CN117230157A - 一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR‑Cas12a系统检测沙门氏菌的方法，特点是包括以下步骤：1)将链酶亲和素化纳米磁珠与生物素化适配混合，得到适配体磁珠；2)将四条单链DNA混合反应得到TDN刚性纳米结构，随后加入适配体得到基于TND的三维四价适配体结构；3)首先通过适配体磁珠对沙门氏菌进行分离和富集，随后加入基于TDN的三维四价适配体结构得到“磁珠‑沙门氏菌‑TDN”三明治结构，最后加入CRISPR‑Cas12a体系，在37℃下反应1小时后得到明显增强的荧光信号，实现不同样品中的沙门氏菌检测，优点具有灵敏度高、特异性强和准确性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种沙门氏菌的检测方法，尤其是涉及一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法。
背景技术
沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌，严重威胁着公众健康。食用沙门氏菌污染的食物可能会导致呕吐、腹泻、腹痛，甚至死亡。据估计，美国每年有135万人感染沙门氏菌，26500人住院，420人因此而死亡。有效、快速的检测沙门氏菌，可以减少沙门氏菌的污染，预防食源性疾病的爆发，特别是在病原体感染的早期。传统的平板计数法法被许多国家和国际组织认为是食源性致病菌检测的金标准方法。然而，这种方法是费时费力的，需要至少两天才能得到检测结果。另外，核酸扩增技术(如聚合酶链式反应，PCR)和基于免疫学的方法(如酶联免疫吸附实验，ELISA)是实验室快速筛选细菌的常用方法。虽然核酸扩增技术有足够高的灵敏度，但需要专业的操作和昂贵的仪器。ELISA具有高通量、高特异性、检测速度快、操作自动化程度高的优点，但是灵敏度不够高(检测限为104CFU/mL)，价格高且不稳定，限制了其在沙门氏菌检测中的应用。因此，迫切需要开发快速、灵敏、简便的沙门氏菌检测方法。
近十年来，适配体作为一种很有前途的识别元件在食品分析中引起了广泛的关注。适配体具有特异性好、稳定性高、易于体外合成、化学修饰多样、免疫原性低等优点，使这种基于适配体的传感器相对于一般的基于抗体的免疫学方法在稳定性、灵活性、价格上具有很大优势。然而，由于适配体的亲和力不够理想，大多数适配体传感器都需要通过复杂的信号放大策略，如纳米材料、核酸信号放大、级联酶催化反应等措施来拿到理想的灵敏度。近年来，DNA纳米编程的多价适配体在提高适配体亲和力上起到了很大的作用，并在细菌检测、医学成像、诊断和治疗领域引起广泛关注。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术由于其突出的特异性和简单的操作过程，已成为生物传感器领域的新工具。值得注意的是，Cas12a在crRNA的引导下被目标DNA激活后，对周围的非靶标单链DNA(ssDNA)表现出反式切割活性，可用于各种核酸靶标的检测。然而，CRISPR-Cas12a系统本身的灵敏度有限，总是需要一些扩增技术来提高灵敏度，这不可避免地延长了检测时间，并可能造成气溶胶污染。因此，开发无扩增的检测方法是很有必要的。
目前，国内外还没有公开关于DNA四面体纳米结构(TDN)同时用于构建三维结构四价适配体与信号放大检测沙门氏菌的方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种一种灵敏度高、特异性强且准确性好的一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR-Cas12a系统检测沙门氏菌，本方法不以诊断或治疗为目的，包括以下步骤：
(1)适配体磁珠的制备
将100μL 1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠与100μL 1μM生物素化适配体1(biotin-poly-Apt)混合并在室温反应45分钟，随后加入200μL4μM D-生物素进行封闭，接着用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，最后复溶于100μL磷酸盐缓冲液，得到用于捕获沙门氏菌的适配体磁珠溶液；
(2)基于TDN的四价适配体的制备
将2μL 25μM的四条单链DNA(S1、S2、S3、S4)混合，并用TM缓冲液(20mM Tris，50mMMgCl2)定容至50μL，于95℃加热10分钟，随后迅速降温至4℃，得到TDN溶液。随后在TDN溶液中加入8μL 25μM退火后的适配体2，并用TM缓冲液定容至200μL，于37℃反应2小时得到基于TDN的三维四价适配体，所述的构成TDN的四条链的核苷酸序列如下：S1：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTC AAA TTACAC TTC CTA CAG TCT GAA ACA TCT ACA GCT CTG CTA CACGAG AGA TGC ACG CAC ATA GTA(划线部分为与适配体互补部分)，S2：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTC AAA TTT ATC ACC AGG TCA GTC TGA CAG TGT AGC AGA GCT GTA GATAGA TGC TGA GGA GTC CAA TAC(划线部分为与适配体互补部分)，S3：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTC AAA TTT CAG ACT GAC CTG GTG ATA AAA CGA CAC TGA CGT GGT GAATCT ACT ATG TGC GTG CAT CTC(划线部分为与适配体互补部分)，S4：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTC AAA TTT TCA GAC TGT AGG AAG TGT GCT TCA CCA CGT CAG TGT CGTTTG TAT TGG ACT CCT CAG CAT(划线部分为与适配体互补部分)；
(3)沙门氏菌的检测
取10μL步骤(1)中制备的适配体磁珠与200μL待测沙门氏菌溶液混合，于室温反应45分钟。用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤三次后，加入20μL步骤(2)中制备的基于TDN的四价适配体。随后于室温反应45分钟，经三次磁分离洗涤后复溶于5μL磷酸盐缓冲液得到“磁珠-沙门氏菌-TDN”三明治复合物，接着将该三明治复合物加入CRISPR-Cas12a系统，于37℃反应1小时，最后将该反应液置于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定荧光值，根据不同浓度沙门氏菌对应的荧光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度。
进一步，步骤(1)所述的生物素化适配体1(biotin-poly-Apt)的核苷酸序列如下：biotin-TTT TTT TTT TTT TTT CTC CTC TGA CTG TAA CCA CGG TGG TTT GAT CAC TATTGG GCC TTT GTGATG TCG GTAGT。
进一步，步骤(1)中退火后的适配体2具体步骤为95℃加热10分钟，立即插入冰上15分钟；所述的适配体2的核苷酸序列如下：ACT AGG TGA TTG AGT GGT GTC TTA AAA ACTCCT CTG ACT GTA ACC ACG GTG GTT TGA TCA CTA TTG GGC CTT TCT GAT GTC GGT AGT(划线部分为与S1、S2、S3、S4互补部分)。
进一步，步骤(1)中所述的CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL。
进一步，单链DNA荧光报告探针核苷酸序列如下：FAM-TTATT-BHQ；crRNA的核苷酸序列如下：GAA UUU CUA CUG UUG UAG AAC UAG GUG AUU GAG UGG UGU GUU。
发明原理：如图1所示，沙门氏菌特异性适配体通过生物素-链酶亲和素相互作用结合在磁珠上，得到适配体磁珠作为识别元件，用于沙门氏菌的捕获。TDN支架由四个设计的单链DNA自组装而成，TDN的每个面都由一条单链DNA构成，又通过碱基互补配对与其它三个单链DNA结合，在TDN支架的顶点留下延伸的悬垂。随后，通过TDN悬垂与适配体5’端延伸序列互补杂交相互作用，将沙门氏菌特异性适配体组装在TDN支架上，形成三维TDN四价适配体结构。此外，TDN与适配体连接部分含有crRNA互补序列，可直接触发Cas12a的裂解活性，进行信号放大和荧光读出。因此，三维TDN四价适配体对沙门氏菌有着高结合亲和力，并通过四个CRISPR触发片段和随后的Cas12a催化反应实现级联信号扩增。最后，结合适配体磁分离技术，三维TDN四价适配体辅助CRISPR/Cas12a检测方法可用于复杂食品样品中沙门氏菌的快速、灵敏检测，无需核酸扩增。
与现有技术相比，本发明的优点在于
(1)本发明中的TDN是一种通过一步法合成的刚性三维纳米结构，并且可以通过调整边长精确控制由此所构建的多价适配体价态。
(2)本发明中的以TDN为骨架构建的三维单价、二价、三价、四价适配体亲和力分别为334.59nM、151.98nM、122.27nM和94.15nM，通过多价的构建实现了适配体亲和力随价态地逐步递增。
(3)本发明中基于TDN的三维四价适配体，在TDN与适配体的连接处设计加入crRNA互补序列，作为将细菌信号转化为荧光信号的媒介。
(4)本发明中基于TDN的三维四价适配体具有双功能性，不仅提高适配体亲和力，还能将细菌信号转化为荧光信号。
(5)本发明中基于TDN的三维四价适配体结合CRIPSR系统，实现信号的无扩增双重放大。
(6)本发明中的通过适配体磁珠对样品的前处理，大大降低了复杂食品基质对体系的干扰，结合基于TDN的三维四价适配体与CRISPR系统，最终实现了1CFU/mL沙门氏菌的检测。
综上所述，本发明一种双功能三维TDN四价适配体辅助CRISPR-Cas12a的无扩增适配体传感器。结合了适配体磁分离技术、TDN介导的三维四价适配体、CRISPR-Cas12a系统。通过生物素-链酶亲和素相互作用将适配体固定在纳米磁珠上，得到适配体磁珠用于沙门氏菌的捕获和分离。并通过碱基互补配对将适配体连接到TDN的顶点上，得到三维四价适配体，增强了对沙门氏菌的结合亲和力和特异性。此外，每个三维四价适配体的TDN支架顶点延伸处含有4个CRISPR-Cas12a靶向DNA片段，可以放大信号并直接触发多个Cas12a的裂解活性，从而实现随后的CRISPR扩增。因此，利用多价增强的结合亲和力和TDN支架诱导的级联信号扩增的协同作用，结合适配体磁分离技术，无需任何扩增步骤即可实现食品样品中沙门氏菌的高灵敏检测。
附图说明
图1为本发明无扩增适配体传感器检测沙门氏菌的原理图；
图2为具体实施例二中TDN以及基于TDN的不同价态三维多价适配体构建的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为具体实施例二中基于TDN的三维四价适配体粒径电位及原子力显微镜图；
图4为本发明基于TDN的不同价态多价适配体的亲和力值；
图5为本发明基于TDN的三维单价适配体与三维四价适配体和沙门氏菌结合的荧光显微镜图；
图6为本发明基于TDN的三维四价适配体激活CRISPR-Cas12a顺势切割的琼脂糖凝胶电泳图(a)和激活CRISPR-Cas12a反式切割的柱状图(b)；
图7为本发明TDN三维四价适配体级联信号放大的柱状图
图8为本发明检测不同浓度沙门氏菌的荧光强度与沙门氏菌浓度的线性关系，缺少该附图；
图9为本发明检测牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度沙门氏菌的荧光强度与沙门氏菌浓度线性关系；
图10为具体实施例六检测方法分别对105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌、105CFU/mL金黄色葡萄球菌:105CFU/mL单增李斯特菌:105CFU/mL大肠杆菌:105CFU/mL沙门氏菌＝1:1:1:1进行检测的荧光强度比较图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
适配体磁珠的制备
将100μL 1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠与100μL 1μM 5’端生物素化适配体1(biotin-poly-Apt)混合并在室温反应45分钟，随后加入等体积4μM D-生物素进行封闭，接着用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，最后复溶于100μL磷酸盐缓冲液，得到适配体磁珠用于沙门氏菌的捕获。生物素化适配体1的核苷酸序列如下：TTT TTT TTT TTT TTT CTC CTCTGA CTG TAA CCA CGG TGG TTT GAT CAC TAT TGG GCC TTT GTG ATG TCG GTAGT。
具体实施例二
TDN支架以及基于TDN的不同价态三维多价适配体的合成
TDN支架是四条分别含有三段互补序列的单链DNA(S1、S2、S3、S4)通过碱基互补配对得到的，具体步骤如下：将2μL 25μM的四条单链DNA(S1、S2、S3、S4)混合，并用TM缓冲液(20mM Tris，50mM MgCl2)定容至50μL，于95℃加热10分钟，随后迅速降温至4℃，得到1μMTDN溶液。其中四条单链DNA的核苷酸序列如下：S1：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTCAAA TTA CAC TTC CTA CAG TCT GAA ACA TCT ACA GCT CTG CTA CAC GAG AGA TGC ACGCAC ATA GTA(划线部分为与适配体互补部分)，S2：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTCAAA TTT ATC ACC AGG TCA GTC TGA CAG TGT AGC AGA GCT GTA GAT AGA TGC TGA GGAGTC CAA TAC(划线部分为与适配体互补部分)，S3：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTCAAA TTT CAG ACT GAC CTG GTG ATA AAA CGA CAC TGA CGT GGT GAA TCT ACT ATG TGCGTG CAT CTC(划线部分为与适配体互补部分)，S4：AAC ACA CCA CTC AAT CAC CTA GTCAAA TTT TCA GAC TGT AGG AAG TGT GCT TCA CCA CGT CAG TGT CGT TTG TAT TGG ACTCCT CAG CAT(划线部分为与适配体互补部分)。
三维四价适配体是通过碱基互补配对将适配体连接到TDN的延伸链上，具体步骤如下：在50μL 1μM TDN溶液中加入10μL 25μM退火后的适配体2，并用TM缓冲液定容至200μL，于37℃反应2小时得到基于TDN的三维四价适配体。其中适配体2的核苷酸序列如下：ACTAGG TGATTGAGT GGT GTC TTAAAAACT CCT CTGACT GTAACC ACG GTG GTT TGA TCACTATTG GGC CTT TCT GAT GTC GGT AGT(划线部分为与S1、S2、S3、S4互补部分)。
三维单价适配体、三维二价适配体、三维三价适配体的合成步骤同三维四价适配体，仅对其中的DNA进行替换。三维单价适配体：50μL 1μM TDN溶液(S1，S5，S6，S7)与3μL 25μM退火后的适配体2混合，并用TM缓冲液定容至200μL，于37℃反应2小时。三维二价适配体：50μL 1μM TDN溶液(S1，S2，S6，S7)与6μL 25μM退火后的适配体2混合，并用TM缓冲液定容至200μL，于37℃反应2小时。三维三价适配体：50μL 1μM TDN溶液(S1，S2，S，S7)与8μL 25μM退火后的适配体2混合，并用TM缓冲液定容至200μL，于37℃反应2小时。其中S5的核苷酸序列如下：TAT CAC CAG GTC AGT CTG ACA GTG TAG CAGAGC TGT AGATAGATG CTGAGGAGTCCAATAC，S6的核苷酸序列如下：TCAGAC TGACCT GGT GATAAAACGACACTGACG TGG TGAATCTAC TAT GTG CGT GCATCT C，S7的核苷酸序列如下：TTCAGACTG TAG GAAGTG TGCTTCACCACG TCAGTG TCG TTT GTATTG GAC TCC TCAGCAT。
为验证本发明具体实施例二中TDN的合成，将S1(S1原液，2.5μL 1μM)、S1+S2(0.1μL 25μM的S1和0.1μL 25μM的S2混合，并用TM缓冲液定容到2.5μL，于95℃加热10分钟，随后迅速降温至4℃)、S1+S2+S3(0.1μL 25μM的S1、0.1μL 25μM的S2和0.1μL 25μM的S3混合，并用TM缓冲液定容到2.5μL，于95℃加热10分钟，随后迅速降温至4℃)、TDN支架(上述方法制备的TDN溶液)依次加入到1％琼脂糖凝胶电泳上分离(GelRed核酸染料染色，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压30分钟)并在凝胶成像仪上成像观察。如图2(a)所示，TDN(泳道4)比单链DNA和其他DNA组合(泳道1-3)移动更慢，表明TDN三维纳米结构的形成。
为了直观表征基于TDN的三维多价适配体的形成，根据具体实施例二合成了三维单价适配体、三维二价适配体、三维三价适配体、三维四价适配体，并将适配体(退火后的适配体)、TDN支架(上述方法制备的TDN溶液)、三维单价适配体(上述方法制备的三维单价适配)、三维二价适配体(上述方法制备的三维二价适配体)、三维三价适配体(上述方法制备的三维三价适配体)、三维四价适配体(上述方法制备的三维四价适配体)依次加入到1％琼脂糖凝胶电泳上分离(GelRed核酸染料染色，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压30分钟)并在凝胶成像仪上成像观察。如图2(b)所示，随着三维多价适配体价态的增加，条带的迁移速度逐渐降低，这表明不同价态三维多价适配体的成功形成。
通过粒径电位仪进一步验证了三维四价适配体的合成。如图3(a)所示，TDN的尺寸约为6.4nm，负电荷为-28.4mV。随着适配体的加入，基于TDN的三维四价适配体的尺寸增加到7.5nm，负电荷变味-35.3mV，表明基于TDN的三维四价适配体的成功制备。
最后，在适配体上修饰生物素，合成基于TDN的三维四价适配体后，添加三倍浓度的链酶亲和素作为标记，使其通过与适配体上生物素的结合附着在基于TDN的三维四价适配体上，随后置于原子力显微镜下观察。如图3(b)所示，三维四价适配体的平均尺寸约为6.4nm，结合上链酶亲和素后尺寸增加到16nm。尺寸的增大说明链酶亲和素与三维四价适配体的结合，进一步验证了适配体在TDN支架上的组装。
具体实施例三
基于TDN的不同价态三维多价适配体结合亲和力比较
通过平衡解离常数(Kds，与结合亲和力成反比)评价基于TDN的不同价态三维多价适配体的结合亲和力，并采用ELISA法测定。具体步骤如下：首先，在高吸附酶标板上加入50μL沙门氏菌(105CFU/mL)，37℃孵育2小时后，用磷酸盐缓冲液(含0.01％吐温-20)洗板三次。随后，加入150μL 1wt％牛血清白蛋白溶液，37℃孵育30分钟。洗板三次后，加入50μL不同浓度的基于TDN的不同价态三维多价适配体：三维单价适配体(150nM，300nM，500nM，800nM，1000nM)，三维二价适配体(50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM)，三维三价适配体(50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM)，三维四价适配体(50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM)。在37℃下与沙门氏菌结合45分钟后，通过三次洗板洗去未结合的适配体，加入50μL链酶亲和素化辣根过氧化物酶，于室温反应25分钟。然后经三次洗涤后加入TMB(50μL)避光显色15分钟并用50μL H2SO4(2M)终止反应，用酶标仪测450nm处的吸光度。最后，通过公式：Y＝BmaxX/(Kd+X)(X：适配体浓度，Y：吸光度强度，Bmax：实验中最高的Y)。如图4所示，三维单价适配体、三维二价适配体、三维三价适配体、三维四价适配体的亲和力Kds分别为334.59nM、151.98nM、122.27nM和94.15nM。
为了进一步证明三维四价适配体比三维单价适配体具有更好的结合能力。用荧光显微镜观察沙门氏菌标记的三维四价适配体和三维单价适配体。适配体的5’端修饰上荧光基团(FAM)并按照具体实施例二构建基于TDN的三维多价适配体。将浓度为109CFU/mL(98.5μL)的沙门氏菌与1μM FAM修饰的三维四价适配体和三维单价适配体(2.5μL)于37℃孵育2小时。随后，标记适配体的沙门氏菌以6000r/min离心5分钟，去除未结合的适配体，重悬于磷酸盐缓冲液中。最后将该沙门氏菌-适配体复合物稀释至107CFU/mL，通过荧光显微镜成像观察。从图5光镜和荧光图的叠加图中，用三维四价适配体处理的沙门氏菌荧光强度远高于用相同浓度三维单价适配体处理的沙门氏菌，说明三维四价适配体具有优越的结合靶标性能。
具体实施例四
CRISPR-Cas12a系统的激活
将5μL 1μM具体实施例二构建的基于TDN的三维四价适配体与CRISPR-Cas12a体系混合，CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL并于37℃反应1小时。将基于TDN的三维四价适配体、空白对照溶液(基于TDN的三维四价适配体与未加crRNA的CRISPR-Ca12a体系混合)、反应溶液(基于TDN的三维四价适配体与CRISPR-Cas12a体系混合)依次加入到1％琼脂糖凝胶电泳上分离(GelRed核酸染料染色，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压30分钟)并在凝胶成像仪上成像观察，以验证基于TDN的三维四价适配体对CRISPR-Cas12a顺势切割活性的激发。然后，将反应溶液与空白对照溶液置于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定相对荧光强度，以验证基于TDN的三维四价适配体对CRISPR-Cas12a反式切割活性的激发。其中单链DNA荧光报告探针核苷酸序列如下：FAM-TTATT-BHQ；crRNA的核苷酸序列如下：GAA UUU CUA CUG UUG UAG AAC UAG GUG AUU GAG UGG UGU GUU。
从图6(a)中可以看到，在反应液中未出现多余的条带，这表明Cas12a对三维四价适配体的切割，三维四价适配体成功激活了Cas12a的顺势切割活性。
从图6(b)中可以看到，反应溶液的荧光强度远高于空白对照溶液，表明Cas12a的反式切割活性被成功激活，实现了对单链DNA荧光报告探针的切割。
具体实施例五
TDN三维四价适配体级联信号放大
为了进一步验证三维四价适配体上的4个CRISPR靶向片段产生的直接信号扩增，将5μL 1μM具体实施例二构建的基于TDN的三维单价适配体、三维二价适配体、三维三价适配体、三维四价适配体加入CRISPR-Cas12a体系，CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL并于37℃反应1小时。
从图7中可以看出，Cas12a体系的荧光强度随着靶标片段的增加而增加，四个靶标片段(4)比一个靶标片段(1)的荧光强度增强了2.7倍，显示了三维四价适配体可用于直接信号放大。因此，基于4个靶标序列的直接信号放大和激活Cas12a的进一步扩增，三维四价适配体可以一步级联扩增信号。
具体实施例六
无扩增适配体传感器检测沙门氏菌
取具体实施例一中制备的适配体磁珠与200μL不同浓度的沙门氏菌溶液混合，于室温反应45分钟，用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤三次后，加入20μL具体实施例二中制备得到的基于TDN的三维四价适配体。随后于室温反应45分钟，经三次磁分离洗涤后复溶于5μL磷酸盐缓冲液得到“磁珠-沙门氏菌-TDN”三明治复合物。接着将该三明治复合物加入CRISPR-Cas12a系统，CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL并于37℃反应1小时，置于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定荧光值。
通过对不同浓度沙门氏菌检测得到相应的荧光强度，绘制相对荧光强度-沙门氏菌浓度曲线，从而对待测溶液中的沙门氏菌进行定量分析；当沙门氏菌浓度越高，其特异性结合的三维四价适配体就越多，越容易激活CRISPR-Cas12a活性，引起对周围单链DNA荧光报告探针的切割。
如图8所示，检测PBS中不同浓度沙门氏菌(100-107CFU/mL)的相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系，标准曲线方程为y＝0.226×106x-0.0139×106，相关系数R2＝0.993，检测限为1CFU/mL，可用于未知浓度的沙门氏菌检测。
具体实施例七
为验证本发明具体实施例六检测方法在实际应用中的价值，分别在牛奶、鸡蛋、鸡肉中加入沙门氏菌标准溶液作为实际样品，对不同样本中不同浓度的沙门氏菌进行了检测，结果如图9所示，牛奶(a)、鸡蛋(b)、鸡肉(c)中不同浓度(100-107CFU/mL)沙门氏菌的相对荧光强度-沙门氏菌浓度线性关系，标准曲线方程分别为y＝0.192×106x+0.00934×106，y＝0.186×106x-0.00468×106，y＝0.186×106x-0.00548×106，相关系数分别为0.995，0.993，0.995，检测限均为1CFU/mL。
具体实施例八
为验证本发明具体实施例六检测方法的检测特异性，分别对105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌、105CFU/mL金黄色葡萄球菌、105CFU/mL单增李斯特菌、105CFU/mL大肠杆菌、105CFU/mL沙门氏菌＝1:1:1:1进行检测。结果如图10所示，在沙门氏菌存在时，检测的荧光强度远远高于干扰食源性致病菌的吸光度值，表明该检测方法对沙门氏菌具有特异性。
具体实施例九
为验证本发明具体实施例七检测方法的准确度以及稳定性，对牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度的沙门氏菌进行检测，并进行回收率的计算。结果如表1所示，
表1为对牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度(5×102-5×104CFU/mL)沙门氏菌的回收率。
由表1可知，牛奶、鸡蛋、鸡肉中不同浓度(5×102-5×104CFU/mL)沙门氏菌的平均回收率分别为102.54％、101.56％、102.32％，表明该检测方法可应用于食品样品中的沙门氏菌检测。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于包括以下步骤：
(1)适配体磁珠的制备
将100μL 1mg/mL链酶亲和素化纳米磁珠与100μL 1μM生物素化适配体1混合并在室温反应45分钟后，加入200μL4μM D-生物素进行封闭，然后用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤两次，最后复溶于100μL磷酸盐缓冲液，得到适配体磁珠溶液；
(2)基于TDN的四价适配体的制备
将2μL 25μM的四条单链DNA混合，并用TM缓冲液定容至50μL，于95℃加热10分钟，随后迅速降温至4℃，得到TDN溶液，随后在TDN溶液中加入8μL 25μM退火后的适配体2，并用TM缓冲液定容至200μL，于37℃反应2小时得到基于TDN的三维四价适配体溶液，其中所述的构成TDN的四条单链的核苷酸序列如下：S1：AAC ACACCACTC AAT CAC CTA GTC AAATTACAC TTCCTA CAG TCT GAAACATCTACA GCT CTG CTACAC GAGAGATGCACG CACATAGTA；S2：AACACACCACTCAAT CAC CTA GTCAAATTTATCACCAGG TCAGTC TGACAG TGTAGC AGAGCT GTAGATAGATGC TGAGGAGTC CAATAC；S3：AACACACCACTCAAT CAC CTAGTCAAATTT CAG ACT GAC CTG GTGATA AAA CGA CAC TGA CGT GGT GAA TCT ACT ATG TGC GTG CAT CTC；S4：AACACACCACTCAAT CAC CTAGTCAAATTT TCA GAC TGTAGGAAG TGT GCT TCACCACGT CAG TGT CGTTTG TAT TGGACT CCT CAG CAT；
(3)沙门氏菌的检测
取10μL步骤(1)制备的适配体磁珠溶液与200μL待测沙门氏菌溶液混合，于室温反应45分钟，用磷酸盐缓冲液磁分离洗涤三次后，加入20μL步骤(2)制备的基于TDN的四价适配体溶液后，于室温反应45分钟，经三次磁分离洗涤后复溶于5μL磷酸盐缓冲液得到磁珠-沙门氏菌-TDN三明治复合物，接着将三明治复合物加入CRISPR-Cas12a系统，于37℃反应1小时后，置于蓝光下观察荧光强度并用酶标仪测定荧光值，根据不同浓度沙门氏菌对应的荧光度值的标准曲线，计算得到待测溶液中沙门氏菌浓度。
2.根据权利要求1所述的一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(1)所述的生物素化适配体1的核苷酸序列如下：biotin-TTT TTT TTT TTT TTT CTC CTC TGA CTG TAACCACGG TGG TTTGAT CAC TATTGG GCC TTT GTGATG TCG GTAGT。
3.根据权利要求1所述的一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(2)所述的退火后的适配体2具体步骤为95℃加热10分钟，立即插入冰上15分钟；所述的适配体2的核苷酸序列如下：ACTAGG TGA TTG AGT GGT GTC TTAAAAACT CCT CTG ACT GTAACC ACG GTG GTTTGATCACTATTG GGC CTT TCT GAT GTC GGTAGT。
4.根据权利要求1所述的一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(3)所述的CRISPR-Cas12a体系为：2.5μL 2μM Cas12a酶、2.5μL 2μM crRNA、2μL 2μM单链DNA荧光报告探针、2μL 10U RNA酶抑制剂，最后用无酶水定容至20μL。
5.根据权利要求4所述的一种TDN介导的三维四价适配体辅助CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于所述的单链DNA荧光报告探针核苷酸序列如下：FAM-TTATT-BHQ；所述的crRNA的核苷酸序列如下：GAA UUU CUACUG UUG UAGAACUAG GUGAUU GAG UGG UGU GUU。
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