液中形成第二混合溶液，并对所述第二混合溶液进行磁分离清洗；
S4、提供化学发光底物，并将所述化学发光底物加入至磁分离清洗后的所述第二混合溶液中形成第三混合溶液，对所述第三混合溶液孵育后进行化学发光信号检测，即可获取所述核酸样品的信息。
优选的，所述S2中对所述第一混合溶液进行磁分离清洗，具体包括：
S21、将所述第一混合溶液置于37℃的温度下孵育20 分钟；
S22、将孵育后的所述第一混合溶液进行三次磁分离清洗。
优选的，所述S3中对所述第二混合溶液进行磁分离清洗，具体包括：
S31、将所述第二混合溶液置于37℃的温度下孵育10 分钟；
S32、将孵育后的所述第二混合溶液进行三次磁分离清洗。
优选的，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的制备方法，具体包括：
S11、提供适量的羧基磁珠，并对所述羧基磁珠进行磁分离去除上清液；
S12、提供适量的活化液，并将所述活化液加入至磁分离后的所述羧基磁珠中混合均匀并进行活化反应形成第一反应溶液，并对所述第一反应溶液进行磁分离去除上清液；
S13、提供适量的缓冲液重悬磁珠和链霉亲和素适配体，并依次将所述缓冲液重悬磁珠和所述链霉亲和素适配体加入至磁分离后的所述第一反应溶液中混合均匀并进行活化反应形成第二反应溶液，并对所述第二反应溶液进行磁分离去除上清液；
S14、提供适量的第一封闭液和第二封闭液，并将所述第一封闭液加入至磁分离后的所述第二反应溶液中混合均匀并进行封闭形成第三反应溶液，对所述第三反应溶液进行磁分离去除上清液，并在磁分离后的所述第三反应溶液内加入第二封闭液形成所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠。
优选的，所述活化液包括EDC溶液、NHS溶液以及MES缓冲液。
优选的，所述第一封闭液和第二封闭液均包括适量的BSA溶液和Tris缓冲液。
优选的，所述生物素偶联碱性磷酸酶的制备方法，具体包括：
S15、提供适量的碱性磷酸酶、PBS缓冲液以及Biotin-LC-NHS溶液；
S16、将所述碱性磷酸酶、所述PBS缓冲液以及所述Biotin-LC-NHS溶液混合均匀并发生化学反应形成第四反应溶液；
S17、使用10 KD超滤管对所述第四反应溶液进行纯化形成所述生物素偶联碱性磷酸酶。
优选的，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的核酸序列为：5’GGGAATCGCCACCCGACGCAGGGTTTCCC-NH2 3’。
优选的，所述crRNA的核酸序列为：5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAAGUAGAUAUGGCAGCAC 3’、5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCACCUCUGUCACGACCGAGGCU 3’以及5’UAAUACGACUCACUAUAGGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAGUGCCAUUUGUUCAGUG 3’中的任意一种。
与现有技术相比，本发明提供一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，包括以下步骤：S1、制备链霉亲和素适配体修饰的磁珠和生物素偶联碱性磷酸酶；S2、提供核酸样品，并将所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠加入Cas12a反应体系形成第一混合溶液，并对所述第一混合溶液进行磁分离清洗；所述Cas12a反应体系用于识别并切割所述核酸样品；所述Cas12a反应体系包括具有非特异性单链DNA反式切割活性的Cas12a切口酶、crRNA以及RNase抑制剂，所述crRNA用于激活所述Cas12a切口酶的非特异性单链DNA反式切割活性；S3、提供链霉亲和素，将所述链霉亲和素和所述生物素偶联碱性磷酸酶加入至磁分离清洗后的所述第一混合溶液中形成第二混合溶液，并对所述第二混合溶液进行磁分离清洗；S4、提供化学发光底物，并将所述化学发光底物加入至磁分离清洗后的所述第二混合溶液中形成第三混合溶液，对所述第三混合溶液孵育后进行化学发光信号检测，即可获取所述核酸样品的信息。通过crRNA识别核酸样品序列，从而激活Cas12a切口酶的非特异性单链DNA反式切割活性，对链霉亲和素核酸适配体修饰的磁珠进行剪切，进行磁分离清洗后，依次加入链霉亲和素和生物素标记的碱性磷酸酶与未被切割的链霉亲和素核酸适配体结合，再次进行磁分离清洗后加入化学发光底物检测信号。当核酸样品中的靶核酸越多时，Cas12a切口酶的反应越强，从而使得化学发光信号越呈现负相关趋势。由于Cas12a酶的切割活性极强，能够在恒温条件下实现核酸信号的快速放大，再结合链霉亲和素及酶促化学发光的信号放大作用，可在短时间内实现核酸样品中靶标信号的快速放大和检测，从而弥补现有核酸检测技术的灵敏度和检测速度不能兼备的问题。
附图说明
下面结合附图详细说明本发明。通过结合以下附图所作的详细描述，本发明的上述或其他方面的内容将变得更清楚和更容易理解。附图中：
图1是本发明种一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法的流程示意图；
图2是本发明S2中对所述第一混合溶液进行磁分离清洗的流程示意图；
图3是本发明S3中对所述第二混合溶液进行磁分离清洗的流程示意图；
图4是本发明链霉亲和素适配体修饰的磁珠的制备方法的流程示意图；
图5是本发明生物素偶联碱性磷酸酶的制备方法的流程示意图；
图6是本发明实验1以人乳头瘤病毒16（HPV 16）DNA作为核酸样品的检测化学发光信号图；
图7是本发明实验2以EB病毒DNA作为核酸样品的检测化学发光信号图；
图8是本发明实验3以乙肝病毒DNA作为核酸样品的检测化学发光信号图；
图9是本发明实验1-3用到的核酸序列的表图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参照图1-5所示，本发明实施例提供基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，包括以下步骤：
S1、制备链霉亲和素适配体修饰的磁珠和生物素偶联碱性磷酸酶；
在本实施例中，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的制备方法包括：S11、提供适量的羧基磁珠，并对所述羧基磁珠进行磁分离去除上清液；S12、提供适量的活化液，并将所述活化液加入至磁分离后的所述羧基磁珠中混合均匀并进行活化反应形成第一反应溶液，并对所述第一反应溶液进行磁分离去除上清液；S13、提供适量的缓冲液重悬磁珠和链霉亲和素适配体，并依次将所述缓冲液重悬磁珠和所述链霉亲和素适配体加入至磁分离后的所述第一反应溶液中混合均匀并进行活化反应形成第二反应溶液，并对所述第二反应溶液进行磁分离去除上清液；S14、提供适量的封闭液，并将所述封闭液加入至磁分离后的所述第二反应溶液中混合均匀并进行封闭形成第三反应溶液，对所述第三反应溶液进行磁分离去除上清液形成所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠。
具体为：取100 μL羧基磁珠（2.5%固含量）磁分离去除上清液后，加入0.25 mL体积的活化液（含有60 mg/mL浓度EDC、60 mg/mL 浓度NHS的0.05M, pH 6.0 MES缓冲液）混合均匀，置于37℃的温度下活化反应30 min后形成第一反应溶液。活化完成后的第一反应溶液进行磁分离去除上清液，依次加入500μL0.05M, pH 6.0 MES缓冲液重悬磁珠和50μL链霉亲和素适配体（10 nM），混匀后置于37℃的温度下活化反应2 h后形成第二反应溶液，对第二反应溶液进行磁分离去除上清液后，加入200μL第一封闭液（含有1%BSA的0.05M, pH 7.4Tris缓冲液）置于37℃的温度下封闭30 min后形成第三反应溶液。封闭完成后，对所述第三反应溶液进行磁分离去除上清液，加入500μL第二封闭液（含有1%BSA的0.05M, pH 7.4Tris缓冲液）形成所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠置于4℃环境保存。
在本实施例中，所述生物素偶联碱性磷酸酶的制备方法，具体包括：S15、提供适量的碱性磷酸酶、PBS缓冲液以及Biotin-LC-NHS溶液；S16、将所述碱性磷酸酶、所述PBS缓冲液以及所述Biotin-LC-NHS溶液混合均匀并发生化学反应形成第四反应溶液；S17、使用10KD超滤管对所述第四反应溶液进行纯化形成所述生物素偶联碱性磷酸酶。
具体为，取10 μL碱性磷酸酶（10 mg/mL）加入100 μL体积0.05M, pH 7.4 PBS缓冲液中，再加入3.5 μL Biotin-LC-NHS（DMSO溶解，浓度5mg/mL），置于37℃反应30 min后，使用10 KD超滤管纯化得到生物素偶联的碱性磷酸酶置于4℃环境保存备用。
S2、提供核酸样品，并将所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠加入Cas12a反应体系形成第一混合溶液，并对所述第一混合溶液进行磁分离清洗；所述Cas12a反应体系用于识别并切割所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠；所述Cas12a反应体系包括具有非特异性单链DNA反式切割活性的Cas12a切口酶、crRNA以及RNase抑制剂，所述crRNA用于激活所述Cas12a切口酶的非特异性单链DNA反式切割活性；
在本实施例中，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的容量为 2μL，所述Cas12a反应体系包括50 nM LbCas12a、62.5 nM crRNA,和40U RNase抑制剂。
在本实施例中，所述S2中对所述第一混合溶液进行磁分离清洗，具体包括：S21、将所述第一混合溶液置于37℃的温度下孵育20 分钟；S22、将孵育后的所述第一混合溶液进行三次磁分离清洗。
S3、提供链霉亲和素，将所述链霉亲和素和所述生物素偶联碱性磷酸酶加入至磁分离清洗后的所述第一混合溶液中形成第二混合溶液，并对所述第二混合溶液进行磁分离清洗；
在本实施例中，所述S3中对所述第二混合溶液进行磁分离清洗，具体包括：
S31、将所述第二混合溶液置于37℃的温度下孵育10 分钟；S32、将孵育后的所述第二混合溶液进行三次磁分离清洗。
S4、提供化学发光底物，并将所述化学发光底物加入至磁分离清洗后的所述第二混合溶液中形成第三混合溶液，对所述第三混合溶液孵育后进行化学发光信号检测，即可获取所述核酸样品的信息。
在本实施例中，所述化学发光底物的容量为200μL，所述第三混合溶液放置于37℃的温度下孵育5 分钟至30 分钟后，在对所述第三混合溶液进行检测化学发光信号。
为了进一步阐述本发明，做了以下三个实验进行说明：
实验1
以人乳头瘤病毒16（HPV 16）DNA作为核酸样品，对所述乳头瘤病毒16（HPV 16）DNA进行定性检测。
1、链霉亲和素适配体修饰的磁珠制备
取100 μL羧基磁珠（2.5%固含量）磁分离去除上清液后，加入0.25 mL体积的活化液（包括60 mg/mL浓度EDC、60 mg/mL 浓度NHS的0.05M, pH 5.5 ~ 6.0 MES缓冲液）混合均匀，置于37℃的温度下活化反应 30 min后形成第一反应溶液。活化完成后第一反应溶液进行磁分离去除上清液，加入500μL0.05M, pH 6.0 MES缓冲液重悬磁珠，再加入50 μL链霉亲和素适配体（10 nM），混匀后置于37℃的温度下活化反应2 h后形成第二反应溶液。对第二反应溶液进行磁分离去除上清液后，加入200 μL第一封闭液（含有1% BSA的0.05M, pH 7.4Tris缓冲液）置于37℃的温度下封闭30 min后形成第三反应溶液。封闭完成后的第三反应溶液进行磁分离去除上清液，加入500 μL第二封闭液（含有1%BSA的0.05M, pH 7.4 Tris缓冲液）形成所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠置于4℃环境保存。
2、生物素偶联碱性磷酸酶制备
取10 μL碱性磷酸酶（10 mg/mL）加入100 μL体积0.05M, pH 7.4 PBS缓冲液中，再加入 3.5 μL Biotin-LC-NHS（DMSO溶解，浓度5mg/mL），置于37℃反应30 min后，使用10 KD超滤管纯化得到生物素偶联的碱性磷酸酶置于4℃环境保存备用。
3、核酸样品检测
取0. 2 μL链霉亲和素适配体修饰的磁珠、50 nM LbCas12a、62 nM crRNA、 40URNase抑制剂与核酸样品混合，置于37℃孵育20 min后磁分离清洗3遍。加入50 ng 链霉亲和素、50 ng生物素偶联碱性磷酸酶，置于37℃孵育10 min后磁分离清洗3遍，加入200 μL化学发光底物37℃孵育5 ~ 30 min后检测化学发光信号。
4、实验 1 检测结果
参图6所示，显示了HPV16病毒核酸的检测化学发光信号图，由图6可知，检测体系的信号随着HPV 16病毒核酸质粒分析物的增加而降低，最低检出限为10 copies。
实验 2
以EB病毒DNA作为作为核酸样品，对所述EB病毒DNA进行定性检测。
1a、链霉亲和素适配体修饰的磁珠制备
取100 μL羧基磁珠（2.5%固含量）磁分离去除上清液后，加入0.25 mL体积的活化液（含包括60 mg/mL浓度EDC、60 mg/mL 浓度NHS的0.05M, pH 5.5 ~ 6.0 MES缓冲液）混合均匀，置于37℃的温度下活化反应 30 min后形成第一反应溶液。活化完成后第一反应溶液进行磁分离去除上清液，加入500μL0.05M, pH 6.0 MES缓冲液重悬磁珠，再加入50 μL链霉亲和素适配体（10 nM），混匀后置于37℃的温度下活化反应2 h后形成第二反应溶液。对第二反应溶液进行磁分离去除上清液后，加入200 μL第一封闭液（含有1% BSA的0.05M, pH7.4 Tris缓冲液）置于37℃的温度下封闭30 min后形成第三反应溶液。封闭完成后的第三反应溶液进行磁分离去除上清液，加入500 μL第二封闭液（含有1%BSA的0.05M, pH 7.4Tris缓冲液）形成所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠置于4℃环境保存。
2a、生物素偶联碱性磷酸酶制备
取10 μL碱性磷酸酶（10 mg/mL）加入100 μL体积0.05M, pH 7.4 PBS缓冲液中，再加入 3.5 μL Biotin-LC-NHS（DMSO溶解，浓度5mg/mL），置于37℃反应30 min后，使用10 KD超滤管纯化得到生物素偶联的碱性磷酸酶置于4℃环境保存备用。
3a、核酸样品检测
取0. 2 μL链霉亲和素适配体修饰的磁珠、50 nM LbCas12a、62 nM crRNA、 40URNase抑制剂与核酸样品混合，置于37℃孵育20 min后磁分离清洗3遍。加入50 ng 链霉亲和素、50 ng生物素偶联碱性磷酸酶，置于37℃孵育10 min后磁分离清洗3遍，加入200 μL化学发光底物37℃孵育5 ~ 30 min后检测化学发光信号。
4a、实验 2 检测结果
参图7所示，显示了EB病毒DNA的检测化学发光信号图，由图7可知，检测体系的信号随着EB病毒DNA分析物的增加而降低，最低检出限为10 copies。
实验 3
以乙肝病毒DNA作为作为核酸样品，对所述乙肝病毒DNA进行定性检测。
1b、链霉亲和素适配体修饰的磁珠制备
取100 μL羧基磁珠（2.5%固含量）磁分离去除上清液后，加入0.25 mL体积的活化液（含包括60 mg/mL浓度EDC、60 mg/mL 浓度NHS的0.05M, pH 5.5 ~ 6.0 MES缓冲液）混合均匀，置于37℃的温度下活化反应 30 min后形成第一反应溶液。活化完成后第一反应溶液进行磁分离去除上清液，加入500μL0.05M, pH 6.0 MES缓冲液重悬磁珠，再加入50 μL链霉亲和素适配体（10 nM），混匀后置于37℃的温度下活化反应2 h后形成第二反应溶液。对第二反应溶液进行磁分离去除上清液后，加入200 μL第一封闭液（含有1% BSA的0.05M, pH7.4 Tris缓冲液）置于37℃的温度下封闭30 min后形成第三反应溶液。封闭完成后的第三反应溶液进行磁分离去除上清液，加入500 μL第二封闭液（含有1%BSA的0.05M, pH 7.4Tris缓冲液）形成所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠置于4℃环境保存。
2b、生物素偶联碱性磷酸酶制备
取10 μL碱性磷酸酶（10 mg/mL）加入100 μL体积0.05M, pH 7.4 PBS缓冲液中，再加入 3.5 μL Biotin-LC-NHS（DMSO溶解，浓度5mg/mL），置于37℃反应30 min后，使用10 KD超滤管纯化得到生物素偶联的碱性磷酸酶置于4℃环境保存备用。
3b、核酸样品检测
取0. 2 μL链霉亲和素适配体修饰的磁珠、50 nM LbCas12a、62 nM crRNA、 40URNase抑制剂与核酸样品混合，置于37℃孵育20 min后磁分离清洗3遍。加入50 ng 链霉亲和素、50 ng生物素偶联碱性磷酸酶，置于37℃孵育10 min后磁分离清洗3遍，加入200 μL化学发光底物37℃孵育5 ~ 30 min后检测化学发光信号。
4b、实验 3 检测结果
参图8所示，显示了乙肝病毒DNA的检测化学发光信号图，由图8可知，检测体系的信号随着乙肝病毒DNA分析物的增加而降低，最低检出限为10 copies。
参图9所示，为本发明实验1-3用到的核酸序列的表图，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的核酸序列为：5’GGGAATCGCCACCCGACGCAGGGTTTCCC-NH2 3’；所述crRNA的核酸序列为：5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAAGUAGAUAUGGCAGCAC 3’、5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCACCUCUGUCACGACCGAGGCU 3’以及5’UAAUACGACUCACUAUAGGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAGUGCCAUUUGUUCAGUG 3’中的任意一种 。当然不限于此，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的核酸序列和所述crRNA的核酸序列可依据核酸样品进行设计调整，且所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的核酸序列和所述crRNA的核酸序列通过使用CHOPCHOP和Benchling等设计工具进行设计的。
与现有技术相比，本发明提供一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，包括以下步骤：S1、制备链霉亲和素适配体修饰的磁珠和生物素偶联碱性磷酸酶；S2、提供核酸样品，并将所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠加入Cas12a反应体系形成第一混合溶液，并对所述第一混合溶液进行磁分离清洗；所述Cas12a反应体系用于识别并切割所述核酸样品；所述Cas12a反应体系包括具有非特异性单链DNA反式切割活性的Cas12a切口酶、crRNA以及RNase抑制剂，所述crRNA用于激活所述Cas12a切口酶的非特异性单链DNA反式切割活性；S3、提供链霉亲和素，将所述链霉亲和素和所述生物素偶联碱性磷酸酶加入至磁分离清洗后的所述第一混合溶液中形成第二混合溶液，并对所述第二混合溶液进行磁分离清洗；S4、提供化学发光底物，并将所述化学发光底物加入至磁分离清洗后的所述第二混合溶液中形成第三混合溶液，对所述第三混合溶液孵育后进行化学发光信号检测，即可获取所述核酸样品的信息。通过crRNA识别核酸样品序列，从而激活Cas12a切口酶的非特异性单链DNA反式切割活性，对链霉亲和素核酸适配体修饰的磁珠进行剪切，进行磁分离清洗后，依次加入链霉亲和素和生物素标记的碱性磷酸酶与未被切割的链霉亲和素核酸适配体结合，再次进行磁分离清洗后加入化学发光底物检测信号。当核酸样品中的靶核酸越多时，Cas12a切口酶的反应越强，从而使得化学发光信号越呈现负相关趋势。由于Cas12a酶的切割活性极强，能够在恒温条件下实现核酸信号的快速放大，再结合链霉亲和素及酶促化学发光的信号放大作用，可在短时间内实现核酸样品中靶标信号的快速放大和检测，从而弥补现有核酸检测技术的灵敏度和检测速度不能兼备的问题。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式用等同变化，均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、制备链霉亲和素适配体修饰的磁珠和生物素偶联碱性磷酸酶；
S2、提供核酸样品，并将所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠加入Cas12a反应体系形成第一混合溶液，并对所述第一混合溶液进行磁分离清洗；所述Cas12a反应体系用于识别并切割所述核酸样品和所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠；所述Cas12a反应体系包括具有非特异性单链DNA反式切割活性的Cas12a切口酶、crRNA以及RNase抑制剂，所述crRNA用于激活所述Cas12a切口酶的非特异性单链DNA反式切割活性；
S3、提供链霉亲和素，将所述链霉亲和素和所述生物素偶联碱性磷酸酶加入至磁分离清洗后的所述第一混合溶液中形成第二混合溶液，并对所述第二混合溶液进行磁分离清洗；
S4、提供化学发光底物，并将所述化学发光底物加入至磁分离清洗后的所述第二混合溶液中形成第三混合溶液，对所述第三混合溶液孵育后进行化学发光信号检测，即可获取所述核酸样品的信息。
2.如权利要求1所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述S2中对所述第一混合溶液进行磁分离清洗，具体包括：
S21、将所述第一混合溶液置于37℃的温度下孵育20 分钟；
S22、将孵育后的所述第一混合溶液进行三次磁分离清洗。
3.如权利要求1所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述S3中对所述第二混合溶液进行磁分离清洗，具体包括：
S31、将所述第二混合溶液置于37℃的温度下孵育10 分钟；
S32、将孵育后的所述第二混合溶液进行三次磁分离清洗。
4.如权利要求1所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的制备方法，包括：
S11、提供适量的羧基磁珠，并对所述羧基磁珠进行磁分离去除上清液；
S12、提供适量的活化液，并将所述活化液加入至磁分离后的所述羧基磁珠中混合均匀并进行活化反应形成第一反应溶液，并对所述第一反应溶液进行磁分离去除上清液；
S13、提供适量的缓冲液重悬磁珠和链霉亲和素适配体，并依次将所述缓冲液重悬磁珠和所述链霉亲和素适配体加入至磁分离后的所述第一反应溶液中混合均匀并进行活化反应形成第二反应溶液，并对所述第二反应溶液进行磁分离去除上清液；
S14、提供适量的第一封闭液和第二封闭液，并将所述第一封闭液加入至磁分离后的所述第二反应溶液中混合均匀并进行封闭形成第三反应溶液，对所述第三反应溶液进行磁分离去除上清液，并在磁分离后的所述第三反应溶液内加入第二封闭液形成所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠。
5.如权利要求4所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述活化液包括EDC溶液、NHS溶液以及MES缓冲液。
6.如权利要求4所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述第一封闭液和第二封闭液均包括适量的BSA溶液和Tris缓冲液。
7.如权利要求1所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述生物素偶联碱性磷酸酶的制备方法，包括：
S15、提供适量的碱性磷酸酶、PBS缓冲液以及Biotin-LC-NHS溶液；
S16、将所述碱性磷酸酶、所述PBS缓冲液以及所述Biotin-LC-NHS溶液混合均匀并发生化学反应形成第四反应溶液；
S17、使用10 KD超滤管对所述第四反应溶液进行纯化形成所述生物素偶联碱性磷酸酶。
8.如权利要求1所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素适配体修饰的磁珠的核酸序列为：5’GGGAATCGCCACCCGACGCAGGGTTTCCC-NH2 3’。
9.如权利要求1所述的基于Cas12a与链霉亲和素适配体级联的核酸化学发光检测方法，其特征在于，所述crRNA的核酸序列为：5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAAGUAGAUAUGGCAGCAC 3’、5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCACCUCUGUCACGACCGAGGCU 3’以及5’UAAUACGACUCACUAUAGGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAGUGCCAUUUGUUCAGUG 3’中的任意一种。
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