KR101605846B1 - 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머 및 이를 이용한 클렙시엘라 뉴모니아 검출 방법 - Google Patents

클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머 및 이를 이용한 클렙시엘라 뉴모니아 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머 및 이를 이용한 클렙시엘라 뉴모니아의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 앱타머 및 이를 이용한 방법, 조성물, 키트 또는 센서는 수질, 식품, 의료 샘플에 존재하는 클렙시엘라 뉴모니아를 특이적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라 식품 위생이나 의료 진단 등의 분야에도 활용될 수 있다.

Description

클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머 및 이를 이용한 클렙시엘라 뉴모니아 검출 방법{Single-stranded nucleic acid aptamers specifically binding to Klebsiella pneumoniae and method for detecting K. pneumoniae using the same}
본 발명은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머 및 이를 이용한 클렙시엘라 뉴모니아의 검출 방법에 관한 것이다.
클렙시엘라 뉴모니아는 다항생제 내성균으로 알려져 있으며, 사람을 감염시켜 폐렴을 유발한다. 클렙시엘라 뉴모니아는 분원성 대장균군 (Fecal Coliforms)에 속하는 것으로 분류되고, 다양한 환경에서 발견되며, 특히 분변에 의한 유출로 수계 환경에서 자주 발견되는 것으로 보고되고 있다. 따라서 수계환경에 대한 클렙시엘라 뉴모니아의 주기적인 측정과 관리가 필요하다. 분원성 대장균군의 공인된 시험법인 막 여과법 및 최적확수법은 젖당 분해능에 근거하여 대장균군의 존재 유무를 정량하고 있다. 그러나 이 시험법은 결과를 산출하기까지 소요 시간이 4일 이상이 걸리며, 통계표에 근거한 결과 산출로 인해 오차가 크고 신뢰성이 높지 않다. 현재 클렙시엘라 뉴모니아의 신속한 검출 방법은 존재하지 않으며, 신속한 진단에 대한 기술적 어려움 때문에 클렙시엘라 뉴모니아 오염에 대한 빠른 대처가 어려워, 결과적으로 분석은 사후 관리적인 측면에서 이루어지고 있는 실정이다. 따라서 수계 또는 다양한 환경에서 클렙시엘라 뉴모니아의 존재를 모니터링 할 수 있는 센서 시스템이 요구되며, 이러한 센서 시스템 개발을 위해, 클렙시엘라 뉴모니아에 고선택적으로 인지하는 리셉터가 반드시 필요하다.
한편 앱타머는 중금속 이온, 유기화합물, 단백질, 박테리아, 암세포 등과 같은 다양한 표적물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 핵산 또는 펩타이드 분자를 지칭한다. 앱타머는 항체에 비해 안정하고, 비교적 용이하게 표적물질에 특이적인 리셉터를 얻을 수 있다는 장점이 있어 다양한 표적물질에 대한 앱타머 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 앱타머는 말단에 다양한 화학적 작용기를 부여할 수 있고, 시험관 조건에서 표적물질과 결합하는 특정 염기서열을 반복적으로 흡착 탈착시켜 표적물질에 대한 특이성과 친화도를 극대화시킬 수 있다. 또한 앱타머의 염기서열이 확보되면 화학적 합성이 용이하기 때문에 고순도로 저비용 대량 생산이 가능하다. 뿐만 아니라 앱타머는 선별과정 중 표적물질과 유사한 물질을 이용하여 역선별법을 통해 비특이성을 줄이는 과정을 통해 표적물질에 대한 특이성을 쉽게 증가시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머 및 이를 이용한 클렙시엘라 뉴모니아 검출 방법을 제공하고자 한다.
미국등록특허공보 제5270163호 (1993.12.14 등록)
A tenascin-C aptamer identified by tumor cell SELEX: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment Proc Nat1 Acad Sci (2003) 100, 15416-15421
일 양상은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머를 제공하는 것이다.
다른 양상은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아 검출용 조성물, 클렙시엘라 뉴모니아 검출 센서, 및 검출용 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머를 이용하여 시료에서 클렙시엘라 뉴모니아를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머를 제공한다. 용어 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정한 삼차구조를 갖고 있고, 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 분자를 의미한다. 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 본 발명의 앱타머가 클렙시엘라 뉴모니아 이외의 다른 미생물에는 실질적으로 결합하지 않음을 의미한다. 용어 "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미하는 것으로, "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 상기 핵산은 DNA 및/또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid) 분자를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 분자의 기본 구성 단위로서, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하며, 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 따라서 상기 "단일가닥 핵산"은 상기 뉴클레오티드 중합체가 단일 가닥으로 존재하는 형태의 핵산을 의미한다.
상기 앱타머는 클렙시엘라 뉴모니아의 표면에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 용어 "클렙시엘라 뉴모니아의 표면"은 클렙시엘라 뉴모니아의 세포의 표면에 존재하는 단백질, 지질, 또는 기타 세포 표면의 특정 구조를 의미한다. 본 발명의 앱타머는 세포의 파쇄과정이 필요 없이 클렙시엘라 뉴모니아의 세포 표면과 선택적으로 직접 결합할 수 있어, 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 및 농도를 더욱 신속하고 정확한 검출을 가능하게 한다.
상기 앱타머는 서열번호 1 내지 25의 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 25의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 서열번호 1 내지 25의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 뉴클레오티드가 치환, 삽입, 결실, 부가 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있다. 예를 들면, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표지는 앱타머의 특정 염기, 특정 구조 예를 들면, 헤어핀-루프(hairpin-loop) 구조의 특정 부위 또는 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다.
상기 광학적 표지는 예를 들면, 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 플로레세인(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 형광물질은 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다.
또한, 상기 광학적 표지는 효소일 수 있다. 상기 효소는 효소결합면역흡착검사(ELISA)에 사용되는 효소일 수 있다. 효소결합면역흡착검사(ELISA)에 사용되는 효소는 알카라인 포스파타제, 홀스레디쉬 페록시다제, 루시퍼라제, 또는 글루코즈 옥시다제 일수 있다. 상기 광학적 표지로 효소를 사용할 경우, 화학 발광 반응을 유도하기 위하여 바람직하게는 화학발광물질로서 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 루시퍼린(luciferin), 루시게닌(lucigenin), 3-(2'-Spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl) phenyl phosphate (CSPD) 등이 사용될 수 있으며, 또한 이외에도 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 상기 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭 (quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다.
상기 전기화학적 표지는 당업계에 알려진 전기화학적 표지를 포함한다. 예를 들면, 상기 전기화학적 표지는 메틸렌 블루일 수 있다.
다른 양상은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 앱타머는 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 특히 클렙시엘라 뉴모니아 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 25 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴크레오티드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 핵산은 DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합일 수 있으며, 예를 들면 DNA일 수 있다. 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 조성물은 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체 형성에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 특이적 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체 형성 촉진 또는 비특이적 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체 형성 억제에 요구되는 요소, 예를 들면, salmon sperm DNA, BSA, Tween-20, 및/또는 PEG를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아 검출 센서를 제공한다.
상기 센서에 있어서, 상기 앱타머는 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 특히 클렙시엘라 뉴모니아 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 25 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 2의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 앱타머의 핵산은 DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합일 수 있으며, 예를 들면 DNA일 수 있다. 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 전기화학적 표지 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지를 포함하는 센서는 예를 들면, FRET 효과, 효소 반응을 이용하는 것일 수 있다. 상기 전기화학적 표지를 포함하는 센서는 예를 들면, 표적 물질과 결합한 앱타머의 구조 변화로 인해 표지 물질이 전극으로부터 멀어지거나, 가까워지거나 또는 앱타머로부터 분리되어 전기화학적 신호가 변화되는 원리에 의한 것일 수 있다.
상기 센서는, 둘 이상의 상기 앱타머가 고정화되어 있는 기판을 포함하는 것, 예를 들면 어레이 형태일 수 있다. 어레이는 복수 개의 특정 분자가 기판 상의 일정 부분에 고정화되어 있는 것을 말한다. 상기 어레이는 기판 및 상기 기판에 형성된, 클렙시엘라 뉴모니아와 결합할 수 있는 앱타머를 포함하는 고정화 영역을 포함할 수 있다. 상기 앱타머는 상기 고정화 영역 내에 공유적으로 부착된 것일 수 있다. 상기 앱타머는 공유적으로 부착시킬 수 있는 관능기를 갖는 복수의 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 관능기는 상기 앱타머를 부착할 수 있도록 하는 것이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 예를 들면, 알데히드, 에폭시 또는 아민기가 될 수 있으며, 상기 화합물은 말단에 알데히드, 에폭시 또는 아민기를 갖는 실록산이 될 수 있다. 상기 기판의 재질은 예를 들면, 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌과 같은 물질이 사용될 수 있다.
다른 양상은 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트에 있어서, 상기 앱타머는 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 특히 클렙시엘라 뉴모니아 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 25 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 앱타머의 핵산은 DNA, RNA, PNA 또는 이들의 조합일 수 있으며, 예를 들면 DNA일 수 있다. 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 전기화학적 표지 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 키트는 상기 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 앱타머가 기판상에 고정화된 어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 칩이나 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 칩 또는 기판을 스트렙트아비딘으로 개질하고, 앱타머의 말단을 비오티닐화(biotinylation)시킨 후, 앱타머의 비오틴과 지지체의 스트렙트아비딘과의 결합을 이용하여 고정화할 수 있다. 상기 어레이는 기판 및 상기 기판에 형성된, 클렙시엘라 뉴모니아와 결합할 수 있는 앱타머를 포함하는 고정화 영역을 포함할 수 있다. 상기 앱타머는 상기 고정화 영역 내에 공유적으로 부착된 것일 수 있다. 상기 앱타머는 공유적으로 부착시킬 수 있는 관능기를 갖는 복수의 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 관능기는 상기 앱타머를 부착할 수 있도록 하는 것이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 예를 들면, 알데히드, 에폭시 또는 아민기가 될 수 있으며, 상기 화합물은 말단에 알데히드, 에폭시 또는 아민기를 갖는 실록산이 될 수 있다. 상기 기판의 재질은 예를 들면, 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌과 같은 물질이 사용될 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 앱타머로 시료 중 클렙시엘라 뉴모니아를 확인하는 방법이 기재되어 있는 설명서를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 시료와 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 접촉시키는 단계, 상기 접촉 단계에서 형성된 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머의 복합체로부터 신호를 측정하는 단계, 및 상기 시료 중 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 또는 농도를 확인하는 단계를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아 검출 방법을 제공한다.
상기 클렙시엘라 뉴모니아를 검출하는 방법은 다음과 같다. 먼저, 시료와 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 시료와 상기 앱타머 간의 접촉은 반응 용액 중에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 앱타머가 클렙시엘라 뉴모니아와 잘 결합할 수 있는 염의 조성과 비특이적 결합을 방지하는 요소가 포함된 반응 용액 중에서 수행될 수 있다. 상기 비특이적 결합을 방지하는 요소는 예를 들면, salmon sperm DNA, BSA 및/또는 Tween-20, PEG 을 포함할 수 있다. 반응 온도는 예를 들면, 15 내지 25℃, 20 내지 30℃, 또는 20 내지 25℃일 수 있다. 반응 시간은 예를 들면, 20 내지 60분, 30 내지 50분, 또는 40 내지 50분일 수 있다. 상기 앱타머는 예를 들면, 클렙시엘라 뉴모니아 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 서열번호 1 내지 25 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 예를 들면, 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합일 수 있다.
다음으로 상기 접촉 단계에서 형성된 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머의 복합체로부터 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체로부터의 신호는 광학적 표지 (형광, 효소), 전기화학적 표지 또는 이들의 조합에 의해 발생되는 것일 수 있다. 상기 광학적 표지 (형광)는, 예를 들면, 도너-수용자 FRET 쌍일 수 있다. 상기 광학적 표지 (효소)는 홀스레디쉬 페록시다제 일 수 있다. 상기 전기화학적 표지는, 예를 들면, 메틸렌 블루일 수 있다.
또한 시료 중 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 또는 농도를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 시료 중 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 또는 농도 확인은 대조군과 비교하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 대조군은 클렙시엘라 뉴모니아와 결합하지 않은 상태의 앱타머일 수 있다. 예를 들면, 앱타머에 부착되는 표지가 도너-수용자 FRET 쌍인 경우, 대조군은 형광 도너 발색소의 형광 신호가 수용자 발색소에 의해 억제되어 있는 앱타머일 수 있다. 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체가 형성되면 FRET 효율이 감소됨으로써 형광 신호가 변화하고, 상기 신호 변화로부터 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다. 예를 들면, 앱타머에 부착되는 표지가 효소인 경우, 대조군은 클렙시엘라 뉴모니아를 인지하지 못하는 앱타머에 부착되어 있는 효소가 될 수 있다. 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체가 형성되면 효소의 기질 변화 반응에 의해 색깔 신호가 변화하고, 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체가 형성되지 못할 경우 색깔 신호가 변화되지 않음을 확인하여 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다. 예를 들면, 앱타머에 부착되는 표지가 전기화학적 표지인 경우, 대조군은 전극에 고정된, 상기 표지된 앱타머일 수 있다. 클렙시엘라 뉴모니아와 결합한 앱타머의 구조 변화로 인해 전기화학적 표지가 전극으로부터 멀어지거나, 가까워지거나 또는 앱타머로부터 분리됨으로써 전기화학적 신호가 변화하고, 상기 신호 변화로부터 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 또는 농도를 확인할 수 있다.
상기 방법은, 상기 시료와 앱타머를 포함하는 반응물로부터 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리 단계는 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체가 형성된 후, 상기 복합체로부터 신호를 측정하기 전에 수행되는 것일 수 있다. 상기 분리는 예를 들면, 막 여과법 또는 원심분리법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분리는 상기 앱타머가 기판에 고정된 경우 이를 세척하는 것일 수 있다. 상기 앱타머에 부착되어 있는 광학적 표지는, 상기한 바와 같은 형광물질일 수 있다. 예를 들면, 상기 형광물질은 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다. 상기 분리된 대장균-앱타머 복합체로부터 발생되는 신호는 예를 들면, 형광측정법 또는 방사성 동위원소 검출법에 의해 측정될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 앱타머를 이용함으로써, 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 및 농도를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 클렙시엘라 뉴모니아에 선택적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 선별하기 위한 Bacteria Cell-SELEX 방법 모식도이다.
도 2는 각각의 선별과정 (Selection round)에서 사용된 ssDNA 라이브러리 중 클렙시엘라 뉴모니아에 결합하는 ssDNA의 퍼센트 그래프이다.
도 3은 mfold 프로그램을 이용하여 예측한 클렙시엘라 뉴모니아에 선택적으로 결합하는 DNA 앱타머 1종(K2)에 대한 2차 구조 모식도이다.
도 4는 클렙시엘라 뉴모니아에 선택적으로 결합하는 DNA 앱타머 1종에 대한 4 종류의 클렙시엘라 뉴모니아와의 결합력 분석 결과 그래프이다.
도 5는 클렙시엘라 뉴모니아에 선택적으로 결합하는 DNA 앱타머 1종에 대한 특이성 분석 결과 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1 : 클렙시엘라 뉴모니아에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제조
1.1 클렙시엘라 뉴모니아 배양
분변 유래 클렙시엘라 뉴모니아종(KCTC2208)을 배양액(nutrient broth) (beef extract 37%, pepton 63%, 8g broth/L D.W, pH 6.8)에 접종한 후 37℃에서 세균의 농도가 108 CFU(colony forming unit)/ml에 도달할 때까지 배양하였다. 이후 PBS 버퍼로 3회 씻어서 배양액을 제거한 다음, 바인딩 버퍼(1x PBS, 0.1mg/ml salmon sperm DNA, 1% BSA, 0.05% tween-20)에 현탁하였다.
1.2 ssDNA 라이브러리 합성
클렙시엘라 뉴모니아의 선택적 앱타머 스크리닝을 위해 하기와 같은 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성된 ssDNA 라이브러리를 합성하였다. 합성한 ssDNA 라이브러리는 총 88-mer 길이의 랜덤 ssDNA 라이브러리로서, 양 말단은 프라이머쌍이 어닐링되는 고정된 염기서열 영역(밑줄 친 부분)으로 구성되며, 중앙에는 무작위로 배열된 염기서열 영역(N45)을 가진다. 여기서 N45는 일반적으로 45개의 임의의 A, G, T, C 염기로 이루어지는 것을 의미한다. 그러나 반드시 45개에만 제한되는 것은 아니며, SELEX 공정의 반복적인 PCR 및 클로닝 과정에 의해 45개에서 임의의 수의 염기가 추가 또는 생략될 수 있으며, 이 경우, 최종적으로 합성한 ssDNA 라이브러리의 88-mer의 길이 역시 변경될 수 있다.
5'-GCAATGGTACGGTACTTCC-N45-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3' (서열번호 26)
최종적으로 1015개의 서로 다른 염기서열을 가지는 랜덤 ssDNA 라이브러리를 합성하였다.
1.3 Whole - Cell SELEX Process
1) ssDNA 선별(selection) 및 분리
합성한 ssDNA 라이브러리를 바인딩 버퍼(1x PBS, 0.1mg/ml salmon sperm DNA, 1% BSA, 0.05% tween-20)에 녹여 95 ℃에서 5분 동안 가열한 다음, 곧바로 4 ℃에서 10분 동안 처리하였다. 이후 상온에서 1시간 동안 1 mL의 클렙시엘라 뉴모니아 현탁액(107 cells)과 섞어 잘 혼합하였다. 원심분리기(13,000rpm, 10분)를 이용하여 클렙시엘라 뉴모니아/ssDNA 복합체를 클렙시엘라 뉴모니아에 결합하지 않은 ssDNA로부터 분리하였으며, 분리된 클렙시엘라 뉴모니아/ssDNA 복합체를 PBS에 현탁하였다. 상기 분리와 현탁 과정을 3회 반복하였다. 최종적으로 클렙시엘라 뉴모니아/ssDNA를 멸균된 증류수 중에 재현탁하였다.
클렙시엘라 뉴모니아 표면에 결합되어 있는 ssDNA를 클렙시엘라 뉴모니아로부터 분리하기 위해 클렙시엘라 뉴모니아/ssDNA 복합체를 95 ℃에서 10분 동안 가열한 후 즉각 냉각하여 4 ℃에서 10분 동안 놓아두었다. 떨어진 ssDNA는 원심분리기(13,000rpm , 10분)를 이용하여 회수하였다.
위 과정을 통해 선별된 ssDNA는 PCR 반응을 통해 양을 증폭하였다. PCR을 위한 두 개의 프라이머는 하기와 같다. forward 프라이머의 5' 말단을 플루오레세인(fluorescein)으로 표지하였고, reverse 프라이머의 5' 말단은 바이오틴(biotin)으로 표지하였다. 이는 이후에 PCR 산물이 이중나선 구조의 dsDNA이므로 이를 단일가닥의 DNA로 분리하기 위한 것이다.
forward: 5‘-fluorescein-GCAATGGTACGGTACTTCC-3' (서열번호 27)
reverse: 5'-biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3' (서열번호 28)
약 100 ng의 ssDNA 10 ul, 및 10 uM의 프라이머를 각각 1.25 ul, PCR master mix 12.5 ul를 혼합하여 총 25 ul의 양으로, 95℃ (30초), 56.3℃ (30초), 72℃ (10초) 하에서 PCR을 수행하였으며 반복 횟수는 10번으로 하였다. PCR 수행 여부를 확인하기 위해 PCR 산물은 2%의 아가로즈 젤 (agarose gel)에서 전기영동을 통해 분석하였다. 최종적으로 PCR 산물 정제 키트 (MinElute PCR Purification kit, QIAGEN)를 이용하여 PCR 산물을 정제하였다.
이후 아비딘(Streptavidin)이 표면에 고정화되어있는 자성비드(Dynabeads MyOne™ Streptavidin, Invitrogen)를 이용하여 PCR 산물의 이중나선 구조의 dsDNA중 필요로 하는 하나의 단일사슬 부분만을 분리하였다. 100 ul의 PCR 산물을 50 uL의 아비딘이 코팅된 자성비드와 혼합하여 상온에서 10분 동안 반응시키고 자석을 이용하여 1ml의 PBS 버퍼로 씻었다. 여기에 500 ul의 가성소다 (NaOH) 200 mM을 넣어준 후 5분 동안 반응시키고, 자석을 이용하여 떨어져 나온 ssDNA를 회수하였다. 회수한 ssDNA는 PCR 정제키트를 이용하여 정제/농축한 후 농도를 분석하였다. 정제/농축된 ssDNA는 다음 라운드의 선별과정에 사용하였으며, 총 10번의 선별 과정을 거쳤다. 최종적으로 클렙시엘라 뉴모니아와 혼합한 ssDNA 중 92.3 % 의 ssDNA가 클렙시엘라 뉴모니아와 결합하는 결과를 얻었다.
3) 역선별(counter selection)
SELEX 과정 중 선별된 ssDNA들의 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 선택성을 높이기 위해 표적 클렙시엘라 뉴모니아와 같이 하수 등과 같은 수계에서 많이 발견되고 있는 대장균(Eschericia coli), 시트로박터(Citrobacter freundii), 엔테로박터(Enterobacter aerogenes), 바실러스(Bacillus subtilis), 포도상구균(Staphylococcus epidermidis)의 5 종의 박테리아들을 이용하여 5, 6, 9번째 선별과정 다음에 총 3회에 걸쳐 역선별(counter selection)을 수행하였다. 실험 방법과 조건은 선별(selection) 과정과 동일하나, 역선별(counter selection) 과정에서는 이들 박테리아들에 결합하는 ssDNA는 버리고 이들과 결합하지 않는 ssDNA들을 회수하여 증폭한 후 다음 단계의 선택 과정에 사용하였다.
1.4 ssDNA 의 클로닝
최종적으로 얻어진 ssDNA들은 프라이머 쌍을 이용하여 PCR한 후 클로닝 키트(TOPO TA cloning kit)를 이용하여 클로닝하였다. 각각의 콜로니에서 플라스미드를 추출하여 염기서열분석을 수행하였으며 총 25개의 서로 다른 염기서열 정보를 획득하였다. 하기 표 1은 SELEX 방법에 의해 선별된 총 25종의 ssDNA 염기서열 (sequence)이다.
명칭 랜덤 부위의 염기서열
K1 5'-GAGTCGGTGGTGTTCCCAGATGGAAGCCGCAGTAATAGTGCAGCT- 3' (서열번호 1)
K2 5'-AATCAGGCTCAGCATGGAGTTGCGAGGCCAATATCCGGTTAAGCG- 3' (서열번호 2)
K3 5'-TGTCCTTCAGACCCCTGATTTGATTAATATTCTTAAAGTCTTCAG- 3' (서열번호 3)
K4 5'-CTTTATAACACTGTTACTATCGCCTGTTAGAGGTAATGAGTTCTT- 3' (서열번호 4)
K5 5'-ATACCGCATGGATGAGGTGTTGTACTTGGGTGCTGGGGGGGTCTG- 3' (서열번호 5)
K6 5'-TTTTACAGCTAAACCGGTGTAATGTCCTTGTTCTTCATACATACA- 3' (서열번호 6)
K8 5'-TCTTTTAGGGAGTCCCTATTAAGTATTGTAACCTTAGGACTGAAT- 3' (서열번호 7)
K9 5'-CTTAACTAGTTGCATGGGTCCTGCTCGAGGGATCGTGGGTGATGG- 3' (서열번호 8)
K10 5'-ATGACTCATTGGTGCTTCGCATTTTACTGCATCTCCTAATATTGG- 3' (서열번호 9)
K11 5'-TCTTTTAGGGAGTCCCTATTAAGTATTGTAACCTTAGGACTGAAT- 3' (서열번호 10)
K13 5'-GGGTGCGCGGGTTAATAGATTTTATAAAAAGTTGTGCCTGTCGTT- 3' (서열번호 11)
K14 5'-CGGCAGTTGGTTTTTTCTGTTCTGCATAGGATGCTCTTAGTCGGC- 3' (서열번호 12)
K17 5'-AGTCTTATGGAGCGGTCGACAACGTCACCGCCCCTGTGGTGAGGT- 3' (서열번호 13)
K18 5'-ATGGCACCCTTGCAAGCGAACCTGGGTTTTTAGTCGTTAGCATTG- 3' (서열번호 14)
K19 5'-TCATAGAGTGTAACTAACTAGTCGTTGATGCGGTTGGCTTTAGC- 3' (서열번호 15)
K20 5'-GATATTGACTAAGAGGTGGTTGTCTCCTTTTGCTAAATCTCGCTC- 3' (서열번호 16)
K21 5'-ATGCACCAGGGATGTATATTGTCTGGCTGTCTTCTTTGGACGCGT- 3' (서열번호 17)
K22 5'-ATGTGCTGGAAGCGCCACAGGATTATTGGTGACGTGTTTGCGCTT- 3' (서열번호 18)
K23 5'-GTTGTGTCTATACTCAGCTTCTTGTTACTTTACTGGACATCTATC- 3' (서열번호 19)
K24 5'-GGGAGCTTATGTAGAAGCAAAGGTGCGATGCTGGGTGAGCGTTA- 3' (서열번호 20)
K25 5'-TTACGAGCGGGCGGGGTTTAGTGTTTCTGTGGGTTCTGTTTCATA- 3' (서열번호 21)
K26 5'-GCAACTGGATTACGTACCTTGCTTTGTGAACTTACTTGTCACCCA- 3' (서열번호 22)
K27 5'-CGACCACACTTCCCTGGAACTCTGAGTTGGCACTCTGCCGCAGCT- 3' (서열번호 23)
K28 5'-CGGCTTCATTTCTGTGTTGGTTGCGTTTGTGTGGGGATTTCTCAT- 3' (서열번호 24)
K29 5'-GTTGTGTCTATACTCAGCTTCTTGTTACTTTACTGGACATCTATC- 3' (서열번호 25)
실시예 2: 앱타머의 클렙시엘라에 대한 결합력 및 선택성 분석
염기서열이 분석된 25개의 ssDNA들 중 mfold 프로그램 (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold; Zuker, M. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 3406)을 이용한 2차 구조 분석을 통해 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 결합력이 높을 것으로 예측되는 1종의 ssDNA에 대해 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 결합력과 선택성을 분석하였다.
2.1 앱타머의 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 결합력 분석
먼저 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 결합력 분석을 위해 클렙시엘라 뉴모니아(KCTC2208)을 배양액(nutrient broth)에 접종한 후 37℃에서 농도가 108 CFU/ml에 도달할 때까지 배양하였다. 배양액을 제거하기 위해 클렙시엘라 뉴모니아 용액을 PBS 버퍼를 이용하여 3회 씻어준 후 바인딩 버퍼(1x PBS, 0.1mg/ml salmon sperm DNA, 1% BSA, 0.05% tween-20)에 현탁하였다. 클렙시엘라 뉴모니아 100 ul(107 cells)를 다양한 농도의 형광 표지된 ssDNA (0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 nM) 100 ul와 혼합한 후 상온에서 45분 동안 반응시켰다. 반응 후 클렙시엘라 뉴모니아 표면에 결합하지 않은 ssDNA들을 PBS 버퍼를 이용하여 2회에 걸쳐 씻어 제거한 후 형광분석기를 이용하여 클렙시엘라 뉴모니아/ssDNA 복합체의 형광 강도를 측정하였다.
각각의 ssDNA 농도 조건에서의 형광의 세기는 비선형 회귀법과 단일 부위 포화형 리간드 결합법으로 시크마플랏(SigmaPlot) 프로그램을 이용하여 그래프화(plotting) 되었고, 여기에 F=Bmax* C/(Kd + C) 식이 이용되었다 (F는 형광의 세기, Bmax는 최대 결합 위치, Kd는 해리상수, C 는 ssDNA의 농도). 결합력 분석결과 클렙시엘라 뉴모니아에 높은 친화도를 보이는 1 종의 ssDNA 시퀀스에 대한 친화도 분석 결과는 도4와 같다. 클렙시엘라 뉴모니아에 높은 친화도를 보이는 1종의 ssDNA (K2) 의 결합력(Kd: 해리상수)은 하기 표 2와 같다.
클렙시엘라 뉴모니아 KCTC2208 균주에 대한 ssDNA K2의 결합력
ssDNA 명칭 해리상수 (Kd)
K2 5.377 nM
또한 다른 3종류의 클렙시엘라 뉴모니아 (KCTC1726, KCTC2619, KCTC2690)에 대한 1종의 ssDNA (K2) 의 결합력 분석을 수행하였다. 실험은 각각의 클렙시엘라 뉴모니아 100 ul(107 cells)와 500 nM의 ssDNA 100 ul를 상온에서 45분 동안 반응시킨 후 PBS 버퍼를 이용해 씻어주었으며, 클렙시엘라 뉴모니아/ssDNA 복합체의 형광 세기를 측정하여 비교하는 방법으로 수행되었다. 형광분석기를 이용하여 클렙시엘라 뉴모니아/ssDNA 복합체의 형광 강도를 측정한 방법은 KCTC2208에서 수행한 방법과 동일하다. 결합력 분석 결과 각 클렙시엘라 뉴모니아에 높은 친화도를 보이는 1종의 ssDNA (K2) 간의 결합력(Kd: 해리상수)은 각각 하기 표3과 같다.
클렙시엘라 뉴모니아 균주 3가지 종에 대한 ssDNA K2의 결합력
클렙시엘라 뉴모니아 종 해리상수 (Kd)
KCTC1726 5.2648 nM
KCTC2619 5.3770 nM
KCTC2690 18.3279 nM
2-2. 앱타머의 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 선택성 확인
위 1종의 ssDNA(K2)의 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 선택성 확인을 위해 대장균(Escherichia coli), 시트로박터(Citrobacter freundii), 엔테로박터(Enterobacter aerogenes), 바실러스(Bacillus Subtilis), 포도상구균(Staphylococcus epidermidis) 5종의 다른 박테리아들을 이용하여 선택성 분석을 수행하였다. 각각의 박테리아 100 uL (107 cells)와 500 nM의 ssDNA 100 uL를 상온에서 45분 동안 반응시킨 후 PBS 버퍼를 이용해 씻어주고 박테리아/ssDNA 복합체의 형광 세기를 측정하여 비교하는 방법으로 수행되었다. 도 5에서와 같이 K2는 표적 클렙시엘라 뉴모니아(KCTC2208)에 비해 대장균, 시트로박터, 엔테로박터, 바실러스, 포도상구균와 혼합하였을 때의 형광세기가 50% 미만으로 낮았다.
<110> KIST <120> Single-stranded nucleic acid aptamers specifically binding to Klebsiella pneumoniae and method for detecting K. pneumoniae using the same <130> PN103323 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K1 <400> 1 gagtcggtgg tgttcccaga tggaagccgc agtaatagtg cagct 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K2 <400> 2 aatcaggctc agcatggagt tgcgaggcca atatccggtt aagcg 45 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K3 <400> 3 tgtccttcag acccctgatt tgattaatat tcttaaagtc ttcag 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K4 <400> 4 ctttataaca ctgttactat cgcctgttag aggtaatgag ttctt 45 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K5 <400> 5 ataccgcatg gatgaggtgt tgtacttggg tgctgggggg gtctg 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K6 <400> 6 ttttacagct aaaccggtgt aatgtccttg ttcttcatac ataca 45 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K8 <400> 7 tcttttaggg agtccctatt aagtattgta accttaggac tgaat 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K9 <400> 8 cttaactagt tgcatgggtc ctgctcgagg gatcgtgggt gatgg 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K10 <400> 9 atgactcatt ggtgcttcgc attttactgc atctcctaat attgg 45 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K11 <400> 10 tcttttaggg agtccctatt aagtattgta accttaggac tgaat 45 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K13 <400> 11 gggtgcgcgg gttaatagat tttataaaaa gttgtgcctg tcgtt 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K14 <400> 12 cggcagttgg ttttttctgt tctgcatagg atgctcttag tcggc 45 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K17 <400> 13 agtcttatgg agcggtcgac aacgtcaccg cccctgtggt gaggt 45 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K18 <400> 14 atggcaccct tgcaagcgaa cctgggtttt tagtcgttag cattg 45 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K19 <400> 15 tcatagagtg taactaacta gtcgttgatg cggttggctt tagc 44 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K20 <400> 16 gatattgact aagaggtggt tgtctccttt tgctaaatct cgctc 45 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K21 <400> 17 atgcaccagg gatgtatatt gtctggctgt cttctttgga cgcgt 45 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K22 <400> 18 atgtgctgga agcgccacag gattattggt gacgtgtttg cgctt 45 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K23 <400> 19 gttgtgtcta tactcagctt cttgttactt tactggacat ctatc 45 <210> 20 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K24 <400> 20 gggagcttat gtagaagcaa aggtgcgatg ctgggtgagc gtta 44 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K25 <400> 21 ttacgagcgg gcggggttta gtgtttctgt gggttctgtt tcata 45 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K26 <400> 22 gcaactggat tacgtacctt gctttgtgaa cttacttgtc accca 45 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K27 <400> 23 cgaccacact tccctggaac tctgagttgg cactctgccg cagct 45 <210> 24 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K28 <400> 24 cggcttcatt tctgtgttgg ttgcgtttgt gtggggattt ctcat 45 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA K29 <400> 25 gttgtgtcta tactcagctt cttgttactt tactggacat ctatc 45 <210> 26 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssDNA library <400> 26 gcaatggtac ggtacttccn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnncaaaag tgcacgctac tttgctaa 88 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 27 gcaatggtac ggtacttcc 19 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 28 ttagcaaagt agcgtgcact tttg 24

Claims (11)

  1. 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 앱타머로서, 상기 앱타머는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 앱타머.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 앱타머는 클렙시엘라 뉴모니아의 표면에 결합하는 것인 앱타머.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 앱타머는 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것인 앱타머.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인 것인 앱타머.
  7. 청구항 1, 2, 5, 및 6 중 어느 한 항의 앱타머를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아 검출용 조성물.
  8. 청구항 1, 2, 5, 및 6 중 어느 한 항의 앱타머를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아의 검출용 키트.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 키트는 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태 또는 기판상에 고정화된 마이크로 어레이 형태인 것인 키트.
  10. 청구항 1, 2, 5, 및 6 중 어느 한 항의 앱타머와 시료를 접촉시키는 단계;
    상기 접촉 단계에서 형성된 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머의 복합체로부터 신호를 측정하는 단계; 및
    시료 중 클렙시엘라 뉴모니아의 존재 또는 농도를 확인하는 단계를 포함하는 클렙시엘라 뉴모니아의 검출 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 시료와 앱타머를 포함하는 반응물로부터 클렙시엘라 뉴모니아-앱타머 복합체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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