KR20230112647A - 콘카티머를 사용한 분석물 검출 방법 - Google Patents

콘카티머를 사용한 분석물 검출 방법 Download PDF

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고우삼 니클레시 쿤데루
존 브로버그
마틴 룬드버그
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Abstract

본 개시물 및 발명은 다수의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는 풀이 조합되고, 각 풀로부터의 단일의 DNA 분자를 사전정의된 순서로 함께 접합함으로써 DNA 콘카티머가 생성되고, 그 다음에 콘카티머가 시퀀싱된다. 각 콘카티머를 시퀀싱함으로써, 다수의 DNA 서열이 검출되고, 검출된 각 DNA 서열이 콘카티머에서의 그의 위치에 의해 그의 기원 풀에 배정될 수 있다. 이렇게 함으로써 이 방법은 다수의 풀 각각으로부터 DNA 서열의 특이적 검출을 가능하게 한다. 또한 이 방법을 수행하는 데 적합한 키트도 제공된다.

Description

콘카티머를 사용한 분석물 검출 방법
분야
본 개시물 및 발명은 다수의 풀(pool)로부터 DNA 서열을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는 풀을 조합하고, 각 풀로부터의 단일의 DNA 분자를 사전정의된 순서로 함께 접합함으로써 DNA 콘카티머(concatemer)를 생성하고, 그 다음에 콘카티머를 시퀀싱한다. 각 콘카티머를 시퀀싱함으로써, 다수의 DNA 서열을 검출하고, 검출된 각 DNA 서열을 콘카티머에서의 그의 위치에 의해 그의 기원 풀에 배정할 수 있다. 이렇게 함으로써 이 방법은 다수의 풀 각각으로부터의 DNA 서열의 특이적 검출을 가능하게 한다. 또한 이 방법을 수행하는 데 적합한 키트도 제공된다.
배경
현대의 단백질체학 방법은 작은 샘플 부피에서 많은 상이한 단백질(또는 단백질 복합체)을 검출할 수 있는 능력을 요구한다. 이것을 달성하기 위해서는, 멀티플렉스(multiplex) 분석을 수행해야 한다. 샘플 내의 단백질의 멀티플렉스 검출을 달성할 수 있는 흔한 방법은 근접 연장 검정(PEA) 및 근접 결찰 검정(PLA)을 포함한다. PEA 및 PLA는 WO 01/61037에 기재되어 있고; PEA는 WO 03/044231, WO 2004/094456, WO 2005/123963, WO 2006/137932 및 WO 2013/113699에 추가로 기재되어 있다.
PEA 및 PLA는 "근접 프로빙" 원칙에 의존하는 근접 검정이다. 이들 방법에서 분석물은 다수(일반적으로 2개)의 프로브의 결합에 의해 검출되고, 이 프로브들은 분석물과의 결합에 의해 근접해질 때(따라서 "근접 프로브") 신호가 생성되는 것을 허용한다. 대표적으로, 근접 프로브는 각각 프로브의 분석물 결합 도메인(또는 모이어티)에 연결된 핵산 도메인(또는 모이어티)을 포함하고, 신호의 생성은 핵산 모이어티 사이의 상호작용을 포함한다. 따라서 신호 생성은 프로브 사이(더 구체적으로 그들의 핵산 모이어티/도메인 사이)의 상호작용에 의존하고, 따라서 필요한 프로브가 분석물에 결합된 경우에만 발생하며, 이렇게 함으로써 검출 시스템에 향상된 특이성을 부여한다.
PEA에서, 프로브 쌍의 분석물 결합 도메인에 연결된 핵산 모이어티는 프로브가 아주 근접해 있을 때(즉, 표적에 결합될 때) 서로 혼성화하고, 그 다음에 핵산 폴리머라제를 사용하여 연장된다. 연장 생성물은 리포터 DNA 분자를 형성하며, 그의 검출은 특정 분석물(관련 프로브 쌍에 의해 결합된 분석물)의 관심 샘플 내에 존재를 입증한다. PLA에서, 프로브 쌍의 분석물 결합 도메인에 연결된 핵산 모이어티들은 프로브 쌍의 프로브들이 그들의 표적에 결합할 때 근접하게 되어 함께 결찰될 수 있거나, 또는 대안적으로, 그들은 함께 그들이 근접할 때 핵산 도메인과 혼성화할 수 있는 별개로 첨가된 올리고뉴클레오티드의 결찰의 주형이 될 수 있다. 그 다음에, 결찰 생성물이 증폭되어 리포터 DNA 분자로 작용한다. PEA 또는 PLA를 사용한 멀티플렉스 분석물 검출은 고유 바코드 서열을 각 프로브의 핵산 모이어티에 포함함으로써 달성될 수 있다.
근접 검정은 핵산 분석물을 포함하여 단백질 뿐만 아니라 임의의 분석물의 검출에 사용될 수 있고, 그러한 분석물의 멀티플렉스 검출에 사용될 수 있다. 게다가, 다른 검출 검정 예를 들어 이뮤노PCR(immunoPCR) 또는 이뮤노RCA(immunoRCA) 검정이 또한 핵산 리포터 분자를 사용할 수 있고, 임의의 분석물의 검출에 사용될 수 있다. 리포터 DNA 분자는 제공될 수 있거나, 또는 검정 과정 동안에 생성될 수 있으며, 바코드 서열을 포함하고, 바코드 서열에 의해 리포터 DNA 분자 및 이렇게 함으로써 이의 상응하는 분석물이 검출될 수 있다.
특정 분석물에 상응하는 리포터 DNA 분자는 그것이 함유하는 바코드 서열로 식별할 수 있다. 멀티플렉스 반응에서, 각 리포터 DNA 분자는 그의 특이적 서열을 검출하는 데 사용되는 기술에 의해 검출될 수 있다. 이것은 리포터를 시퀀싱함으로써, 또는 리포터 또는 그의 앰플리콘과 혼성화하는 특이적 프라이머 및/또는 특이적 검출 프로브를 사용하여 증폭시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, qPCR이 정의된 서열의 리포터 분자를 검출하는 데 사용될 수 있거나, 또는 동시계류 중인 출원 PCT/EP2021/058008에 기재된 바와 같이, 차세대 시퀀싱(NGS)이 특정 검정에서 생성된 모든 리포터 DNA 분자를 시퀀싱하는 데 사용될 수 있고, 이렇게 함으로써 생성된 모든 리포터 DNA 분자를 식별한다. 특정 리포터 DNA 분자의 검출은 그 리포터 DNA 분자에 상응하는 분석물이 관심 샘플에 존재한다는 것을 지시한다.
검출 검정에서 생성된 리포터 DNA 분자를 시퀀싱에 의해 검출하는 기존 방법에서는, 각 리포터 DNA 분자를 개별적으로 시퀀싱하여 검출한다. 따라서 임의의 주어진 시퀀싱 반응으로 시퀀싱하고 검출할 수 있는 리포터 DNA 분자의 수는 시퀀싱 플랫폼(예를 들어 플로우 셀)의 용량에 의해 제한된다. NGS 반응으로 검출될 수 있는 리포터 DNA 분자의 수를 증가시키는 것이 검출 검정의 효율을 증가시킬 것이기 때문에 유리할 것이다.
DNA 분자의 연쇄화(concatenation)에 의해 NGS의 처리량을 증가시키는 방법이 이전에 보고되었고(Schlecht et al., Scientific Reports 7: 5252, 2017), ConcatSeq라고 부른다. ConcatSeq 기술은 Gibson Assembly를 활용하여 관심 DNA 분자의 콘카티머를 생성하고, 시퀀싱 처리량을 5배 넘게 증가시키는 것으로 보고되었다. 이 문헌에서는 콘카티머의 특정 위치에 기초한 검정과 관련하여, 예를 들어 콘카티머에 그 위치에서 통합된 서열의 기원과 관련하여 정보를 전달하기 위해 멀티플렉스 검정의 맥락에서 콘카티머 구성을 사용하는 것이 제안되어 있지 않다. 본 발명은 멀티플렉스 검출 검정, 예컨대 PEA 및 PLA의 맥락에서 특히 유용한 시퀀싱을 위한 콘카티머를 생성하는 개선된 방법을 제공하며, 그에 의하면 다수의 풀로부터의 리포터 DNA 분자를 사전정의된 순서로 연쇄화함으로써 시퀀싱 처리량이 증가되고, 이렇게 해서 결과적인 콘카티머 내의 각 리포터 DNA 서열의 위치는 그것이 기원하는 풀을 지시한다. 각 풀은 예를 들어 별개의 샘플로부터, 또는 별개의 근접 프로브 패널을 사용하여 생성될 수 있다. 이 방법은 리포터 DNA 분자의 각 풀이 동일한 핵산 모이어티 세트를 운반하는 프로브를 사용하여 생성될 때 특히 유리하다. 콘카티머의 각 리포터 DNA 서열을 특정 기원 풀에 배정하는 능력은 다수의 풀 내에 존재하는 일치하는(identical) 리포터 서열이 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 구별될 수 있음을 의미한다.
따라서 본원에서 제공되는 방법은 근접 검정(예를 들어 PEA 및 PLA 검정)의 맥락에서 특별한 유용성을 갖지만, 그의 유용성이 이들 검정에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법은 DNA 분자의 풀을 분석하는 것을 요망하는 임의의 상황에서 사용될 수 있다.
요약
제1 측면에서, 다수의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 방법으로서, 각 풀이 다수의 DNA 분자 종을 포함하고, 방법이
(i) 풀을 조합하는 단계;
(ii) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는 단계; 및
(iii) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되는 단계
를 포함하는 방법이 본원에 개시되고 제공된다.
특히, 풀은 사전정의된 및 지향성 순서로 연쇄화될 수 있는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 각 풀의 DNA 분자는 사전지정된, 또는 선택된, 다른 풀로부터의 분자에만 연쇄화될 수 있거나 또는 연결될 수 있다. 따라서 각 풀이 콘카티머의 사전지정된 장소 또는 위치에 지정되거나 또는 할당된다. 따라서 콘카티머는 사전결정된 "풀 순서"의 단량체 위치를 가지며, 콘카티머의 각 단량체가 유래된 풀의 정체성이 콘카티머 내의 단량체 위치로부터 결정될 수 있다. 다시 말해서, 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치는 그것이 유래된 풀과 상관관계가 있다. 사전정의된 풀 순서의 콘카티머가 구성되는 것을 허용하기 위해, 각 DNA 분자(즉, 단량체)가 단 1개의 다른 DNA 분자에 연결될 수 있거나(그것이 종말 단량체인 경우) 또는 2개의 다른 DNA 분자에 연결될 수 있다(다시 말해서, 각 DNA 분자(단량체)가 단 1개의 다른 풀로부터의(그것이 종말 단량체인 경우) 또는 2개의 다른 풀로부터의 DNA 분자에 연결될 수 있다.
따라서, 풀의 DNA 분자에 연쇄화를 위한 준비를 시킬 수 있다. 구현예에서, 방법은 단계 (i) 전에 다수의 DNA 분자 풀에 연쇄화를 위한 준비를 시키는 단계를 포함하고, 상기 준비를 시키는 것이 각 풀 내의 DNA 분자에 연쇄화 단계에서 접합될 수 있는 정의된 말단 서열을 제공하는 것을 포함하고, 동일한 풀의 DNA 분자가 동일한 말단 서열을 가지고 상이한 풀은 상이한 말단 서열을 가지며, 이렇게 해서 1개의 풀로부터의 DNA 분자가 1개 또는 2개의 사전결정된 상이한 풀로부터의 DNA 분자에만 접합될 수 있다. DNA 분자는 콘카티머에서의 그의 위치에 의존하여 1개 또는 2개의 말단 서열을 가질 수 있다. 또한, 콘카티머의 종말 위치에 있는 DNA 분자에 또 다른 분자(즉, 풀로부터의 DNA 분자가 아닌 분자), 예를 들어 시퀀싱 또는 다른 어댑터에 연결하기 위한 제2 말단 서열이 제공될 수 있다.
제2 측면에서,
(i) 멀티플렉스 근접 프로브 쌍으로서, 각 근접 프로브가 분석물에 특이적인 결합 도메인 및 핵산 도메인을 포함하고, 각 근접 프로브 쌍이 상이한 분석물에 특이적이고, 이렇게 해서 근접 프로브 쌍이 그들의 각각의 분석물에 근접 결합할 때 근접 프로브 쌍의 핵산 도메인이 상호작용하여 리포터 DNA 분자를 생성할 수 있고, 각 쌍에서 한 근접 프로브의 핵산 도메인이 제1 범용 프라이머 결합 부위 및 3'에 바코드 서열을 포함하고, 다른 한 근접 프로브의 핵산 도메인이 제2 범용 프라이머 결합 부위 및 3'에 바코드 서열을 포함하는 프로브 쌍;
(ii) 제1 프라이머 쌍으로서, 프라이머가 제1 및 제2 범용 프라이머 결합 부위에 결합하도록 설계된 프라이머 쌍;
(iii) DNA 분자에 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의한 선형 콘카티머로의 지향성 조립을 위한 준비를 시키는 데 적합한 조립 프라이머 쌍 세트로서, 각 프라이머가 5'에서 3' 방향으로 조립 부위 및 혼성화 부위를 포함하고, 각 프라이머 쌍에서 혼성화 부위가 제1 및 제2 범용 프라이머 결합 부위에 결합하도록 설계된 프라이머 쌍 세트;
(iv) DNA 단편을 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의해 조립하는 데 적합한 효소로서, 효소가 조립 프라이머 쌍과 동일한 DNA 조립 수단에 사용하기에 적합한 효소; 및
(v) 제2 프라이머 쌍으로서, 각 프라이머가 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 인덱스 서열 및 혼성화 부위를 포함하고, 혼성화 부위가 선형 콘카티머의 말단을 형성하도록 설계된 조립 프라이머의 조립 부위에 결합하도록 설계되고;
이 쌍에서 제1 프라이머가 제1 시퀀싱 어댑터, 제1 시퀀싱 프라이머 부위 및 제1 인덱스 서열을 포함하고, 이 쌍에서 제2 프라이머가 제2 시퀀싱 어댑터, 제2 시퀀싱 프라이머 부위 및 제2 인덱스 서열을 포함하는 프라이머 쌍
을 포함하는 키트가 본원에 개시되고 제공된다.
구현예에서, 근접 프로브는 PEA를 위한 프로브일 수 있다. 그러한 구현예에서, 근접 프로브 쌍은 서로 혼성화하고 연장 반응의 주형이 되는 핵산 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 한 근접 프로브의 핵산 도메인은 그 쌍의 다른 한 프로브의 핵산 도메인이 주형이 되는 연장 반응을 프라이밍할 수 있다. 또 다른 구현예에서 근접 프로브는 PLA를 위한 프로브일 수 있다. 그러한 구현예에서, 근접 프로브 쌍은 함께 결찰될 수 있도록 공통 결찰 주형과 혼성화하는 핵산 도메인, 또는 1개 이상의 첨가된 올리고뉴클레오티드의 결찰의 주형이 되고/거나 결찰 생성물의 증폭을 프라이밍하는 핵산 도메인을 포함한다.
상세한 설명
위에서 언급한 바와 같이, 제1 측면은 다수의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 방법을 제공한다. DNA 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 검출된다. 주어진 DNA 서열이 시퀀싱에 의해 식별되고, 따라서 풀에서의 그의 존재가 확인된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "풀"은 다수의 DNA 분자 종을 함유하는 혼합물(예를 들어 용액)이다. 한 DNA 분자 "종"은 본원에서는 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 의미한다. 따라서 각 풀은 다수의, 또는 다시 말해서 복수의, 상이한 DNA 분자(즉, 상이한 서열을 갖는 DNA 분자)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "다수" 또는 "복수"는 적어도 2개를 의미한다. 복수의 상이한 DNA 분자를 포함하는 풀은 임의의 편리한 또는 요망되는 방식으로 제조될 수 있거나 또는 생성될 수 있다. 상이한 핵산 분자가 자연적으로 한 샘플에서 발생할 수 있고, 상이한 샘플은 상이한 풀을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 풀은 핵산 분자를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 핵산 분자의 풀은 생성될 수 있으며, 예를 들어 리포터 핵산 분자의 풀은 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이 샘플에서 다수의 상이한 분석물을 검출하는 멀티플렉스 검정에 의해 생성될 수 있다. 따라서 각 풀은 적어도 2개의 DNA 분자 종, 예를 들어 적어도 10개, 적어도 50개 또는 적어도 100개 또는 그 초과의 DNA 분자 종을 포함한다. 각 DNA 분자 종의 다수의 사본(copy)이 각각의 풀에 존재할 수 있다. 방법에서 검출된 각 풀로부터의 DNA 서열은 풀에 존재하는 다양한 DNA 분자 종의 서열 또는 다양한 DNA 분자 종 내에 포함된 서열이다. 검출된 서열은 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이 각 DNA 분자 전체일 수 있거나, 또는 각 DNA 분자의 일부일 수 있다(즉, 검출된 서열이 각 DNA 분자 내에 위치할 수 있다).
각 풀은 동일한 수의 DNA 분자 종을 포함할 수 있거나, 또는 각 풀은 상이한 수의 DNA 분자 종을 포함할 수 있다. 각 풀은 각 DNA 분자를 유사한 농도 또는 상이한 농도로 포함할 수 있다. 각 풀 내의 DNA 분자의 총 수가 유사한 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "DNA 분자"는 관련 분야에서의 그의 표준 의미를 가지고, 즉 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체이다. 각 DNA 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있지만, 일반적으로 이중가닥일 것이다. 일반적으로, DNA 분자는 4개의 표준 DNA 염기(아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌)를 포함(또는 주로 포함)하지만, 또한 다른 비표준 DNA 염기, 예를 들어 변형된 염기 및 DNA 부가물을 포함할 수 있다. 아래에서 추가로 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서 DNA 분자는 우라실 염기를 포함할 수 있다. 풀의 DNA 분자는 선형이다. 원형 DNA 분자는 연쇄화가 일어나기 위해서는 선형화되어야 한다.
방법은 복수의 풀, 다시 말해서 적어도 2개의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 데 사용된다. 바람직하게는 한 구현예에서, 방법은 적어도 3개의 풀, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 또는 그 초과의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 방법은 3 내지 8개의 풀, 3 내지 7개의 풀, 3 내지 6개의 풀 또는 4 내지 6개의 풀로부터 서열을 검출하는 데 사용된다. 실제로는 콘카티머의 길이 및 따라서, 풀의 수에 대한 실제 한계는 없고, 요망되는 경우 이것은 훨씬 더 많을 수 있다.
단계 (i)에서는, DNA 분자 풀을 조합한다. 다시 말해서, 모든 풀을 함께 첨가하여 혼합해서 단일의 반응 혼합물을 형성한다. 따라서 반응 혼합물은 각 풀로부터의 DNA 분자를 포함한다.
풀의 조합(즉, 혼합) 후, 연쇄화 반응을 수행한다. 연쇄화 반응은 풀링된 DNA 분자로부터 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성한다. 일반적인 용어로, DNA 콘카티머는 반복 DNA 단위의 연결된 사본을 함유하는 분자이다. 반복 DNA 단위가 풀로부터의 DNA 분자라는 점에서, 이것은 청구된 방법에 대해서도 적용된다. 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 각 DNA 분자는 일반적으로 공통 구조를 가지고(일부는 공통 서열을 공유할 수 있고), 이렇게 하여 이것은 콘카티머를 따라서 반복된다. 그러나, 반복 단위, 즉 콘카티머의 단량체는 일치할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 콘카티머의 단량체는 각 풀로부터 1개씩인 개별 DNA 분자로 구성되고, 이들이 콘카티머에서 함께 연결된다. 생성된 콘카티머는 선형이고, 즉 그것은 원형 분자가 아니고 오히려 2개의 말단을 가진다.
각 콘카티머는 각 풀로부터의 1개의 DNA 분자를 함께 접합함으로써 생성된다. 따라서, 예를 들어 방법이 4개의 DNA 분자 풀에 대해 수행되는 경우, 결과적으로 얻은 콘카티머는 각각 4개의 반복 단위, 즉 4개의 풀 각각으로부터의 1개의 DNA 분자를 포함할 것이다. 따라서 생성된 콘카티머는 사전결정된 DNA 분자 수(풀 수에 상응함)를 포함하고, 방법에 사용된 풀 수와 상관있는 사전정의된 길이를 가진다. 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 DNA 분자를 포함하지만, 각 콘카티머에 통합된 각 풀로부터의 특이적 DNA 분자는 랜덤이고, 즉 각 콘카티머는 각 풀로부터의 단일의 DNA 분자를 포함하고, 각 콘카티머로 조립된 각 풀로부터의 DNA 분자는 랜덤으로 선택된다.
위에서 언급한 바와 같이, 방법에서는 다수의 콘카티머가 생성된다. 생성된 콘카티머의 수는 각 풀의 총 DNA 분자 수(및 특히, 가장 적은 총 DNA 분자 수를 갖는 풀의 총 DNA 분자 수 - 위에서 언급한 바와 같이 풀들은 유사한 DNA 분자 수를 함유하는 것이 바람직함)에 상응한다. 연쇄화 반응이 조합된 DNA 분자를 본질적으로 소진하고, 이렇게 해서 풀로부터의 본질적으로 모든 DNA 분자가 콘카티머로 통합되는 것이 바람직하다.
연쇄화 동안, 각 풀로부터의 DNA 분자는 사전정의된 순서로 조립되고, 이렇게 해서 각 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치(또는 다시 말해서 콘카티머 내의 그의 위치)는 DNA 분자가 기원하는 풀에 기초해서 정의된다. 형성된 각 콘카티머에서, DNA 분자는 (각 DNA 분자가 기원하는 풀에 기초하여) 동일한 순서로 배열된다. 따라서 미리 정의된 풀의 순서(소위 "풀 순서")가 있고, 각 콘카티머에 대해서 동일하다. 임의의 적합한 방법이 연쇄화를 수행하는 데 사용될 수 있다. 유일한 요건은 방법이 DNA 분자의 지향성 조립을 수행하는 데 적합하다는 것이다.
각 콘카티머가 각 풀로부터의 DNA 분자를 포함하고 DNA 분자가 그의 기원 풀에 기초해서 사전정의된 순서로 배열된다는 사실은 각 콘카티머를 시퀀싱할 때 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 기원 풀이 단지 콘카티머 내의 DNA 분자의 위치에 기초해서 결정될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 방법이 풀 A, B, C 및 D라는 4개의 풀에 대해 수행되는 경우, 각 풀이 콘카티머의 위치에 사전배정될 것이다. 예를 들어 풀 A는 1번 위치에, 풀 B는 2번 위치에, 풀 C는 3번 위치에, 및 풀 D는 4번 위치에 배정될 수 있다. 따라서 각 콘카티머는 다음 순서로 조립된 4개의 DNA 분자를 함유할 것이다:
풀 A 분자 - 풀 B 분자 - 풀 C 분자 - 풀 D 분자
샘플 A 분자 - 샘플 B 분자 - 샘플 C 분자 - 샘플 D 분자
이것은 도 7에 개략적으로 묘사되고, 도 7은 풀 1, 2, 3 및 4라는 4개의 풀각각으로부터의 분자가 콘카티머로 통합되는 방법을 나타낸다. 이 도면은 각 풀에서 생성된 단일의 분자를 묘사한다. 별표(*)는 상보적 서열을 지시한다. 다시 말해서, "A" 및 "A*"는 서로 상보적이다.
DNA가 이중가닥이고 각 가닥이 시퀀싱 시에 별개로 판독될 수 있기 때문에, 분명히 DNA 분자는 두 가닥에서 반대 순서로 배열될 것이다. 따라서 상기 예에서, 상기 순서가 콘카티머의 제1 가닥에서의 분자의 순서라면, 콘카티머의 제2 가닥은 4개의 DNA 분자를 역순으로 함유할 것이다: 즉,
풀 D 분자 - 풀 C 분자 - 풀 B 분자 - 풀 A 분자
각 콘카티머의 두 가닥은 구별가능하다. 일반적으로 방법이 수행될 때 각 풀 내의 DNA 분자의 가능한 서열은 알려져 있고, 예를 들어 각 풀 내의 DNA 분자의 서열은 알려진 DNA 서열 세트로부터 선택되고, 이렇게 해서 각 DNA 분자는 제한된 DNA 서열 세트 중 하나를 가질 수 있을 뿐이다. 이 구현예에서, 두 가닥은 그들이 각 DNA 분자의 순방향 서열을 포함하는지 역방향 서열을 포함하는지에 기초하여 구별될 수 있다. 따라서, 상기 예에서 제1 가닥은 각 DNA 분자의 순방향 서열을 포함하고, 역방향 가닥은 각 DNA 분자의 역방향 서열을 포함한다(여기서 역방향은 물론 역방향 상보체를 의미함). 따라서 각 가닥이 시퀀싱될 때 콘카티머의 순방향 가닥인지 역방향 가닥인지를 결정하고, 이렇게 함으로써 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 기원 풀을 확립하는 것이 가능하다. 이를 위해, DNA 분자가 회문 서열을 갖지 않는 것이 바람직할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 및 특히, DNA 분자의 가능한 서열이 알려지지 않은 경우, 각 콘카티머의 말단에 그들이 구별될 수 있도록 태그를 붙일 수 있다. 특히, 종말 특이적 태그가 콘카티머의 한쪽 또는 양쪽 말단에 첨가될 수 있다. 제1 종말 특이적 태그가 각 DNA 콘카티머의 한쪽 말단, 예를 들어 1번 위치의 DNA 분자의 자유로운 말단에 부착될 수 있다. 임의로, 제2 종말 특이적 태그가 콘카티머의 다른 한쪽 말단의 DNA 분자의 자유로운 말단에 부착될 수 있다(예를 들어, 상기 예에서 제2 태그는 4번 위치의 DNA 분자의 자유로운 말단에 부착될 수 있다). 종말 특이적 태그는 각 콘카티머 서열의 배향을 가능하게 하는데, 하지만 이것은 그 안에 함유된 DNA 분자의 서열로부터는 가능하지 않다. 2개의 종말 특이적 태그가 사용되는 경우, 제1 및 제2 종말 특이적 태그는 상이한 서열을 가진다. 적합한 태그의 예는 아래에서 기재되고, 예를 들어 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 종말 특이적 태그로 작용할 수 있다.
일단 콘카티머가 생성되면, 그것을 시퀀싱한다. 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 임의의 적합한 시퀀싱 방법이 사용될 수 있다. 일단 콘카티머가 시퀀싱되면, 각 콘카티머 내의 DNA 분자를 식별할 수 있다. 이것은 각 콘카티머 내의 각 풀로부터의 DNA 서열이 검출된다는 것을 의미한다. 각 DNA 서열의 기원 풀이 각 콘카티머 내의 서열의 위치에 의해 결정될 수 있기 때문에, 이것은 각 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그의 기원 풀에 배정되는 것을 허용한다. 모든 콘카티머를 시퀀싱함으로써, 각 풀에 존재하는 모든 DNA 서열을 식별할 수 있다.
흔히, 방법은 단계 (i) 전에 수행되는 준비 단계를 포함한다. 준비 단계에서는, 각 풀 내의 DNA 분자에 연쇄화 단계에서 접합될 수 있는 정의된 말단 서열을 제공함으로써 다수의 DNA 분자 풀에 연쇄화를 위한 준비를 시킨다. 대표적으로, 각 DNA 분자가 각 말단에 1개씩 2개의 말단 서열을 받겠지만, 이것은 엄격하게 필요한 것은 아니며, 콘카티머에서 종말 단량체로 지정된 DNA 분자는 1개만 받을 수 있다. 준비 단계에서, 각 풀 내의 모든 DNA 분자에 동일한 말단 서열이 제공된다(하지만 각 풀에서 두 말단 서열은 동일하지 않고 - 각 DNA 분자에 2개의 상이한 말단 서열이 제공된다). 그러나, 각 상이한 풀의 DNA 분자에 상이한 말단 서열이 제공된다. 다시 말해서, 각 풀 내에서 모든 DNA 분자에 동일한 말단 서열 쌍이 제공되지만, 각 상이한 풀로부터의 DNA 분자에는 상이한 말단 서열 쌍이 제공된다.
본원에서 말단 서열은 각 풀에서 DNA 분자의 말단에 부착된 서열을 의미하고, 이렇게 해서 그들의 부착 후 정의된 말단 서열이 풀 내의 각 DNA 분자의 양쪽 말단을 형성한다. 따라서 각 DNA 분자에는 DNA 분자의 한쪽 말단에 부착된 제1 정의된 말단 서열, 및 DNA 분자의 다른 한쪽 말단에 부착된 제2 정의된 말단 서열이 제공된다. 위에 명시된 바와 같이, 제1 말단 서열 및 제2 말단 서열은 상이하다. 대안적으로 말단 서열을 어댑터 서열, 더 특히 종말 어댑터 서열 또는 조립 어댑터 서열이라고 부를 수 있다.
말단 서열은 다양한 풀의 DNA 분자들이 정의된 순서로 서로 접합하는 것을 가능하게 하도록 구성된다. 따라서 각 말단 서열(콘카티머의 종말을 형성하도록 설계된 것들은 제외함)은 사용된 말단 서열 세트 내에서 쌍을 이루는 말단 서열(예를 들어 상보적 말단 서열)을 가진다. 각 말단 서열 쌍의 경우, 2개의 말단 서열이 상이한 풀에 제공된다. 다시 말해서, 주어진 말단 서열 쌍 중에서, 제1 말단 서열은 제1 풀의 DNA 분자에 부착되고 제2 말단 서열은 제2 풀의 DNA 분자에 부착된다. 이것은 풀의 조합 후 제1 풀로부터의 DNA 분자가 제2 풀로부터의 DNA 분자에 그의 쌍을 이루는 말단 서열을 통해 접합될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 연쇄화 반응에서 모든 풀에 걸쳐서 쌍을 이루는 말단 서열을 통해 각 풀로부터의 DNA 분자가 2개의 다른 정의된 풀로부터의 DNA 분자(각각이 1개의 다른 DNA 분자에만 접합되는 콘카티머의 종말을 형성하도록 설계된 DNA 분자는 제외함)에 정의된 배향으로 접합될 수 있다. 적합한 유형의 쌍을 이루는 말단 서열은 관련 분야에 알려져 있고, 예를 들어 각 말단 서열 쌍은 그들을 접합하는 데 사용될 수 있는 특이적 제한 부위를 공유할 수 있다. DNA 분자의 지향성 접합을 위한 다른 수단은 아래에서 논의된다.
아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 말단 서열은 풀의 DNA 분자의 말단에 임의의 적합한 방법에 의해 첨가될 수 있다. 말단 서열을 함유하는 프라이머를 사용하는 증폭, 예를 들어 PCR에 의한 증폭이 바람직한 방법이다.
따라서 특정 구현예에서, 다수의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 방법으로서, 각 풀이 다수의 DNA 분자 종을 포함하고, 방법이
(i) 각 풀 내의 DNA 분자에 연쇄화 단계에서 접합될 수 있는 정의된 말단 서열을 제공함으로써 각 풀 내의 DNA 분자에 연쇄화를 위한 준비를 시키는 단계로서, 동일한 풀의 DNA 분자가 동일한 말단 서열을 가지고 상이한 풀은 상이한 말단 서열을 가지며, 이렇게 해서 1개의 풀로부터의 DNA 분자가 1개 또는 2개의 사전결정된 상이한 풀로부터의 DNA 분자에만 접합될 수 있는 단계;
(ii) 풀을 조합하는 단계;
(iii) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는 단계; 및
(iv) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되는 단계
를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 방법에서 연쇄화되고 시퀀싱될 DNA 분자는 DNA 증폭 반응에서 생성되는 앰플리콘이다. 앰플리콘은 임의의 알려진 DNA 증폭 반응, 예를 들어 LAMP(루프-매개 등온 증폭)에 의해 생성될 수 있지만, 가장 바람직하게는 PCR에 의해 생성된다.
다시 말해서, 연쇄화 전에, DNA 분자를 증폭 반응(바람직하게는 PCR)에 의해 생성할 수 있다. 이 경우에는 각 풀의 DNA 분자가 별개의 증폭 반응에 의해, 예를 들어 별개의 PCR에 의해 생성된다. 동일한 PCR이 풀에서 DNA 분자를 생성하는 데 뿐만 아니라 또한 위에서 기재된 바와 같이 DNA 분자에 말단 서열을 첨가하는 데도 사용될 수 있다. 이 구현예에서, 말단 서열은 증폭에 사용된 프라이머의 5' 종말(또는 적어도 5'의 프라이머 혼성화 부위)에 포함된다. 대안적 구현예에서는, 제1 PCR을 각 풀에서 수행하여 DNA 분자를 생성하고, 이어서 제2 PCR을 각 풀에서 수행하여 말단 서열을 DNA 분자에 첨가한다.
특정 구현예에서, 각 DNA 분자는 분석물에 특이적인 리포터 DNA 분자이다(본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리포터 DNA" 및 "리포터 DNA 분자"는 호환가능하다). 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "분석물"은 검출 검정을 사용하여 검출하고자 하는 임의의 물질(예를 들어 분자) 또는 실체를 의미한다. 이 구현예에서, 본 발명의 방법(위에서 기재된 바와 같음)은 검출 검정의 일부를 구성한다. 따라서 분석물은 검출 검정의 그 "표적" 또는 표적이다.
따라서 분석물은 검출하고자 하는 임의의 생체분자 또는 화학적 화합물, 예를 들어 펩티드 또는 단백질, 또는 핵산 분자, 또는 유기 및 무기 분자를 포함한 소분자일 수 있다. 분석물은 세포, 또는 바이러스를 포함한 미생물, 또는 그의 단편 또는 생성물일 수 있다. 따라서 분석물은 특이적 결합 파트너(예를 들어 친화성 결합 파트너)가 발달될 수 있는 임의의 물질 또는 실체일 수 있음을 알게 될 것이다. 요구되는 모든 것은 분석물이 적어도 2개의 결합 파트너(더 특히, 적어도 2개의 근접 프로브의 분석물 결합 도메인)에 동시에 결합할 수 있다는 것이다.
위에서 상술한 바와 같이, 방법은 근접 프로브 기반 검정에서 특별한 유용성을 가진다. 그러한 검정은 단백질 또는 폴리펩티드의 검출에서 특별한 유용성을 가진다. 따라서 특히 관심을 끄는 분석물은 단백질성 분자 예컨대 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 프리온, 또는 단백질 또는 폴리펩티드 성분 등을 포함하는 임의의 분자, 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서 분석물은 전체적으로 또는 부분적으로 단백질성 분자, 가장 특히 단백질이다. 다시 말해서, 구현예에서 분석물은 단백질이거나 또는 단백질을 포함한다. 이 맥락에서, 용어 "단백질"은 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 데 사용된다.
분석물은 단일의 분자이거나, 또는 서로 공유결합될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있는 2개 이상의 분자 하위세트를 함유하는 복합 분자일 수 있다. 따라서 세포 또는 미생물 외에도, 그러한 복합 분석물은 또한 단백질 복합체, 또는 단백질 및 하나 이상의 다른 유형의 생체분자를 포함하는 생체분자 복합체일 수 있다. 따라서 그러한 복합체는 동종다합체 또는 이종다합체일 수 있다. 또한 분자(예를 들어 단백질)의 집합체, 예를 들어 동일한 단백질 또는 상이한 단백질의 집합체가 표적 분석물을 구성할 수 있다. 분석물은 또한 단백질 또는 펩티드와 핵산 분자 예컨대 DNA 또는 RNA 사이의 복합체일 수 있다. 특히 관심을 끄는 것은 단백질과 핵산, 예를 들어 조절 인자 예컨대 전사 인자와 DNA 또는 RNA 사이의 상호작용일 수 있다. 따라서 특정 구현예에서 분석물은 단백질-핵산 복합체(예를 들어, 단백질-DNA 복합체 또는 단백질-RNA 복합체)이다. 또 다른 구현예에서, 분석물은 비핵산 분석물이고, 비핵산 분석물은 핵산 분자를 포함하지 않는 분석물을 의미한다. 비핵산 분석물은 단백질 및 위에서 언급한 바와 같은 단백질 복합체, 소분자 및 지질을 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 각 DNA 분자는 분석물에 대한 리포터 DNA 분자일 수 있다. 이 구현예에서, 검출 검정은 샘플에서 하나 이상의 분석물의 검출을 위해 사용된다. 한 구현예에서, 샘플 내에 특정 분석물의 존재는 검출 검정 동안에 특정 분석물에 상응하는 것으로 알려진 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 생성을 초래한다. 또 다른 구현예에서는, 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자가 검정에서 분석물의 존재에 대한 리포터로서, 예를 들어 분석물에 결합하는 모이어티를 위한 태그 또는 표지자로서 제공될 수 있다. 특정 뉴클레오티드 서열의 검출은 그 서열이 상응하는 분석물이 샘플에 존재한다는 것을 지시한다. 따라서 "리포터 DNA 분자"는 검출 검정 동안 존재(또는 검출) 또는 생성이 샘플에 특정 분석물의 존재를 지시하는 핵산 분자이다. 구현예에서, 각 풀은 별개의 검출 검정에서 생성된 리포터 DNA 분자를 포함한다. 예를 들어, 3개의 검출 검정이 수행되는 경우에는, 3개의 리포터 DNA 분자 풀이 생성될 수 있다.
검출 검정은 각 검정이 샘플에서 특정 분석물을 검출하는 심플렉스(simplex)로, 또는 검정이 샘플에서 다수의 상이한 분석물을 검출하는 멀티플렉스로 수행될 수 있다. 다수의 심플렉스 검정으로부터의 리포터 DNA 분자를 풀링하여 다수의 상이한 리포터 분자를 포함하는 풀을 생성할 수 있다. 대안적으로, 멀티플렉스 검정이 상이한 리포터 분자의 풀을 산출할 수 있다. 예를 들어, 단일의 샘플에 대해 멀티플렉스 검정을 수행하여 다수의 상이한 분석물을 검출할 수 있다. 다수의 풀이 다수의 멀티플렉스 검정으로부터 생성될 수 있으며, 여기서는 각 멀티플렉스 검정이 상이한 풀을 산출한다.
위에서 언급한 바와 같이, 각 리포터 DNA 분자는 특정 분석물에 특이적이다. 따라서, 리포터 DNA 분자는 주어진 분석물을 식별하거나, 또는 더 특히, 분석물을 검출할 수 있는 바코드 서열로서 기능하는 서열 또는 도메인을 함유할 수 있다. 대략적으로 말하면, 바코드 서열은 리포터 및 따라서 검출되는 분석물을 식별하는 리포터 DNA 분자 내의 뉴클레오티드 서열로 정의될 수 있다. 검출 검정에서 생성된 각 리포터 DNA 분자 완전체는 고유할 수 있고, 이 경우 완전한 리포터 DNA 분자가 바코드 서열로 간주될 수 있다. 더 흔히, 리포터 DNA 분자의 1개 이상의 더 작은 부분이 바코드 서열로 작용한다.
따라서 특정 구현예에서,
(i) 다수의 별개의 검출 검정을 수행하는 단계로서, 각 검출 검정이 다수의 상이한 리포터 DNA 분자의 풀을 생성하고, 각 리포터 DNA 분자가 특정 분석물에 특이적인 단계;
(ii) 풀을 조합하는 단계;
(iii) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 리포터 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 리포터 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 리포터 DNA 분자를 포함하는 단계; 및
(iv) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 리포터 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 리포터 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되고, 이렇게 함으로써 샘플 또는 각 샘플에서 분석물을 검출하는 단계
를 포함하는 하나 이상의 샘플에서 분석물을 검출하는 방법이 제공된다.
특히, 방법은 단계 (i) 후에 각 풀 내의 리포터 DNA 분자에 연쇄화 단계에서 접합될 수 있는 정의된 말단 서열을 제공하는 단계로서, 동일한 풀의 리포터 DNA 분자가 모두 동일한 말단 서열을 가지고 상이한 풀은 상이한 말단 서열을 가지며, 이렇게 해서 한 풀로부터의 리포터 DNA 분자가 1개 또는 2개의 사전결정된 상이한 풀로부터의 리포터 DNA 분자에만 접합될 수 있는 단계를 포함할 수 있다.
이 구현예에서는, 다수의 검출 검정이 모두 동일한(즉, 리포터 DNA 분자의 각 풀을 생성하는데 동일한 검정이 사용됨) 것이 바람직하다.
용어 "검출하는" 또는 "검출된"은 본원에서는 광범위하게 사용되어 분석물의 존재 또는 부재를 결정하는 것(즉, 표적 분석물이 관심 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것)을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이 구현예를 수행하고 샘플 내의 특정 관심 분석물을 검출하려고 시도하지만 분석물이 샘플에 존재하지 않아서 그것이 검출되지 않는 경우, 샘플로부터의 그의 존재 또는 부재가 평가되었기 때문에 "분석물 검출" 단계를 여전히 수행하였다. 분석물을 "검출"하는 단계는 그 검출이 성공적임을 증명하는지에, 즉 분석물이 실제로 검출되는지에 의존하지 않는다.
분석물을 검출하는 것은 샘플에서의 분석물의 농도 또는 풍부도의 임의의 형태의 측정을 추가로 포함할 수 있다. 표적 분석물의 절대 농도 또는 분석물의 상대 농도를 결정할 수 있으며, 그 목적을 위해 표적 분석물의 농도를 그 샘플에서의 또는 다른 샘플에서의 또 다른 표적 분석물(또는 다른 표적 분석물)의 농도와 비교할 수 있다. 따라서 "검출하는 것"은 분석물의 존재 또는 부재 또는 양을 결정하는 것, 측정하는 것, 평가하는 것 또는 검정하는 것을 포함할 수 있다. 반정량적 결정을 포함하여 정량적 및 정성적 결정, 측정 또는 평가가 포함된다. 그러한 결정, 측정 또는 평가는 예를 들어 샘플에서 둘 이상의 상이한 분석물이 검출되는 경우에는 상대적일 수 있거나, 또는 절대적일 수 있다. 이와 같이, 샘플에서 표적 분석물의 정량화와 관련하여 사용될 때 용어 "정량화"는 절대적 또는 상대적 정량화를 지칭할 수 있다. 절대적 정량화는 알려진 농도(들)의 하나 이상의 대조 분석물의 포함에 의해 및/또는 표적 분석물의 검출된 수준과 알려진 대조 분석물을 (예를 들어 표준 곡선의 생성을 통해) 참조함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 상대적 정량화는 둘 이상의 상이한 표적 분석물 사이의 검출된 수준 또는 양을 비교하여 그 둘 이상의 상이한 분석물 각각의, 즉 서로에 대한, 상대적 정량화를 제공함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 방법에서 정량화를 달성할 수 있는 방법은 아래에서 추가로 논의된다.
방법의 이 구현예는 하나 이상의 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 것이다. 위에서 상술한 바와 같이, 각 별개의 검출 검정은 상이한 샘플에 대해 수행될 수 있다. 이 경우, 각 검출 검정이 다수의 상이한 샘플에서 동일한 분석물을 검출하기 위해 또는 상이한 샘플에서 상이한 분석물을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 각 검출 검정이 동일한 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 각 별개의 검출 검정에서 상이한 분석물이 검출된다. 대안적으로, 다수의 샘플이 검정되고 다수의 샘플 각각에 대해 다수의 별개의 검출 검정이 수행되는 조합이 사용될 수 있다.
임의의 관심 샘플은 방법에 따라서(즉, 방법의 모든 구현예에 따라서) 검정될 수 있다. 다시 말해서, 관심 분석물을 함유하거나 또는 함유할 수 있고, 관심 분석물을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 및/또는 관심 분석물의 농도를 결정하기 위해 분석하고자 하는 임의의 샘플.
따라서 임의의 생물학적 또는 임상 샘플, 예를 들어 유기체의 또는 유기체로부터의 임의의 세포 또는 조직 샘플, 또는 임의의 체액 또는 그로부터 유래된 조제물, 뿐만 아니라 세포 배양물, 세포 조제물, 세포 용해물 등과 같은 샘플을 분석할 수 있다. 환경 샘플, 예를 들어 토양 및 물 샘플, 또는 식품 샘플도 또한 본원의 방법에 따라 분석할 수 있다. 샘플은 갓 준비될 수 있거나, 또는 그것은 예를 들어 보관을 위해 임의의 편리한 방법으로 사전처리될 수 있다.
따라서 대표 샘플은 예를 들어 식품 및 관련 제품, 임상 및 환경 샘플을 포함하여 생체분자 또는 임의의 다른 요망되는 또는 표적 분석물을 함유할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 샘플은 생물학적 샘플일 수 있고, 생물학적 샘플은 원핵 또는 진핵 세포, 바이러스, 박테리오파지, 마이코플라즈마, 원형질체 및 소기관을 포함하여 임의의 바이러스 또는 세포 물질을 함유할 수 있다. 따라서 그러한 생물학적 물질은 임의의 유형의 포유류 및/또는 비포유류 동물 세포, 식물 세포, 남조류를 포함하는 조류, 진균, 박테리아, 원생동물 등을 포함할 수 있다. 그것은 추가로 제조된 또는 합성 샘플, 예를 들어 단리된 또는 정제된 분석물을 함유하는 샘플일 수 있다.
샘플은 임상 샘플, 예를 들어 전혈 및 혈액 유래 생성물 예컨대 혈장, 혈청, 버피 코트 및 혈액 세포, 소변, 대변, 뇌척수액 또는 임의의 다른 체액(예를 들어 호흡기 분비물, 타액, 젖 등), 조직 및 생검일 수 있다. 구현예에서 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플이다. 따라서 이 방법은 예를 들어 바이오마커의 검출에 사용될 수 있거나, 또는 병원균 유래 분석물 또는 질병 또는 임상 병태와 연관된 분석물에 대해 샘플을 검정하는 데 사용될 수 있다. 샘플은 특히 인간으로부터 유래될 수 있지만, 방법은 비인간 동물로부터 유래된 샘플(즉, 수의학적 샘플)에 동일하게 적용될 수 있다. 샘플에 방법에 사용하기 위한 준비를 시키기 위해 샘플은 임의의 편리한 또는 요망되는 방식으로, 예를 들어 세포 용해 또는 제거 등에 의해 사전처리될 수 있다.
분석물 검출 방법의 한 구현예에서, 다수의 별개의 검출 검정 각각이 다수의 분석물을 검출하는 데 사용된다. 다시 말해서, 구현예에서 각 검출 검정은 멀티플렉스 검출 검정이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "멀티플렉스"는 다수의(즉, 적어도 2개의) 상이한 검출 검정이 동시에 동일한 반응 용기 또는 반응 혼합물에서 수행되는 검정을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, 다수의 상이한 분석물이 동시에 검정된다. 바람직하게는 각 멀티플렉스 검출 검정이 적어도 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250 또는 300개 분석물을 검출하는 데 사용된다. 따라서 구현예에서 리포터 DNA 분자는 샘플에 대해 수행된 멀티플렉스 검출 검정에 의해 생성되고, 방법은 각 샘플에서 다수의 분석물을 검출하기 위해 하나 이상의 샘플에 대해 다수의 멀티플렉스 검출 검정을 수행하는 것을 포함하고, 각 멀티플렉스 검출 검정은 리포터 DNA 분자 풀을 산출한다.
따라서 특정 구현예에서,
(i) 다수의 별개의 멀티플렉스 검출 검정을 수행하는 단계로서, 각 멀티플렉스 검출 검정이 샘플에서 다수의 분석물을 검출하고, 각 멀티플렉스 검출 검정이 리포터 DNA 분자의 풀을 생성하고, 각 리포터 DNA 분자가 특정 분석물에 특이적인 단계;
(ii) 풀을 조합하는 단계;
(iii) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 리포터 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 리포터 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 리포터 DNA 분자를 포함하는 단계; 및
(iv) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 리포터 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 리포터 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되고, 이렇게 함으로써 샘플 또는 각 샘플에서 분석물을 검출하는 단계
를 포함하는 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출하는 방법을 제공한다.
특히, 방법은 단계 (i) 후에 각 풀 내의 리포터 DNA 분자에 연쇄화 단계에서 접합될 수 있는 정의된 말단 서열을 제공하는 단계로서, 동일한 풀의 리포터 DNA 분자가 모두 동일한 말단 서열을 가지고 상이한 풀은 상이한 말단 서열을 가지며, 이렇게 해서 한 풀로부터의 리포터 DNA 분자가 1개 또는 2개의 사전결정된 상이한 풀로부터의 리포터 DNA 분자에만 접합될 수 있는 단계를 포함할 수 있다.
위에서 상술한 바와 같이, 각 멀티플렉스 검출 검정이 동일한(즉, 동일한 검정이 각 리포터 DNA 분자 풀을 생성하는 데 사용되는) 것이 바람직하다. 또한 위에서 상술한 바와 같이, 각 멀티플렉스 검출 검정이 상이한 샘플에 대해 수행될 수 있다. 이 경우, 각 멀티플렉스 검출 검정이 다수의 상이한 샘플에서 동일한 분석물을 검출하기 위해, 또는 상이한 샘플에서 상이한 분석물을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 각 멀티플렉스 검출 검정이 동일한 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 각 별개의 멀티플렉스 검출 검정에서 상이한 분석물이 검출된다. 대안적으로, 다수의 샘플이 검정되고, 다수의 샘플 각각에 대해 다수의 별개의 멀티플렉스 검출 검정이 수행되는 조합이 사용될 수 있다.
위에 기재된 검출 검정 및 멀티플렉스 검출 검정은 PCR을 이용하여 검출되는 리포터 DNA 분자를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 PCR이 검출 검정 및 멀티플렉스 검출 검정에서 수행되고, 이어서 제2 PCR이 수행된다. 그러한 구현예에서, 제1 PCR은 제1 PCR 생성물을 생성할 수 있고, 이어서 제1 PCR 생성물에 연쇄화를 위한 준비를 시키기 위해 제1 PCR 생성물을 제2 PCR에 의해 변형할 수 있다. 이 구현예에서, 제2 PCR은 DNA 분자의 풀을 생성한다. 다시 말해서, 제2 PCR은 DNA 분자를 생성하고, 이어서 이들을 조합하고 연쇄화한다. 이 구현예에서, 제2 PCR은 위에서 기재된 바와 같이 연쇄화 단계에서 접합될 정의된 말단 서열을 제1 PCR의 생성물에 제공하는 데 사용된다. 따라서 제1 및 제2 PCR 반응 둘 모두가 풀이 조합되기 전에 수행된다.
특정 구현예에서, 위에서 기재된 검출 검정 및 멀티플렉스 검출 검정은 근접 프로브 기반 검출 검정, 예를 들어 PLA 또는 PEA이다. 대표 구현예에서 각 검출 검정은 근접 연장 검정(PEA)이다. 마찬가지로 각 멀티플렉스 검출 검정은 근접 연장 검정(즉, 멀티플렉스 근접 연장 검정)일 수 있다.
근접 연장 검정(PEA)은 위에 간략하게 기재되어 있다. 위에서 언급한 바와 같이 이들 기술은 둘 모두 근접 프로브 쌍의 사용에 의존한다. PEA는 일반적으로 WO 2012/104261에서 논의되며, 이 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
근접 프로브는 본원에서는 분석물에 특이적인 결합 도메인(또는 대안적으로 "분석물 특이적 결합 도메인"으로 표현됨) 및 핵산 도메인을 포함하는 실체로 정의된다. "분석물에 특이적인" 또는 "분석물 특이적"은 분석물 결합 도메인이 특정 표적 분석물을 직접적으로 또는 간접적으로 특이적으로 인식하고 결합한다는 것을 의미하며, 즉 그것은 그것이 다른 분석물 또는 모이어티에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 그의 표적 분석물에 결합한다. 결합 도메인은 분석물에 직접적으로 결합할 수 있고, 즉 결합 도메인은 분석물의 1차 결합 파트너일 수 있거나, 또는 결합 도메인은 분석물에 간접적으로 결합할 수 있고, 즉 결합 도메인은 분석물의 2차 결합 파트너일 수 있다. 후자의 경우, 결합 도메인은 분석물의 1차 결합 파트너에 결합할 수 있다. 구현예에서, 결합 도메인은 항체, 또는 항원-결합 도메인을 함유하는 항체의 단편 또는 유도체이고, 특히 여기서 항체는 단일클론 항체이다 그러한 항체 단편 또는 유도체의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 scFv 분자를 포함한다.
근접 프로브의 핵산 도메인은 DNA 도메인 또는 RNA 도메인일 수 있다. 바람직하게는 그것은 DNA 도메인이다. 각 쌍에서 근접 프로브의 핵산 도메인은 대표적으로 서로 혼성화하거나 또는 1개 이상의 공통 올리고뉴클레오티드 분자(1쌍 중의 두 근접 프로브 모두의 핵산 도메인과 혼성화할 수 있음)와 혼성화하도록 설계된다. 따라서 핵산 도메인은 적어도 부분적으로 단일가닥이어야 한다. 특정 구현예에서 근접 프로브의 핵산 도메인은 완전히 단일가닥이다. 다른 구현예에서, 근접 프로브의 핵산 도메인은 부분적으로 단일가닥이며, 단일가닥 부분 및 이중가닥 부분 둘 모두를 포함한다.
근접 프로브는 대표적으로 쌍으로 제공되며, 각 쌍이 표적 분석물에 특이적이다. 이것은 각 근접 프로브 쌍 내에서 두 프로브 모두가 동일한 분석물에 특이적인 결합 도메인을 포함한다는 것을 의미한다. 멀티플렉스 검출 검정에서 다수의 상이한 프로브 쌍이 각 검출 검정에 사용되며, 각 프로브 쌍이 상이한 분석물에 특이적이다. 다시 말해서, 각 상이한 프로브 쌍의 분석물 결합 도메인이 상이한 표적 분석물에 특이적이다.
각 근접 프로브의 핵산 도메인은 프로브가 사용되는 방법에 의존하여 설계된다. 근접 연장 검정 포맷의 대표 샘플을 도 1에 개략적으로 나타내고, 이들 구현예를 아래에 상세히 기재한다. 일반적으로, 근접 연장 검정에서, 1쌍의 근접 프로브가 그들의 표적 분석물에 결합할 때, 두 프로브의 핵산 도메인이 서로 근접하게 되어 상호작용한다(즉, 직접적으로 또는 간접적으로 서로 혼성화한다). 두 핵산 도메인 사이의 상호작용은 적어도 1개의 자유로운 3' 말단을 포함하는 핵산 듀플렉스를 산출한다(즉, 듀플렉스 내의 핵산 도메인 중 적어도 1개가 연장될 수 있는 3' 말단을 가진다). 검정 믹스 내에서 핵산 폴리머라제 효소의 첨가 또는 활성화는 적어도 1개의 자유로운 3' 말단의 연장을 유발한다. 따라서 듀플렉스 내의 핵산 도메인 중 적어도 1개가 그의 쌍을 이루는 핵산 도메인을 주형으로 사용하여 연장된다. 얻은 연장 생성물은 연장 생성물을 생성한 근접 프로브 쌍에 의해 결합된 분석물의 존재를 지시하는 바코드 서열을 포함하는 본원에서 사용되는 바와 같은 리포터 핵산 분자이다. 특히, 리포터 분자의 바코드 서열은 그 쌍의 각 프로브의 핵산 도메인으로부터의 바코드 서열을 포함할 수 있다. 다시 말해서, 근접 프로브 쌍의 각 핵산 도메인이 리포터 분자의 바코드 서열에 기여하거나, 또는 다시 말해서, 부분 바코드 서열을 함유한다는 것을 알 수 있다.
도 1의 버전 1은 "전통적인" 근접 연장 검정을 묘사하고, 여기서 각 근접 프로브의 핵산 도메인(화살표로 표시됨)은 단일가닥이고, 분석물 결합 도메인(뒤집힌 "Y"로 나타냄)에 그의 5' 말단에서 부착되고, 이렇게 함으로써 2개의 자유로운 3' 말단을 남긴다. 상기 근접 프로브가 그들의 각각의 분석물에 결합할 때(분석물은 도면에 나타내지 않음) 그들의 3' 말단에서 상보적인 프로브의 핵산 도메인들은 혼성화에 의해 상호작용할 수 있고, 즉 듀플렉스를 형성할 수 있다. 검정 혼합물에서 핵산 폴리머라제 효소의 첨가 또는 활성화는 각 핵산 도메인이 다른 근접 프로브의 핵산 도메인을 주형으로 사용하여 연장되는 것을 허용한다. 결과적으로 얻은 연장 생성물은 검출되는 리포터 핵산 분자이고, 이렇게 함으로써 프로브 쌍에 의해 결합된 분석물을 검출한다.
도 1의 버전 2는 대안적인 근접 연장 검정을 묘사하며, 여기서 제1 근접 프로브의 핵산 도메인은 분석물 결합 도메인에 그의 5' 말단에서 부착되고, 제2 근접 프로브의 핵산 도메인은 분석물 결합 도메인에 그의 3' 말단에서 부착된다. 따라서 제2 근접 프로브의 핵산 도메인은 연장될 수 없는 자유로운 5' 말단(뭉툭한 화살표로 나타냄)를 가진다. 제2 근접 프로브의 3' 말단은 효과적으로 "차단"되고, 즉, 그것은 "자유"롭지 않고, 그것은 그것이 분석물 결합 도메인에 컨쥬게이션되고 따라서 그에 의해 차단되기 때문에 연장될 수 없다. 버전 1과 대조적으로, 제1 근접 프로브의 핵산 도메인(자유로운 3' 말단을 가짐)만이 제2 근접 프로브의 핵산 도메인을 주형으로 사용하여 연장되어 연장 생성물(즉, 리포터 핵산 분자)을 산출할 수있다.
도 1의 버전 3에서는, 버전 2와 마찬가지로, 제1 근접 프로브의 핵산 도메인이 분석물 결합 도메인에 그의 5' 말단에서 부착되고, 제2 근접 프로브의 핵산 도메인이 분석물 결합 도메인에 그의 3' 말단에서 부착된다. 따라서 제2 근접 프로브의 핵산 도메인은 연장될 수 없는 자유로운 5' 말단(뭉툭한 화살표로 나타냄)을 가진다. 그러나, 이 구현예에서, 각각의 근접 프로브의 분석물 결합 도메인에 부착된 핵산 도메인은 상보성 영역을 가지지 않고, 따라서 듀플렉스를 직접적으로 형성할 수 없다. 대신에, 각 근접 프로브의 핵산 도메인과 상동성 영역을 가지는 제3 핵산 분자가 제공된다. 이 제3 핵산 분자는 핵산 도메인 사이에서 "분자 브릿지"(bridge) 또는 "스플린트"(splint)로 작용한다. 이 "스플린트" 올리고뉴클레오티드는 핵산 도메인 사이의 갭에 브릿지를 형성하여 그들이 서로 간접적으로 상호작용하는 것을 허용하고, 즉, 각 핵산 도메인이 스플린트 올리고뉴클레오티드와 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 근접 프로브가 분석물 상의 그들의 각각의 분석물 결합 표적에 결합할 때, 프로브의 핵산 도메인은 각각 혼성화에 의해 상호작용하고, 즉, 스플린트 올리고뉴클레오티드와 듀플렉스를 형성한다. 따라서 제3 핵산 분자 또는 스플린트가 근접 프로브 중 하나에 제공된 부분적 이중가닥 핵산 도메인의 제2 가닥으로 간주될 수 있음을 알 수 있다. 이 구현예에서 제1 근접 프로브의 핵산 도메인(자유로운 3' 말단을 가짐)은 "스플린트 올리고뉴클레오티드"(또는 다른 핵산 도메인의 단일가닥 3' 종말 영역)를 주형으로 사용하여 연장될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 스플린트 올리고뉴클레오티드의 자유로운 3' 말단(즉, 부착되지 않은 가닥 또는 3' 단일가닥 영역)은 제1 근접 프로브의 핵산 도메인을 주형으로 사용하여 연장될 수 있다.
한 구현예에서는, 스플린트 올리고뉴클레오티드가 검정의 별개의 성분으로 제공될 수 있다. 다시 말해서, 그것은 반응 믹스에 별개로 첨가될 수 있다(즉, 분석물을 함유하는 샘플에 근접 프로브에 대해 별개로 첨가됨). 그것은 그럼에도 불구하고 부분적 이중가닥 핵산 도메인의 가닥으로 간주될 수 있지만, 그것은 별개로 첨가된다. 대안적으로, 스플린트는 근접 프로브의 핵산 도메인 중 하나와 사전혼성화할 수 있고, 즉 근접 프로브를 샘플과 접촉시키기 전에 혼성화할 수 있다. 이 구현예에서, 스플린트 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 근접 프로브의 핵산 도메인의 일부로 볼 수 있다.
따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 근접 프로브의 핵산 도메인의 연장은 또한 "스플린트" 올리고뉴클레오티드의 연장을 포함한다. 유리하게는, 연장 생성물이 스플린트 올리고뉴클레오티드의 연장으로부터 발생하는 경우, 결과적으로 얻은 연장된 핵산 가닥은 오직 핵산 분자의 두 가닥 사이의 상호작용에 의해서(두 핵산 가닥 사이의 혼성화에 의해서) 근접 프로브 쌍에 커플링된다. 따라서, 이들 구현예에서, 연장 생성물은 변성 조건을 사용하여, 예를 들어 온도 증가, 염 농도 감소 등을 사용하여 근접 프로브 쌍으로부터 해리될 수 있다.
도 1의 버전 4는 버전 1의 변형이고, 여기서 제1 근접 프로브의 핵산 도메인은 그의 3' 말단에 제2 근접 프로브의 핵산 도메인과 완전히 상보적이지는 않은 서열을 포함한다. 따라서, 상기 근접 프로브가 그들의 각각의 분석물에 결합할 때 프로브의 핵산 도메인은 혼성화에 의해 상호작용할 수 있지만, 즉 듀플렉스를 형성할 수 있지만, 제1 근접 프로브의 핵산 도메인의 극단 3' 말단(자유로운 3' 히드록실 기를 포함하는 핵산 분자의 부분)은 제2 근접 프로브의 핵산 도메인과 혼성화할 수 없고, 따라서 단일가닥 비혼성화된 "플랩"으로 존재한다. 핵산 폴리머라제 효소의 첨가 또는 활성화 시, 제2 근접 프로브의 핵산 도메인만 제1 근접 프로브의 핵산 도메인을 주형으로 하여 연장될 수 있다.
도 1의 버전 5는 버전 3의 변형으로 볼 수 있다. 그러나, 버전 3과 달리, 두 근접 프로브 모두의 핵산 도메인은 그들의 각각의 분석물 결합 도메인에 그들의 5' 말단에서 부착된다. 이 구현예에서 핵산 도메인의 3' 말단은 상보적이지 않고, 따라서 근접 프로브의 핵산 도메인은 상호작용할 수 없거나 또는 직접적으로 듀플렉스를 형성할 수 없다. 대신에, 제3 핵산 분자, 즉 위에서 논의된 바와 같은 "스플린트" 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 따라서, 근접 프로브가 그들의 각각의 분석물에 결합할 때, 프로브의 핵산 도메인은 각각 스플린트 올리고뉴클레오티드와 혼성화에 의해 상호작용하고, 즉 듀플렉스를 형성한다.
버전 3에 따르면, 따라서 제3 핵산 분자 또는 스플린트는 근접 프로브 중 하나에 제공된 부분적 이중가닥 핵산 도메인의 제2 가닥으로 간주될 수 있음을 알 수 있다. 이 구현예에서 (자유로운 3' 말단을 가지는) 제2 근접 프로브의 핵산 도메인은 "스플린트 올리고뉴클레오티드"를 주형으로 사용하여 연장될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 스플린트 올리고뉴클레오티드의 자유로운 3' 말단(즉, 제1 근접 프로브의 부착되지 않은 가닥, 또는 3' 단일가닥 영역)은 제2 근접 프로브의 핵산 도메인을 주형으로 사용하여 연장될 수 있다.
버전 3과 관련하여 위에서 논의된 바와 같이, 스플린트 올리고뉴클레오티드는 검정의 별개의 성분으로 제공될 수 있거나 또는 스플린트는 근접 프로브의 핵산 도메인 중 하나와 사전혼성화될 수 있고, 즉, 근접 프로브와 샘플을 접촉시키기 전에 혼성화될 수 있다.
따라서, 이 구현예에서도, 위에서 논의된 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 근접 프로브의 핵산 도메인의 연장은 또한 "스플린트" 올리고뉴클레오티드의 연장을 포함한다.
도 1의 버전 3 및 5에 묘사된 스플린트 올리고뉴클레오티드가 제1 근접 프로브의 핵산 도메인의 전체 길이에 상보적인 것으로 나타내지만, 이것은 한 예일 뿐이며, 스플린트가 근접 프로브의 핵산 도메인의 말단과(또는 말단 근처에서) 듀플렉스를 형성할 수 있는 것, 즉 근접 프로브의 핵산 도메인 사이에 브릿지를 형성하는 것이 충분하다.
도 1의 버전 6은 특히 관심을 끄는 PEA의 버전을 나타낸다. 다시 말해서, 방법이 PEA의 맥락 내에서 수행되거나, 또는 PEA를 포함할 때, 특정 대표 구현예에서 PEA는 도 1의 버전 6에 따라 수행된다. 묘사된 바와 같이, 이 버전에서는 1쌍에서 두 프로브 모두가 부분적 단일가닥 핵산 분자에 컨쥬게이션된다. 각 프로브에서 짧은 핵산 가닥은 그의 5' 말단을 통해 분석물 결합 도메인에 컨쥬게이션된다(하지만 대신에 가닥들은 그들의 3' 말단을 통해 분석물 결합 도메인에 컨쥬게이션될 수 있다). 분석물 결합 도메인에 컨쥬게이션된 짧은 핵산 가닥은 서로 혼성화하지 않는다. 오히려, 각 짧은 핵산 가닥은 단일가닥 오버행을 3' 말단에 가지는 더 긴 핵산 가닥과 혼성화된다(다시 말해서, 더 긴 핵산 가닥의 3' 말단이 분석물 결합 도메인에 컨쥬게이션된 더 짧은 가닥의 5' 말단을 넘어서 연장된다. 2개의 더 긴 핵산 가닥의 오버행이 서로 혼성화하여 듀플렉스를 형성한다. 2 개의 더 긴 핵산 분자의 3' 말단이 서로 완전히 혼성화하면, 나타낸 바와 같이, 듀플렉스는 2개의 자유로운 3' 말단을 포함하지만, 더 긴 핵산 분자의 3' 말단은 버전 4에서와 같이 설계될 수 있고, 이렇게 해서 더 긴 핵산 분자 중 하나의 극단 3' 말단이 다른 하나와 상보적이지 않아서 플랩을 형성하며, 이는 듀플렉스가 단 1개의 자유로운 3' 말단을 함유한다는 것을 의미한다. 서로 상호작용하는 2개의 더 긴 핵산 분자는 함께 그들이 분석물 결합 도메인에 직접적으로 컨쥬게이션되는 2개의 짧은 올리고뉴클레오티드 사이에 브릿지를 형성한다는 점에서 스플린트 올리고뉴클레오티드로 볼 수 있다.
핵산 폴리머라제의 첨가 또는 활성화는 스플린트 올리고뉴클레오티드의 자유로운 3' 말단 또는 말단들의 연장을 초래한다. 특히, 어느 한 스플린트 올리고뉴클레오티드의 연장은 다른 한 스플린트 올리고뉴클레오티드를 주형으로 사용한다. 따라서, 한 스플린트 올리고뉴클레오티드가 연장될 때, 다른 한 "주형" 스플린트 올리고뉴클레오티드는 분석물 결합 도메인에 컨쥬게이션되는 더 짧은 가닥으로부터 대체된다.
특정 구현예에서, 분석물 결합 도메인에 직접적으로 컨쥬게이션되는 짧은 핵산 가닥은 "범용 가닥"이다. 다시 말해서, 동일한 가닥이 멀티플렉스 검출 검정에 사용되는 모든 근접 프로브에 직접적으로 컨쥬게이션된다. 따라서 각 스플린트 올리고뉴클레오티드는 범용 가닥과 혼성화하는 서열로 이루어진 "범용 부위", 및 프로브에 고유한 바코드 서열을 포함하는 "고유 부위"를 포함한다. 이 구현예에서, 범용 부위는 각 스플린트 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하고, 고유 부위는 3' 말단에 위치한다. 그러한 근접 프로브 및 그의 제조 방법은 WO 2017/068116에 기재되어 있다.
모든 근접 검출 검정 기술에서, 특정 구현예에서는 각 개별 근접 프로브의 핵산 도메인은 특정 프로브를 식별하는 고유 바코드 서열을 포함한다(PEA 버전 6에 대해 위에서 기재된 바와 같음). 이 경우, 리포터 핵산 분자(이것은 근접 연장 검정의 맥락에서 연장 생성물임)는 각 근접 프로브의 고유 바코드 서열을 포함한다. 따라서 이들 2개의 고유 바코드 서열은 함께 리포터 핵산 분자의 바코드 서열을 형성한다. 다시 말해서, 리포터 핵산 분자 바코드 서열은 조합하여 리포터 핵산 분자를 생성하는 근접 프로브로부터의 2개의 프로브 바코드 서열의 조합을 포함한다. 따라서 특정 리포터 서열의 검출은 2개의 프로브 바코드 서열의 특정 조합을 검출함으로써 달성된다. 이와 관련하여, 위에서 언급한 바와 같이 개별 근접 프로브의 바코드 서열은 리포터 분자의 부분적 바코드 서열로 볼 수 있다.
위에서 상술한 바와 같이, 근접 연장 검정은 프로브가 그들의 표적에 결합한 직후에 수행되는 연장 단계를 포함한다. 연장 단계는 검정에서 생성된 리포터 핵산 분자의 초기 사본을 형성한다. 연장 단계는 핵산 폴리머라제를 사용하여 수행된다. 연장 단계 후에, 연장 단계에서 생성된 리포터 핵산 분자를 증폭시키기 위해 증폭 단계를 수행할 수 있다. 증폭 단계는 일반적으로 PCR에 의해 수행된다.
구현예에서 PEA는 PEA의 연장 단계 및 증폭 단계 둘 모두를 포함하는 단일의 PCR을 포함한다. 다시 말해서, PEA는 리포터 DNA 분자를 생성하는 연장 단계 및 리포터 DNA 분자가 증폭되는 증폭 단계를 포함할 수 있으며, 연장 단계 및 증폭 단계가 단일의 PCR 내에서 발생한다. 이 구현예에서는, (PCR에서 통상적으로 하는 바와 같이) 변성 단계부터 시작하는 것이 아니라, 반응이 연장 단계부터 시작하고, 연장 단계 동안에 리포터 핵산 분자가 생성된다. 그 후, 리포터 분자의 변성부터 시작하여 표준 PCR을 수행하여 리포터 핵산 분자를 증폭시킨다. 위에서 상술한 바와 같이, 구현예에서는 모든 리포터 DNA 분자가 5' 범용 부위 및 3' 고유 부위를 포함하는 핵산 도메인을 포함하는 근접 프로브를 사용하여 생성된다. 이것은 이 구현예에서 모든 리포터 DNA 분자가 중앙 바코드 서열의 양측에 있는 범용 말단 서열을 가진다는 것을 의미한다. 구현예에서 2개의 범용 말단 서열은 상이하고, 즉 모든 리포터 DNA 분자는 한쪽 말단에 제1 범용 말단 서열 및 다른 한쪽 말단에 제2 범용 말단 서열을 포함한다. 따라서 증폭 반응은 리포터 DNA 분자의 범용 말단 서열과 혼성화하고 따라서 모든 리포터 DNA 분자를 증폭시키는 기능을 하는 단일의 공통 프라이머 세트로 수행될 수 있다. 모든 풀에서 증폭 단계(즉, 제1 PCR)에 동일한 범용 (공통) 프라이머 세트를 사용할 수 있다.
따라서 구현예에서는,
(i) 다수의 별개의 멀티플렉스 근접 연장 검정을 수행하는 단계로서, 각 멀티플렉스 근접 연장 검정이 샘플에서 다수의 분석물을 검출하고, 각 멀티플렉스 검출 검정이 리포터 DNA 분자의 풀을 생성하고, 각 리포터 DNA 분자가 특정 분석물에 특이적이고;
각 근접 연장 검정이 제1 PCR을 포함하고, 제1 PCR이 리포터 DNA 분자가 생성되는 연장 단계 및 리포터 DNA 분자가 증폭되는 증폭 단계를 포함하는 단계;
(ii) 각 풀에서 제2 PCR을 수행하는 단계로서, 리포터 DNA 분자가 연쇄화 단계에서 접합될 수 있는 정의된 말단 서열의 첨가에 의해 변형되고, 동일한 풀의 리포터 DNA 분자가 모두 동일한 말단 서열을 가지고 상이한 풀은 상이한 말단 서열을 가지며, 이렇게 해서 1개의 풀로부터의 리포터 DNA 분자가 1개 또는 2개의 사전결정된 상이한 풀로부터의 리포터 DNA 분자에만 접합될 수 있는 단계;
(iii) 풀을 조합하는 단계;
(iv) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 리포터 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 리포터 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 리포터 DNA 분자를 포함하는 단계;
(v) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 리포터 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 리포터 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되고, 이렇게 함으로써 샘플 또는 각 샘플에서 분석물을 검출하는 단계
를 포함하는 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출하는 방법이 제공된다.
위에서 언급한 바와 같이, 범용 (공통) 말단 서열을 갖는 리포터 DNA 분자가 생성될 수 있다. 따라서 각 제2 PCR은 모든 리포터 DNA 분자와 혼성화하여 증폭할 수 있는 단일의 범용 프라이머 쌍으로 수행할 수 있다. 그러나, 단일의 프라이머 쌍이 모든 풀에서 사용될 수 있는 제1 PCR과 달리, 제2 PCR에서는 각 별개의 풀에서 상이한 프라이머 쌍이 사용되며, 각 프라이머 쌍은 동일한 3' 혼성화 부위 및 상이한 5' 정의된 말단 서열 쌍을 포함한다.
특정 구현예에서는, 다수의 멀티플렉스 PEA를 수행하여 동일한 샘플에서 상이한 분석물 세트를 검출한다. 따라서 다수의 멀티플렉스 PEA가 단일의 샘플에서 수행되고, 각 PEA는 상이한 근접 프로브 쌍 패널을 사용한다. 각 근접 프로브 쌍 패널은 상이한 근접 프로브 쌍 세트를 포함한다. 다시 말해서, 각 패널의 근접 프로브 쌍이 상이한 분석물 세트와 결합한다. 일반적으로, 각 패널의 근접 프로브 쌍은 완전히 상이한 분석물 세트와 결합하고, 즉, 상이한 패널의 근접 프로브 쌍에 의해 결합되는 분석물이 겹치지 않는다. 따라서 각 근접 프로브 패널은 상이한 분석물 그룹을 검출하기 위한 것임을 알 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 각 근접 프로브 패널은 상이한 근접 프로브 쌍 세트를 포함한다. 각 개별 패널 내에서, 모든 프로브는 상이한 핵산 도메인을 포함한다(즉, 모든 프로브는 상이한 서열을 갖는 핵산 도메인을 포함한다). 따라서 모든 프로브 쌍은 상이한 핵산 도메인 쌍을 포함하고, 따라서 패널 내의 각 프로브 쌍에 대해 고유 리포터 DNA 분자가 생성된다. 그러나, 동일한 핵산 도메인(및 일반적으로 동일한 핵산 도메인 쌍)이 각 상이한 패널의 프로브 쌍에서 사용된다. 다시 말해서, 상이한 패널에서 프로브 쌍은 동일한 핵산 도메인 쌍을 포함한다. 이것은 동일한 리포터 DNA 분자가 모든 패널에서 생성됨을 의미한다. 그러나, 리포터 DNA 분자가 상이한 프로브 쌍을 사용하는 각 패널에 의해 생성되기 때문에, 동일한 리포터 DNA 분자는 각 프로브 패널에 상이한 분석물의 존재를 나타낸다.
상이한 근접 프로브 쌍 패널이 멀티플렉스 PEA 각각에 사용되기 때문에, 각 리포터 DNA 분자 풀이 1개의 근접 프로브 쌍 패널로부터 형성된다. 연쇄화 후, 따라서 모든 리포터 DNA 서열이 샘플에 특정 분석물의 존재를 나타낸다는 것이 알려져 있다. 콘카티머 시퀀싱 시에, 콘카티머 내의 각 리포터 DNA 서열의 위치는 그 서열이 샘플 내에 어떤 분석물의 존재를 나타내는지에 관한 정보를 제공한다.
따라서 이 구현예는 바로 위에 기재된 바와 같은 방법으로서, 다수의 멀티플렉스 근접 연장 검정이 동일한 샘플에 대해 수행되고,
각 근접 연장 검정이 근접 프로브 쌍을 사용하여 분석물을 검출하는 것을 포함하고, 각 근접 프로브가
(i) 분석물에 특이적인 분석물 결합 도메인; 및
(ii) 핵산 도메인
을 포함하고,
각 쌍 내의 두 프로브 모두가 동일한 분석물에 특이적인 분석물 결합 도메인을 포함하고, 각 프로브 쌍이 상이한 분석물에 특이적이며, 각 프로브 쌍이 근접 프로브 쌍이 그들의 각각의 분석물에 근접 결합할 때 근접 프로브의 핵산 도메인이 상호작용하여 리포터 DNA 분자를 생성하도록 설계되고;
적어도 2개의 근접 프로브 쌍 패널이 사용되고, 각 패널이 상이한 분석물 그룹의 검출을 위한 것이고, 각 멀티플렉스 근접 연장 검정이 1개의 근접 프로브 쌍 패널을 사용하고;
(a) 각 패널 내에서, 모든 프로브 쌍이 상이한 핵산 도메인 쌍을 포함하고; (b) 상이한 패널에서 프로브 쌍이 동일한 핵산 도메인 쌍을 포함하고;
각 근접 프로브 쌍 패널의 생성물이 풀을 형성하는
방법을 제공한다고 볼 수 있다.
근접 프로브의 핵산 도메인이 상호작용하여 리포터 DNA 분자를 생성한다는 언급은 근접 프로브의 핵산 도메인이 서로 혼성화하고, 이렇게 해서 그들이 연장 반응을 위한 주형 또는 주형들을 형성할 수 있음을 의미한다. 그 다음, 먼저 리포터 DNA 분자를 생성하는 연장 단계, 이어서 리포터 DNA 분자의 증폭을 위한 증폭 단계를 포함하는 PCR을 수행한다.
대안적 구현예에서는, 다수의 멀티플렉스 PEA를 수행하여 다수의 상이한 샘플에서 동일한 분석물 세트를 검출한다. 이 구현예에서, 각 PEA는 동일한 근접 프로브 쌍 세트(즉, 패널)를 이용하고, 각 PEA는 상이한 샘플에 대해 수행된다. 위에서 기재된 바와 같이, 각 PEA는 리포터 DNA 분자 풀을 생성하고, 이어서 이것을 연쇄화하고 시퀀싱한다. 동일한 근접 프로브 쌍 패널이 각 PEA에서 사용되기 때문에, 각 리포터 DNA 서열이 특이적 분석물(이것은 모든 풀 전체에 걸쳐서 동일함)을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 콘카티머 시퀀싱 시 콘카티머 내의 각 리포터 DNA 서열의 위치는 표시된 분석물이 어떤 샘플에 존재하는지에 관한 정보를 제공한다.
위에서 상술한 바와 같이, 또 다른 대안적인 구현예에서는, 다수의 멀티플렉스 PEA를 수행하여 다수의 상이한 샘플에서 다수의 분석물 세트를 검출한다. 예를 들어, 두 분석물 세트가 두 상이한 샘플에서 검출될 수 있으며, 총 4개의 멀티플렉스 PEA 반응을 요구한다. 위에서 상술한 바와 같이, 두 분석물 세트 각각은 상이한 근접 프로브 쌍 패널을 사용하여 검출될 것이고, 따라서 두 샘플 각각의 분석에 두 근접 프로브 쌍 세트가 요구될 것이다. 이 구현예에서, 연쇄화 및 시퀀싱 후, 콘카티머 내의 각 리포터 DNA 서열의 위치는 표시된 분석물(리포터 분자가 생성된 근접 프로브 쌍 패널에 의존함) 및 분석물이 존재하는 샘플 둘 모두에 관한 정보를 제공할 것이다.
위에서 상술한 바와 같이, 연쇄화는 관련 분야에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 연쇄화는 USER 조립에 의해 수행된다. USER 조립의 기본 원리는 수년 동안 알려져 왔고, Geu-Flores et al., Nucleic Acids Research 35(7): e55, 2007에 기재되어 있고; 개선된 프로토콜은 Lund et al., PLoS ONE 9(5): e96693, 2014에 기재되어 있다. 두 문헌 모두가 참고로 포함된다. USER는 우라실 특이적 절제 시약의 약자이고, 제한 효소의 사용을 전혀 필요로 하지 않는 다수의 DNA 단편의 지향성 조립의 수단이다.
USER 조립에서는, 조립될 DNA 단편에 그들의 말단에서(또는 적어도 조립 반응에서 또 다른 DNA 단편에 융합될 어느 말단(들)에서든) 이중가닥 연장부가 제공된다. 연장 서열은 고유 조립 부위를 포함한다. 각 이중가닥 연장부는 적어도 1개의(바람직하게는 다수의) 우라실 잔기를 포함하는 제1 가닥을 가지고, 반면에 제2 가닥은 표준 DNA 염기만 함유한다(제1 가닥의 우라실 잔기는 제2 가닥의 아데닌 잔기와 쌍을 이룸). 융합될 DNA 단편에서, 우라실 잔기를 함유하지 않는 연장부의 가닥에서 조립 부위 서열은 상보적이다. 일반적으로, 연장부는 우라실 뉴클레오티드(들)를 포함하는 5' 조립 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 조립될 DNA 단편에 제공된다. 따라서, 각 연장부에서는, 우라실 잔기가 일반적으로 5' 가닥(즉, 연장부의 말단에 5' 말단을 갖는 가닥)에 있다.
DNA 단편의 조립은 USER 효소 믹스(우라실 DNA 글리코시다제(UDG) 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도 VIII(EndoVIII))를 가함으로써 수행된다. UDG는 우라실 뉴클레오티드 내의 우라실 염기 모이어티와 데옥시리보시 당 모이어티 사이의 글리코시드 결합을 절단하여 뉴클레오티드로부터 우라실 염기의 상실을 야기하고 무염기 부위를 형성한다. EndoVIII은 UDG에 의해 생성된 무염기 부위를 인식하고 무염기 부위의 포스포디에스테르 결합 3' 및 5'을 절단하여 그 위치에서 DNA에 닉(nick)을 생성한다. USER 효소 믹스에 의한 우라실 뉴클레오티드의 절제는 DNA 가닥의 이중나선을 불안정하게 하여 닉이 있는 가닥으로부터 닉 상류에서 짧은 서열의 상실을 초래하고, 그 결과로 단일가닥 3' 오버행을 초래한다. 우라실 절제 후 DNA 분자의 가열은 불안정화를 강화하여 오버행 형성을 개선할 수 있다. 마찬가지로, 조립 부위에 다수의 우라실 잔기의 포함은 DNA에 다수의 닉의 형성 및 강화된 불안정화를 초래한다.
단일가닥 3' 오버행의 생성 후, 융합될 DNA 단편의 상보적 오버행이 서로 혼성화하고 함께 결찰된다(DNA 리가제를 사용함).
방법에서는, 조립 부위가 PCR에 의해 DNA 분자(예를 들어 리포터 DNA 분자)에 첨가된다. PCR은 3' 혼성화 부위(표적 DNA 분자와 혼성화함) 및 5' 조립 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 수행된다. 그러한 프라이머는 본원에서는 조립 프라이머라고 불린다. 프라이머의 5' 조립 부위는 정의된 말단 서열을 제공한다. 그것은 프라이머의 "풀 특이적" 부분으로 볼 수 있다. 3' 혼성화 부위는 조립 프라이머의 "범용" 부분으로 볼 수 있으며, 임의의 풀로부터 기원하는 DNA 분자에 결합할 수 있다. 프라이머의 5' 조립 부위는 각각 적어도 1개의 우라실 잔기, 바람직하게는 다수의 우라실 잔기를 포함한다. 예를 들어, 각 조립 부위는 적어도 2개의 우라실 잔기, 더 바람직하게는 적어도 3개의 우라실 잔기를 포함할 수 있다. 조립 부위가 다수의 우라실 잔기를 포함할 때, 우라실 잔기들은 서로 옆에 있을 수 있거나, 또는 조립 부위 전체에 퍼져 있어서 다른 비-우라실 잔기에 의해 분리될 수 있다. 1개의 우라실 잔기는 조립 부위의 3' 말단에 위치해야 하고, 이렇게 해서 USER 믹스를 가한 후 생성된 3' 오버행은 전체 조립 부위를 포함한다.
따라서 조립 프라이머를 사용하여 각 DNA 분자 풀에 대해 PCR을 수행한다. 상기 교시에 따라, 각 풀에서 사용되는 조립 프라이머는 최대 1쌍의 조립 부위를 포함하고, 즉 각 풀에서 순방향 프라이머(또는 프라이머들)는 제1 조립 부위를 포함하고(또는 포함하고) 역방향 프라이머(또는 프라이머들)는 제2 상이한 조립 부위를 포함한다(또는 포함한다). 특히, 각 풀 내의 모든 DNA 분자는 1쌍의 공통 프라이머 결합 부위를 포함하고, 이렇게 해서 단일의 조립 프라이머 쌍이 각 풀의 모든 DNA 분자를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 콘카티머의 말단을 형성하는 것이 의도된 DNA 분자의 풀에 대해 수행되는 PCR은 추가 조립 부위가 콘카티머의 말단에 요망되는지에 의존하여 1개의 조립 프라이머 및 1개의 표준 프라이머(즉, 조립 부위를 포함하지 않음)를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 모든 DNA 분자 풀은 1쌍의 조립 프라이머를 사용하여 PCR이 수행된다.
상기 교시에 따라, 각 상이한 풀에서 수행되는 PCR에 사용되는 프라이머에는 상이한 조립 부위가 제공된다. 그러나, 서로 접합되도록 의도된 풀의 DNA 분자에 상보적 조립 부위가 제공되고, 이렇게 해서 풀이 조합될 때 서로 접합하도록 의도된 DNA 분자가 그들의 조립 부위를 통해 서로 혼성화하고, 그 다음에 함께 결찰되고, 이렇게 해서 콘카티머를 형성한다.
조립 프라이머를 사용하는 PCR 동안, 조립 부위의 증폭은 표준 DNA 뉴클레오티드를 사용하여 진행되며, 아데닌 잔기가 조립 프라이머로부터의 우라실 잔기와 쌍을 이룬다. 따라서 PCR은 양쪽 말단에 조립 부위를 포함하는 DNA 생성물을 생성하며(잠재적으로, 위에서 언급한 바와 같이 한쪽 말단에만 조립 부위를 가질 수 있는 콘카티머의 말단을 형성하도록 의도된 DNA 분자의 경우는 제외함), 여기서 각 가닥(조립 프라이머로부터 기원함)의 5' 말단의 조립 부위는 적어도 1개의 우라실 잔기를 포함하고, 반면에 가닥의 3' 말단의 상보적 조립 부위는 표준 DNA 염기만 포함한다. 따라서 결과적으로 얻은 DNA 생성물을 USER 효소 믹스로 처리하는 것은 각 가닥에 3' 오버행을 가지는 DNA 생성물을 초래하고, 그 다음에 이것은 다른 풀의 DNA 분자의 상보적 3' 오버행과 혼성화할 수 있다.
대안적 구현예에서, 연쇄화는 Gibson 조립에 의해 수행된다. Gibson 조립은 Gibson et al., Nature Methods 6: 343-345, 2009; 및 Gibson et al., Science 329: 52-56, 2010에 기재되어 있고, 두 문헌 모두가 본원에 참고로 포함된다. USER 조립과 마찬가지로, DNA 단편의 Gibson 조립은 겹치는 말단을 갖는 DNA 단편을 생성함으로써 수행된다. 흔히, 단편은 접합될 DNA 단편의 겹치는 말단을 형성하는 5' 조립 부위를 포함하는 조립 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 생성된다. DNA 단편을 함께 혼합하고, DNA 엑소뉴클레아제, DNA 폴리머라제 및 DNA 리가제를 함유하는 Gibson 효소 믹스를 가한다. 엑소뉴클레아제는 각 단편의 5' 말단으로부터 DNA를 분해하고, 그 결과로 각 단편의 말단에 3' 오버행을 초래한다. 오버행은 서로 혼성화하고, 혼성화 후 DNA 가닥 사이의 임의의 갭은 DNA 폴리머라제에 의해 채워진다. 그 다음, 가닥들은 DNA 리가제에 의해 접합된다.
따라서 Gibson 및 USER 조립 기술에는 차이가 있지만 둘 모두가 조립될 DNA 분자의 종말에 있는 조립 부위를 활용하고, 이것은 일반적으로 조립 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 DNA 분자에 도입된다. 두 경우 모두에서, DNA 분자의 말단에 3' 오버행이 생성되고, 이들은 접합될 다른 DNA 분자의 상보적 3' 오버행과 혼성화한다.
따라서 특정 구현예에서, 방법은 조립 프라이머를 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 각 풀의 모든 DNA 분자는 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되고, 상이한 프라이머 쌍이 각 풀에서 증폭에 사용되고, 각 조립 프라이머 종은 고유 조립 부위(또는 "풀 특이적" 부분)를 포함하고, 이렇게 해서 각 풀의 모든 PCR 생성물이 한쪽 또는 양쪽 말단에 고유 사전정의된 조립 부위를 포함하고;
여기서 연쇄화 단계에서, 각 풀의 PCR 생성물은 상보적 조립 부위를 가지는상이한 풀의 PCR 생성물에 접합되고, 이렇게 함으로써 콘카티머를 생성한다.
다시 말해서, 다수의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 방법으로서, 각 풀이 다수의 DNA 분자 종을 포함하고, 방법이
(i) 조립 프라이머 쌍을 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계로서, 각 풀의 모든 DNA 분자가 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되고, 상이한 프라이머 쌍이 각 풀에서 증폭에 사용되고, 각 조립 프라이머 종이 고유 조립 부위를 포함하고, 이렇게 해서 각 풀의 모든 PCR 생성물이 한쪽 또는 양쪽 말단에 고유 사전정의된 조립 부위를 포함하고;
조립 부위가 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의한 PCR 생성물의 접합에 적합한 단계;
(ii) 풀을 조합하는 단계;
(iii) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 각 풀의 PCR 생성물이 상보적 조립 부위를 가지는 상이한 풀의 PCR 생성물에 접합되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하고;
콘카티머가 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의해 생성되는 단계; 및
(iv) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되는 단계
를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
위에서 언급한 바와 같이, 이 구현예에서 각 풀의 모든 DNA 분자는 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭된다. 다시 말해서, 각 풀에서의 PCR 반응은 1개의 순방향 프라이머 및 1개의 역방향 프라이머를 사용한다. 이것은 각 풀의 모든 DNA 분자가 공통 프라이머 결합 부위를 포함하고, 이렇게 해서 각 풀의 모든 DNA 분자가 단일의 프라이머 세트를 사용하여 증폭될 수 있음을 의미한다. 특정 구현예에서, 모든 풀에 걸쳐서 모든 DNA 분자는 동일한 공통 프라이머 결합 부위를 포함하고, 이렇게 해서 방법에 사용되는 모든 프라이머는 동일한 혼성화 부위(또는 "범용" 부분)를 포함하고, 그들의 조립 부위만 상이하다.
조립 프라이머 쌍은 적어도 1개의 조립 프라이머를 포함한다. 위에서 상술한 바와 같이, 조립 프라이머는 3' 혼성화 부위("범용" 부위) 및 5' 조립 부위("풀 특이적" 부분)를 포함한다. 일부 또는 모든 조립 프라이머 쌍에서 두 프라이머 모두가 조립 프라이머이고, 즉 1쌍에서 두 프라이머 모두가 5' 조립 부위를 포함할 수 있다. 그러나, 위에서 상술한 바와 같이, 콘카티머의 말단을 형성할 풀에서 DNA 분자를 증폭시키는 데 사용되는 조립 프라이머 쌍에서는, 조립 부위가 콘카티머의 관련 말단에서 요망되는지에 의존하여 조립 프라이머 쌍의 두 프라이머 중 하나만 조립 프라이머이어야 한다(즉, 조립 부위를 포함해야 한다). 그러나, 특정 구현예에서 모든 조립 프라이머 쌍은 2개의 조립 프라이머를 포함하고, 즉 그 쌍에서 그 두 프라이머 모두가 조립 부위를 포함한다. 이것은 형성된 콘카티머의 말단에 조립 부위가 존재하는 결과를 초래하여 추가 조립이 발생하게 된다.
각 풀의 모든 DNA 분자가 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되기 때문에, 각 풀에서 생성된 모든 PCR 생성물은 동일한 조립 부위(들)를 포함한다.
상술한 바와 같이, 상이한 프라이머 쌍이 각 풀에서의 증폭에 사용된다. 이와 관련하여 "상이한"은 특이적 프라이머가 2개 이상의 상이한 풀에서 사용되지 않음을 의미한다. 모든 증폭 반응 전체에 걸쳐 사용되는 모든 프라이머는 1개의 풀에서만 사용되고, 이렇게 해서 임의의 주어진 풀에서 증폭에 사용되는 2개의 프라이머는 고유하고 임의의 다른 풀에서 증폭에 사용되는 임의의 프라이머와 상이하다(즉, 임의의 프라이머와 상이한 서열을 가진다).
본원에서 사용되는 바와 같은 "프라이머 종"은 특정 서열의 프라이머를 지칭한다(따라서 "조립 프라이머 종"은 특정 서열의 조립 프라이머를 지칭한다). 따라서 각 PCR은 2개의 프라이머 종을 사용하며, 위에서 언급한 바와 같이 각 PCR에 사용되는 2개의 프라이머 종은 고유하고, 각 프라이머 종은 1개의 풀에 대해 수행되는 단일의 PCR에만 사용된다. 위에서 언급한 바와 같이, 특정 구현예에서는 프라이머 혼성화 서열이 모든 풀에 걸쳐 공유되고, 이렇게 해서 모든 풀에 걸쳐 사용되는 주어진 배향(즉, "순방향" 또는 "역방향")의 모든 프라이머 종은 동일한 혼성화 부위를 가진다. 그러나 위에서 언급한 바와 같이 모든 조립 프라이머 종은 고유 조립 부위를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "조립 부위"는 (특정 풀로부터의) 특정 DNA 분자가 (사전정의된 다른 풀로부터의) 또 다른 DNA 분자와 혼성화하는 데 사용되는 서열로 정의된다. 본 구현예에서와 같이 조립 부위가 PCR에 의해 DNA 분자에 도입되는 경우에, 조립 부위는 프라이머의 5' 말단에 위치하고, 혼성화 부위와 겹치지 않는다. 특히, DNA 분자가 검출 검정에서 생성된 리포터 DNA 분자인 경우, 조립 부위는 리포터 DNA 분자가 처음 생성될 때는 리포터 DNA 분자에 존재하지 않고 오직 PCR 단계에서 도입된다. 특히, 조립 부위는 리포터 DNA 분자 바코드 서열의 일부를 형성하지 않는다. 조립 부위가 그 부위를 도입하는 데 사용되는 조립 프라이머의 5' 말단에 위치하기 때문에, 결과적으로 얻은 PCR 생성물에는 조립 부위가 종말에 위치한다.
풀 전체에 걸쳐 사용되는 각 조립 프라이머 종은 고유 조립 부위를 포함한다. 다시 말해서, 각 조립 프라이머 종은 고유 서열을 갖는 조립 부위를 포함하고, 이렇게 해서 2개의 조립 프라이머 종은 동일한 조립 부위 서열을 포함하지 않는다. 물론, 이것은 각 풀로부터의 DNA 분자가 콘카티머 내의 정의된 위치에 위치하기 위해서는 필수적이다. 그러나, 위에서 논의된 바와 같이 2개의 조립 프라이머 종이 동일한 조립 부위 서열을 포함하지 않는 반면, 상보적 조립 부위 쌍이 풀 전체에 걸쳐 사용된다. 따라서 상보적 조립 부위를 포함하는 PCR 생성물은 서로 혼성화하여 접합될 수 있다. 따라서 풀 전체에 걸쳐 PCR에서 사용되는 모든 조립 부위는 쌍을 이루는 상보적 조립 부위를 가진다. 상보적 조립 부위 쌍이 상이한 풀에서의 PCR에 사용되고, 즉 특정 풀에 대해 수행되는 단일의 PCR은 상보적 조립 부위를 갖는 프라이머를 결코 사용하지 않는다. 이것은 PCR 생성물의 원형화를 초래할 수 있을 것이고, 그러면 이것은 연쇄화에 적합하지 않을 것이다.
따라서, 위에서 설명한 바와 같이, 각 PCR은 상이한 조립 프라이머 쌍으로 수행되고, 이렇게 해서 결과적으로 얻은 PCR 생성물 각각은 한쪽 또는 양쪽 말단에 고유 사전정의된 조립 부위를 함유한다. "사전정의된"은 주어진 풀에서 DNA 분자의 특정 말단에 첨가될 조립 부위가 선택되고 따라서 PCR이 수행되기 전에 알려져 있음을 의미한다. 고유 사전정의된 조립 부위가 각 풀의 DNA 분자에 첨가되기 때문에, 상보적 조립 부위가 상이한 풀의 DNA 분자의 말단에 의도적으로 첨가될 수 있고, 이렇게 해서 그들은 서로 혼성화하여 접합될 것이다. 따라서 연쇄화 반응 동안에 상이한 풀로부터의 DNA 분자가 접합되는 순서는 풀 전체에 걸쳐서 상보적 조립 부위의 배열에 기초하여 사전정의된다. 따라서 각 풀의 PCR 생성물은 연쇄화 단계 동안 사전정의된 상이한 풀의 PCR 생성물에 접합되며, 어느 상이한 풀이 상보적 조립 부위를 가지는 PCR 생성물을 포함하는지에 의해 결정된다.
위에서 언급한 바와 같이, 연쇄화는 특히 USER 조립에 의해 수행될 수 있다. USER 조립이 연쇄화에 사용되는 경우, 특히 모든 조립 프라이머 종 전체에서 각 조립 부위는 다수의 우라실 잔기를 포함하고, 더 특히, 모든 조립 부위는 적어도 3개의 우라실 잔기를 포함한다.
위에서 상술한 바와 같이, 일단 PCR이 수행되어 각 풀의 DNA 분자에 조립 부위를 도입하면, PCR 생성물을 효소(또는 효소 혼합물)로 가공하여 연쇄화에 요구되는 3' 오버행을 생성한다. USER 조립이 연쇄화에 사용될 때는 3' 오버행이 USER 효소 믹스(UDG 및 EndoVIII)를 사용하여 생성되고, 반면에 Gibson 조립이 사용될 때는 3' 오버행이 엑소뉴클레아제로 생성된다. 3' 오버행을 생성하는 이 단계는 풀을 조합하기 전 또는 후에 수행될 수 있다.
구현예에서는, 3' 오버행이 풀이 조합되기 전에 생성된다. 이 구현예에서는, 조립 프라이머를 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행한다. PCR 후, 3' 오버행을 생성하기 위해 생성물을 적절한 효소 또는 효소 믹스(연쇄화에 사용되는 방법에 의존함)로 처리한다. 그 다음, 풀을 조합하고, 이렇게 해서 다양한 풀로부터의 DNA 분자들이 그들의 상보적 3' 오버행을 통해 서로 혼성화할 수 있다. 그 다음, 콘카티머를 형성하기 위해 혼성화된 DNA 분자들을 서로 접합하고, 이 접합은 적절한 효소 또는 효소 믹스(연쇄화에 사용되는 방법에 의존함)를 사용하여 수행된다. USER 조립이 연쇄화에 사용될 때는, 혼성화된 DNA 분자가 DNA 리가제 단독에 의해 접합되고; Gibson 조립이 연쇄화에 사용될 때는 혼성화된 DNA 분자가 DNA 폴리머라제(가닥 사이의 임의의 갭을 채우기 위해) 및 DNA 리가제의 조합에 의해 접합된다.
따라서 이 구현예에서는 다수의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 방법으로서, 각 풀이 다수의 DNA 분자 종을 포함하고, 방법이
(i) 조립 프라이머 쌍을 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계로서, 각 풀의 모든 DNA 분자가 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되고, 상이한 프라이머 쌍이 각 풀에서 증폭에 사용되고, 각 조립 프라이머 종이 고유 조립 부위를 포함하고, 이렇게 해서 각 풀의 모든 PCR 생성물이 한쪽 또는 양쪽 말단에 고유 사전정의된 조립 부위를 포함하고;
조립 부위가 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의한 PCR 생성물의 접합에 적합한 단계;
(ii) 풀로부터의 PCR 생성물을 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의해 선형 콘카티머로 조립하는 단계로서, 조립 단계가
(a) 각 풀의 PCR 생성물을 가공하여 조립 부위를 포함하는 3' 오버행을 생성하는 단계;
(b) 풀을 조합하는 단계;
(c) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 각 풀의 PCR 생성물이 상보적 3' 오버행을 가지는 상이한 풀의 PCR 생성물에 접합되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는 단계
를 포함하는 단계;
(iii) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되는 단계
를 포함하는 방법이 제공된다.
대안적으로, 위에서 기재된 바와 같이 PCR 생성물의 3' 오버행은 PCR 생성물의 조합 후에 생성될 수 있다. 이 경우, 모든 필요한 조립 효소(즉, USER 믹스 + DNA 리가제, 또는 Gibson 믹스)가 조합된 PCR 생성물에 함께 첨가될 수 있다.
위에서 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서 접합될 DNA 분자는 하나 이상의 샘플에서 분석물을 검출하기 위해 수행된 PEA에서 생성된 리포터 DNA 분자이다. 따라서 특정 구현예에서,
(i) 다수의 멀티플렉스 근접 연장 검정을 수행하고, 이렇게 함으로써 다수의 리포터 DNA 분자 풀을 생성하는 단계로서, 각 풀의 리포터 DNA 분자가 범용 프라이머 결합 부위를 그들의 3' 및 5' 종말에 포함하는 단계;
(ii) 조립 프라이머 쌍을 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계로서, 각 풀의 모든 DNA 분자가 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되고, 각 풀에서 증폭에 상이한 프라이머 쌍이 사용되고, 각 조립 프라이머 종이 고유 조립 부위를 포함하고, 이렇게 해서 각 풀의 모든 PCR 생성물이 한쪽 또는 양쪽 말단에 고유 사전정의된 조립 부위를 포함하고;
조립 부위가 USER 조립에 적합하고, 이렇게 해서 각 풀로부터의 PCR 생성물이 1개 또는 2개의 상이한 풀로부터의 PCR 생성물에 접합될 수 있는 단계;
(iii) 풀로부터의 PCR 생성물을 USER 조립에 의해 선형 콘카티머로 조립하는 단계로서, 조립 단계가
(a) 각 풀의 PCR 생성물을 가공하여 조립 부위를 포함하는 3' 오버행을 생성하는 단계;
(b) 풀을 조합하는 단계; 및
(c) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 각 풀의 PCR 생성물이 상보적 3' 오버행을 가지는 상이한 풀의 PCR 생성물에 접합되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는 단계
를 포함하는 단계;
(iv) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되고, 이렇게 함으로써 샘플 또는 각 샘플에서 분석물을 검출하는 단계
를 포함하는 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출하는 방법이 본원에 제공된다.
더 일반적으로,
(i) 다수의 멀티플렉스 근접 연장 검정을 수행하고, 이렇게 함으로써 다수의 리포터 DNA 분자 풀을 생성하는 단계로서, 각 풀의 리포터 DNA 분자가 그들의 3' 및 5' 종말에 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단계;
(ii) USER 조립을 위한 조립 부위를 포함하는 조립 프라이머를 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계;
(iii) 각 풀의 PCR 생성물을 조합하고, USER 조립에 의해 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는 단계; 및
(iv) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되고, 이렇게 함으로써 샘플 또는 각 샘플에서 분석물을 검출하는 단계
를 포함하는 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출하는 방법이 본원에 제공된다.
위에서 상술한 바와 같이, 생성된 후 콘카티머는 시퀀싱된다. 편리하게도, 고처리량 DNA 시퀀싱의 한 형태가 이 단계에서 사용될 수 있다. 합성에 의한 시퀀싱은 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 DNA 시퀀싱 방법의 한 예이다. 합성 기술에 의한 시퀀싱의 예는 파이로시퀀싱, 가역적 염료 종결인자 시퀀싱 및 이온 토렌트(ion torrent) 시퀀싱을 포함하며, 이들 중 어느 것이든 본 방법에서 사용될 수 있다. 구현예에서, 콘카티머는 대량 병렬 DNA 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱된다. 대량 병렬 DNA 시퀀싱은 특히 합성에 의한 시퀀싱(예를 들어 위에서 언급한 바와 같이 가역적 염료 종결인자 시퀀싱, 파이로시퀀싱 또는 이온 토렌트 시퀀싱)에 적용될 수 있다. 가역적 염료 종결인자 방법을 사용하는 대량 병렬 DNA 시퀀싱이 본원에 제공된 방법에서 사용하기에 편리한 시퀀싱 방법이다. 예를 들어 Illumina® NovaSeq™ 시스템을 사용해서 가역적 염료 종결인자 방법을 사용하여 대량 병렬 DNA 시퀀싱이 수행될 수 있다.
관련 분야에 알려진 바와 같이, 대량 병렬 DNA 시퀀싱은 다수의 (예를 들어, 수천 또는 수백만 개 또는 그 초과) DNA 가닥이 병렬로, 즉 동시에 시퀀싱되는 기술이다. 대량 병렬 DNA 시퀀싱은 표적 DNA 분자가 고체 표면, 예를 들어 플로우 셀의 표면에 또는 비드에 고정되는 것을 요구한다. 그 다음, 각 고정된 DNA 분자를 개별적으로 시퀀싱한다. 일반적으로, 가역적 염료 종결인자 시퀀싱을 사용하는 대량 병렬 DNA 시퀀싱은 플로우 셀을 고정화 표면으로 활용하고, 파이로시퀀싱 또는 이온 토렌트 시퀀싱을 사용하는 대량 병렬 DNA 시퀀싱은 비드를 고정화 표면으로 활용한다.
숙련된 자에게 알려진 바와 같이, 대량 병렬 시퀀싱의 맥락에서 표면에 DNA 분자의 고정화는 일반적으로 분자의 말단에 1개 이상의 시퀀싱 어댑터를 부착함으로써 달성된다. 따라서 방법은 시퀀싱을 위한 1개 이상의 어댑터(시퀀싱 어댑터)를 콘카티머에 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
흔히, 시퀀싱 어댑터는 핵산 분자(특히 DNA 분자)이다. 이 경우, 어댑터 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드가 어댑터 서열을 통해 고정화 표면(예를 들어 비드 또는 플로우 셀의 표면)에 컨쥬게이션되어 표면에 표적 DNA 분자의 어닐링을 가능하게 한다. 대안적으로, 표적 DNA 분자를 고정화 표면에 컨쥬게이션하는 데는 임의의 다른 결합 파트너 쌍, 예를 들어 비오틴 및 아비딘/스트렙타비딘이 사용될 수 있다. 이 경우에는 비오틴이 시퀀싱 어댑터로 사용될 수 있고 아비딘 또는 스트렙타비딘이 고정화 표면에 컨쥬게이션되어 비오틴 시퀀싱 어댑터에 결합하거나, 또는 그 역도 가능하다.
따라서 시퀀싱 어댑터는 일반적으로 10-30개 뉴클레오티드 길이(예를 들어 15-25개 또는 20-25개 뉴클레오티드 길이)의 짧은 올리고뉴클레오티드(바람직하게는 DNA)일 수 있다. 위에서 상술한 바와 같이, 시퀀싱 어댑터의 목적은 고정화 표면에 표적 DNA 분자의 어닐링을 가능하게 하는 것이고, 따라서 핵산 시퀀싱 어댑터의 뉴클레오티드 서열은 고정화 표면에 컨쥬게이션된 그의 결합 파트너의 서열에 의해 결정된다. 이것을 제외하고는, 핵산 시퀀싱 어댑터의 뉴클레오티드 서열에 대한 특별한 제약은 없다.
시퀀싱 어댑터가 아래에서 추가로 상술하는 바와 같이 PCR 증폭 동안에 콘카티머에 첨가될 수 있다. 핵산 시퀀싱 어댑터의 경우, 이것은 1개의 프라이머에서 또는 2개의 프라이머 모두에서 시퀀싱 어댑터 뉴클레오티드를 포함함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 시퀀싱 어댑터가 비핵산 시퀀싱 어댑터(예를 들어 단백질/펩티드 또는 소분자)인 경우에는 어댑터가 하나의 PCR 프라이머에 또는 두 PCR 프라이머 모두에 컨쥬게이션될 수 있다. 대안적으로, 시퀀싱 어댑터를 콘카티머에 직접적으로 결찰시키거나 또는 컨쥬게이션함으로써 시퀀싱 어댑터가 콘카티머에 부착될 수 있다. 특정 구현예에서 시퀀싱 어댑터는 연쇄화 과정 동안 콘카티머의 양쪽 말단에 첨가된다. 다시 말해서, 조립 부위가 위에서 기재된 바와 같이 각 시퀀싱 어댑터에 첨가되고, DNA 분자의 풀과 조합되고, 위에서 기재된 바와 같이 콘카티머로 조립될 수 있다(이렇게 해서 시퀀싱 어댑터가 콘카티머의 말단을 형성한다). 특히, 본 방법에서 사용되는 1개 이상의 시퀀싱 어댑터는 핵산 시퀀싱 어댑터, 특히 DNA 시퀀싱 어댑터이다.
따라서 1개 이상의 핵산 시퀀싱 어댑터가 증폭 단계에서 콘카티머에 첨가될 수 있다. 특히, 콘카티머에 대해 PCR을 수행하여 적어도 제1 시퀀싱 어댑터를 콘카티머에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 단일의 PCR에서 (즉, 둘 모두가 시퀀싱 어댑터를 함유하는 1쌍의 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해) 2개의 시퀀싱 어댑터가 콘카티머에 (각 말단에 1개씩) 첨가되지만, 대안적으로 2회의 증폭 단계를 수행할 수도 있다(이렇게 해서, 제1 PCR을 수행하여 제1 시퀀싱 어댑터를 콘카티머에 첨가한 다음, 제2 PCR을 수행하여 제2 시퀀싱 어댑터를 콘카티머의 다른 한쪽 말단에 첨가한다). 일반적으로, 2개의 시퀀싱 어댑터가 콘카티머에 첨가될 때, 각 말단에 상이한 시퀀싱 어댑터가 첨가된다.
위에서 언급한 바와 같이 1개 이상의 시퀀싱 어댑터가 콘카티머에 첨가될 수 있다. 이것은 1개 또는 2개의 시퀀싱 어댑터를 의미하고 - 시퀀싱 어댑터가 DNA 분자의 말단에 첨가되기 때문에, 단일의 DNA 분자(이 경우 콘카티머)에 첨가될 수 있는 시퀀싱 어댑터의 최대 수는 2개이다. 따라서 단일의 시퀀싱 어댑터가 콘카티머의 한쪽 말단에 첨가될 수 있거나, 또는 2개의 시퀀싱 어댑터가 콘카티머에 각 말단에 1개씩 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서 Illumina P5 및 P7 어댑터가 사용되고, 즉 P5 어댑터가 콘카티머의 한쪽 말단에 첨가되고 P7 어댑터가 다른 한쪽 말단에 첨가된다. P5 어댑터의 서열은 서열번호: 1에 제시되고, P7 어댑터의 서열은 서열번호: 2에 제시된다.
특정 구현예에서, 콘카티머 생성 후 단일의 PCR을 수행하여 콘카티머를 증폭시키고 그의 말단에 시퀀싱 어댑터를 부착한다(즉, 콘카티머의 양쪽 말단에 시퀀싱 어댑터를 첨가한다). 이 구현예에서, PCR은 3' 혼성화 부위의 상류에 5' 시퀀싱 어댑터를 각각 포함하는 1쌍의 프라이머를 사용하여 수행된다.
시퀀싱 어댑터가 콘카티머의 말단에 첨가될 때, 시퀀싱 어댑터가 시퀀싱 단계에서 사용되어 콘카티머를 시퀀싱을 위한 표면 상에 고정시킨다.
위에서 상술한 바와 같이, 구현예에서 콘카티머는 양쪽 말단에 조립 부위를 가지는 DNA 분자로부터 조립되고, 이렇게 해서 결과적으로 얻은 콘카티머는 양쪽 말단에 조립 부위를 가진다. 구현예에서는 시퀀싱 어댑터를 콘카티머에 부착하기 위해 수행되는 PCR에 사용되는 프라이머가 종말 조립 부위와 혼성화한다. 다시 말해서, 시퀀싱 어댑터를 콘카티머에 첨가하는 데 사용되는 프라이머의 혼성화 부위는 콘카티머의 종말 조립 부위에 상보적일 수 있다. 모든 콘카티머가 동일한 종말 조립 부위를 함유하기 때문에, 단일의 프라이머 쌍이 모든 콘카티머를 증폭할 수 있다.
또 다른 구현예에서는, 콘카티머에 대해 PCR을 수행하여 적어도 제1 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머에 첨가한다. 관련 분야에 잘 알려진 바와 같이, 대량 병렬 DNA 시퀀싱에 현재 사용되는 모든 것을 포함하여 대부분의 DNA 시퀀싱 기술은 시퀀싱 프라이머를 이용하여 시퀀싱 가닥의 합성을 개시한다. 따라서 시퀀싱 프라이머 결합 부위는 시퀀싱 프라이머의 서열에 상보적인 DNA 서열이고, 이렇게 해서 시퀀싱 프라이머가 그와 혼성화할 수 있다. 시퀀싱 프라이머 결합 부위의 서열에 대한 특별한 제약이 없다.
따라서 증폭 단계에서 1개 이상의 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 콘카티머에 첨가될 수 있다. 특히, 콘카티머에 대해 PCR을 수행하여 적어도 제1 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 단일의 PCR에서 (즉, 둘 모두가 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 함유하는 1쌍의 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해) 2개의 시퀀싱 결합 부위가 콘카티머에 (각 말단에 1개씩) 첨가되지만, 대안적으로 2회의 증폭 단계를 수행할 수도 있다(이렇게 해서, 제1 PCR을 수행하여 제1 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머에 첨가한 다음, 제2 PCR을 수행하여 제2 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머의 다른 한쪽 말단에 첨가한다). 2개의 시퀀싱 프라이머 부위가 콘카티머에 첨가될 때, 일반적으로 상이한 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 각 말단에 첨가되지만, 이것은 양방향에서의 DNA 분자의 시퀀싱에 동일한 시퀀싱 프라이머가 사용될 수 있으므로 필수적인 것은 아니다. 그러나, 콘카티머의 각 말단에서 상이한 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 사용하는 것이 바람직하고, 그 이유는 그렇지 않으면 각 가닥이 그의 말단에 역방향 상보적 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 포함하여 헤어핀 구조가 콘카티머 가닥 내에 형성될 위험을 증가시킬 것이기 때문이다.
PCR(또는 다른 증폭 기술)을 사용하는 대신, 대안적으로, 위에서 시퀀싱 어댑터에 대해 상술한 바와 같이, 연쇄화 동안에 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 콘카티머에 조립될 수 있다.
구현예에서, 콘카티머 생성 후 단일의 PCR을 수행하여 콘카티머를 증폭시키고 그들의 말단에 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 부착한다(즉, 콘카티머의 양쪽 말단에 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 첨가한다). 이 구현예에서는, PCR이 3' 혼성화 부위의 상류에 5' 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 각각 포함하는 1쌍의 프라이머를 사용하여 수행된다. 특정 구현예에서는, 아래 실시예에서 입증되는 바와 같이, Read 1 시퀀싱 프라이머(Rd1SP) 및 Read 2 시퀀싱 프라이머(Rd2SP)가 콘카티머 시퀀싱에 사용되고, 즉 Rd1SP 결합 부위가 콘카티머의 한쪽 말단에 첨가되고 Rd2SP 결합 부위가 다른 한쪽 말단에 첨가된다. Rd1SP 결합 부위의 서열은 서열번호: 3에 제시되고, Rd2SP 결합 부위의 서열은 서열번호: 4에 제시된다.
위에서 상술한 바와 같이, 콘카티머는 양쪽 말단에 조립 부위를 갖는 DNA 분자로부터 조립될 수 있으며, 이렇게 해서 결과적으로 얻은 콘카티머는 양쪽 말단에 조립 부위를 가진다. 구현예에서, 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머에 부착시키기 위해 수행되는 PCR에 사용되는 프라이머는 종말 조립 부위와 혼성화한다. 다시 말해서, 콘카티머에 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 첨가하는 데 사용되는 프라이머의 혼성화 부위는 콘카티머의 종말 조립 부위에 상보적일 수 있다.
특정 구현예에서 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위 둘 모두가 콘카티머의 말단에 부착된다. 예를 들어, 1개의 시퀀싱 어댑터 및 1개의 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 콘카티머의 각 말단에 첨가된다. 특히, 시퀀싱 어댑터가 첨가되고, 이렇게 해서 그들이 콘카티머의 종말을 형성하고, 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 시퀀싱 어댑터의 바로 하류에 있고 콘카티머를 형성하는 관심 DNA 분자가 시퀀싱 프라이머 결합 부위의 하류에 있다. 위에서 기재된 바와 같이, 일반적으로 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위는 PCR에 의해 콘카티머에 첨가된다. 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 부착하기 위해 다수의 PCR이 수행될 수 있지만, 구현예에서는 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위 둘 모두를 콘카티머에 부착하기 위해 단일의 PCR이 수행된다. 따라서 그 다음에 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 혼성화 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다.
따라서 특정 구현예에서, 다수의 풀로부터 DNA 서열을 검출하는 방법으로서, 각 풀이 다수의 DNA 분자 종을 포함하고, 방법이
(i) 조립 프라이머 쌍을 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계로서, 각 풀의 모든 DNA 분자가 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되고, 상이한 프라이머 쌍이 각 풀에서 증폭에 사용되고, 각 조립 프라이머 종이 고유 조립 부위를 포함하고, 이렇게 해서 각 풀의 모든 PCR 생성물이 한쪽 또는 양쪽 말단에 고유 사전정의된 조립 부위를 포함하고;
조립 부위가 USER 조립에 의한 PCR 생성물의 접합에 적합한 단계;
(ii) 각 풀의 PCR 생성물을 조합하고 USER 조립에 의해 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는 단계; 및
(iii) 콘카티머에 대해 PCR을 수행하여 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머의 각 말단에 첨가하는 단계로서, PCR이 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 혼성화 부위를 각각 포함하는 1쌍의 프라이머로 수행되는 단계; 및
(iv) 콘카티머를 대량 병렬 DNA 시퀀싱에 의해 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되는 단계
를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 구현예에서,
(i) 다수의 멀티플렉스 근접 연장 검정을 수행하고, 이렇게 함으로써 다수의 리포터 DNA 분자 풀을 생성하는 단계로서, 각 풀의 리포터 DNA 분자가 그들의 3' 및 5' 종말에 범용 프라이머 결합 부위를 포함하는 단계;
(ii) 조립 프라이머 쌍을 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계로서, 각 풀의 모든 DNA 분자가 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되고, 상이한 프라이머 쌍이 각 풀에서 증폭에 사용되고, 각 조립 프라이머 종이 고유 조립 부위를 포함하고, 이렇게 해서 각 풀의 모든 PCR 생성물이 한쪽 또는 양쪽 말단에 고유 사전정의된 조립 부위를 포함하고;
조립 부위가 USER 조립에 적합하고, 이렇게 해서 각 풀로부터의 PCR 생성물이 1개 또는 2개의 상이한 풀로부터의 PCR 생성물에 접합될 수 있는 단계;
(iii) 각 풀의 PCR 생성물을 조합하고 USER 조립에 의해 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는 단계;
(iv) 콘카티머에 대해 PCR을 수행하여 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머의 각 말단에 첨가하는 단계로서, PCR이 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 혼성화 부위를 각각 포함하는 1쌍의 프라이머로 수행되는 단계; 및
(v) 콘카티머를 대량 병렬 DNA 시퀀싱에 의해 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되고, 이렇게 함으로써 샘플 또는 각 샘플에서 분석물을 검출하는 단계
를 포함하는 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출하는 방법이 제공된다.
각 풀의 PCR 생성물을 조합하고 USER 조립에 의해 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머를 생성하는 단계는 위에서 더 상세히 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
특정 구현예에서 방법은 다수의 DNA 분자 풀 세트에서 수행된다. 풀 세트들은 임의의 관련성을 가질 수 있다. 예를 들어, 각 풀 세트는 특정 샘플로부터 유래될 수 있고, 각 샘플 내의 각 풀은 상이한 분석물 패널을 검출하는 검출 검정에 의해 생성되었다.
여하튼, 이 구현예에서, 각 풀은 위에서 기재된 바와 같이 가공되고, 다수의 풀 세트가 개별적으로 조합되고, 각 풀 세트에 대해 별개의 연쇄화 반응이 수행되어 다수의 연쇄화 반응 생성물을 산출한다. 다시 말해서, 각 세트로부터의 모든 풀이 조합되고, 따라서 각 원래 풀 세트로부터 별개의 조합된 풀을 형성한다. 각 풀 세트에 대해 별개의 연쇄화 반응이 수행되고, 따라서 다수의 연쇄화 반응 생성물을 생성한다. 연쇄화 반응 생성물은 단일의 연쇄화 반응의 생성물이다.
증가된 효율성을 위해 각 연쇄화 반응에서 생성된 모든 콘카티머를 함께 시퀀싱하는 것이 바람직할 수 있다. 이를 가능하게 하기 위해, PCR에 의해 각 연쇄화 반응 생성물에 고유 인덱스 서열이 첨가된다. 대안적으로, 고유 인덱스 서열은 위에서 기재된 바와 같이 연쇄화 반응 동안에 콘카티머에 통합될 수 있다(즉, 조립 부위가 인덱스 서열에 첨가될 수 있고, 그 서열은 연쇄화를 위한 DNA 분자 풀과 조합될 수 있다). "고유 인덱스 서열"은 동일한 인덱스 서열이 특정 연쇄화 반응에서 생성된(즉, 특정 풀 세트로부터 생성된) 모든 콘카티머에 첨가되고, 한편 상이한 (고유) 인덱스 서열이 각 상이한 연쇄화 반응 생성물에(즉, 각 상이한 풀 세트로부터 생성된 콘카티머에) 사용되고, 이렇게 해서 각 콘카티머가 기원하는 풀 세트가 콘카티머 내에 함유된 인덱스 서열에 의해 결정될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 인덱스 서열은 각 콘카티머가 기원하는 풀 세트에 관하여 콘카티머를 표지화하는 역할을 한다. 인덱스 서열은 임의의 길이 및 서열을 가질 수 있지만, 바람직하게는 상대적으로 짧고, 예를 들어 3-12, 4-10 또는 4-8개 뉴클레오티드이다.
일단 모든 연쇄화 반응 생성물이 인덱스 서열로 표지화되면, 다양한 연쇄화 반응 생성물을 조합하여 시퀀싱한다. 따라서 시퀀싱 반응은 각 콘카티머 내에 함유된 인덱스 서열에 기초하여 각 콘카티머가 기원하는 풀 세트를 식별하고, 한편 각 세트 내의 풀에 존재하는 DNA 분자는 위에서 상술한 바와 같이 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그의 특정 풀에 배정될 수 있다.
위에서 상술한 바와 같이, 인덱스 서열은 PCR에 의해 콘카티머에 첨가된다. 따라서 콘카티머에 인덱스 서열을 첨가하기 위해 각 연쇄화 반응에 대해 별개의 PCR 반응이 수행된다. 특히, 각 콘카티머에 각 말단에 1개씩 2개의 인덱스 서열이 첨가될 수 있다. 이 구현예에서 PCR은 인덱스 서열을 각각 함유하는 1쌍의 프라이머로 수행되고, 즉 각 프라이머가 5' 인덱스 서열 및 3' 혼성화 부위를 함유한다. 특히, 콘카티머의 각 말단에 첨가된 인덱스 서열이 상이하고, 예를 들어 각 콘카티머에 한쪽 말단에 제1 인덱스 서열이 첨가되고 다른 한쪽 말단에 제2 인덱스 서열이 첨가되지만, 콘카티머의 양쪽 말단에 동일한 인덱스 서열이 첨가될 수 있다.
이 구현예에서는, 인덱스 서열(들) 외에도, 위에서 논의된 바와 같이 콘카티머에 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 첨가될 수 있다. 이들 요소는 별개의 PCR 라운드에서 콘카티머에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서는, 인덱스 서열이 각 연쇄화 반응 생성물에 대해 수행된 별개의 PCR에서 각 연쇄화 반응 생성물에 첨가되고, 그 다음에 인덱싱된 생성물을 풀링하고, 하나 이상의 추가의 PCR을 풀링된 인덱싱된 생성물에 대해 수행하여 시퀀싱 어댑터 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 콘카티머에 첨가한다. 대안적으로, 각 연쇄화 반응 생성물에 대해 다수의 연속 PCR을 별개로 수행하여 인덱스 서열, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 시퀀싱 어댑터를 순차적으로 첨가한다. 이들 세 요소가 순차적으로 첨가될 때, 어댑터 서열이 결과적으로 얻은 생성물의 종말에 위치해야 하기 때문에 시퀀싱 어댑터가 마지막에 첨가되지만, 인덱스 서열 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위는 어느 순서로도 첨가될 수 있다.
구현예에서는, 세 요소(즉, 인덱스 서열, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 시퀀싱 어댑터)가 모두 단일의 PCR 반응에서 동시에 연쇄화 반응 생성물에 첨가된다. 다시 말해서, 각 연쇄화 반응 생성물에 대해 별개의 PCR을 수행하고, 여기서는 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열이 콘카티머의 양쪽 말단에 첨가된다. 이것은 PCR을 각 프라이머가 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 혼성화 부위의 상류에 포함하는 프라이머 쌍으로 수행함으로써 달성된다. 이 구현예에서는, PCR 후 다수의 PCR 생성물(시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 각 말단에 갖는 콘카티머를 포함함)을 조합하여 시퀀싱한다.
위에서 기재된 바와 같이, 구현예에서는, 콘카티머가 조립 부위를 양쪽 말단에 가지는 DNA 분자로부터 조립되고, 이렇게 해서 결과적으로 얻은 콘카티머가 조립 부위를 양쪽 말단에 가진다. 편리하게도, 이 PCR(즉, 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 콘카티머에 부착하기 위해 수행되는 PCR)에 사용되는 프라이머는 종말 조립 부위와 혼성화할 수 있다. 다시 말해서, 이 PCR에 사용된 프라이머의 혼성화 부위는 콘카티머의 종말 조립 부위와 상보적일 수 있다.
위에서 기재된 바와 같이, 시퀀싱 어댑터가 콘카티머에 첨가되고, 이렇게 해서 그들이 시퀀싱되는 최종 생성물의 종말을 형성하는 것이 요구된다. 그러나, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열은 어느 순서로도 배열될 수 있다. 다시 말해서, PCR은 각 말단에 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 포함하는 생성물을 생성할 수 있다. 대안적으로, PCR은 각 말단에 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 인덱스 서열 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위를 포함하는 생성물을 생성할 수 있다. 일반적으로, 길이가 알려지지 않은 표적을 시퀀싱할 때(예를 들어, 게놈 시퀀싱에서)는 시퀀싱 프라이머 결합 부위의 상류에 인덱스 서열을 위치시키는 것이 유리할 수 있다. 이 경우, 인덱스 서열은 주 시퀀싱 반응과 별개인 특이적 "인덱스 시퀀싱" 반응에서 판독된다. 그러나, 시퀀싱 표적의 길이가 (본 방법에서와 같이) 알려진 때는 일반적으로 인덱스 서열이 시퀀싱 프라이머 결합 부위의 하류에 위치하고, 이렇게 해서 인덱스 서열이 시퀀싱 표적과 동시에 판독될 수 있고 이렇게 해서 각 가닥으로부터 모든 필요한 서열 정보를 얻는 데 오직 단일의 시퀀싱 반응을 수행하는 것을 필요로 하는 것이 유리하다. 따라서, 구현예에서 콘카티머에 대해 수행되는 PCR은 각 말단에 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 포함하는 생성물(즉, 시퀀싱 프라이머 결합 부위의 하류에 인덱스 서열을 갖는 생성물)을 산출하도록 설계된다. 관심 DNA 분자의 콘카티머는 인덱스 서열의 하류에 위치한다. 따라서 PCR은 각 프라이머가 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 인덱스 서열 및 혼성화 부위를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 수행된다.
위에서 상술한 바와 같이, 본 방법은 여러 단계를 포함한다. 흔히, 이 방법은 다수의 근접 연장 검정으로 시작한다. 그 다음, PEA 생성물에 대해 시퀀싱 전에 PCR 및 연쇄화 반응(예를 들어 USER 또는 Gibson 조립)을 수행한다. 시퀀싱 전에 수행되는 다양한 반응은 많은 상이한 효소(예를 들어 DNA 폴리머라제, DNA 리가제, UDG, EndoVIII, 엑소뉴클레아제)를 사용한다. 효소 반응은 일반적으로 문제의 효소의 활성에 최적인 완충제에서 수행된다. 그러나, 본 발명의 방법을 각 단계에서 그 단계에 사용되는 특이적 효소에 최적화된 완충제를 사용하여 수행하는 것은 비효율적일 것이다. 더욱이, 각 단계에서 예를 들어 PCR 클린업에 의한 완충제 교체는 그 방법을 통해 집계될 때 생성물의 실질적 손실을 초래할 것이다.
따라서, 유리하게, 구현예에서는, 시퀀싱 이전의 모든 단계가 동일한 완충제에서 수행되고, 이렇게 해서 반응 클린업 또는 완충제 교환이 요구되지 않는다. 오히려, 각 단계에서 요구되는 추가 효소(들) 및/또는 시약을 단순히 순차적으로 용액에 첨가한다.
이 목적을 위해 임의의 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 사용되는 완충제가공정에 사용되는 효소 전부는 고사하고 그 중 임의의 효소와 함께 사용하기에 최적화되어야 한다는 것이 요구되지는 않지만, 공정에 사용되는 모든 효소는 사용된 완충제에서 중등도 내지 높은 활성을 가지는 경우가 있을 수 있다. 공정 전반에 걸쳐 사용되는 완충제는 특히 Tris 기반 완충제일 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 시퀀싱 이전의 모든 단계에서 동일한 완충제를 사용할 수 있다. 가능하다면, 시퀀싱 반응도 또한 동일한 완충제에서 수행될 수 있다(이렇게 해서 전체 방법이 오직 단일의 완충제를 사용한다). 그러나, 더 일반적으로, 시퀀싱 반응에는 이전 방법 단계에서 사용된 것과는 상이한 완충제가 요구된다. 따라서, 일반적으로 시퀀싱 이전에(즉, 연쇄화 후, 또는 후속 PCR 단계가 수행되는 경우에는 콘카티머를 변형하기 위한 PCR 후) 반응 혼합물을 클린업한다. 다시 말해서, 시퀀싱할 분자(콘카티머 또는 변형된 콘카티머)가 정제되고, 혼합물의 다른 부분(완충제, 효소, 뉴클레오티드 등)이 제거된다. 이것은 관련 분야에서 임의의 표준 방법에 의해, 예를 들어 입수할 수 있는 예를 들어 Qiagen(독일)로부터의 PCR 정제 키트를 사용하여 달성될 수 있다. 그 다음, 시퀀싱할 분자를 특수 시퀀싱 완충제, 효소 등을 포함하여 시퀀싱에 필요한 시약을 함유하는 시퀀싱 반응 믹스에 첨가할 수 있다. 시퀀싱 시약은 상업적으로 예를 들어 Illumina(USA)로부터 입수할 수 있다.
위에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 분석물 검출 검정, 특히 PEA와 관련하여 사용될 수 있다. 그러한 검출 방법은 흔히 그렇듯이 샘플의 분석물(예를 들어 관심 단백질)이 넓은 농도 범위로 존재할 때 높은 농도의 분석물로부터의 신호가 낮은 농도의 분석물로부터의 신호를 압도할 수 있기 때문에 과제에 직면하고, 그 결과로 더 낮은 농도로 존재하는 분석물이 검출되지 못한다. 이 쟁점은 동시계류 중인 출원 PCT/EP2021/058008에서 다뤄지고, 그 출원에서 사용되는 동일한 방법이 본 방법과 함께 사용될 수 있다.
따라서 특정 구현예에서, 방법은 (위에서 기재된 바와 같이) 다수의 멀티플렉스 검출 검정에서 생성된 리포터 DNA 분자를 검출하는 데 사용되고, 검출 검정을 수행해서 다수의 분석물이 어느 범위의 풍부도 수준을 가지는 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출한다. 이 구현예에서, 검출 검정은
(i) 샘플 또는 각 샘플로부터 다수의 분취물을 제공하는 단계; 및
(ii) 각 분취물에 대해 별개의 멀티플렉스 검정을 수행함으로써 각 분취물에서 상이한 분석물 하위세트를 검출하는 단계로서, 각 하위세트의 분석물이 샘플에서의 그의 예측 풍부도에 기초하여 선택되는 단계
를 포함한다.
특히, 이 구현예에서 방법은
(i) 샘플 또는 각 샘플로부터 다수의 분취물을 제공하는 단계;
(ii) 각 분취물에 대해 별개의 멀티플렉스 검출 검정을 수행함으로써 각 분취물에서 상이한 분석물 하위세트를 검출하고, 각 분취물로부터 제1 PCR 생성물을 생성하는 단계로서, 각 하위세트의 분석물이 샘플에서의 그들의 예측 풍부도에 기초하여 선택되는 단계;
(iii) 제1 PCR 생성물을 다수의 풀로 조합하는 단계;
(iv) 각 풀에 대해 제2 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 변형해서 제1 PCR 생성물에 연쇄화를 위한 준비를 시키는 단계
를 포함한다.
이 구현예에서, 제1 및 제2 PCR은 위에서 기재된 바와 같다. 따라서 각 멀티플렉스 검출 검정은 특정 분석물에 특이적인 리포터 DNA 분자를 생성하고, 제1 PCR을 수행해서 생성된 리포터 DNA 분자를 증폭시킨다. 따라서 제1 PCR 생성물은 리포터 DNA 분자이다. 그 다음, 리포터 DNA 분자를 다수의 풀로 조합한다. 풀의 수 및 제조된 제1 PCR 생성물의 조합은 위에서 논의된 바와 같이 풀의 의도된 특성에 의존한다. 예를 들어, 각 풀이 상이한 샘플을 나타내는 경우에는, 각 샘플로부터의 모든 제1 PCR 생성물(즉, 분취물)을 조합하고, 이렇게 함으로써 각 샘플에 대해 풀을 산출한다. 대안적으로, 각 풀이 동일한 샘플로부터의 상이한 분석물 패널을 나타내는 경우에는 (즉, 각 풀이 상이한 근접 프로브 쌍 패널로 수행되는 검출 검정을 나타내는 경우), 각 패널로부터의 모든 제1 PCR 생성물(즉, 분취물)을 조합하고, 이렇게 함으로써 각 패널에 대해 풀을 산출한다. 추가의 대안에서, 방법이 다수의 샘플로부터의 다수의 분석물 패널을 분석하는 데 사용되는 경우에는, 각 샘플의 각 패널로부터의 모든 제1 PCR 생성물(즉, 분취물)을 조합하고, 이렇게 함으로써 각 샘플의 각 패널에 대해 풀을 산출한다.
따라서, 샘플 또는 각 샘플로부터의 다수의 분석물 패널 또는 검출 검정에서 검출되는 경우에는, 샘플 또는 각 샘플의 각 패널에 다수의 분취물이 제공된다. 다시 말해서, 각 근접 프로브 쌍 패널로 수행되는 검출 검정에 다수의 분취물이 제공된다.
제2 PCR은 리포터 DNA 분자를 변형하여 리포터 DNA 분자에 연쇄화를 위한 준비를 시키기 위해 각 풀에 대해 별개로 수행된다. 이 단계는 위에서 기재된 바와 같이 수행된다. 따라서 제2 PCR을 수행하여 위에서 기재된 바와 같이 각 리포터 DNA 분자에 정의된 말단 서열을 제공하고, 예를 들어 USER 또는 Gibson 조립을 위한 조립 서열을 제공한다.
제2 PCR 단계 후, 풀을 조합하고, 위에서 기재된 바와 같이 연쇄화를 수행한다. 그 다음, 콘카티머를 (위에서 기재된 바와 같이) 변형할 수 있고, 그 다음에 위에서 기재된 바와 같이 시퀀싱한다.
다르게 보면, 위에서 기재된 방법은 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출하는 방법으로 정의될 수 있고, 여기서 상기 분석물은 샘플(들)에서 다양한 수준의 풍부도를 가지고, 상기 방법은
샘플 또는 각 샘플로부터의 별개의 다수의 분취물 각각에 대해 별개의 검정 블록을 수행하여 각 별개의 분취물에서 분석물 하위세트를 검출하는 단계로서, 각 하위세트의 분석물이 샘플에서의 그들의 예측 풍부도에 기초하여 선택되는 단계를 포함한다.
개별 분취물에 대해 수행되는 각 검정 블록은 위에서 상술한 바와 같이 멀티플렉스 검정(특히 멀티플렉스 PEA)이다. 따라서 분석물 하위세트(즉, 임의의 하나의 특정 분취물에서 검출되도록 지정된 분석물 하위세트)에서 다수의 분석물을 검출하는 멀티플렉스 검정은 "풍부도 블록"으로 볼 수 있다. 따라서 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "풍부도 블록"은 샘플에서 검출될(즉, 검정될) 특정 분석물 그룹 또는 하위세트를 검출하기 위해 수행되는 검정 블록(또는 검정 세트)을 지칭하고, 여기서는 분석물이 샘플에서의 그들의 풍부도, 즉 샘플에서의 그들의 예상 또는 예측 풍부도, 또는 상대 풍부도에 기초하여 각 검정 블록(또는 세트)에 배정된다. 다시 말해서, 검정을 풍부도에 기초하여 그룹화하거나 또는 "블록화"한다. 따라서, 예를 들어 낮은, 높은 또는 다양한 정도의 중간 수준 풍부도 등에 기초하여 특정 분석물 하위세트의 검출에 상이한 분취물, 또는 상이한 풍부도 블록이 지정될 수 있다. 이것은 검정 블록 또는 세트에서 각 분석물의 풍부도가 동일하거나 또는 대략 동일하다는 것을 암시하지 않고, 풍부도는 블록 또는 세트에서의 상이한 분석물/검정마다, 및/또는 상이한 샘플마다 달라질 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 방법의 이 구현예는 하나 이상의 샘플에서 다수의 분석물을 검출하기 위한 것이며, 여기서 분석물은 샘플(들)에서 다양한 수준의 풍부도를 가진다. 다시 말해서, 분석물은 샘플(들)에 상이한 농도로, 또는 어느 범위의 농도로 존재한다. 샘플 또는 각 샘플의 모든 분석물이 모든 다른 분석물과 실질적으로 상이한 농도로 존재하는 것이 요구되지는 않고, 오히려 모든 분석물이 실질적으로 동일한 농도로 존재하지는 않는 것이 요구된다. 샘플(들)에서 분석물들은 어느 범위의 농도로 존재하긴 하지만, 일부 분석물은 매우 유사한 농도로 존재할 수도 있다.
분석물이 샘플(들)에 여러 자릿수에 걸친 농도 범위로 존재할 수도 있다. 예를 들어, 샘플(들)에 가장 높은 농도로 존재하는(또는 존재할 것으로 예상되는) 분석물(들)은 샘플(들)에 가장 낮은 농도로 존재하는(또는 존재할 것으로 예상되는) 분석물의 (예상) 농도보다 약 1000배 높은 농도로 존재(또는 존재할 것으로 예상)될 수도 있다. 샘플의 분석물들은 예를 들어 농도가 서로에 대해 약 10배, 약 100배, 약 1000배 또는 그 초과, 및 물론 그 사이의 임의의 값만큼 다를 수 있다. 임상 샘플에서, 분석물은 여러 자릿수, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6 또는 그 초과 자릿수의 범위에 걸쳐서 존재할 수 있다.
상이한 분석물, 또는 더 특히, 상이한 분석물에 대한 검정을 블록화하거나 또는 함께 그룹화하는 데 사용되는 풍부도의 수준 또는 값은 샘플에 존재하는(존재할 것으로 예상되는) 분석물의 절대 수준 또는 농도에만 의존하지 않을 수 있다. 검정 방법의 특성, 상이한 분석물에 대한 검정의 성능 차이 등을 포함하여 다른 요인을 고려할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 다른 결합제에 기초하는 검출 검정의 경우, 이것은 분석물에 대한 항체 친화도, 또는 결합력(avidity)에 의존할 수 있다. 상이한 분석물에 대한 검정 사이의 그러한 가변성이 고려될 수 있다. 예를 들어 풍부도는 검정 산출량 값 또는 측정값 면에서 검정에서 검출되는 분석물의 풍부도를 반영할 수 있다. 따라서, 하위세트의 어떤 분석물이 선택되는지에 기초하는 예측 풍부도는 적어도 샘플 내의 분석물의 예측 수준 또는 농도에 의존할 수 있지만, 그것은 또한 또는 대안적으로 특정 검출 검정에서 결정되는 풍부도의 예측 수준 또는 값에 의존할 수 있다. 다시 말해서, 샘플 내의 분석물의 풍부도는 그의 겉보기 풍부도, 또는 검출 검정에 의존하는 개념적 풍부도일 수 있다. 분석물의 겉보기 풍부도는 사용되는 검정, 및 특히, 그 검정의 민감도에 의존하여 달라질 수 있다.
방법은 샘플 또는 각 샘플로부터 다수의(다시 말해서, 적어도 2개의) 분취물을 제공하는 단계를 포함한다. 다시 말해서, 샘플의 다수의 별개의 부분이 제공된다. 위에서 언급한 바와 같이, 샘플 또는 각 샘플에 대한 각 검정 패널에 다수의 분취물이 제공될 수 있다. 각 샘플은 다수의 분취물로 분할될 수 있거나(이렇게 해서 전체 샘플이 분취됨), 또는 샘플 또는 각 샘플의 일부가 분취물로 제공될 수 있어서 전체 샘플이 사용되지는 않는다. 분취물은 동일한 크기 또는 부피, 또는 상이한 크기 또는 부피를 가질 수 있거나, 또는 일부 분취물은 동일한 크기를 가질 수 있고 일부 분취물은 상이한 크기를 가질 수 있다.
분취물 중 적어도 일부는 희석될 수 있다. 예를 들어, 분취물은 1:2, 1:4, 1:5, 1:10 등으로 희석될 수 있다. 특히, 분취물은 10배 희석될 수 있고, 즉, 1개 이상의 분취물이 10배(또는 1:10) 희석될 수 있고, 1개 이상의 분취물이 100배(1:100) 희석될 수 있고, 1개 이상의 분취물이 1000배(1:1000) 희석될 수 있다. 요망되는 경우, 추가로 희석할 수 있지만(예를 들어 1:10,000 또는 1:100,000), 일반적으로 최대 희석은 1:1000이면 충분할 것으로 예상할 수 있다. 1개 이상의 분취물이 희석되지 않을 수 있다(본원에서는 1:1이라고 부름).
특정 구현예에서는, 연이은 10배 희석이 이루어져서 다음 희석을 갖는 분취물을 제공한다: 1:1, 1:10, 1:100 및 1:1000. 이 구현예에서, 1:10 희석은 희석되지 않은 샘플을 10배 희석함으로써 생성된다. 1:100 및 1:1000 희석은 희석되지 않은 샘플을 (각각) 직접적으로 100배 및 1000배 희석함으로써, 또는 1:10 희석된 분취물을 연이어서 10배씩 희석함으로써 이루어질 수 있다(즉, 1:10 희석된 분취물을 10배 희석하여 1:100 희석된 분취물을 생성하고, 1:100 희석된 분취물을 10배 희석하여 1:1000 희석된 분취물을 산출할 수 있다). 샘플 희석(및 실제로 본 발명의 방법 전체에 걸쳐서 모든 피펫팅 단계)은 수동으로, 또는 대안적으로 자동 피펫팅 로봇(예컨대 SPT Labtech Mosquito)을 사용하여 수행될 수 있다.
분취물의 희석은 검정되는 샘플의 유형에 의존할 수 있는 임의의 적합한 희석제로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 희석제는 물 또는 식염수 용액, 또는 완충 제 용액, 특히 생물학적 상용성 완충제 화합물을 포함하는 완충제 용액(즉, 사용된 검출 검정과 상용성이 있는 완충제, 예를 들어 PEA 또는 PLA와 상용성이 있는 완충제)일 수 있다. 적합한 완충제 화합물의 예는 HEPES, Tris(즉, Tris(히드록시메틸)아미노메탄), 인산이나트륨 등을 포함한다. 희석제로 사용하기에 적합한 완충제는 PBS(포스페이트 완충 식염수), TBS(Tris 완충 식염수), HBS(HEPES 완충 식염수) 등을 포함한다. 사용된 완충제(또는 다른 희석제)는 정제된 용매(예를 들어 물)에서 구성되어야 하고, 이렇게 해서 그것은 오염 물질 분석물을 함유하지 않는다. 따라서 희석제는 멸균성이어야 하고, 물이 희석제 또는 희석제의 베이스로 사용되는 경우, 사용되는 물은 바람직하게는 초순수(예를 들어 Milli-Q 물)이다.
임의의 적합한 수의 분취물이 샘플 또는 각 샘플로부터 제공될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 적어도 2개의 분취물이 제공되지만, 대부분의 구현예에서는 2개 초과가 제공될 것이다. 특정 구현예에서는, 위에서 상술한 바와 같이, 4개의 분취물이 각 샘플로부터, 또는 각 샘플로부터의 각 검정 패널에 제공될 수 있다: 희석되지 않은 샘플 분취물, 및 샘플이 1:10, 1:100 및 1:1000 희석된 분취물. 더 많거나 더 적은 샘플 희석이 요망되는 경우에는. 이보다 더 많거나 더 적은 분취물이 제공될 수 있다. 게다가, 수행되는 특정 검정의 요망/요구에 따라서 각 희석 계수의 1개 이상의 분취물이 제공될 수 있다.
일단 샘플로부터 다수의 분취물이 제공되면, 각 분취물에서 표적 분석물 하위세트를 검출하기 위해 각 분취물에 대해 별개의 멀티플렉스 검출 검정(특히 PEA)이 수행된다. 각 분취물에 대해 별개의 멀티플렉스 검정이 수행되고, 이렇게 해서 각 분취물이 별개로 분석된다(즉, 다수의 분취물이 멀티플렉스 반응 동안 혼합되지 않는다). 각 샘플로부터 제공되는, 및 멀티플렉스 검정이 수행되는 모든 분취물 전체에 걸쳐 모든 표적 분석물이 검출된다. 다시 말해서, 각 샘플로부터의 모든 분취물 전체에 걸쳐 검정을 수행하여 각 표적 분석물이 샘플에 존재하는지 샘플에 존재하지 않는지를 결정한다. 그러나, 특정 분석물을 검출하기 위한 각 개별 검정은 각 샘플로부터의 단 1개의 분취물에서 수행될 수 있다. 따라서 상이한 분석물 하위세트가 각 샘플로부터의 각 분취물에서 검출되고, 다시 말해서 주어진 샘플로부터의 각 분취물에서 상이한 분석물이 검출된다. 바람직하게는, 특정 샘플로부터의 각 분취물에서 검출된 하위세트는 완전히 상이하고, 즉 각 표적 분석물이 각 샘플로부터의 단 1개의 분취물에서 검출되고, 이렇게 해서 분석물 하위세트가 겹치지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서는 적절하다고 판단되는 경우, 특정 분석물이 각 샘플로부터의 다수의 분취물에서 검출될 수 있다. 이 경우 일부 분석물이 다수의 분석물 하위세트에 존재할 것이라는 점에서 하위세트 사이에서 분석물이 일부 겹치겠지만 다른 분석물은 단 1개의 하위세트에 존재할 것이다.
각 하위세트의 분석물은 샘플 또는 기원에서 그들의 예측 풍부도(즉, 농도)에 기초하여 선택된다. 다시 말해서, 샘플에 유사한 농도로 존재할 것으로 예상될 수 있는 분석물이 동일한 하위세트에 포함될 수 있고 동일한 멀티플렉스 반응에서 분석될 수 있다. 반대로, 샘플에 상이한 농도로 존재할 것으로 예상될 수 있는 분석물이 상이한 하위세트에 포함될 수 있고, 상이한 멀티플렉스 반응에서 분석될 수 있다. 각 분석물은 샘플 또는 기원에 유사한 농도(예를 들어 특정 자릿수 내의 농도)로 존재할 것으로 예상되는 분석물 하위세트에 배정된다. 그 다음, 각 분석물 하위세트가 분석물의 예상 농도를 고려하여 적절한 계수로 희석된 분취물에서 검출된다. 따라서 가장 낮은 농도로 존재할 것으로 예상되는 분석물은 희석되지 않은 분취물 또는 낮은 희석 계수를 가지는 분취물에서 검출될 수 있고; 가장 높은 농도로 존재할 것으로 예상되는 분석물은 가장 많이 희석된 분취물에서 검출되고; 이들 극단 사이의 농도로 존재할 것으로 예상되는 분석물은 "중간적" 희석 계수를 가지는 분취물에서 검출된다.
위에서 언급한 바와 같이, 일부 구현예에서 일부 분석물은 다수의 하위세트에 포함될 수 있다. 이것은 예를 들어 분석물이 본질적으로 두 하위세트의 예상 농도 사이의 예상 농도를 가져서 그것이 분명히 두 하위세트의 예상 농도 중 어디에도 "속하지" 않는 경우일 수 있다. 이 경우, 분석물은 두 하위세트 모두에 포함될 수 있다. 또한 분석물이 샘플 또는 기원에 대단히 넓은 범위의 농도로 존재할 수 있다고 알려진 경우에는 분석물이 2개(또는 그 초과)의 하위세트에 포함될 수도 있다.
각 하위세트의 분석물이 샘플에서의 그의 예측 풍부도에 기초하여 선택된다는 점을 고려하면 각 하위세트에 상이한 수의 분석물이 있을 수 있음을 인식할 것이다. 대안적으로, 적절하게 각 하위세트에 동일한 수의 분석물이 있을 수 있다.
샘플에서 각 분석물의 풍부도/농도는 분석할 샘플 유형 내의 각 분석물의 정상 수준에 관한 알려진 사실에 기초하여 예측할 수 있다. 예를 들어, 샘플이 혈장 또는 혈청 샘플(또는 임의의 다른 체액 샘플)인 경우, 그 안의 분석물의 농도는 이들 유체에 있는 종의 알려진 농도에 기초하여 예측할 수 있다. 관심을 끌 가능성이 있는 넓은 범위의 분석물의 정상 혈장 농도는 https://www.olink.com/resources-support/document-download-center/로부터 입수가능하다. 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, 특정 하위세트(블록)에 분석물을 할당하는 데 사용되는 풍부도 값은 검정, 및 그 검정으로부터 얻을 수 있는 결과(예를 들어 측정값)에 의존할 수 있다.
위에서 상술한 바와 같이, PEA에서 생성된 리포터 DNA 분자는 PCR에 의해 증폭되고, 흔히, 리포터 DNA 분자를 생성하는 연장 단계 및 증폭 단계는 단일의 PCR 내에서 수행된다. 특히, "풍부도 블록"이 샘플에서 분석물 농도의 차이를 보상하기 위해 위에서 기재된 바와 같이 사용될 때, PEA에 의해 생성된 리포터 DNA 분자를 증폭시키기 위해 수행되는 PCR은 (리포터 DNA 분자의 생성과 동시에 수행되든 별개로 수행되든) 포화에 이를 때까지 실행될 수 있다. 관련 분야에 잘 알려진 바와 같이, 사이클 수 대비 PCR 증폭 생성물의 양은 "S" 형상을 취한다. 앰플리콘 농도의 느린 초기 증가 후, 지수 증폭기에 도달하고, 그 동안에 생성물의 양이 각 증폭 사이클에 따라 (대략) 2배가 된다. 지수기 후에, 선형기에 도달하고, 여기서는 생성물의 양이 지수 방식이 아니라 선형 방식으로 증가한다. 마지막으로, 반응 설정 및 사용된 성분의 농도 등을 고려하면, 생성물의 양이 그의 최대 가능 수준에 도달하는 정체기에 도달한다.
본 방법에서, 포화된 PCR은 지수기를 지난 임의의 PCR, 즉 선형기 또는 정체를 유지하는 PCR이라고 광범위하게 간주될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 "포화"는 최대 가능 생성물이 얻어질 때까지 반응이 실행되고, 이렇게 해서 더 많은 증폭 사이클이 수행되더라도 더 이상 생성물이 생성되지 않는다(즉, 반응이 생성물의 양이 정체를 유지할 때까지 실행된다)는 것을 의미한다. 포화는 반응 성분의 고갈 시, 예를 들어 프라이머 고갈 또는 dNTP 고갈 시에 도달할 수 있다. 반응 성분의 고갈은 반응이 느려진 후 정체기에 진입하는 결과를 초래한다. 드물게는, 포화는 폴리머라제 고갈 시에(즉, 폴리머라제가 그의 활성을 잃은 경우에) 도달할 수 있다. 또한 포화는 앰플리콘의 농도가 DNA 폴리머라제의 농도가 지수 증폭을 유지하기에 충분하지 않을 정도로 높은 수준에 도달하는 경우에, 즉 폴리머라제 분자보다 앰플리콘 분자가 더 많은 경우에 도달할 수 있다. 이 경우, 충분한 프라이머 및 dNTP가 반응 믹스에 남아 있는 한, 증폭이 선형기에 진입하고 선형기가 계속 유지된다.
PCR 증폭은 단순히 그것을 많은 수의 사이클 동안 실행함으로써 포화에 이를 때까지 실행될 수 있고, 이렇게 해서 포화를 가정할 수 있다. 예를 들어, 적어도 25, 30, 35회 또는 그 초과의 증폭 사이클 동안 실행되는 PCR 증폭은 지수 증폭기가 그 단계까지 종료될 것이라는 점에서 종료점에서는 포화에 도달했다고 가정할 수 있다. 대안적으로, 포화는 정량적 PCR(qPCR)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, TaqMan PCR은 모든 리포터 DNA 분자 전체에 걸쳐 공통 서열에 결합하는 프로브를 사용하여 수행될 수 있거나, 또는 qPCR은 이중가닥 DNA에 결합할 때 색이 변하는 염료, 예컨대 SYBR Green을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서 그 반응이 뒤따를 수 있고, 포화에 도달하는 데 요구되는 증폭 사이클의 최소 수가 결정된다. 어느 쪽이든, 증폭된 리포터 DNA 분자의 추가 가공(시퀀싱까지 포함함)이 요구된다는 점을 고려하면, TaqMan 프로브 또는 인터칼레이팅 염료가 방법의 추가 단계를 방해할 가능성이 있기 때문에, 시퀀싱을 위한 리포터 DNA 분자를 생성하는 데 실험적으로 사용되는 것과 별개의 분취물에서 포화점을 식별하기 위해 임의의 그러한 실험 qPCR을 수행하는 것이 필요할 것이다.
위에서 상술한 바와 같이, 관심 샘플의 각 분취물에 대해 별개의 멀티플렉스 반응이 수행된다. 각 분취물은 샘플에 상이한 수준으로 존재하는 분석물의 검출에 사용된다. 리포터 DNA 분자는 처음에 샘플 내의 각 분석물의 양에 상응하는 양으로 생성될 것이다. 따라서 높은 농도로 존재하는 분석물의 경우에는, 높은 농도의 리포터 DNA 분자가 생성될 것으로 예상할 수 있고, 낮은 농도로 존재하는 분석물의 경우에는 낮은 농도의 리포터 DNA 분자가 예상될 수 있다. 생성된 리포터 DNA 분자의 양은 샘플에 존재하는 상응하는 분석물의 양에 비례할 것으로 예상할 수 있고, 예를 들어, 제1 분석물이 샘플에 제2 분석물의 농도의 10배로 존재하는 경우, 제1 분석물의 경우에는 제2 분석물의 경우에 비해 10배 많은 리포터 DNA 분자가 생성될 것으로 예상된다. 따라서 샘플에 높은 농도로 존재할 것으로 예상되는 분석물의 검출에 사용되는 분취물에서는 샘플에 낮은 농도로 존재할 것으로 예상되는 분석물의 검출에 사용되는 분취물에서보다 훨씬 더 많은 수의 리포터 DNA 분자가 초기에 생성될 것이다.
리포터 DNA 분자 양의 이러한 차이가 연쇄화 및 시퀀싱 단계까지 달성되면, 가장 높은 양으로 존재하는 리포터 DNA 분자가 낮은 양으로 존재하는 리포터 DNA 분자를 "잠식시킬" 수 있을 것이고, 그 결과로 샘플에 낮은 양으로 존재하는 분석물의 저조한 검출이 초래될 것이다.
포화에 이를 때까지 실행되는 PCR에서 각 멀티플렉스 반응으로부터의 리포터 DNA 분자의 증폭은 분취물 사이의 리포터 DNA 분자 농도의 이러한 차이가 제거될 것임을 의미한다. 일단 포화에 도달하면 각 분취물에 본질적으로 동일한 양의 리포터 DNA 분자가 존재할 것이다. 이것은 샘플에 존재하는 각 분석물에 유사한 양의 리포터 DNA 분자가 존재할 것으로 예상될 수 있음을 의미하며, 또 이것은 리포터 DNA 분자가 연쇄화되어 시퀀싱될 때 모든 리포터 DNA 분자(및 그의 상응하는 분석물)가 검출되어야 함을 의미한다.
제1 PCR을 포화에 이를 때까지 실행하는 것은 그것이 각 풀이 거의 동일한 수의 리포터 DNA 분자를 함유하는 것을 보장하기 때문에 풍부도 블록이 사용되든 사용되지 않든 본 발명에 유리하다. 위에서 논의된 바와 같이, 그것은 1개 이상의 풀로부터의 큰 비율의 리포터 DNA 분자가 연쇄화되지 않고 남게 하는 것이 아니라 풀링된 리포터 DNA 분자가 연쇄화 동안에 본질적으로 고갈될 수 있다는 것을 보장하기 때문에 유리하다.
위에서 기재된 방법은 샘플 내의 각 관심 분석물의 검출을 가능하게 한다. 방법은 또한 각 샘플의 각 하위세트 내의 분석물의 수준의 비교를 허용하고, 즉 그것은 분석되는 각 특정 샘플 분취물 내의 분석물의 수준의 비교를 허용한다. 각 개별 분취물 내에서, 생성된 각 상이한 리포터 DNA 분자의 수준은 그들의 각각의 분석물의 수준에 비례한다(예를 들어 제1 분석물이 특정 분취물에 제2 분취물의 수준의 2배로 존재하는 경우에는, 제2 분석물에 상응하는 리포터 DNA 분자의 2배의 제1 분석물에 상응하는 리포터 DNA 분자가 생성될 것이다). 이러한 리포터 수준의 차이는 리포터 DNA 분자의 검출 동안 검출될 것이고, 시퀀싱 동안에 샘플에 존재하는 분석물의 상대적인 양의 비교를 가능하게 하지만, 동일한 분취물에서 검출되는 분석물에 대해서만 가능하다.
샘플에 존재하는 모든 분석물의 상대적인 양을 비교할 수 있는 것(즉, 상이한 분취물에서 검출되는 분석물을 비교할 수 있는 것)이 유리하다. 상이한 샘플에 존재하는 분석물의 상대적인 양을 비교할 수 있는 것은 추가 이점이다. 이것은 각 분취물에 대한 내부 대조물을 포함함으로써 달성될 수 있다. 각 샘플의 각 분취물에 동일한 내부 대조물이 포함된다. 내부 대조물은 샘플의 각 분취물에 분취물의 희석 계수에 의존하여 상이한 농도로 포함된다. 내부 대조물의 농도는 분취물의 희석 계수에 비례한다. 따라서, 예를 들어, 내부 대조물이 희석되지 않은 샘플 분취물에서 특정 주어진 농도로 사용되는 경우, 1:10 희석된 샘플 분취물에서는 내부 대조물이 희석되지 않은 샘플에서 사용되는 농도의 10분의 1 농도로 사용되는 등이다. 이것은 분취물 사이의 분석물의 상대 농도의 단도직입적 비교를 가능하게 하고, 한편으로는 내부 대조물이 각 분취물에 거기에서 검출되는 분석물에 적절한 농도로 존재하기 때문에 내부 대조물로부터의 신호가 분취물에서 검출되는 분석물로부터의 신호를 압도하지도 않고 그에 의해 압도되지도 않는 것을 보장한다.
내부 대조물은 대조 리포터 DNA 분자이거나 또는 대조 리포터 DNA 분자의 생성을 초래한다. 각 리포터 DNA 분자의 양을 대조 리포터와 비교함으로써, 상이한 분취물에서 및/또는 상이한 샘플로부터 분석되는 분석물의 상대적인 양을 비교할 수 있다. 이것은 각 리포터 DNA 분자와 대조 리포터 사이의 상대적 차이가 비슷하기 때문에 달성될 수 있다.
예를 들어, 상이한 샘플로부터의 2개의 상이한 리포터 DNA 분자가 대조 리포터에 비해 동일한 상대적 수준으로 (예를 들어 2배 또는 3배 적게 또는 2배 또는 3배 많게) 존재하는 경우, 이것은 2개의 리포터 DNA 분자에 의해 지시되는 분석물들이 두 샘플에 본질적으로 동일한 농도로 존재한다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, 대조 리포터에 대한 특정 리포터 DNA 분자의 비가 대조 리포터에 대한 상이한 샘플로부터의 동일한 리포터 DNA 분자의 비의 2배인 경우(예를 들어, 리포터 분자가 제1 샘플에 대조 리포터의 수준의 2배로 존재하고, 리포터 분자가 제2 샘플에 대조 리포터와 본질적으로 동일한 수준으로 존재하는 경우), 이것은 특정 리포터 DNA 분자에 의해 지시되는 분석물이 제1 샘플에 그것이 제2 샘플에 존재하는 수준의 거의 2배로 존재한다는 것을 나타낸다.
내부 대조물로 사용될 수 있는 다양한 대체물이 있다. 적합한 대조물은 사용되는 검출 기술에 의존할 수 있다. 임의의 검출 검정의 경우, 내부 대조물은 스파이킹된(spiked) 분석물, 즉 각 분취물에 정의된 농도로 첨가된 대조 분석물일 수 있다. 대조 분석물은 멀티플렉스 검출 검정 전에 분취물에 첨가되고, 각 분취물에서 샘플의 다른 분석물과 동일한 방식으로 검출된다. 특히, 대조 분석물의 검출은 대조 분석물에 특이적인 대조 리포터 DNA 분자의 생성을 유발한다. 대조 분석물이 사용되는 경우, 대조 분석물은 관심 샘플에 존재할 수 없는 분석물이다. 예를 들어, 그것은 인공 분석물일 수 있거나, 또는 샘플이 동물(예를 들어 인간)로부터 유래된 경우, 대조 분석물은 관심 동물에 존재하지 않는 다른 종으로부터 유래된 생체 분자일 수 있다. 특히 대조 분석물은 비인간 단백질일 수 있다. 전형적인 대조 분석물은 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청록색 형광 단백질(CFP)을 포함한다.
내부 대조물의 또 다른 예는 멀티플렉스 검출 검정에서 생성된 리포터 DNA 분자와 동일한 일반 구조를 가지는 이중가닥 DNA 분자이다. 다시 말해서, DNA 분자는 그것을 대조 리포터 DNA 분자로 식별하는 바코드 서열, 및 증폭 반응(들)에서 사용되는 프라이머의 결합을 가능하게 하는, 분석물 검출에 반응하여 생성된 모든 다른 리포터 DNA 분자와 공유되는 공통 프라이머 결합 부위를 포함한다. 이 방식으로 대조물로 사용되는 이중가닥 DNA 분자는 검출 대조물이라고 부를 수 있다.
방법의 특정 구현예에서, 대조 분석물 및 검출 대조물은 둘 모두 각 분취물에 첨가된다. 이 경우, 분명히 대조 분석물의 바코드 서열은 검출 대조물의 바코드 서열과 상이하고, 이렇게 해서 두 내부 대조물을 개별적으로 식별할 수 있다.
멀티플렉스 근접 연장 검정이 분석물 검출에 사용될 때, 추가 내부 대조물인 연장 대조물을 사용하는 것이 유리하다. 연장 대조물은 연장될 수 있는 자유로운 3' 말단을 포함하는 듀플렉스를 포함하는 핵산 도메인에 컨쥬게이션된 분석물 결합 도메인을 포함하는 단일의 프로브이다. 구현예에서, 연장 대조물은 그것이 오직 단일의 분석물 결합 도메인을 포함한다는 것을 제외하고는 두 실험 프로브가 그들의 표적 분석물에 결합할 때 두 실험 프로브 사이에 형성된 듀플렉스와 본질적으로 동등한 구조를 가진다. 연장 대조물에 사용되는 분석물 결합 도메인은 관심 샘플에 존재할 가능성이 있는 분석물을 인식하지 못한다. 적합한 분석물 결합 도메인은 상업적으로 입수가능한 다클론 이소형 대조 항체, 예컨대 염소 IgG, 마우스 IgG, 토끼 IgG 등이다.
도 2는 본 방법에서 사용될 수 있는 연장 대조물의 예를 나타낸다. 부분 A-F는 각각 도 1의 PEA 검정 버전 1-6에서 사용될 수 있는 연장 대조물에 상응한다. 연장 대조물은 연장 단계가 의도한 대로 발생하는지 확인하는 데 사용된다. 연장 대조물의 연장은 고유 바코드를 포함하는 리포터 DNA 분자를 산출하고, 이렇게 해서 그것은 연장 대조 리포터 핵산 분자로 식별될 수 있다. 멀티플렉스 PEA가 분석물 검출에 사용될 때, 대조 분석물, 연장 대조물 및 검출 대조물이 모두 검정에 사용되는(예를 들어 각 분취물에 첨가되는) 것이 유리하다. 다른 구현예에서는 내부 대조물 중 2개만, 예를 들어 대조 분석물 및 연장 대조물, 대조 분석물 및 검출 대조물, 또는 연장 대조물 및 검출 대조물이 사용된다.
PEA의 별개의 성분 대신, 내부 대조물은 대안적으로 각 리포터 DNA 분자에 존재하는 고유 분자 식별자(UMI) 서열일 수 있고, 이것은 각 분자에 고유하다. 이것은 분석물 검출의 초기 단계 동안 생성된 각 개별 리포터 DNA 분자가 UMI 서열을 포함한다는 것을 의미한다.
통상적으로 PEA를 수행할 때, 검출할 각 분석물에 대한 다수의 일치하는 프로브 쌍을 샘플에 가한다. "일치하는" 프로브 쌍은 다수의 프로브 쌍 모두가 동일한 분석물 결합 분자 쌍 및 동일한 핵산 도메인 쌍을 포함한다는 것을 의미하고, 이렇게 해서 표적 분석물에 결합하는 모든 일치하는 프로브 쌍이 일치하는 리포터 DNA 분자의 생성을 야기하고, 이는 샘플에 분석물의 존재를 지시한다.
UMI 서열이 내부 대조물로 활용될 때, 각 특정 분석물을 검출하는 데 사용되는 프로브는 일치하지 않는다. 특정한 분석물 결합 분자 쌍이 사용되지만, 각 개별 프로브, 또는 적어도 그 쌍의 두 분석물 결합 분자 중 특정한 하나를 포함하는 각 개별 프로브는 상이한 고유 핵산 도메인을 포함한다. 각 핵산 도메인은 그 안에 UMI 서열의 존재에 의해 고유하게 된다. 이것은 특정 분석물 분자에 결합하는 각 특이적 프로브 쌍이 고유 리포터 DNA 분자의 생성을 유발한다는 것을 의미한다. 따라서 근접 프로브 쌍에 의해 결합된 모든 개별 분석물 분자에 대해 고유 리포터 DNA 분자가 생성된다. 이것은 샘플에 존재하는 분석물의 양의 절대적 정량화를 허용하는데, 그 이유는 검출된 분석물 분자의 정확한 수가 특정 분석물에 대해 생성된 고유 리포터 핵산 분자의 수에 기초하여 계수될 수 있기 때문이다.
따라서 특정 구현예에서, 방법은 하나 이상의 샘플에 대해 다수의 멀티플렉스 PEA를 수행하는 단계를 포함하고, 각 PEA가 리포터 DNA 분자의 풀을 산출하고, 각 멀티플렉스 PEA가 리포터 DNA 분자를 생성하는 연장 단계 후에 리포터 DNA 분자를 증폭시키는 증폭 단계를 포함하는 PCR을 포함하고;
내부 대조물이 각 PCR에 제공되고, 상기 내부 대조물이
(i) 사전결정된 양으로 존재하고, 리포터 DNA 분자와 동일한 프라이머에 의해 증폭되는 대조 리포터 DNA 분자이거나 또는 그를 포함하거나 또는 그의 생성을 유발하는 별개의 성분; 또는
(ii) 연장 단계에서 생성된 각 분자에 고유한, 각 리포터 DNA 분자에 존재하는 고유 분자 식별자(UMI) 서열이다.
동일한 1개 이상의 내부 대조물이 각 멀티플렉스 PEA에서 사용된다.
특정 구현예에서, 내부 대조물(위에서 기재된 바와 같음)은 대조 리포터 DNA 분자이거나 또는 그를 포함하거나 또는 그의 생성을 유발하고, 여기서 대조 리포터 DNA 분자는 리포터 DNA 분자의 역방향 서열인 서열을 포함한다. 다시 말해서, 대조 리포터 DNA 분자는 검출되는 분석물에 특이적인 리포터 DNA 분자 중 하나의 역방향 서열인 서열을 포함한다. 이와 관련하여 사용된 "역방향"은 역방향 상보적 서열이 아니라 정확하게, 즉 단순히 역방향 서열을 의미한다는 것을 유의해야 한다. 대조 리포터 DNA 분자가 단지 분석물의 검출에 반응하여 생성된 리포터 DNA 분자의 역방향 서열을 가지기 때문에, 대조 리포터 DNA 분자는 문제의 리포터 DNA 분자와 혼성화할 수 없다. 이것은 대조 리포터 DNA 분자와 분석물의 검출에 반응하여 생성된 역방향 서열 리포터 DNA 분자 사이에 최대 유사도 수준의 유지를 허용하고, 이는 PCR 증폭에 유리하고, 한편으로 대조 리포터 DNA 분자와 분석물의 검출에 반응하여 생성된 리포터 DNA 분자 사이의 원치않는 혼성화 상호작용을 피한다. 특히, 대조 리포터 DNA 분자는 분석물의 검출에 반응하여 생성된 리포터 DNA 분자의 바코드 서열의 역방향 서열인 바코드 서열을 포함할 수 있지만, 검출 검정에서 생성된 리포터 DNA 분자와 동일한 공통 범용 서열이 바코드 양측에 있어서, 다른 리포터 DNA 분자와 함께 대조 리포터 DNA 분자의 증폭을 허용한다.
위에서 언급한 바와 같이, 구현예에서, 방법에서 사용되는 검출 검정은 대조 분석물, 연장 대조물 및 검출 대조물을 내부 대조물로 사용한다. 이들 세 대조물이 함께 기능하기 위해서는, 대조물들에 의해 생성된/제공된 대조 리포터 핵산 분자들이 서로 구별가능해야 한다는 것, 즉 모두 상이한 서열을 가져야 한다는 것이 명백하다. 구현예에서, 사용된/생성된 각 대조 리포터 DNA 분자는 분석물의 검출에 반응하여 생성된 리포터 DNA 분자의 역방향 서열인 서열을 가진다. 이 경우, 분명히 각 대조 리포터 DNA 분자는 분석물의 검출에 반응하여 생성된 상이한 리포터 DNA 분자의 역방향 서열을 가진다.
근접 연장 검정이 직면한 또 다른 과제는 일부 "배경"(즉, 위양성) 신호가 불가피하다는 것이다. 배경 신호는 반응 용액에서 비결합된 근접 프로브와의 또는 그들 사이의 랜덤 상호작용의 결과로 발생할 수 있다. 현재, 근접 반응에서 배경 신호의 수준은 별개의 음성 대조물을 사용하여 결정된다. 음성 대조물의 경우에는 근접 검정이 완충제만 사용하여(즉, 샘플 없이) 수행되고, 이렇게 해서 모든 신호가 배경이다. 실험 검정과 음성 대조물의 비교는 진양성 신호를 결정하는 것을 허용한다. 이 쟁점은 동시계류 중인 출원 PCT/EP2021/058025에서 다뤄지고, 그 출원에서 사용된 것과 동일한 방법이 본 출원에서 사용될 수 있다.
특히, 배경 대조는 공유된 혼성화 부위를 갖는 근접 프로브 쌍을 사용함으로써 개선될 수 있다. 이것은 동일한 혼성화 부위를 공유하는 모든 비결합된 프로브 사이에 "배경" 신호의 형성을 장려한다. 생성된 리포터 DNA 분자로부터의 모든 신호는 연쇄화되어 함께 판독된다(진양성 및 위양성 둘 모두). 리포터 DNA 분자가 쌍을 이루는 바코드 서열(즉, 동일한 분석물에 각각 상응하는 바코드 서열, 진양성 신호를 지시함)을 포함하는지 쌍을 이루지 않는 바코드 서열(즉, 상이한 분석물에 상응하는 바코드 서열, 위양성 신호를 지시함)을 포함하는지에 기초하여 진양성 신호는 위양성 신호와 구별될 수 있다. 반응에서 생성된 위양성 신호의 수준은 배경의 수준을 지시하고, 이는 배경 수준을 결정하는 별개의 음성 대조물 반응을 더 이상 수행할 필요가 없다는 것을 의미하며, 전체 검정을 단순화한다.
공유된 혼성화 부위를 배경을 결정하는 데 사용하는 것은 또한 상이한 혼성화 부위 사이의 성능 차이를 완화한다. 상이한 혼성화 부위 쌍들이 다른 것들보다 더 또는 덜 강하게 상호작용할 수 있고, 그 결과로 각 혼성화 부위 쌍으로부터 상이한 배경 수준이 생성된다. 공유된 혼성화 부위는 각 혼성화 부위 쌍으로부터 생성된 배경 수준을 개별적으로 결정하는 것을 허용하고, 그 결과로 계산할 배경 수준이 더 정확하게 결정된다.
이를 위해, 한 구현예에서 근접 연장 검정은
(i) 샘플 또는 각 샘플(또는 그의 분취물)을 복수의 근접 프로브 쌍(위에서 기재된 바와 같음)과 접촉시키는 단계로서, 각 쌍 내의 두 프로브 모두가 동일한 분석물에 특이적인 분석물 결합 도메인을 포함하고 분석물에 동시에 결합할 수 있고; 각 프로브 쌍이 상이한 분석물에 특이적이고;
각 근접 프로브의 핵산 도메인이 바코드 서열 및 혼성화 서열을 포함하고, 각 근접 프로브의 바코드 서열이 상이하고;
각 근접 프로브 쌍에서, 제1 근접 프로브 및 제2 근접 프로브가 쌍을 이루는 혼성화 서열을 포함하고, 이렇게 해서 제1 및 제2 근접 프로브가 그들의 분석물에 결합할 때, 제1 및 제2 근접 프로브의 각각의 쌍을 이루는 혼성화 서열이 각각에 직접적으로 또는 간접적으로 혼성화하고;
적어도 1쌍의 혼성화 서열이 적어도 2쌍의 근접 프로브에 의해 공유되는 단계;
(ii) 근접 프로브의 핵산 도메인이 서로 혼성화하는 것을 허용하고, 위에서 기재된 바와 같은 연장 반응을 수행하여 제1 근접 프로브의 바코드 서열 및 제2 근접 프로브의 바코드 서열을 포함하는 리포터 DNA 분자를 생성하는 단계; 및
(iii) 리포터 DNA 분자를 증폭시키는 단계
에 의해 수행된다.
생성된 리포터 DNA 분자를 위에서 기재된 바와 같이 가공하고 연쇄화하고 시퀀싱하여 각 리포터 DNA 분자의 상대적 양을 결정한다. 그 다음, 샘플 또는 각 샘플에 존재하는 분석물을 식별하고, 여기서 식별 단계에서:
(a) 제1 근접 프로브 쌍에 속하는 제1 근접 프로브로부터의 제1 바코드 서열 및 제2 근접 프로브 쌍에 속하는 제2 근접 프로브로부터의 제2 바코드 서열을 포함하는 리포터 DNA 분자를 배경으로 간주하고,
(b) 근접 프로브 쌍으로부터의 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함하고 배경보다 더 높은 양으로 존재하는 리포터 DNA 분자는 근접 프로브 쌍에 의해 특이적으로 결합된 분석물이 샘플에 존재한다는 것을 지시한다.
위에서 언급한 바와 같이, 각 샘플(또는 그의 분취물)은 복수의 근접 프로브 쌍과 접촉한다. 그러한 복수의 근접 프로브는 예를 들어 위에서 정의된 바와 같은 근접 프로브 패널 또는 그의 하위세트에 상응할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 각 근접 프로브는 고유 바코드 서열을 포함한다(즉, 상이한 바코드 서열이 각 근접 프로브에 존재한다). 특히, 이것은 각 개별 프로브 분자가 고유 바코드 서열을 포함한다는 것을 의미하지 않는다(하지만 위에서 언급한 바와 같이 각 프로브는 UMI를 포함할 수 있으며, 이 경우 UMI는 바코드 서열을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있거나, 또는 그것으로 이루어질 수 있거나 또는 이루어질 수 없다). 오히려, 각 프로브 종은 고유 바코드 서열을 포함한다. "프로브 종"은 특정 분석물 결합 도메인을 포함하는 프로브를 의미하고, 따라서 달리 말해서 및 위에서 PEA에 대해 더 일반적으로 기재한 바와 같이, 동일한 분석물 결합 도메인을 포함하는 모든 프로브 분자는 동일한 고유 바코드 서열을 포함한다. 모든 상이한 프로브 종은 상이한 바코드 서열을 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 각 근접 프로브의 핵산 도메인은 또한 혼성화 서열을 포함한다. 혼성화 서열은 각 근접 프로브 쌍 내에서 쌍을 이룬다. "쌍을 이루는 혼성화 서열"은 그 쌍 내의 두 혼성화 서열이 직접적으로 또는 간접적으로 서로 상호작용할 수 있다는 것을 의미하고, 이렇게 해서 방법이 수행되고 1쌍의 근접 프로브가 그들의 표적 분석물에 결합할 때 두 프로브의 핵산 도메인이 직접적으로 또는 간접적으로 서로 연결된다.
특정 구현예에서, 쌍을 이루는 혼성화 서열은 직접적으로 서로 상호작용하고, 이 경우 그들은 서로 상보적이고, 이렇게 해서 그들은 서로 혼성화한다. 이 구현예에서, 1쌍에서 제1 근접 프로브의 혼성화 서열은 그 쌍에서 제2 근접 프로브의 혼성화 서열의 역방향 상보체이다. 이것은 예를 들어 도 1의 PEA 버전 1, 2, 4 및 6에 해당한다. 버전 6에서, 혼성화 부위는 부분적 이중가닥 핵산 도메인(이것은 위에서 언급한 바와 같이 스플린트 올리고뉴클레오티드라고 부를 수 있음)에서 2개의 더 긴 핵산 가닥의 상호작용 부위이다.
위에서 기재된 바와 같이, 대안적으로, 쌍을 이루는 혼성화 부위는 간접적으로 서로 상호작용할 수 있다. 이 경우에, 쌍을 이루는 혼성화 서열은 직접적으로 서로 혼성화하지 않고, 대신 둘 모두가 별개의 브릿지 올리고뉴클레오티드, 즉 스플린트 올리고뉴클레오티드와 혼성화한다. 별개의 올리고뉴클레오티드는 검정 방법에서 제3 올리고뉴클레오티드라고 부를 수 있다. 다시 말해서, 이 경우에 쌍을 이루는 혼성화 서열은 공통 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있다. 이것은 예를 들어 도 1의 PEA 버전 3 및 5에 해당하고, 이것은 위에서 기재된 바와 같이 스플린트 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 이들 구현예에서, 쌍을 이루는 혼성화 부위는 스플린트 상의 상보적 부위와 혼성화하는 단일가닥 프로브 핵산 도메인 상의 부위이다.
쌍을 이루는 혼성화 서열이 스플린트 올리고뉴클레오티드를 통해 간접적으로 상호작용할 때, 스플린트 올리고뉴클레오티드는 2개의 혼성화 서열을 포함한다: 하나는 프로브 쌍에서 제1 프로브의 혼성화 서열에 상보적이고, 다른 하나는 프로브 쌍에서 제2 프로브의 혼성화 서열에 상보적이다. 따라서 스플린트 올리고뉴클레오티드는 그의 근접 검정 세트에서 근접 프로브의 쌍을 이루는 혼성화 서열 둘 모두와 혼성화할 수 있다. 특히, 스플린트 올리고뉴클레오티드는 동시에 그의 근접 검정 세트에서 근접 프로브의 쌍을 이루는 혼성화 서열 둘 모두와 혼성화할 수 있다. 따라서, 1쌍의 근접 프로브가 그들의 분석물에 결합하고 근접하게 될 때, 프로브의 핵산 도메인은 둘 모두가 스플린트 올리고뉴클레오티드와 혼성화하고, 이렇게 해서 2개의 프로브 핵산 도메인 및 스플린트 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복합체를 형성한다.
본 방법에서는, 적어도 1쌍의 혼성화 서열이 적어도 2쌍의 근접 프로브에 의해 공유된다. 다시 말해서, 적어도 2쌍의 근접 프로브(상이한 분석물에 결합함)가 동일한 혼성화 서열을 가진다. 1쌍의 혼성화 서열을 공유하는 쌍들로부터의 프로브는 서로 혼성화할 수 있거나, 또는 함께 복합체를 형성할 수 있다. 혼성화는 근접 프로브 둘 모두가 그들의 각각의 분석물에 결합될 때 그 근접 프로브 쌍의 핵산 도메인 사이에서 발생할 가능성이 가장 높고, 그 이유는 프로브와 분석물의 결합이 핵산 도메인들을 밀접하게 근접시키기 때문이다. 그러나, 용액에서 비결합된 근접 프로브의 핵산 도메인(즉, 분석물에 결합되지 않은 근접 프로브의 핵산 도메인)의 쌍을 이루는 혼성화 서열 사이에 약간의 상호작용이 불가피하게 형성될 것이거나, 또는 단 1개의 근접 프로브만 그의 표적 분석물에 결합할 때는, 그것이 용액에서 또 다른 프로브와 상호작용할 수 있다. 특히, 용액에서는 비결합된 근접 프로브의 핵산 도메인이 마찬가지로 쌍을 이루는 혼성화 서열을 가지는 임의의 근접 프로브의 핵산 도메인과 혼성화할(또는 복합체를 형성할) 가능성이 있고, 이는 근접 프로브가 동일한 분석물에 결합하는지 상이한 분석물에 결합하는지에 관계없이 일어날 수 있다. 아래에서 추가로 기재된 바와 같이, 그러한 비특이적 혼성화의 결과로(즉, 용액에서 비결합된 근접 프로브 사이의 혼성화의 결과로) 생성된 리포터 DNA 분자는 배경을 형성한다.
구현예에서, 상당한 비율의 프로브 쌍이 그들의 혼성화 서열을 적어도 1개의 다른 근접 프로브 쌍과 공유한다. 특정 구현예에서, 근접 프로브 쌍의 적어도 25%, 50% 또는 75%가 그들의 혼성화 서열을 또 다른 근접 프로브 쌍(즉, 적어도 1개의 다른 근접 프로브 쌍)과 공유한다. 특정 구현예에서, 모든 근접 프로브 쌍은 그들의 혼성화 서열을 적어도 1개의 다른 근접 프로브 쌍과 공유한다. 그러나, 위에서부터 명백한 바와 같이, 또 다른 구현예에서 적어도 1쌍의 혼성화 서열은 단일의 근접 프로브 쌍에 고유하다. 다시 말해서, 적어도 1쌍의 근접 프로브는 그의 혼성화 서열을 임의의 다른 근접 프로브 쌍과 공유하지 않는다. 특정 구현예에서, 근접 프로브 쌍들 중 최대 75%, 50% 또는 25%가 그들의 혼성화 서열을 임의의 다른 근접 프로브 쌍과 공유하지 않는다.
구현예에서, 단일의 혼성화 서열 쌍이 공유된 혼성화 서열을 갖는 모든 프로브 쌍 전체에 걸쳐서 공유된다. 다시 말해서, 혼성화 서열을 또 다른 프로브 쌍과 공유하는 모든 프로브 쌍은 동일한 혼성화 서열 쌍을 가진다. 이 구현예에서, 멀티플렉스 검출 검정에 사용되는 잠재적으로 모든 프로브 쌍은 동일한 혼성화 서열 쌍을 가질 수 있다.
그러나, 너무 많은 프로브 쌍이 동일한 혼성화 서열 쌍을 공유하는 경우, 이것은 너무 많은 배경 상호작용이 발생하는 것을 허용하여, 진양성 신호를 숨길 수 있다. 따라서, 각 혼성화 서열 쌍이 더 제한된 수의 프로브 쌍에 의해 공유되는 것이 유리할 수 있다. 특정 구현예에서는, 20, 15, 10 또는 5개 이하의 근접 프로브 쌍이 동일한 혼성화 서열 쌍을 공유한다. 따라서 구현예에서 멀티플렉스 검정은 다수의 근접 프로브 쌍 세트를 사용하고, 각각이 특정한 혼성화 서열 쌍을 공유한다. 따라서 특정 근접 프로브 쌍 세트에서는 모든 근접 프로브 쌍이 동일한 혼성화 서열 쌍을 공유하지만, 상이한 혼성화 서열 쌍이 각 상이한 근접 프로브 쌍 세트에 의해 사용된다. 이것은 각 프로브 쌍 세트 내의 모든 프로브 쌍 사이의 비특이적 혼성화를 가능하게 하지만, 상이한 프로브 쌍 세트 내의 프로브 쌍 사이의 비특이적 혼성화를 방지한다. 일반적으로, 각 프로브 쌍 세트는 2 내지 5개 범위의 프로브 쌍을 포함하지만, 바람직한 경우에는 더 큰 세트가 사용될 수 있다.
일단 리포터 DNA 분자가 연쇄화되고 시퀀싱에 의해 검출되고 계수되면, 결정 단계를 수행하여 샘플에 어떤 분석물이 존재하는지를 결정한다. 이 단계에서는, 먼저 배경의 수준을 결정한다. 비특이적 프로브 상호작용의 결과로 생성된 모든 리포터 DNA 분자는 배경 상호작용으로 간주될 수 있다. 이들 배경 상호작용 각각의 상대적 양이 결정되고, 이렇게 해서 배경 상호작용의 수준이 결정된다. "비특이적 프로브 상호작용"은 쌍을 이루지 않는 프로브 사이의 상호작용, 즉 상이한 분석물에 결합하는 프로브들 사이의 상호작용을 의미한다. 배경 리포터 DNA 분자는 제1 근접 프로브 쌍에 속하는 제1 근접 프로브로부터의 제1 바코드 서열 및 제2 근접 프로브 쌍에 속하는 제2 근접 프로브로부터의 제2 바코드 서열을 포함한다. 대안적으로 그러한 리포터 DNA 분자는 제1 분석물에 특이적인 근접 프로브로부터의 제1 바코드 서열 및 제2(또는 상이한) 분석물에 특이적인 근접 프로브로부터의 제2 바코드 서열을 포함한다고 기재할 수 있다. 위에서 기재된 바와 같이, 쌍을 이루지 않은 근접 프로브들 사이의 비특이적 상호작용이 그들의 공유된 혼성화 부위의 결과로 용액에서 자유로운 프로브들 사이에서, 또는 단 1개의 프로브만 그의 분석물에 결합될 때 발생할 수 있다.
그 다음, 특이적 프로브 상호작용에 의해 생성된 리포터 DNA 분자를 분석한다. "특이적 프로브 상호작용"은 프로브 쌍 내의 프로브들 사이의, 즉 동일한 분석물에 결합하는 두 프로브 사이의 상호작용을 의미한다. 그러한 리포터 DNA 분자는 근접 프로브 쌍으로부터의 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함한다. 대안적으로 그러한 리포터 DNA 분자는 동일한 분석물에 특이적인 근접 프로브들로부터의 제1 바코드 서열 및 제2 바코드 서열을 포함한다고 기재할 수 있다.
프로브 쌍 내의 프로브는 또한 용액에서 상호작용할 수 있고, 따라서 특이적 프로브 상호작용에 의해 생성된 리포터 DNA 분자는 또한 배경을 구성할 수 있다(즉, 배경 상호작용의 결과로 생성될 수 있다). 따라서 특이적 프로브 상호작용에 의해 생성된 각 리포터 DNA 분자의 양은 비특이적 프로브 상호작용의 결과로 생성된 리포터 DNA 분자의 양에 의해 결정되는 배경 상호작용의 수준과 비교된다. 특이적 프로브 상호작용에 의해 생성된 리포터 DNA 분자가 배경 상호작용의 수준(즉, 비특이적 배경 리포터 DNA 분자의 수준)보다 높은 수준으로 존재하는 경우, 이것은 관련 프로브 쌍에 의해 결합된 분석물이 샘플에 존재한다는 것을 지시한다. 다른 한편, 특이적 프로브 상호작용에 의해 생성된 리포터 DNA 분자가 비특이적 배경 리포터 DNA 분자보다 높지 않은 수준으로 존재하는 경우(예를 들어 특이적 프로브 상호작용에 의해 생성된 리포터 DNA 분자가 비특이적 배경 리포터 DNA 분자와 동일하거나 그보다 낮은 수준으로 존재하는 경우), 그러면 관련 프로브 쌍 사이의 상호작용은 단지 배경로 간주된다. 이 경우, 프로브 쌍의 프로브들 사이의 상호작용이 단지 배경일 뿐이라는 사실은 프로브 쌍에 결합된 분석물이 샘플에 존재하지 않음을 지시한다.
대안적으로, 임의의 개별 표적 분자에 대해, 배경 상호작용은 그 표적 분자에 결합하는 프로브를 포함하는 비특이적 상호작용으로만 정의될 수 있다. 다시 말해서, 각 표적 분자에 대해 배경 상호작용은 표적 분자를 인식하는 프로브와 표적 분자를 인식하는 프로브 쌍과 혼성화 부위를 공유하는 쌍을 이루지 않는 프로브(즉, 표적 분자를 인식하지 못하는 프로브) 사이의 비특이적 상호작용으로 정의될 수 있다. 따라서 이 경우에 표적 분자를 인식하지 못하는 프로브들 사이의 비특이적 상호작용은 그 특정 표적 분자에 대한 배경 상호작용으로 간주되지 않는다.
특정 구현예에서, 특이적 프로브 상호작용의 수준과 비교되는 배경 수준은 고려되는 배경 상호작용의 평균(average) 수준, 특히 고려되는 배경 상호작용의 평균(mean) 수준이다.
특정 구현예에서, PEA는 분석물에 결합하지 않는 1개 이상의 배경 프로브를 추가로 활용하며, 상기 배경 프로브는 바코드 서열 및 적어도 1개의 근접 프로브와 공유되는 혼성화 서열을 포함하는 핵산 도메인을 포함한다. "배경 프로브"는 또한 본원에서 "비활성 프로브"라고 부를 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이 비활성 프로브는 분석물에 결합하지 않는다. 그럼에도 불구하고 비활성 프로브는 그것이 샘플에 존재하지 않는 것으로 알려진 분석물, 특히 항체에 특이적인 경우 분석물 결합 도메인을 포함할 수 있다. 비활성 프로브는 사실상 기능성 근접 프로브의 분석물 결합 도메인과 동등하지만 분석물 결합 기능을 수행하지 않는 "결합 도메인"을 포함할 수 있고, 즉 결합 도메인 동등물은 비활성이다. 한 구현예에서, 비활성 도메인은 벌크 IgG에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 비활성 프로브는 불활성 분석물 결합 도메인, 즉 비기능성 분석물 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비활성 프로브는 가짜 분석물 결합 도메인, 예컨대 항체의 불변 영역, 또는 항체의 한 사슬(중쇄 또는 경쇄만)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 비활성 프로브는 핵산 도메인이 부착되지만 기능을 가지지 않고 활성 프로브의 분석물 결합 도메인과 관련없는 비활성 도메인을 포함할 수 있다. 비활성 도메인은 예를 들어 검정에 첨가될 수 있지만 검정 반응을 방해하지는 않는 단백질, 예컨대 혈청 알부민(예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민)일 수 있다. 또 다른 대안에서, 비활성 프로브는 단순히 핵산 분자이고, 비핵산 도메인을 함유하지 않는다.
각 비활성 프로브는 그의 핵산 도메인 내에 바코드 서열을 포함한다. 비활성 프로브 각각은 적어도 1개의 근접 프로브와 공유되는 혼성화 서열을 포함한다. 바람직하게는 비활성 프로브 각각은 다수의 근접 프로브와 공유되는 혼성화 서열을 포함한다. 비활성 프로브가 사용될 때는, 오직 단일의 비활성 프로브 종이 사용될 수 있고, 즉 모든 비활성 프로브가 동일한 혼성화 서열을 가진다. 그러나 바람직하게는 다수의 비활성 프로브 종이 사용되고, 각 비활성 프로브 종은 (상이한 근접 프로브 또는 상이한 근접 프로브 그룹과 공유되는) 상이한 혼성화 서열을 포함한다. 각 상이한 비활성 프로브 종은 상이한 고유 ID 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 모든 상이한 종의 모든 비활성 프로브가 공통 비활성 프로브 ID 서열을 사용할 수 있다. 어느 쪽이든, 분명히 비활성 프로브에 사용된 ID 서열 또는 서열들은 어느 근접 프로브와도 공유되지 않는다.
비활성 프로브와 특정 근접 프로브 사이에 공유되는 혼성화 부위 때문에, 용액에서 비활성 프로브와 근접 프로브 사이의 배경 상호작용이 가능하다. 비활성 프로브와 근접 프로브의 상호작용은 비활성 프로브 바코드 서열 및 근접 프로브 바코드 서열을 포함하는 리포터 DNA 분자의 형성을 초래한다. 비활성 프로브와 근접 프로브 사이의 상호작용으로부터 생성된 리포터 DNA 분자는 분석물 식별 단계에서 배경으로 간주된다.
제2 측면에서, 본 개시물 및 발명은 위에서 상술된 바와 같은 키트를 제공한다. 키트는 본원에서 정의되고 기재된 바와 같은 방법을 수행하기에 적합하고,
(i) 다수의 근접 프로브 쌍으로서, 각 쌍에서 한 근접 프로브가 제1 범용 프라이머 결합 부위 및 3'에 바코드 서열을 포함하는 핵산 도메인을 포함하고, 다른 한 근접 프로브가 제2 범용 프라이머 결합 부위 및 3'에 바코드 서열을 포함하는 핵산 도메인을 포함하는 프로브 쌍;
(ii) 제1 프라이머 쌍으로서, 프라이머가 제1 및 제2 범용 프라이머 결합 부위에 결합하도록 설계된 프라이머 쌍;
(iii) DNA 분자에 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의한 선형 콘카티머로의 지향성 조립을 위한 준비를 시키는 데 적합한 조립 프라이머 쌍 세트로서, 각 프라이머가 5'에서 3' 방향으로 조립 부위 및 혼성화 부위를 포함하고, 각 프라이머 쌍에서 혼성화 부위가 제1 및 제2 범용 프라이머 결합 부위에 결합하도록 설계된 프라이머 쌍 세트;
(iv) DNA 단편을 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의해 조립하는 데 적합한 효소로서, 효소가 조립 프라이머 쌍과 동일한 DNA 조립 수단에 사용하기에 적합한 효소; 및
(v) 제2 프라이머 쌍으로서, 각 프라이머가 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 인덱스 서열 및 혼성화 부위를 포함하고, 혼성화 부위가 선형 콘카티머의 말단을 형성하도록 설계된 조립 프라이머의 조립 부위에 결합하도록 설계되고;
이 쌍에서 제1 프라이머가 제1 시퀀싱 어댑터, 제1 시퀀싱 프라이머 부위 및 제1 인덱스 서열을 포함하고, 이 쌍에서 제2 프라이머가 제2 시퀀싱 어댑터, 제2 시퀀싱 프라이머 부위 및 제2 인덱스 서열을 포함하는 프라이머 쌍
을 포함한다.
키트의 근접 프로브 및 근접 프로브 쌍은 위에서 기재된 바와 같다. 특히, 근접 프로브는 근접 연장 검정에 사용하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 근접 프로브는 PEA 버전 6(도 1)에 나타낸 프로브의 구조를 가지고, 즉 각 프로브는 부분적 단일가닥 핵산 분자에 컨쥬게이션되는 분석물 결합 도메인을 포함한다. 각 프로브에서 짧은 핵산 가닥은 분석물 결합 도메인에 예를 들어 그의 5' 말단을 통해 컨쥬게이션된다. 각 짧은 핵산 가닥은 단일가닥 오버행을 3' 말단에 가지는 더 긴 핵산 가닥과 혼성화한다(다시 말해서, 더 긴 핵산 가닥의 3' 말단은 분석물 결합 도메인에 컨쥬게이션되는 더 짧은 가닥의 5' 말단을 넘어서 연장한다). 2개의 더 긴 핵산 가닥의 오버행은 서로 혼성화하여 듀플렉스를 형성할 수 있는 혼성화 부위를 포함한다.
특정 구현예에서, 다수의 근접 프로브 쌍은 위에서 기재된 바와 같이 단일의 혼성화 부위 쌍을 공유하는 핵산 도메인을 포함한다.
구현예에서, 조립 프라이머 쌍 및 효소는 DNA 단편을 USER 조립에 의해 조립하는 데 적합하다. 따라서 제공된 효소는 우라실 DNA 글리코시다제(UDG), DNA 글리코실라제-리아제 엔도 VIII(EndoVIII) 및 DNA 리가제일 수 있다. DNA 분자에 USER 조립을 위한 준비를 시키기 위한 조립 프라이머는 유리하게 각각 위에서 기재된 바와 같이 다수의 우라실 잔기를 포함하는 조립 부위를 포함한다. 특히, 각 조립 부위는 적어도 3개의 우라실 잔기를 포함할 수 있다.
제2 프라이머 쌍은 위에서 기재된 바와 같다. 위에서 상술한 바와 같이, 구현예에서 제2 프라이머 쌍의 각 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 인덱스 서열 및 혼성화 부위를 포함한다. 대안적인 구현예에서, 제2 프라이머 쌍의 각 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 인덱스 서열, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 혼성화 부위를 포함할 수 있다.
키트는 하나 이상의 PCR 단계를 수행하기 위한 DNA 폴리머라제 및 dNTP 믹스를 추가로 포함할 수 있다. 특히 DNA 폴리머라제는 PEA 및/또는 USER 조립과 관련하여 PCR을 수행하는 데 적합할 수 있다. DNA 폴리머라제는 특히 Taq 폴리머라제일 수 있다. dNTP 믹스는 PCR을 위한 저장 용액이고, 따라서 4개의 표준 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)를 포함한다.
키트는 또한 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 완충제는 키트에 제공된 적어도 하나의 효소와 상용성이 있을 수 있다. 바람직하게는 완충제는 조립 효소(예를 들어, USER 효소) 및 DNA 폴리머라제 둘 모두와 상용성이 있을 수 있고, 이렇게 해서 완충제는 위에서 기재된 바와 같이 시퀀싱 전의 본 발명의 방법의 모든 단계에서 사용하기에 적합하다.
키트는 또한 PEA 검정에 사용하기에 적합한 1개 이상의 대조물을 포함할 수 있다. 대조물은 위에서 기재된 바와 같을 수 있고, 예를 들어 키트는 위에서 기재된 바와 같이 대조 분석물, 연장 대조물 및/또는 검출 대조물을 포함할 수 있다.
본원의 방법 및 키트는 아래의 비제한적 실시예 및 도면을 참고하여 추가로 이해할 수 있다.
도면 설명
도 1은 위에서 상세히 기재된 근접 연장 검정의 6가지 상이한 버전의 개략도를 나타낸다. 뒤집힌 'Y' 모양은 전형적인 근접 프로브 분석물 결합 도메인으로서 항체를 나타낸다.
도 2는 근접 연장 검정에서 사용될 수 있는 연장 대조물의 예의 개략도를 나타낸다. 부분 A-F는 각각 도 1의 버전 1-6에 사용하기 위한 적합한 연장 대조물을 나타낸다. 부분 B-E에서는, 각각 도 1의 버전 2-5에 사용하기 위한 상이한 가능한 연장 대조물을 옵션 (i) 및 (ii)에 나타낸다. 도 1의 범례는 또한 도 2에도 적용된다.
도 3은 4개의 프로브 패널을 사용하여 혈장 샘플을 검정하는 두 PEA 프로토콜에 의해 얻은 정규화된 카운트 수의 비교를 나타낸다. "인덱스 내부" 연쇄화 프로토콜을 사용하여 얻은 정규화된 카운트를 연쇄화를 포함하지 않는 방법을 사용하여 얻은 정규화된 카운트와 비교한다. 두 프로토콜을 사용하여 얻은 정규화된 카운트 사이의 높은 상관관계를 알 수 있다(R = 0.91).
도 4는 특히 도 3에서 비교한 검정들로부터의 IL-8의 정규화된 카운트 수의 비교를 나타낸다. 각 패널에 대해서 두 프로토콜을 사용하여 얻은 정규화된 카운트 사이의 높은 상관관계를 알 수 있다(R = 0.97-0.99).
도 5는 4개의 프로브 패널을 사용하여 혈장 샘플을 검정하는 두 PEA 프로토콜에 의해 얻은 정규화된 카운트 수의 비교를 나타낸다. "인덱스 내부" 연쇄화 프로토콜을 사용하여 얻은 정규화된 카운트를 "인덱스 외부" 연쇄화 프로토콜을 사용하여 얻은 정규화된 카운트와 비교한다. 두 프로토콜을 사용하여 얻은 정규화된 카운트 사이의 높은 상관관계를 알 수 있다(R = 0.98).
도 6은 특히 도 5에서 비교한 검정들로부터의 IL-8의 정규화된 카운트 수의 비교를 나타낸다. 각 패널에 대해서 두 프로토콜을 사용하여 얻은 정규화된 카운트 사이의 높은 상관관계를 알 수 있다(R = 0.99-1.00).
도 7은 본원에 개시된 방법의 개략도를 나타내고, 4개의 풀 1, 2, 3 및 4 각각으로부터 PCR 앰플리콘을 포함하는 콘카티머의 생성을 묘사한다. 각 풀은 한 검정 세트로부터의 앰플리콘을 포함한다. 각 풀의 PCR 앰플리콘은 PCR1에 의해 생성된다. 각 풀로부터의 단일의 앰플리콘을 나타낸다. PCR2에서는 앰플리콘에 정의된 말단 서열이 제공되고, 이것은 정의된 말단 서열을 포함하는 5' "풀 특이적" 부분 및 앰플리콘과 혼성화하는 3' 혼성화 부위("범용" 부분)를 포함하는 조립 프라이머를 사용해서 지향성 연쇄화를 허용한다. 별표(*)는 상보적 서열을 지시한다. 말단이 다이제스팅된다. 풀 1, 2, 3 및 4로부터의 다이제스팅된 생성물을 풀링하고(조합하고) 결찰하여 콘카티머 생성물을 생성한다. PCR3을 수행하여 시퀀싱 어댑터를 말단에 첨가한다.
실시예
실시예 1 - 전형적인 실험 프로토콜
단계 1 - 샘플 준비 및 인큐베이션
48 내지 96개의 혈장 샘플 각각으로부터의 16개 분취물을 96-웰 또는 384-웰 인큐베이션 플레이트에서 16개의 근접 프로브 세트(4개의 384-프로브 쌍 패널 각각으로부터 4개의 풍부도 블록) 중의 각 세트 중 하나와 함께 인큐베이션한다.
희석을 요구하는 프로브 패널/그룹 함유 검정의 경우에는 샘플을 1:10, 1:100, 1:1000 및 1:2000 사전희석할 수 있다.
혈장 샘플을 희석하여 인큐베이션 용액에 분주하는 것은 수동으로 또는 피펫팅 로봇, 예를 들어 LabTech의 Mosquito® HTS에 의해 수행할 수 있다. 인큐베이션 용액을 플레이트의 웰에 분주한다.
1 μl의 샘플을 각 웰의 바닥에서 3 μl의 인큐베이션 믹스에 첨가하고, 플레이트를 접착 필름으로 밀봉하고, 400 x g로 1 분 동안 실온에서 스피닝하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션한다.
위에서 언급한 피펫팅 로봇을 사용하는 경우에는, 부피를 0.2 μl 샘플 및 0.6 μl 인큐베이션 믹스로 감소시킬 수 있다(5x 감소).
아래 표는 전형적인 시약 제제를 제공한다. 다른 성분, 예를 들어 다른 차단제가 프로브 용액에 포함될 수 있다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
[표 5]
단계 2- 근접 연장 및 리포터 분자 증폭
연장 및 증폭은 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 수행된다. PCR은 모든 연장 생성물의 증폭에 공통 프라이머를 사용하여 수행된다. (예를 들어 도 7의 PCR1 참조)
인큐베이션 플레이트(단계 1로부터)를 실온에 이르게 하고, 400 x g로 1 분 동안 원심분리한다. 연장 믹스(초순수, DMSO, Pwo DNA 폴리머라제 및 반응 용액을 포함함)를 플레이트에 첨가한 다음, 플레이트를 밀봉하고, 잠시 볼텍싱(vortexing)하고 400 x g로 1분 동안 원심분리한 다음, PEA 반응 및 증폭을 위해 열순환기에 놓는다(50℃ 20 분, 95℃ 5 분, (95℃ 30 초, 54℃ 1 분, 60℃ 1 분) x 25 사이클, 10℃ 홀드(hold)). 바람직하게는, 분주 로봇, 예를 들어 Thermo Scientific™ Multidrop™ Combi Reagent Dispenser를 사용하여 연장 믹스를 플레이트에 분주할 수 있다.
[표 6]
[표 7]
단계 3 - 풍부도 블록 풀링
각 샘플의 각 384-프로브 쌍 패널로부터의 각 풍부도 블록의 PCR 생성물을 함께 풀링한다. 이 결과로 샘플당 4개의 PCR 생성물 혼합물(풀)이 생성되며, 이것은 각 384-프로브 쌍 패널당 1개씩이다. 따라서 이 경우 각 풀은 근접 프로브 패널, 또는 다시 말해서 샘플에 대해 수행되는 검정 패널에 상응하는 PCR 생성물의 혼합물 또는 수집물이다. 풀은 4개의 풍부도 블록으로부터 유래된 PCR 생성물로 구성된다(즉, 각 패널에 대해 4개의 풍부도 블록이 있다. 각 블록은 각 검정에서 시험되는 분석물의 상대적 풍부도에 기초하여 검정 세트에 상응한다).
블록 사이의 검정의 상대적 수를 균등화하기 위해 각 풍부도 블록으로부터 상이한 부피를 취할 수 있다. PCR 생성물의 풀링은 수동으로 또는 피펫팅 로봇에 의해 수행할 수 있다.
단계 4 - 조립 프라이머로 증폭
각 샘플로부터의 각 PCR 생성물 혼합물(즉, 각 384-프로브 쌍 패널의 생성물)에 대해, USER 조립을 위한 조립 프라이머를 사용하여 별개의 제2 PCR을 수행한다. 이것은 도 7에서 PCR2로 묘사된다. 각 조립 프라이머는 앰플리콘에 첨가될 정의된 말단 서열을 포함하거나 또는 제공하는 "풀 특이적" 부분 및 앰플리콘과 혼성화하는 "범용" 부분을 포함하고; 범용 부분 및 그의 상보적 결합 부위는 상이한 풀의 앰플리콘 사이에 공유된다). USER 조립 프라이머 세트가 각 샘플의 다양한 패널 생성물에 사용된다. 전형적인 조립 프라이머 세트를 아래 표에 나타낸다(나타낸 바와 같이, 각 프라이머는 고유 조립 부위를 가지고, 이것은 종말 조립 부위를 제외하고는 이웃하는 상보적 부위를 가지며, 순방향 및 역방향 혼성화 부위 각각은 각각 동일하다). 1쌍의 조립 프라이머가 샘플로부터의 각 패널(각 풀에 상응함)의 생성물의 증폭에 사용되고, 예를 들어 예시된 프라이머가 사용되며, 각 샘플에 대해서 (도 7에 묘사된 바와 같은 풀 1-4에 상응하는) 패널 1에 쌍 A, 패널 2에 쌍 B, 패널 3에 쌍 C 및 패널 4에 쌍 D가 사용된다. 제1 PCR의 생성물을 제2 PCR 믹스(Taq 폴리머라제, dNTP, 범용 완충제 및 조립 프라이머를 초순수에 포함함)에 첨가하고, PCR을 수행한다: 95℃ 3 분, (95℃ 30 초, 45℃ 30 초, 72℃ 1 분) x 5 사이클, (95℃ 30 초, 65℃ 30 초, 72℃ 1 분) x 10 사이클, 10℃ 홀드.
[표 8]
[표 9]
단계 5 - 다이제스천
단계 4의 생성물을 다이제스팅해서 우라실 함유 조립 부위를 분해하여, 각 PCR 생성물의 말단에 3' 오버행을 남긴다. 각 별개의 제2 PCR의 생성물을 별개로 다이제스팅한다. 제2 PCR 생성물을 USER 효소에 첨가하고, 37℃에서 60 내지 120 분 동안 인큐베이션한다.
[표 9]
단계 6 - 연쇄화
각 샘플로부터의 각 PEA 패널(각 패널은 4개의 풍부도 블록으로부터의 생성물 풀을 나타냄)의 다이제스팅된 생성물을 조합하고 결찰시켜 문제의 샘플의 각 패널로부터의 생성물을 포함하는 콘카티머를 생성한다. 생성물들을 조립 부위로부터 생성된 상보적 오버행에 의해 정의된 순서대로 연쇄화한다. 패널 1을 조립 프라이머 쌍 A로, 패널 2를 조립 프라이머 쌍 B로, 패널 3을 조립 프라이머 쌍 C로, 및 패널 4를 조립 프라이머 쌍 D로 증폭시키는 상기 실시예에서는, 패널의 생성물들이 패널 1 - 패널 2 - 패널 3 - 패널 4 순서로 연쇄화된다.
[표 10]
단계 7 - 시퀀싱 어댑터 부착
Illumina 시퀀싱을 위해, 시퀀싱 어댑터를 각 콘카티머의 양쪽 말단에 첨가한다. 이것은 제3 PCR(도 7에서 PCR3으로 묘사됨)에서 수행되며, 이것은 또한 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 각 콘카티머가 유래된 샘플을 식별하는 인덱스 서열을 첨가하는 데도 사용된다. 제3 PCR을 위한 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터(예를 들어 위에서 언급한 P5 및 P7 어댑터), 시퀀싱 프라이머 결합 부위(예를 들어 위에서 언급한 Rd1SP 및 Rd2SP 결합 부위), 인덱스 서열 및 혼성화 부위를 포함한다.
결찰된 콘카티머를 Taq 폴리머라제, 프라이머, 완충제 및 dNTP를 포함하는 제3 PCR 믹스에 첨가하고 증폭시킨다: 95℃ 3 분, (95℃ 30 초, 60℃ 30 초, 72℃ 1 분) x 5 사이클, (95℃ 30 초, 65℃ 30 초, 72℃ 1 분) x 15 사이클, 10℃ 홀드.
[표 11]
단계 8 - 시퀀싱
콘카티머를 풀링한 다음, Illumina 플랫폼(예를 들어 NoveSeq 플랫폼)을 사용하여 시퀀싱한다. 4개의 패널로부터의 리포터 DNA 분자를 포함하는 콘카티머를 생성함으로써, 각 시퀀싱 실행의 처리량이 4배 증가한다.
단계 9 - 데이터 출력
바코드(각 리포터 DNA 분자로부터) 및 인덱스(각 콘카티머로부터) 서열을 데이터에서 식별하고, 계수하고, 합산하고, 알려진 바코드-검정-샘플 키(key)에 따라서 정렬/표지화한다.
"바코드 매칭"은 2개의 쌍을 이루는 PEA 프로브 사이의 상호작용을 나타낸다. 카운트는 PEA에서의 상호작용의 수에 대비된다.
샘플들을 비교할 수 있도록 내부 참조 대조물을 사용하여 각 검정 및 샘플의 카운트를 정규화하여야 한다.
각 풍부도 블록은 그 자체의 내부 참조 대조물을 가진다.
실시예 2 - 연쇄화가 없는 방법의 참조예
이 참조 프로토콜은 동시계류 중인 출원 PCT/EP2021/058008에 개시되어 있다. 이 프로토콜에서는 단계 1 내지 3을 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 그 후에는 프로토콜은 다음과 같다.
단계 4 - PCR2 인덱싱
48 내지 96개의 역방향 프라이머를 함유하는 프라이머 플레이트를 제공한다(일반적으로 96-웰 플레이트의 각 웰에 1개의 프라이머). 각 역방향 프라이머는 "Illumina P7" 시퀀싱 어댑터 서열(서열번호: 2) 및 샘플 인덱스 바코드를 포함한다. 각 상이한 샘플로부터의 PCR1 생성물(즉, 단계 2에서 수행된 PCR의 생성물)에 고유 바코드 서열이 사용된다. 바람직하게는 동일한 혈장 샘플을 포함하는 최대 4개의 PCR1 풀(각 384-프로브 쌍 패널에 대해 1개씩) 각각은 용이한 식별 및 데이터 가공을 위해 동일한 인덱스 서열을 받는다. "Illumina P5" 시퀀싱 어댑터 서열을 포함하는 순방향 공통 프라이머(PCR1에서 사용된 것과 동일한 순방향 프라이머)가 PCR2 용액에 제공된다.
각 PCR1 풀을 순방향 공통 프라이머, 프라이머 플레이트로부터의 단일의 역방향 (인덱스) 프라이머 및 DNA 폴리머라제(Taq 또는 Pwo DNA 폴리머라제)를 함유하는 PCR2 용액과 접촉시킨다. 프라이머가 고갈될 때까지 PCR에 의해 증폭을 수행한다 (95℃ 3 분, (95℃ 30 초, 68℃ 1 분) x 10 사이클, 10℃ 홀드)
풀링된 PCR1 생성물의 이론적 최종 농도는 1μM이다(모든 프라이머가 사용됨). PCR1 앰플리콘을 PCR2를 위해 1:20 희석으로 희석하여, 각 PCR2 반응에 50 nM의 출발 농도를 제공한다. 각 PCR2 프라이머의 농도는 500 nM이다. 따라서 PCR2 프라이머 고갈은 3.3 사이클 후에 발생해야 한다(10배 증폭).
[표 8]
[표 9]
[표 10]
단계 5 - 최종 풀
동일한 384-프로브 쌍 패널에 속하는 48 내지 96개의 인덱싱된 샘플 풀 모두를 각 샘플로부터 동일한 부피를 첨가해서 함께 풀링한다. 이것은 각 384-프로브 쌍 패널당 1개씩 최대 4개의 최종 풀을 산출한다.
단계 6 - 정제 및 정량화(선택 사항)
라이브러리들을 자기 비드를 사용하여 별개로 정제하고, 정제된 라이브러리의 총 DNA 농도를 DNA 표준 곡선과 함께 qPCR을 사용하여 결정한다. 더 긴 DNA 단편에 우선적으로 결합하는 AMPure XP 비드(Beckman Coulter, USA)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. AMPure XP 비드는 긴 PCR 생성물에는 결합하지만 짧은 프라이머에는 결합하지 않으며, 따라서 임의의 남는 프라이머로부터 PCR 생성물의 정제를 가능하게 한다.
PCR2 프라이머의 고갈은 이 정제 단계가 필요하지 않을 수 있음을 의미한다.
단계 7 - 품질 관리(선택 사항)
각 (정제된) 라이브러리의 소량의 분취물을 Agilent Bioanalyser(Agilent, USA)로 제조업체의 지침에 따라 분석하여 성공적인 DNA 증폭을 확인한다.
단계 8 - 시퀀싱
라이브러리를 Illumina 플랫폼(예를 들어 NoveSeq 플랫폼)을 사용하여 시퀀싱한다. 최대 4개의 라이브러리(각 384-프로브 쌍 패널로부터) 각각을 플로우 셀의 별개의 "레인"에서 실행한다. 사용된 플로우 셀 및 시퀀서의 크기 및 모델에 의존하여, 최대 4개의 라이브러리를 상이한 플로우 셀에서 병렬로 또는 순차적으로(하나씩 차례로) 시퀀싱할 수 있다.
단계 9 - 데이터 출력
바코드(각 리포터 핵산 분자로부터) 및 샘플 인덱스(각 샘플 인덱스 프라이머로부터) 서열을 데이터에서 식별하고, 계수하고, 합산하고, 알려진 바코드-검정-샘플 키에 따라서 정렬/표지화한다.
"바코드 매칭"은 2개의 쌍을 이루는 PEA 프로브 사이의 상호작용을 나타낸다. 카운트는 PEA에서의 상호작용의 수에 대비된다.
샘플들을 비교할 수 있도록 내부 참조 대조물을 사용하여 각 검정 및 샘플의 카운트를 정규화하여야 한다.
4개의 풍부도 블록 각각은 그 자체의 내부 참조 대조물을 가진다.
각 384-프로브 쌍 패널을 그것이 판독되는 레인에 기초하여 분리한다. 각 패널은 동일한 96개 샘플 인덱스 및 동일한 384개 바코드 조합 및 내부 참조 대조물을 포함한다.
실시예 3 - 연쇄화된 리포터 및 비연쇄화된 리포터의 시퀀싱
세 가지 반응 프로토콜을 비교하였다:
1. 실시예 1에서 위에서 기재된 바와 같은 프로토콜("인덱스 내부"라고 부름)
2. 제3 PCR에 사용된 프라이머가 상이하다는 것을 제외하고는 실시예 1에서 위에서 기재된 바와 같은 프로토콜. 프로토콜 2에서는, 제3 PCR을 위한 프라이머들이 실시예 1과 상이하게 배열되었다. 구체적으로, 제3 PCR을 위한 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 인덱스 서열, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 혼성화 부위를 포함하였다(즉, 인덱스 서열 및 시퀀싱 프라이머 결합 부위의 순서가 뒤바뀌고, "인덱스 외부"라고 부른다).
3. 실시예 2에 기재된 바와 같은 프로토콜.
세 프로토콜 각각에 대해, 8개의 혈장 샘플을 시험하고 비교하였다. 각 샘플을 4개의 PEA 프로브 패널을 사용하여 검정하였고, 각 패널은 372개의 프로브 쌍을 함유하였다. 각 패널은 IL-8 검출을 위한 프로브 쌍을 포함하였다. 시퀀싱 후, 각 풍부도 블록 내의 모든 매칭되는 바코드 판독값(카운트)를 내부 대조물에 대해 정규화하였다. 각 프로토콜에 의해 생성된 정규화된 바코드 카운트를 비교하였다.
하나의 샘플(샘플 7)에 대해 프로토콜 1 및 3으로부터 얻은 정규화된 카운트의 비교를 도 3에 나타낸다. 이 도면은 두 상이한 프로토콜로 얻은 정규화된 카운트 사이의 높은 상관관계(R2 = 0.91)를 나타내고, 이는 두 상이한 프로토콜이 샘플을 검정하는 데 사용된 각 프로브 쌍에 대해 거의 동일한 수의 정규화된 바코드 카운트를 생성한다는 것을 나타낸다. 또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 동일한 샘플에 대해 프로토콜 1 및 2로부터 얻은 정규화된 카운트를 비교하였다. 이 도면은 두 상이한 프로토콜로 얻은 정규화된 카운트 사이의 매우 높은 상관관계(R2 = 0.98)를 나타내고(나머지 7개 샘플에 대해서도 유사한 R2 값을 얻음), 이것은 "인덱스 내부" 및 "인덱스 외부" 프로토콜의 성능이 본질적으로 차이가 없다는 것을 나타낸다.
또한 IL-8에 대한 상이한 프로토콜로부터의 정규화된 카운트를 구체적으로 비교하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 8개 샘플 각각에 대해 프로토콜 1 및 3을 사용하여 각 검정 패널로부터 얻은 IL-8의 카운트를 비교하였다. 이 도면은 두 방법으로 얻은 정규화된 카운트 사이의 높은 수준의 상관관계를 나타낸다(4개의 상이한 검정 패널의 R2 값이 0.97 내지 0.99임). 도 6에 나타낸 바와 같이, 프로토콜 1 및 2를 사용하여 얻은 정규화된 카운트에 대해 동일한 비교를 하였다. 이 도면은 두 방법으로 얻은 정규화된 카운트 사이의 매우 높은 수준의 상관관계를 나타낸다(4개의 상이한 검정 패널의 R2 값이 0.99 내지 1임).
이들 결과는 본원에 제공된 바와 같은 연쇄화 단계를 포함하는 PEA 방법을 사용하여 샘플을 검정할 때는 각 리포터 DNA 분자가 개별적으로 시퀀싱되는 이전 방법을 사용할 때와 매우 유사한 결과를 얻는다는 것을 보여준다. 샘플이 높은 또는 낮은 수준의 특정 표적 단백질(예를 들어 IL-8)을 함유하는 경우, 이것은 시험된 세 프로토콜 모두에서 정확하게 식별된다. 위에서 상술한 바와 같이, 연쇄화는 방법의 처리량의 상당한 개선을 허용하고, 이들 결과는 처리량의 개선이 정확도의 손실 없이 얻어진다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> OLINK PROTEOMICS AB <120> ANALYTE DETECTION METHOD EMPLOYING CONCATEMERS <130> 27.130.150778/01 <150> GB 2018503.9 <151> 2020-11-25 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 adapter <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 adapter <400> 2 caagcagaag acggcatacg agat 24 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rd1SP binding site <400> 3 tctttcccta cacgacgctc ttccgatct 29 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rd2SP binding site <400> 4 gtgagtggac ttcagtggtg tcagagatgg 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 5 ccucugcugc ucucauuguc gctcttccga tct 33 <210> 6 <211> 25 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 6 acacuguacg utagagactc caagc 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 7 acguacagug ucgctcttcc gatct 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 8 agcucaaucc utagagactc caagc 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 9 aggauugagc ucgctcttcc gatct 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 10 acagacuuac utagagactc caagc 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 11 aguaagucug ucgctcttcc gatct 25 <210> 12 <211> 33 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Assembly Primer <400> 12 gugcgugcau gauccuacut agagactcca agc 33

Claims (32)

  1. 다수의 풀(pool)로부터 DNA 서열을 검출하는 방법으로서, 각 풀이 다수의 DNA 분자 종을 포함하고, 방법이
    (i) 풀을 조합하는 단계;
    (ii) 사전정의된 길이의 다수의 선형 DNA 콘카티머(concatemer)를 생성하는 단계로서, 각 콘카티머가 각 풀로부터의 1개의 랜덤 DNA 분자를 사전결정된 순서로 함께 접합함으로써 생성되고, 이렇게 해서 콘카티머 내의 각 DNA 분자의 위치가 그것이 유래된 풀을 지시하고, 각 콘카티머가 사전결정된 수의 DNA 분자를 포함하는, 단계; 및
    (iii) 콘카티머를 시퀀싱하여 각 콘카티머에서 각 풀로부터의 DNA 서열을 검출하는 단계로서, 각 풀로부터의 DNA 서열이 그의 콘카티머 내의 그의 위치에 기초하여 그 풀에 배정되는, 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 단계 (i) 전에, 연쇄화를 위한 다수의 DNA 분자 풀을 준비하는 단계를 포함하며, 상기 준비하는 단계가 각 풀 내의 DNA 분자에 연쇄화 단계에서 접합될 수 있는 정의된 말단 서열을 제공하는 것을 포함하고, 동일한 풀의 DNA 분자들이 동일한 말단 서열을 가지고, 상이한 풀은 상이한 말단 서열을 가지며, 이렇게 해서 1개의 풀로부터의 DNA 분자가 1개 또는 2개의 사전결정된 상이한 풀로부터의 DNA 분자에만 접합될 수 있는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 DNA 분자가 DNA 증폭 반응에서 생성된 앰플리콘인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 DNA 증폭 반응이 PCR인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    각 DNA 분자가 분석물에 특이적인 리포터 DNA 분자이고, 각 리포터 DNA 분자의 시퀀싱이 상응하는 분석물의 검출을 초래하는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분석물이 단백질이거나 또는 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 리포터 DNA 분자가 샘플에 대해 수행되는 멀티플렉스 검출 검정에 의해 생성되고;
    상기 방법이 각 샘플에서 다수의 분석물을 검출하기 위해 하나 이상의 샘플에 대해 다수의 멀티플렉스 검출 검정을 수행하는 단계를 포함하고, 각 멀티플렉스 검출 검정이 리포터 DNA 분자의 풀을 산출하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 멀티플렉스 검출 검정이 제1 PCR 생성물을 생성하는 제1 PCR을 포함하고;
    연쇄화를 위한 제1 PCR 생성물을 준비하기 위해, 제1 PCR 생성물이 제2 PCR에 의해 변형되며, 제2 PCR이 DNA 분자의 풀을 생성하는 것인, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 검출 검정이 리포터 DNA 분자를 생성하는 연장 단계 및 리포터 DNA 분자가 증폭되는 증폭 단계를 포함하는 근접 연장 검정이고, 상기 연장 단계 및 증폭 단계가 단일 PCR 내에서 일어나는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 다수의 멀티플렉스 근접 연장 검정이 동일한 샘플에 대해 수행되고;
    각 근접 연장 검정이 근접 프로브 쌍을 사용하여 분석물을 검출하는 것을 포함하며, 각 근접 프로브가
    (i) 분석물에 특이적인 분석물 결합 도메인; 및
    (ii) 핵산 도메인
    을 포함하며,
    각 쌍 내의 두 프로브 모두가 동일한 분석물에 특이적인 분석물 결합 도메인을 포함하고, 각 프로브 쌍이 상이한 분석물에 특이적이고, 각 프로브 쌍이, 근접 프로브 쌍이 그들의 각각의 분석물에 근접 결합할 때, 근접 프로브의 핵산 도메인이 상호작용하여 리포터 DNA 분자를 생성하도록 설계되고;
    적어도 2개의 근접 프로브 쌍 패널이 사용되고, 각 패널이 상이한 분석물 그룹의 검출을 위한 것이고, 각 멀티플렉스 근접 연장 검정이 1개의 근접 프로브 쌍 패널을 사용하고;
    (a) 각 패널 내에서, 모든 프로브 쌍이 상이한 핵산 도메인 쌍을 포함하고; (b) 상이한 패널에서 프로브 쌍이 동일한 핵산 도메인 쌍을 포함하고;
    각 근접 프로브 쌍 패널의 생성물이 풀을 형성하는 것인, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플이 혈장 또는 혈청 샘플인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    연쇄화가 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의해 수행되는 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 방법이 조립 프라이머를 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하며, 각 풀의 모든 DNA 분자가 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되고, 상이한 프라이머 쌍이 각 풀에서의 증폭에 사용되고, 각 조립 프라이머 종이 고유 조립 부위를 포함하여 각 풀의 모든 PCR 생성물이 고유한 사전정의된 조립 부위를 한쪽 또는 양쪽 말단에 포함하고;
    단계 (ii)에서, 각 풀의 PCR 생성물이 상보적 조립 부위를 가지는 상이한 풀의 PCR 생성물에 접합되고, 이렇게 함으로써 콘카티머를 생성하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    연쇄화가 USER 조립에 의해 수행되고, 각 조립 부위가 다수의 우라실 잔기, 바람직하게는 적어도 3개의 우라실 잔기를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 방법이
    (a) 다수의 멀티플렉스 근접 연장 검정을 수행하고, 이렇게 함으로써 다수의 리포터 DNA 분자 풀을 생성하는 단계로서, 각 풀의 리포터 DNA 분자가 범용 프라이머 결합 부위를 그의 3' 및 5' 말단에 포함하는, 단계;
    (b) USER 조립을 위한 조립 부위를 포함하는 조립 프라이머를 사용하여 각 풀에 대해 PCR을 수행하는 단계;
    (c) 풀로부터의 PCR 생성물을 USER 조립에 의해 선형 콘카티머로 조립하는 단계로서, 조립 단계가
    (i) 각 풀의 PCR 생성물을 가공하여 조립 부위를 포함하는 3' 오버행을 생성하고;
    (ii) 풀을 조합하고;
    (iii) 각 풀의 PCR 생성물이 상보적 3' 오버행을 가지는 상이한 풀의 PCR 생성물과 접합되는 것인 선형 DNA 콘카티머를 다수 생성하는 것
    을 포함하는, 단계; 및
    (d) 콘카티머를 시퀀싱하고, 이렇게 함으로써 각 근접 연장 검정에서 검출된 분석물을 식별하는 단계로서, 각 근접 연장 검정에서 검출된 분석물이 각 리포터 DNA 분자의 서열 및 그의 콘카티머 내의 그의 위치의 조합에 기초하여 식별되는 단계;
    를 포함하는 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선형 DNA 콘카티머에 대해 PCR이 수행되어 적어도 제1 시퀀싱 어댑터가 콘카티머에 첨가되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 PCR에서 제1 시퀀싱 어댑터가 콘카티머의 한쪽 말단에 첨가되고, 제2 시퀀싱 어댑터가 콘카티머의 다른 한쪽 말단에 첨가되는 것인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선형 DNA 콘카티머에 대해 PCR이 수행되어 적어도 제1 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 콘카티머에 첨가되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 PCR에서 제1 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 콘카티머의 한쪽 말단에 첨가되고, 제2 시퀀싱 프라이머 결합 부위가 콘카티머의 다른 한쪽 말단에 첨가되는 것인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) 다수의 풀 세트가 개별적으로 조합되고 별개의 연쇄화 반응이 각 풀 세트에 대해 수행되어 다수의 연쇄화 반응 생성물을 산출하고;
    (II) 고유 인덱스 서열이 PCR에 의해 각 연쇄화 반응 생성물에 첨가되고;
    (III) 연쇄화 반응 생성물이 조합되고;
    (IV) 콘카티머가 시퀀싱되고, 인덱스 서열이 각 콘카티머가 기원하는 풀 세트를 식별하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 PCR에서 제1 인덱스 서열이 콘카티머의 한쪽 말단에 첨가되고, 제2 인덱스 서열이 콘카티머의 다른 한쪽 말단에 첨가되는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 콘카티머에 대해 단일의 PCR이 수행되고, 이 PCR에서 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열이 각 콘카티머의 양쪽 말단에 첨가되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 콘카티머에 대해 수행되는 PCR이 각 말단에 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 포함하는 생성물을 산출하는 것인, 방법.
  24. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다수의 분석물이 샘플에서 어느 범위의 풍부도 수준을 가지고, 상기 방법이
    (i) 샘플로부터 다수의 분취물을 제공하는 단계;
    (ii) 각 분취물에 대해 별개의 멀티플렉스 검출 검정을 수행함으로써 각 분취물에서 상이한 분석물 하위세트를 검출하고, 각 분취물로부터 제1 PCR 생성물을 생성하는 단계로서, 각 하위세트의 분석물이 샘플에서 그들의 예측 풍부도에 기초하여 선택되는, 단계;
    (iii) 제1 PCR 생성물을 다수의 풀로 조합하는 단계; 및
    (iv) 제2 PCR을 수행하여 제1 PCR 생성물을 변형해서, 연쇄화를 위한 제1 PCR 생성물을 준비하는 단계
    를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 방법이 제10항에 정의된 바와 같이 수행되고, 다수의 분취물이 샘플로부터 각 근접 프로브 쌍 패널에 제공되고, 각 패널로부터의 제1 PCR 생성물이 조합되고 제2 PCR이 수행되고, 이렇게 함으로써 샘플의 각 패널로부터 풀을 산출하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    시퀀싱 이전의 모든 단계가 동일한 완충제에서 수행되는 것인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콘카티머가 대량 병렬 DNA 시퀀싱에 의해 시퀀싱되는 것인, 방법.
  28. (i) 다수의 근접 프로브 쌍으로서, 각 근접 프로브 및 근접 프로브 쌍이 제10항에 정의된 바와 같고, 각 쌍에서 한 근접 프로브가 제1 범용 프라이머 결합 부위 및 이의 3'에 바코드 서열을 포함하는 핵산 도메인을 포함하고, 다른 한 근접 프로브가 제2 범용 프라이머 결합 부위 및 이의 3'에 바코드 서열을 포함하는 핵산 도메인을 포함하는 프로브 쌍;
    (ii) 제1 프라이머 쌍으로서, 프라이머가 제1 및 제2 범용 프라이머 결합 부위에 결합하도록 설계된 프라이머 쌍;
    (iii) USER 조립 또는 Gibson 조립에 의한 선형 콘카티머(concatemer)로의 지향성 조립을 위해 DNA 분자를 준비하는 데 적합한 조립 프라이머 쌍 세트로서, 각 프라이머가 5'에서 3'으로 조립 부위 및 혼성화 부위를 포함하고, 각 프라이머 쌍에서 혼성화 부위가 제1 및 제2 범용 프라이머 결합 부위에 결합하도록 설계된 프라이머 쌍 세트;
    (iv) DNA 단편을 USER 조립 또는 Gibson 조립에 의해 조립하는 데 적합한 효소로서, 효소가 조립 프라이머 쌍과 동일한 DNA 조립 수단에 사용하기에 적합한, 효소; 및
    (v) 제2 프라이머 쌍으로서, 각 프라이머가 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 인덱스 서열 및 혼성화 부위를 포함하고, 혼성화 부위가 선형 콘카티머의 말단을 형성하도록 설계된 조립 프라이머의 조립 부위에 결합하도록 설계된, 프라이머 쌍;
    을 포함하는 키트로서,
    쌍에서 제1 프라이머가 제1 시퀀싱 어댑터, 제1 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 제1 인덱스 서열을 포함하고, 쌍에서 제2 프라이머가 제2 시퀀싱 어댑터, 제2 시퀀싱 프라이머 결합 부위 및 제2 인덱스 서열을 포함하는, 키트.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 제2 프라이머 쌍에서 각 프라이머가 5'에서 3' 방향으로 시퀀싱 어댑터, 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 인덱스 서열 및 혼성화 부위를 포함하는 것인, 키트.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 조립 프라이머 및 효소가 조립을 위해 DNA 분자를 준비하고 USER 조립에 의해 DNA 분자를 조립하는 데 적합하고, 각 조립 프라이머가 다수의 우라실 잔기, 바람직하게는 적어도 3개의 우라실 잔기를 포함하는 조립 부위를 포함하는 것인, 키트.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트가 제26항에 정의된 바와 같이 사용하기에 적합한 반응 완충제를 추가로 포함하는 것인, 키트.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA 폴리머라제 및 dNTP 믹스를 추가로 포함하는, 키트.
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