CN116735867A - 基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于HCR介导的多价适配体和CRISPR‑Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，特点是包括以下步骤：1)将链酶亲和素纳米磁珠与生物素化适配体混合，得到适配体磁珠；2)将触发链、发夹DNA H1、发夹DNA H2混合反应得到HCR支架，随后加入适配体得到基于HCR的多价适配体结构，其检测方法是通过适配体磁珠对沙门氏菌进行分离富集，并加入基于HCR的多价适配体得到磁珠‑沙门氏菌‑HCR三明治结构，随后加入CRISPR‑Cas12a体系，在37℃下反应1小时后得到增强的荧光信号，实现对待测溶液中沙门氏菌的检测，优点是灵敏度高、特异性强且准确性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测沙门氏菌的方法，尤其是涉及一种基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是一种最具威胁性的食源性病原体，在多种食品中都有着很高的感染率，对人类健康有着巨大威胁并对全球经济产生广泛影响。因此，开发出简单、灵敏的沙门氏菌检测方法对食品中沙门氏菌进行监测和约束是十分必要的。
传统培养法、基于核酸的方法和基于免疫学的分析方法是常用的食源性致病菌检测方法。其中，传统培养法是对菌种进行培养和生化鉴定，该方法可靠性强、灵敏度高，可在单细胞水平上实现细菌的检测。然而，这种方法操作复杂、劳动密集、耗时长。基于核酸和基于免疫学的方法是近年来得到广泛发展的方法，大大缩短了检测时间并简化了操作步骤。基于核酸的检测方法具有很高的检测灵敏度，但需要复杂的DNA提取步骤、长时间的扩增过程，以及昂贵的仪器设备。而基于免疫学的方法通常通过抗体识别来特异性检测整个细菌细胞，这是一种简单、高通量的快速检测致病菌的工具。然而，抗体具有不稳定性，对反应环境非常敏感，这使得检测条件更为苛刻，检测结果也不稳定。因此，开发出一种简单、灵敏、特异、稳定的沙门氏菌检测方法是迫在眉睫的。
适体是从随机核酸文库中分离出来的能于靶标特异性结合的短链寡核苷酸，由于其与抗体相比具有分子量小、成本低、合成简单、易于修饰、无免疫原性、热稳定性好、pH稳定等明显优势，在食源性致病菌的检测中受到广泛关注。现在已经开发出许多基于适配体的传感器用于沙门氏菌的检测，然而，由于适配体在复杂食品基质中的低亲和力和低特异性，其实际应用仍然具有挑战性。自然界中普遍存在的多价相互作用可以提高配体在目标位点的有效浓度，从而降低后续结合事件的熵惩罚，最终增强结合亲和力，此外，多价相互作用也有助于更好的选择性目标识别。受此启发，多价性在近十几年已经成为提高目标识别的结合亲和力、特异性和反应动力学的有效策略。因此，开发基于多价适配体的适配体传感器在食源性致病菌灵敏、特异性检测上具有很大的潜力。
CRISPR-Cas系统是细菌和古生菌中的一种适应性免疫系统，其中CRISPR-Cas12a可以在crRNA的引导下与靶标核酸结合，进而激发其随机剪切周围单链DNA的反式切割活性。然而，单独使用CRISPR-Cas12a系统用于细菌检测只能达到pM水平，这并不能满足低浓度食源性致病菌的检测。因此，为了提高灵敏度，很大一部分CRISPR-Cas12a细菌分析技术需要结合PCR、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等核酸扩增技术。通过这种方式可以实现高灵敏的检测病原体，但是需要大量的样品处理、耗时的扩增，且有污染的风险，使得这种检测方式的应用受到限制。目前，国内外还没有公开关于HCR介导的多价适配体结合CRISPR-Cas12a的适配体传感器用于检测沙门氏菌的方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强且准确性好的基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，包括以下步骤：
(1)适配体磁珠的合成
将100μL 1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠溶液和100μL 1μM生物素化适配体1(biotin-poly-Apt)溶液混合，于室温反应45分钟后，加入200μL 4μM D-生物素，于室温反应30分钟以对纳米磁珠进行封闭，用含0.01wt％吐温-20的磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，复溶于100μL磷酸盐缓冲液中，得到适配体磁珠溶液，于4℃保存备用；(2)基于HCR的多价适配体的合成
将发夹DNA1、发夹DNA2和适配体2分别经退火前处理后，将发夹DNAH1、发夹DNAH2和触发链DNA混合反应，得到HCR骨架溶液，然后在HCR骨架溶液中加入经退火处理的适配体2，得到基于HCR的多价适配体溶液；
(3)沙门氏菌的检测
将步骤(1)中制备得到的适配体磁珠溶液与200μL不同浓度沙门氏菌菌液进行混合，于室温反应45分钟并经三次洗涤后，加入20μL 0.5μM步骤(2)中制备得到的基于HCR的多价适配体，于室温反应45分钟并经三次洗涤后，复溶于5μL PBS溶液得到“磁珠-沙门氏菌-HCR”的三明治结构，将该三明治结构加入CRISPR-Cas12a体系，最后将反应体系于37℃反应1小时后，于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定相对荧光强度，根据检测不同浓度沙门氏菌对应的吸光度值得到的曲线，对待测溶液中沙门氏菌浓度进行定量检测。
进一步，步骤(1)所述的生物素化适配体1(biotin-poly-Apt)的核苷酸序列如下：biotin-TTT TTT TTT TTT TTT CTC CTC TGA CTG TAA CCA CGG TGG TTT GAT CAC TATTGG GCC TTT GTG ATG TCG GTA GT。
进一步，步骤(2)具体为：将发夹DNAH1、发夹DNAH2和适配体2分别于95℃加热10分钟，然后立即插到冰上冷却10分钟，得到退火后的发夹DNA和适配体2；再将2.5μL 10μM的发夹DNAH1、2.5μL 10μM的发夹DNAH2和2.5μL 0.2μM的触发链DNA混合，并加入17.5μL的磷酸盐缓冲液，于37℃孵育过夜，得到HCR骨架；然后在HCR骨架溶液中加入1.5μL 25μM适配体2溶液，并用磷酸盐缓冲液定容至50μL，于37℃反应2小时，得到基于HCR的多价适配体。
进一步，所述的触发链DNA的核苷酸序列如下：GTA TGT TGT TGC GGA ATG GTCTAG GTG ATT GAG TGG；所述的发夹DNAH1的核苷酸序列如下：TTT CCC TTA TAT TCT CTCTCT CTC CTG CGG GTT TGA CTA GGT GAT TGA GTG GTG TGT TAT CCC ACT CAA TCA CCTAGA CCA TTC CGC AAC AAC ATA C(划线部分为与适配体互补部分)；所述的发夹DNA H2的核苷酸序列如下：GAT AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTC AAA CCC GCA GTA TGT TGTTGC GGA ATG GTC TAG GTG ATT GAG TGG；所述的适配体2的核苷酸序列如下：GAG AGA GAA TAT AAG GGA AAA AAA ACT CCT CTG ACT GTA ACC ACG GTG GTT TGA TCA CTA TTG GGCCTT TGT GAT GTC GGT AGT(划线部分为与H1互补部分)。
进一步，步骤(3)中所述的CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL。
进一步，所述的单链DNA荧光报告探针核苷酸序列如下：FAM-TTA TT-BHQ；所述的crRNA的核苷酸序列如下：GAA UUU CUA CUG UUG UAG AAC UAG GUG AUU GAG UGG UGUGUU。
发明原理：如图1所示，通过生物素-链霉亲和素相互作用，将沙门氏菌特异性的适配体附着在纳米磁珠表面，制备得到适配体磁珠，用于特异性捕获沙门氏菌。同时，设计了两个发夹DNA，其中H1的5’端有一段分支臂，H2中含有CRISPR靶向序列，在触发链的作用，H1和H2相互杂交得到含有大量重复CRISPR靶向序列的长双链DNA支架，并为适配体提供结合位点。在适配体加入后，通过5’端延伸序列与HCR支架上的分支臂之间的碱基互补配对得到基于HCR的多价适配体结构。在沙门氏菌存在的情况下，目标菌被适配体磁珠捕获分离，并被基于HCR的多价适配体高亲和力识别，两者同时附着在沙门氏菌上，得到“磁珠-沙门氏菌-HCR”三明治复合物。其中靶标菌的信号通过HCR支架被放大到数百个重复的CRISPR靶向单元，随后，HCR支架上的CRISPR靶向单元激活Cas12a的反式切割活性，随机切割周围的单链DNA报告探针，产生放大的荧光信号。在多价适配体高亲和力和级联信号放大作用下，实现对沙门氏菌的高灵敏度检测。
与现有技术相比，本发明的优点在于
(1)本发明中的基于HCR的多价适配体通过碱基互补配对将适配体连接到HCR支架上，得到高亲和力的多价适配体；
(2)本发明中基于HCR的多价适配体，HCR支架上含有CRISPR靶向单元，进而触发Cas12a反式切割活性产生荧光信号，可以将细菌信号转化为荧光信号；
(3)本发明中的基于HCR的多价适配体通过DNA的设计，在提高适配体亲和力的同时还能将细菌信号转化为荧光信号；
(4)本发明中通过HCR支架上的多个CRISPR靶向单元和Cas12a对多个单链DNA荧光探针的切割实现对信号的一步级联放大，最终得到2CFU/mL的检测限；
(5)本发明中适配体磁珠对样品中的沙门氏菌进行捕获、分离，降低复杂样品基质对检测体系的干扰。
综上所述，本发明一种双功能HCR介导的多价适配体结合CRISPR-Cas12a的适配体传感器，将适配体磁分离技术和基于HCR的多价适配体与CRISPR-Cas12a系统结合在一起。将沙门氏菌特异性适配体通过生物素-链酶亲和素相互作用附着在纳米磁珠表面得到适配体磁珠，并通过碱基互补配对将适配体组装到HCR支架上得到基于HCR的多价适配体。在多价的作用下，多价适配体的亲和力得到显著增强，同时，在HCR支架上包含大量重复的CRISPR靶向单元，这可以触发Cas12a的反式切割活性以产生荧光信号的输出。通过长HCR支架上的多个重复单元和Cas12a的活性，一步级联放大目标细菌的信号，结合适配体磁分离技术，实现食品样品中沙门氏菌的高灵敏、高特异检测。
附图说明
图1为本发明适配体传感器检测沙门氏菌的原理图；
图2为具体实施例二中基于HCR的多价适配体构建的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为具体实施例二中基于HCR的多价适配体的原子力显微镜图；
图4为本发明基于HCR的多价适配体和单价适配体与沙门氏菌结合能力的比较图；
图5为本发明基于HCR的多价适配体和单价适配体与沙门氏菌结合的荧光显微镜图；
图6为本发明基于HCR的多价适配体激活CRISPR-Cas12a反式切割的柱状图(a)和激活CRISPR-Cas12a顺势切割的琼脂糖凝胶电泳图(b)；
图7为本发明PBS中不同浓度(1-107CFU/mL)的沙门氏菌的相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系；
图8为本发明牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度(1-107CFU/mL)沙门氏菌的相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系；(a)为牛奶，(b)为鸡蛋，(c)为鸡肉；
图9为具体实施例一种检测方法分别对105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌、105CFU/mL金黄色葡萄球菌:105CFU/mL单增李斯特菌:105CFU/mL大肠杆菌:105CFU/mL沙门氏菌＝1:1:1:1进行检测的相对荧光强度。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
适配体磁珠的合成
适配体磁珠是将纳米磁珠与适配体通过生物素-链酶亲和素相互作用连接在一起，具体步骤如下：将100μL 1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠溶液和100μL 1μM生物素化适配体1(biotin-poly-Apt)溶液混合，于室温反应45分钟。随后加入200μL 4μM D-生物素，于室温反应30分钟以对纳米磁珠进行封闭。用磷酸盐缓冲液(含0.01％吐温-20)磁分离洗涤两次，复溶于100μL磷酸盐缓冲液中，得到适配体磁珠溶液，于4℃保存备用。其中生物素化适配体1(biotin-poly-Apt)的核苷酸序列如下：biotin-TTT TTT TTT TTT TTT CTC CTC TGACTG TAA CCA CGG TGG TTT GAT CAC TAT TGG GCC TTT GTG ATG TCG GTA GT。
具体实施例二
基于HCR的多价适配体的合成
基于HCR的多价适配体是通过碱基互补配对将适配体连接到杂交链式反应(HCR)得到的长双链DNA上，具体步骤如下：首先将两个发夹DNA(H1、H2)与适配体2分别于95℃加热10分钟，然后立即插到冰上冷却10分钟，得到退火后的发夹DNA和适配体。随后，将2.5μL10μM的两个发夹DNA(H1、H2)与2.5μL 0.2μM的触发链混合，并加入17.5μL的磷酸盐缓冲液，于37℃孵育过夜，得到HCR骨架。最后，在HCR骨架溶液中加入1.5μL 25μM适配体溶液，并用磷酸盐缓冲液定容至50μL，于37℃反应2小时，得到基于HCR的多价适配体。其中触发链DNA的核苷酸序列如下：GTA TGT TGT TGC GGA ATG GTC TAG GTG ATT GAG TGG；发夹DNA H1的核苷酸序列如下：TTT CCC TTA TAT TCT CTC TCT CTC CTG CGG GTT TGA CTA GGT GATTGA GTG GTG TGT TAT CCC ACT CAA TCA CCT AGA CCA TTC CGC AAC AAC ATA C(划线部分为与适配体互补部分)；发夹DNA H2的核苷酸序列如下：GAT AAC ACA CCA CTC AAT CACCTA GTC AAA CCC GCA GTA TGT TGT TGC GGA ATG GTC TAG GTG ATT GAG TGG；适配体2的核苷酸序列如下：GAG AGA GAA TAT AAG GGA AAA AAA ACT CCT CTG ACT GTA ACC ACGGTG GTT TGA TCA CTA TTG GGC CTT TGT GAT GTC GGT AGT(划线部分为与H1互补部分)。
为验证本发明具体实施例二中基于HCR的多价适配体的合成，将发夹DNA H1(退火后的发夹DNA H1)、发夹DNA H2(退火后的发夹DNA H2)、触发链(触发链原液)、发夹DNA H1+发夹DNA H2(0.5μL 10μM退火后的发夹DNA H1、H2混合，并加入4μL PBS，于37℃反应过夜)、HCR骨架(上述方法制备的HCR骨架)、基于HCR的多价适配体(上述方法制备的基于HCR的多价适配体)、适配体2(退火后的适配体2)依次加入到1％琼脂糖凝胶电泳上进行分离(4SGelRed核酸染料预染色，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压30分钟)并通过凝胶成像仪成像分析。结果如图2所示，泳道1-3以及泳道7分别为发夹DNA H1、发夹DNA H2、触发链、适配体2，在不同分子量作用下呈现出不同的条带。在缺乏触发链的情况下，两个发夹DNA能在溶液中保持稳定(泳道4)，随着触发链的添加，HCR产物(泳道5)的分子量明显增大，且随着适配体的加入(泳道6)，分子量得到进一步地增加，表明基于HCR的多价适配体的成功合成。
为进一步证明具体实施例二中基于HCR的多价适配体的构建，在适配体上修饰生物素，合成基于HCR的多价适配体后，添加三倍浓度的链酶亲和素，使其通过与适配体上生物素的结合附着在基于HCR的多价适配体上，随后置于原子力显微镜下观察。结果如图3所示，在线性HCR骨架上有着许多的亮点，即链酶亲和素，这表明基于HCR的多价适配体的构建完成。
具体实施例三
基于HCR的多价适配体和单价适配体与沙门氏菌结合能力的比较通过ELISA比较基于HCR的多价适配体和单价适配体与沙门氏菌的结合能力，具体步骤如下：首先将50μL105CFU/mL的沙门氏菌菌液添加至高吸附酶标板，于37℃孵育2小时，随后用磷酸盐缓冲液(含0.01％吐温-20)洗板三次，加入150μL 1wt％的牛血清白蛋白溶液，于37℃孵育30分钟以封闭酶标板上的多余结合位点。以同样的方式洗板三次后，加入50μL不同浓度(25、50、100、250、500、800nM)的基于HCR的多价适配体(用5’端修饰有生物素的适配体按具体实施例二构建基于HCR的多价适配体)和单价适配体(退火后的5’端修饰有生物素的适配体)，于37℃孵育45分钟。经三次洗板后，加入50μL链酶亲和素化辣根过氧化物酶，室温孵育25分钟。最后经三次洗板后加入50μL TMB显色液，并在避光显色15分钟后用50μL 2M H2SO4终止反应，用酶标仪测450nm处的吸光度。如图4所示，在低浓度下，单价适配体的信号很低，随着浓度的增加信号才逐渐增强，而基于HCR的多价适配体即使在低浓度下也有很强的信号，这表明基于HCR的多价适配体具有优越的结合靶标性能。
另外，通过荧光显微镜可视化比较基于HCR的多价适配体和单价适配体跟沙门氏菌的结合能力强弱。适配体的5’端修饰上荧光基团(FAM)并按照具体实施例二构建基于HCR的多价适配体。将2.5μL 1μM的单价适配体或基于HCR的多价适配体与100μL109CFU/mL沙门氏菌菌液混合并于37℃孵育2小时，随后经6000rmp离心5分钟，用磷酸盐缓冲液洗2次去除上清液，并将得到的混合物复溶于1mL磷酸盐缓冲液中置于荧光显微镜下观察。结果如图5所示，从光镜和荧光图的叠加图(merge)中可以看出，经单价适配体和多价适配体处理过的沙门氏菌上均出现荧光，且多价适配体处理过的菌上有更明显的荧光信号，这表明适配体能与靶标菌结合，且与单价适配体相比，多价适配体对沙门氏菌有更强的结合能力。
具体实施例四
基于HCR的多价适配体激发CRISPR-Cas12a活性
将5μL 1μM具体实施例二构建的基于HCR的多价适配体与CRISPR-Cas12a体系混合，CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL。将反应体系于37℃反应1小时，随后将反应液于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定相对荧光强度，以验证基于HCR的多价适配体对CRISPR-Cas12a反式切割活性的激发。最后，将基于HCR的多价适配体、反应溶液(基于HCR的多价适配体与CRISPR-Cas12a体系混合)、对照溶液(基于HCR的多价适配体与未加crRNA的CRISPR-Ca12a体系混合)加入到1％琼脂糖凝胶电泳上进行分离(4S GelRed核酸染料预染色，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压30分钟)并通过凝胶成像仪成像分析。其中单链DNA荧光报告探针核苷酸序列如下：FAM-TTA TT-BHQ。
从图6(a)中可以看到基于HCR的多价适配体与CRISPR-Cas12a体系混合后，荧光强度得到了很大程度地提高，这表明基于HCR的多价适配体成功激活了CRISPR-Cas12a的反式切割活性，非特异性的切割溶液中的单链DNA荧光报告探针。
从图6(b)中可以看到反应溶液中未出现多价适配体条带，这表明基于HCR的多价适配体成功激活了CRISPR-Cas12a的顺势切割活性，对HCR骨架进行了切割。
具体实施例五
适配体传感器检测沙门氏菌
将具体实施例一中制备得到的适配体磁珠与200μL不同浓度沙门氏菌菌液进行混合，于室温反应45分钟并经三次洗涤后，加入20μL 0.5μM具体实施例二中制备得到的基于HCR的多价适配体，于室温反应45分钟并经三次洗涤后，复溶于5μL PBS得到“磁珠-沙门氏菌-HCR”的三明治结构，将该三明治结构加入CRISPR-Cas12a体系，CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL。将反应体系于37℃反应1小时，随后将反应液于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定相对荧光强度，检测原理如图1所示。
根据检测不同浓度沙门氏菌菌液对应的相对荧光强度值得到的曲线，对待测溶液中的沙门氏菌浓度进行定量分析；当加入的沙门氏菌浓度越高，其特异性结合的多价适配体越多，越容易激活CRISPR-Cas12a活性，引起对周围单链DNA荧光报告探针的切割。
如图7所示，检测PBS中不同浓度沙门氏菌(1-107CFU/mL)的相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系，标准曲线方程为y＝0.446×106x+0.0719×106，相关系数R2＝0.993，检测限为2CFU/mL，可用于未知浓度的沙门氏菌检测。
具体实施例六
为验证本发明具体实施例五中的检测方法在实际样品检测中的应用，分别在牛奶、鸡蛋、鸡肉的处理样品中加入沙门氏菌标准溶液作为实际样品，对并三种样品中不同浓度的沙门氏菌进行检测，结果如图8所示，牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度(1-107CFU/mL)沙门氏菌的相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系，标准曲线方程分别为y＝0.409×106x+0.0648×106(R2＝0.998)、y＝0.380×106x+0.0813×106(R2＝0.997)、y＝0.345×106x+0.0901×106(R2＝0.995)检测限均为2CFU/mL。
具体实施例七
为验证本发明具体实施例五检测方法的检测特异性，分别对105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌、105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌＝1:1:1:1进行检测。结果如图9所示，在沙门氏菌存在时，检测的相对荧光强度远远大于其它食源性致病菌的荧光值，表明该检测方法对沙门氏菌具有特异性。
具体实施例八
为验证本发明具体实施例五检测方法的准确度以及稳定性，对牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度的沙门氏菌进行检测，并进行回收率计算，结果如表1所示，
表1为对牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度沙门氏菌的回收率
由表1可知，牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度(5×102-5×104CFU/mL)沙门氏菌的平均回收率分别为95.81％、95.53％、99.26％，表明该检测方法可应用于食品样品中的沙门氏菌检测。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于包括以下步骤：
(1)适配体磁珠的合成
将100μL 1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠溶液和100μL 1μM生物素化适配体1溶液混合，于室温反应45分钟后，加入200μL 4μM D-生物素，于室温反应30分钟以对纳米磁珠进行封闭，用含0.01wt％吐温-20的磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，复溶于100μL磷酸盐缓冲液中，得到适配体磁珠溶液，于4℃保存备用；
(2)基于HCR的多价适配体的合成
将发夹DNA1、发夹DNA2和适配体2分别经退火前处理后，将发夹DNAH1、发夹DNAH2和触发链DNA混合反应，得到HCR骨架溶液，然后在HCR骨架溶液中加入经退火处理的适配体2，得到基于HCR的多价适配体溶液；
(3)沙门氏菌的检测
将步骤(1)中制备得到的适配体磁珠溶液与200μL不同浓度沙门氏菌菌液进行混合，于室温反应45分钟并经三次洗涤后，加入20μL 0.5μM步骤(2)中制备得到的基于HCR的多价适配体，于室温反应45分钟并经三次洗涤后，复溶于5μL PBS溶液得到磁珠-沙门氏菌-HCR的三明治结构，再加入CRISPR-Cas12a体系，最后将反应体系于37℃反应1小时后，于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定相对荧光强度，根据检测不同浓度沙门氏菌对应的吸光度值得到的曲线，对待测溶液中沙门氏菌浓度进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(1)所述的生物素化适配体1的核苷酸序列如下：biotin-TTT TTT TTT TTT TTT CTC CTC TGA CTG TAA CCA CGG TGG TTTGAT CAC TAT TGG GCC TTT GTG ATG TCG GTA GT。
3.根据权利要求1所述的基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(2)具体为：将发夹DNAH1、发夹DNAH2和适配体2分别于95℃加热10分钟，然后立即插到冰上冷却10分钟，得到退火后的发夹DNA和适配体2；再将2.5μL 10μM的发夹DNAH1、2.5μL10μM的发夹DNAH2和2.5μL 0.2μM的触发链DNA混合，并加入17.5μL的磷酸盐缓冲液，于37℃孵育过夜，得到HCR骨架；然后在HCR骨架溶液中加入1.5μL 25μM适配体2溶液，并用磷酸盐缓冲液定容至50μL，于37℃反应2小时，得到基于HCR的多价适配体。
4.根据权利要求3所述的基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于所述的触发链DNA的核苷酸序列如下：GTA TGT TGT TGC GGA ATG GTC TAG GTG ATT GAG TGG；所述的发夹DNAH1的核苷酸序列如下：TTTCCCTTA TATTCTCTC TCT CTC CTG CGG GTT TGA CTA GGT GAT TGA GTG GTGTGT TAT CCC ACT CAA TCA CCT AGA CCA TTC CGC AAC AAC ATA C；所述的发夹DNA H2的核苷酸序列如下：GAT AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTC AAA CCC GCA GTA TGT TGTTGC GGA ATG GTC TAG GTG ATT GAG TGG；所述的适配体2的核苷酸序列如下：GAGAGA GAA TATAAGGGA AAA AAA ACT CCT CTG ACT GTA ACC ACG GTG GTT TGA TCA CTA TTG GGC CTTTGT GAT GTC GGT AGT。
5.根据权利要求1所述的基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(3)中所述的CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10URNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL。
6.根据权利要求5所述的基于HCR介导的多价适配体和CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于所述的单链DNA荧光报告探针核苷酸序列如下：FAM-TTA TT-BHQ；所述的crRNA的核苷酸序列如下：GAA UUU CUA CUG UUG UAGAAC UAG GUG AUU GAG UGG UGU GUU。
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Legal Events
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