JP2002509731A

JP2002509731A - 混合培養中の生きた微生物の存在を決定する選択的アッセイ法

Info

Publication number: JP2002509731A
Application number: JP2000541329A
Authority: JP
Inventors: ヘイドック，ポール・ブイ; ユーレン，ジャック・アール
Original assignee: セイジーン・コーポレーション
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 2002-04-02
Also published as: CA2325851A1; US20040023208A1; US6511804B1; AU3206199A; WO1999050441A1; EP1064396A1; AU770283B2; EP1064396A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、混合培養物中の未知の生きた微生物を同定する方法を提供する。この微生物は、細菌、真菌、ウイルス、または原生動物などである。本発明はさらに、化学薬剤の存在下での混合培養物中の選択された微生物の複製能力を測定するためのアッセイを提供する。混合培養物中の生きた微生物を同定し、混合培養物中の微生物の複製能力を測定するキットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本出願は、米国特許仮出願第６０／０７９６８４号、１９９８年３月２７日出
願の一部係属出願であり、この出願の内容は参考として援用されている。

【０００２】（発明の背景）何十年もの間、科学者らは感染の制御および微生物の検出の向上に努力してき
た。特定の化学薬剤に対する微生物の感受性を決定することは、臨床医学におい
て特に重要であり、医師らは多くの可能性のある微生物のどれが患者の感染原因
となる可能性があるかだけでなく、患者に感染した特定の菌種がどの薬剤に感受
性であるかを決定する必要に差し迫られている。正常な菌叢（通常体のある部位
に存在するが、正常な状態では疾患の原因とならない細菌）、またはたまたま存
在しているが患者の原疾患の原因菌ではないその他の微生物が存在するため、こ
れは複雑または混乱さえする作業である。したがって、試料中に存在する生物を
同定し、また標的の生物の生存力を決定することは重要である。しかし実際問題
として医師らは、生物を培養し、同定し、従来の技術で抗生物質感受性を試験し
ている間に、患者の状態を悪化させる危険を冒すことはできず、通常は実際に原
因となる微生物に対して有効であることを期待して広域スペクトル薬剤を選択す
ることが多い。

【０００３】微生物の生存力を決定する多くの技法が当分野では公知である。これらの技法
は一般に、存在する微生物を複製させるため、意味のある結果を得るためには単
離された、純粋な培養を使用する必要がある。たとえば、米国特許第４，４１６
，９９５号は、薬剤の存在下で細菌に取り込まれたトリチウムチミジンの量を、
薬剤非存在下での第２の培養に取り込まれた量と比較して測定して、化学薬剤に
対する細菌の感受性を決定する方法を教示している。米国特許第４８１２３９４
号でＤｏｌｂｅａｒｅ等は、フローサイトメトリによって総細胞ＤＮＡおよび取
り込まれたヌクレオチド類似体を同時に測定する非放射活性技法を教示している
。５−ブロモデオキシウリジン（「ＢｒｄＵ」）などのヌクレオチド類似体の存
在下で細胞を生長させ、次いで２本鎖ＤＮＡ部分を１本鎖ＤＮＡにする。次いで
この部分をヌクレオシド類似体に対する抗体などの免疫化学的手段で「染色」す
る。次いで、無変化の２本鎖ＤＮＡを、挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌｃａｔｉｎｇ）
色素ヨウ化プロピジウムや臭化エチジウムなどの非改変ＤＮＡ特異的染色によっ
て検出する。

【０００４】多くのヌクレオチド類似体に対する抗体が、取り込み検出用に市販されている
。ＥＬＩＳＡキットは、細胞生存力または増殖のアッセイの一部としてＤＮＡに
取り込まれたＢｒｄＵの測定用に市販されている。たとえば、ベーリンガー・マ
ンハイムの「ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ」
では、ＢｒｄＵとともに試料をインキュベートする。次いで、治療中のＤＮＡを
マイクロタイタープレートの穴に固定して、抗ＢｒｄＵ抗体−ペルオキシダーゼ
複合体を注入する。次いで、ＢｒｄＵ−標識ＤＮＡの存在を、テトラメチルベン
ジジン（「ＴＭＢ」）基質を注入することによって比色計で検出する。この方法
では、臨床現場においてしばしば患者から得られる病原微生物および正常微生物
叢の混合した培養物の取り扱いに関係した、微生物の同定はできない。

【０００５】最後に、核酸の増幅方法は当分野で公知である。これらの方法は、試料中に存
在する全てを増幅するという欠点を有する。したがって、試料中に存在する生き
た微生物および死んだ微生物の両方の核酸を増幅するので、微生物の生存力を決
定するために使用することはできない。

【０００６】（発明の概要）本発明では、（ｉ）類似体特異的結合剤によって認識され、微生物の複製細胞
の核酸に取り込まれる核酸類似体を含む培地中で微生物を培養する段階と、（ｉ
ｉ）その核酸を遊離させるために微生物を溶解する段階と、（ｉｉｉ）類似体特
異的結合剤を使用して類似体を取り込んだ核酸を捕獲する段階と、（ｉｖ）捕獲
されていない核酸から捕獲された核酸を分離する段階と、（ｖ）特定の生物また
は生物群に選択的な方法を使用して捕獲した核酸を増幅する段階と、（ｖｉ）増
幅された、捕獲核酸の存在または不在を検出する段階とを含む、混合培養物中の
生きた微生物を同定するためのアッセイを開示する。増幅はポリメラーゼ連鎖反
応によって行うことができる。

【０００７】さらに本発明は、微生物が病原体であり、その病原体が哺乳類の病原体であり
、この微生物が細菌、ウイルス、真菌、または原生動物である場合に、このアッ
セイ法を使用することができることを開示する。

【０００８】さらに本発明は、最初に微生物を単離する必要なく、化学薬剤に対する培養物
中の微生物の感受性を決定するために使用することができる。

【０００９】本発明は、ヌクレオチド類似体がブロモデオキシウリジンであることができる
ことを開示する。さらに、本発明は結合剤が抗体であることができることを開示
する。さらに、類似体結合剤は固体支持体に付着できる。

【００１０】本発明はさらに、少なくとも１回、段階を繰り返すことによって（または微生
物を含む培地を２等分することによって）実行することができ、１連の段階のう
ちの１段階（または等分されたものの１つ）では抗生物質が培地に添加されてお
り、１連の段階の少なくとも１段階（または等分されたものの１つ）では抗生物
質が培地に添加されていない。

【００１１】最後に、本発明は、混合した培養物中の微生物を同定するため、または混合培
養物中で選択された生物の複製能力を測定するため、あるいはその両方のための
キットであって、類似体特異的結合剤によって認識され、微生物の核酸に取り込
むことが可能である（関心のある微生物の性質に応じた）ＤＮＡまたはＲＮＡ類
似体と、類似体を取り込んだ核酸を捕獲するための類似体特異的結合剤と、関心
のある微生物の複製能力を決定するアッセイ中のこれらの成分を使用するための
説明書とを含むキットを開示する。

【００１２】図１は試料中の微生物が抗生物質に対して感受性であるか耐性であるかを検出
する本発明の実施方法を示す概略図である。「ＢｒｄＵ」は「ブロモデオキシウ
リジン」を表す。「抗ＢｒｄＵ」は抗ＢｒｄＵ抗体を表す。「ＧｒｏＥＬプライ
マ」は、多種の細菌に共通した遺伝を増幅するプライマである。使用した特異的
プライマを以下の表１に記載する。

【００１３】図２は、取り込まれたヌクレオチド類似体を有する核酸を検出する能力を示す
免疫捕獲アッセイの結果を示す写真であり、この場合、ＢｒｄＵはＥ．ｃｏｌｉ
．のＤＮＡに取り込まれている。図２の第１列（「−ＤＮＡ」で印されている）
は、ＤＮＡを含まないマイナスの背景対照である。次の８列は、ＢｒｄＵ標識Ｄ
ＮＡ（図中では「＋」で示す）またはＢｒｄＵで標識されないＤＮＡ（「−」で
示す）のいずれかについて行ったＰＣＲ反応である。この８列のうち最初の２列
では、ＰＣＲはＢｒｄＵ標識（「＋」）ＤＮＡおよびＢｒｄＵ非標識ＤＮＡ（「
−」）の両方について行われた。「被覆されていない試験管」と示した次の２列
は、プロテインＡで被覆していない容器で免疫捕獲を実施した。ほんのわずかな
背景が得られた。「−抗ＢｒｄＵ」と示した次の２列は、抗ＢｒｄＵ抗体を添加
していない免疫捕獲である。ほとんどまたは全く何も表れなかった。「完全」と
示した列は、標識ＤＮＡに対するＰＣＲの使用、プロテインＡで被覆された試験
管の使用、および抗−ＢｒｄＵ抗体の使用を表す。

【００１４】図３は、２種のＥ．ｃｏｌｉ．の生長曲線を表す図である。グラフの上部は、
野生種Ｗ３１１０の生長曲線を示しており、ナリジキシン酸（「ＮａＬ］に対し
て感受性であることを示すために「ＮＡＬ^sens」で標識されている。グラフの下
部は、ナリジキシン酸耐性のＮＫ５８３０株の生長を示している。両グラフには
、以下の印が使用されている。塗りつぶした四角：ＢｒｄＵ存在下、抗体非存在
下で生長した培養物。菱形：ＢｒｄＵ、抗体非存在下で生長した培養物。塗りつ
ぶした三角：テトラサイクリン（「（＋）Ｔｅｔ」）存在下で生長した培養物。
中抜き三角：ＮａＬ（「（＋）ＮａＬ」）存在下で生長した培養物。

【００１５】図４は、抗体に対して異なる感受性および耐性を有する２種のＥ．ｃｏｌｉ．
のＰＣＲ後のＤＮＡのゲル電気泳動の結果を示す図である。図４の最初の２列は
、ＤＮＡ無添加（−）またはＤＮＡ添加（＋）のいずれかのＰＣＲ対照である。
Ｗ３１１０の題の下で「対照」と表された２列、およびＮＫ５８３０の題の下の
対応する２列は、抗生物質を添加していない免疫捕獲アッセイの対照である。こ
れら２列のそれぞれの最初の列の試料は、「−」で示しており、細胞増殖中にＢ
ｒｄＵは添加されなかった。２列のそれぞれの第２の＋の列は、培地中にＢｒｄ
Ｕを存在させて生長した対照から得たのもである。各題の下の次の２列は、ナリ
ジキシン酸（＋Ｎａｌ）またはテトラサイクリン（＋Ｔｅｔ）のいずれかの存在
下で生長させた試料を示す。

【００１６】図５は、比色サンドイッチアッセイにおける２種のＥ．ｃｏｌｉのＰＣＲ生成
物の比色分析を示す図である。ＰＣＲ生成物は、９５℃で２分間加熱して、試薬
プレートに添加した。Ｅ．ｃｏｌｉに特異的な捕獲プローブ（以下の表１参照の
こと）を、ＰＣＲ生成物の存在を検出するために使用した。結果は６５０ｎｍで
読み取った。Ｗ３１１０株はＮａＬに感受性であり（「ＮａＬ^sens」）、ＮＫ５
８３０株はＮａｌに耐性である（「Ｎａｌ^res」）。「−ＢｒｄＵ」で示された列は、ＢｒｄＵ非存在下で生長した陰性対照を表しており、「＋ＢｒｄＵ」で示
された列は、ＢｒｄＵ存在下で生長した培養物を示している。「＋Ｎａｌ」は、
Ｎａｌ存在下で生長した培養物を示している。「＋鋳型」および「−鋳型」で示
された列はＰＣＲ対照である。

【００１７】図６は、同種の抗生物質耐性生物および抗生物質感受性生物が、耐性生物の割
合を減じて培養中に混合した場合の研究結果を示す図である。最初の２列はＰＣ
Ｒ対照で、ＤＮＡ無添加（−）またはＤＮＡ添加（＋）のいずれかである。「対
照」と示した次の２列は、抗生物質を添加していない免疫捕獲アッセイ対照であ
る。第１の対照列の試料は、「−」で示されており、細胞生長中にＢｒｄＵを添
加しなかった。第２の＋の列は、培地にＢｒｄＵを存在させて生長させた対照か
ら得たものである。次の列は、ナリジキシン酸耐性株ＮＫ５８３０を表示した割
合でナリジキシン酸感受性株Ｗ３１１０との混合培養中に存在させた結果を示し
ている。

【００１８】図７は、ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動によって口腔細菌Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏ
ｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生長に対する抗生物質の影響を示した図である
。最初の２列はＢｒｄＵ非存在下（「−」）または存在下（「＋」）で生長させ
た対照培養増殖である。次の３列は、メトロニダゾール、ナリジキシン酸、また
はテトラサイクリンそれぞれの存在下での生長させた培養物からの結果を示して
いる。

【００１９】図８は、ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動によって口腔細菌Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓの生長に対する抗生物質の影響を示した図である。最初
の列は、背景を示すためのＰＣＲ対照である。「免疫捕獲対照」で示された２列
は、ＢｒｄＵ非存在下（「−」）または存在下（「＋」）で生長させた対照培養
物である。次の３列は、メトロニダゾール、ナリジキシン酸、またはテトラサイ
クリンそれぞれの存在下で生長させた生物の培養物から得られた結果を示してい
る。

【００２０】図９は、ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動によって口腔細菌Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
ｄｅｎｔｉｃｏｌａの生長に対する抗生物質の影響を示した図である。最初の列
は、ＢｒｄＵ存在下（「＋」）で生長させた免疫捕獲対照増殖である。次の３列
は、メトロニダゾール、ナリジキシン酸、またはテトラサイクリンそれぞれの存
在下で生長させた生物の培養物から得られた結果を示している。

【００２１】（具体的な実施形態の説明）Ｉ．緒言本発明は、標本または試料中の生きた微生物の存在を決定するだけでなく、そ
れらの微生物の種類を同定するための迅速かつ簡便な方法を提供する。さらに、
本発明は、微生物を同定する前に、まず試料または標本中の微生物を分離して単
離された純粋な培養物にする必要性を排除する。この両者によって、正確さを犠
牲にすることなく段階が排除され、時間が節約される。本発明は、標識核酸を捕
獲することと、捕獲した標識核酸を標識していない核酸から物理的に分離するこ
とと、および選択的に増幅することとを組合わせて実施する。本発明は迅速かつ
正確なので、臨床適用に特に有用となることが期待される。

【００２２】本発明ではさらに、粗細胞溶解物またはウイルス溶解物の使用が可能である。
精製したＤＮＡを使用して本発明を実施することが確かに可能であるが、そうす
る必要はない。必要な試薬がより少なく、かつ精製段階が排除されることによっ
て、所与の期間中に大量アッセイの実施が可能となるので、時間および費用の節
約が期待される。さらに、元試料中の生きた複製する微生物だけが類似体を摂取
し、標的生物（または標的生物群）の核酸だけが増幅されるので、結果によって
標的微生物が元試料中に存在したかどうか、およびその微生物が生きていたかど
うかの両方が示される。

【００２３】本発明はまた、薬剤に暴露していない対照培養物と試験培養物に対する薬剤の
効果の違いを比較することによって、患者に感染している特定の微生物、または
特定の微生物種が特定の化学薬剤による治療に感受性であるかどうかを速やかに
決定することが可能である。このようなより迅速な決定は、患者の感染原因であ
る特定の微生物を同定し、適切な治療を決定するために特に有用であることが期
待される。

【００２４】本発明はまた、食品試料中の生きた微生物の存在を迅速に決定し同定すること
ができないと、輸送食品を市場に送り出すのが遅れ、費用が増大する食品製造お
よび加工産業において有用である。ある肉加工会社が汚染の経路を指摘すること
ができなかったために、最近数百万ポンドもの挽肉を予防のために回収し、破棄
することとなった。輸送貨物のいくつかに生存可能な病原体がないことを示す能
力があれば、破棄すべき肉の量を減じることが可能であったろう。

【００２５】生存活性のある微生物の存在を決定し同定する必要性はまた、その他の数多く
の状況に存在する。たとえば、地方自治体は、未処理の下水が公共の浜辺に接近
した海に及んでいるかどうかを決定するためにマーカーとして生きたＥ．ｃｏｌ
ｉの有無の決定に依拠することが多い。本発明を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉならび
に病原体または存在する可能性のある微生物の存在を迅速に決定することが可能
である。

【００２６】本発明の基本方法は以下に簡単に記述されているが、もちろんより完全に以下
の考察およびクレームに記述されている。この方法の最も簡単な形態では、微生
物を含むと考えられる試料を、（１）微生物の複製細胞（または、微生物がウイ
ルスと考えられる場合は、複製ビリオン）の核酸に取り込まれることができ、（
２）核酸類似体に特異的な結合剤（たとえば、その類似体上のエピトープを認識
する特異的抗体、または類似体の化学的部分に高い親和性を有する化合物）によ
って認識され、かつ（３）この核酸の増幅を可能にする核酸類似体の存在下で、
微生物の複製を可能にする条件で培養する。次いで、この微生物を溶解して核酸
を遊離し、類似体を取り込んだ核酸を類似体特異的結合剤で捕獲して、捕獲した
核酸を類似体特異的結合剤で捕獲されていない核酸から分離して、その核酸を、
生物または関心のある生物からの核酸を選択的に増幅させる条件に暴露する。次
いで、増幅した捕獲核酸の有無を検出する。

【００２７】最も一般的には、特定の標的生物からの核酸だけを増幅するプライマを使用し
て選択的増幅を行う。しかし、医師が所望する特異性の程度に応じて、プライマ
を変性させることができ、プライマの設計に応じて、関連する生物の限定された
かまたはかなり広い範囲から得た核酸の増幅を可能にする。

【００２８】前記のように、本発明は目的の微生物が化学薬剤に感受性かまたは耐性かを決
定するために使用することができる。最も一般的には、培養の初期前後に試料を
少なくとも２つに等分し、一方（「試験」試料）は化学薬品を含み、もう一方（
「対照」試料）は含まないとする。その後の定量を容易にするために、通常標本
中の微生物の数および標本中の培地の量はほぼ等しくするのが望ましい。その後
、２種以上の試料を核酸類似体の存在下で培養して、残りの段階を行い、核酸類
似体を取り込んだ核酸の量を比較する。取り込まれた量がほぼ等しい場合、この
薬剤は微生物の増殖に全くまたはほとんど影響を与えないと決定することができ
る。試験試料に取り込まれた類似体の量が対照試料に取り込まれた量より検出で
きるほど有意に下回る場合、その化学薬剤は微生物の増殖に抑制効果を有すると
言うことができる。別法として、一連の段階を２回、１回は抗生物質を有さず、
もう１回は抗生物質を有して実施することによってアッセイを実行することがで
きる。

【００２９】以下の本文では、本発明の多くの使用のいくつかおよび実施方法について述べ
る。用語の定義および本発明の使用の記述の後、本文ではヌクレオチド類似体が
生きた微生物に取り込まれたかどうかを決定するアッセイおよび手段の一般的形
式について述べる。その後、微生物の培養、例示的核酸類似体およびそれら類似
体用の結合剤、微生物の核酸に接近するための溶解方法、および核酸類似体を取
り込んだ核酸を捕獲する方法、捕獲されていない核酸から捕獲された核酸の分離
、微生物の選択的増幅方法、および本発明を実施するキットについて述べる。最
後に、本発明の使用を示すために実施例を記述する。

【００３０】ＩＩ．定義本明細書では、「微生物」は細菌、真菌、原生動物、およびウイルスを含む。
たとえば、細菌に関しては、真核細胞内で複製するマイコプラズマ、リケッチア
、およびクラミジア、ならびに真核細胞内で複製しない細菌を含む。ウイルスに
関しては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの両方を含む。真菌に関しては、酵母な
どの単細胞形態および２形性病原体の単細胞形態の両者を含む。原生動物に関し
ては、生物が核酸類似体の存在下で培養でき、核酸に取り込まれることができる
限り、単細胞の生物および蠕虫類など多細胞の生物の両者を含む。さらに一般的
にこの用語は、生物が原核動物または真核動物であるかということよりもむしろ
、通常顕微鏡を使用することによってのみ見ることのできる生物のことである。

【００３１】本明細書では、「混合培養」とは一種以上の微生物の種、族、科または部類、
またはこれらのある組合せのことを意味する。たとえば、臨床試料は病原体だけ
でなく、正常な菌叢および正常な菌叢の一部ではないが患者の最も重篤な病気の
原因菌ではないその他の可能な微生物も含むことが可能である。本明細書では「
部類」とは、以下の生物の型、ウイルス、細菌、真菌、および原生動物に区別す
ることを意味する。この用語はまた、医師が最初に別々の培養物に分離しないで
、異なる株の存在を決定し、またはそれらの生存力および化学薬剤に対する感受
性の違いを測定したいと望むときは、特定種の１「株」以上の微生物を含む培養
物を含むものである。

【００３２】混合培養とは対照的に、「純粋培養」とは、ある微生物の株の特徴を研究する
ときは、単独の株の微生物のみを含む培養物または試料のことを意味し、または
微生物の種類を同定しようとするときは、単独の種類の微生物のみを含む培養物
または試料を意味する。

【００３３】本明細書では、「同定する」と言う用語は、医師にとって関心のある微生物の
分類学的分類決定のプロセスを意味する。医師の研究の特定の目的に応じて、こ
の決定は微生物の科、属、種、または株など一種または複数の分類学的レベルで
あることができる。たとえば医師は、患者試料がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
属の微生物を含むかどうか、それらの微生物がＳ．ａｕｒｅｕｓ種であるかどう
か、およびＳ．ａｕｒｅｕｓの株が特定の抗生物質に対して耐性の株であるかど
うかを知りたいと望む可能性がある。本明細書では「同定する」とは、試料中に
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在することを同定するなど、このプロセスによる分類学的
分類のことである。

【００３４】「抗生物質」と言う用語は、本明細書では関心のある微生物の複製を抑制また
は殺す活性を有する、または有する可能性のある化学薬剤を意味する。参照の便
宜上、この用語は本明細書では関心のある微生物が細菌、ウイルス、真菌または
原生動物のいずれであろうとも、このような薬剤を意味するために広く使用され
ている。したがって、医師が関心の有る微生物の部類に応じて、抗細菌、抗ウイ
ルス、抗真菌、および抗原生動物剤が含まれる。「抗生物質」および「化学薬剤
」と言う用語は、一般に本明細書では同義語として使用される。

【００３５】本明細書では、「水性培地で微生物を培養する」という文章は、（ａ）この方
法で首尾良く培養することのできる細菌などの微生物について、水性培地で直接
微生物培養すること、および（ｂ）細胞内寄生物である微生物について、それ自
身が水性培地中にある細胞中で微生物を培養することを意味する。たとえば、ウ
イルスおよびマラリア原虫は一般にそれ自身が水性培地で培養される細胞中で培
養される。

【００３６】本明細書では、「類似体特異的結合剤」または「結合剤」とは核酸類似体に特
異的に結合することのできる特質を有するが、天然のヌクレオチドまたは核酸前
駆体に測定可能程度に結合しない部分、成分、化合物、抗体、抗体フラグメント
またはその他の実体を意味する。

【００３７】「取り込まれた」と言う用語は、本明細書で類似体に関係して使用するときは
、細胞（または、ウイルスの場合はウイルス）ＤＮＡまたはＲＮＡ内に細胞（ビ
リオン）合成機構によって統合されたヌクレオシド類似体のことである。

【００３８】本明細書で微生物または微生物の培養物に関して使用される「生長する」また
は「生長」と言う用語は、複製、つまり微生物の大きさの増加よりもむしろ微生
物の数の増加を意味する。「複製する」および「生長する」と言う用語は、状況
によって異なる意味が必要となる可能性があるときを除いて、本明細書では一般
的に同義的に使用される。

【００３９】「培養」と言う言葉は、名詞として使用されるときは、本明細書では通常はそ
れらの複製を可能にする培地中における一種または複数の微生物の株または種の
集団のことである。動詞として使用するときは「培養する」と言う用語は、本明
細書では、微生物がさらされる特定の条件下ですることができる場合に微生物が
複製の機会を与えられている期間のことである。

【００４０】本明細書では、「核酸類似体」、「類似体」、「ヌクレオシド類似体」、また
は「ヌクレオチド類似体」とは、ＤＮＡの天然成分である４種のデオキシリボヌ
クレオシド、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、お
よびデオキシチミジンの一種、またはＲＮＡに天然成分である４種のリボヌクレ
オシドの一種などの核酸前駆体の天然にはない変種を意味する。これらの文章で
使用される「類似体」と言う用語は、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成中に正し
い（すなわち、鋳型ヌクレオシドに関して）３リン酸塩前駆体の代わりにこのよ
うな部分の３リン酸塩誘導体を受け入れることを示唆する。たとえば、Ｓｔｒｙ
ｅｒ、Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３版、１９８８（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎａｎｄＣｏ．、ニューヨーク）、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ、第４版、１９８７（Ｂｅ
ｎｊａｍｉｎＣｕｍｍｉｎｇｓ、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、ＣＡ）を参照のこと
。

【００４１】「抗体」と言う用語は、特異的に分析物（抗原）に結合し、認識する免疫グロ
ブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子類、またはそれらのフラグメントによ
って実質的にコード化されたポリペプチドのことである。認識された免疫グロブ
リン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよ
びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含ま
れる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、ミ
ュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらによってそ
れぞれ免疫グロブリン型、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが定め
られる。「抗体」と言う用語にはまた、抗体（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）₂ ）の抗原結合形態が含まれる。

【００４２】具体的な免疫グロブリン（抗体）構造単位には、４量体が含まれる。各４量体
は、２組の同一のポリペプチド鎖を含み、各組は一種の「軽い」鎖（約２５ｋＤ
）および一種の「重い」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗
原認識に主に関与する約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域
を限定する。可変軽鎖（Ｖ_L）および可変重鎖（Ｖ_H）と言う用語は、それぞれこ
れらの軽鎖および重鎖を意味する。

【００４３】たとえば、抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼ
で消化することによって得られる多くのよく特徴づけられたフラグメントとして
存在する。したがって、たとえばペプシンがヒンジ部のジスルフィド結合の下で
抗体を消化するとＦ（ａｂ）’₂、ジスルフィド結合によってＶ_H−Ｃ_H１を結合したそれ自身が軽鎖であるＦａｂの２量体が得られる。このＦ（ａｂ）’₂はヒンジ部のジスルフィド結合を切断する温和な条件下で切断することが可能で、そ
れによってＦ（ａｂ）’₂２量体はＦａｂ’単量体に変換される。このＦａｂ’ 単量体は本質的にヒンジ部部分を有するＦａｂである（たとえば、Ｆｕｎｄａｍ
ｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ著、第３版、１９９３を参照のこ
と）。種々の抗体フラグメントが完全な抗体の消化に関して明らかにされている
一方、当業者はこのようなフラグメントは新たに化学的または組換えＤＮＡ法を
使用することによって合成することが可能であることを理解するであろう。した
がって、本明細書では「抗体」と言う用語はまた、１本鎖Ｆｖ、キメラ抗体（す
なわち、異なる種由来の定常領域および可変領域を含む）、人化抗体（すなわち
、非ヒト原料由来相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）およびヘテロ結合抗体（た
とえば、２種特異的抗体）などの抗体フラグメントを含む。

【００４４】「免疫アッセイ」と言う用語は、特異的に分析物に結合する抗体を使用するア
ッセイのことである。この免疫アッセイは、分析物を単離し、標的とし、および
／または定量するための特定の抗体の特異的結合特性を使用することによって特
徴づけられる。

【００４５】ヌクレオチド類似体に関連する場合、「抗体への特異的（または選択的）結合
」、「特異的（選択的）免疫反応性」、および「特異的認識（または認識される
）」と言う文章は、核酸およびその他の生体成分の異種集団中のヌクレオチド類
似体の存在を決定する結合反応のことである。したがって、指定された免疫アッ
セイ条件下では、特定の抗体は特定のヌクレオチド類似体に結合し、試料中に存
在する天然のヌクレオチドには有意量結合しない。特定のヌクレオチド類似体に
特異的に免疫反応する抗体を選択するために、様々な免疫アッセイ法を使用する
ことが可能である。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、蛋白質に特異的
に免疫反応する抗体を選択するために通常使用されており（たとえば、免疫アッ
セイ法および特異的免疫活性を測定するために使用することのできる条件の記載
については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、１９８８（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参
照のこと）、ヌクレオチド類似体と特異的に免疫反応する抗体を選択するために
は、同様の方法を使用することができる。一般に、特異的または選択的反応は、
少なくとも背景信号またはノイズの２倍であり、より典型的には背景の１０から
１００倍以上である。

【００４６】核酸類似体を取り込んでいる核酸と共に使用した「捕獲する」または「捕獲す
ること」と言う用語は、核酸が類似体特異的結合剤によって認識かつ結合される
ことを意味する。しばしば、この類似体特異的結合剤は、ビーズまたはその他の
表面など固相支持体に結合している。

【００４７】これらの用語はまた、本明細書では数種の第２の意味で使用される。たとえば
ある使用では、モノクローナル抗体などの類似体特異的結合剤を核酸類似体を取
り込んでいる可能性のある核酸を含んだ溶液に添加することが便利である可能性
がある。その後、この結合剤を溶液中で核酸類似体を取り込んだ核酸と複合させ
て、次いでこの複合体を、たとえばプロテインＡなど抗体のＦｃ部位に結合する
物質、または結合剤を認識する抗体で被覆した表面と接触させて単離することが
できる。ヌクレオチド類似体を取り込んだ核酸と類似体特異的結合剤との複合体
を結合する方法はまた、本明細書では「捕獲する」または「捕獲すること」と呼
んでいる。最後に、「捕獲プローブ」とは、（ＰＣＲプライマを使用するときに
意図するような）標的配列を横から攻撃して配列の増幅ではなく、むしろ標的配
列自体が存在するかどうかの情報を望む場合に、標的配列とハイブリッド形成す
るために使用される核酸配列のことである。一般に捕獲プローブは関心のある生
物の特定の同定を行う配列とハイブリッド形成するように選択する。

【００４８】「捕獲する」または「捕獲すること」の特定の意味のいずれが意図されている
かは、状況によって明らかとなろう。

【００４９】ＩＩＩ．本発明の用途Ａ．緒言本発明は、臨床、研究、産業、および公衆衛生の適用分野において微生物を同
定するために有用であると期待される。

【００５０】Ｂ．臨床用途１）一般論本発明は、臨床微生物学において有用であることが期待される。この分野に関
して、本発明は特定の患者が患っている細菌性、ウイルス性、真菌性および原生
動物性疾患の診断を補助するために有用であり、特にどの化学薬剤が特定の患者
に感染している特定の生物または生物種に対して有効であるかを決定するために
有用であることが期待される。

【００５１】２）細菌の同定本発明は、核酸類似体の摂取が可能な方法で細菌を培養することができる限り
、病原性または非病原性にかかわらず、どんな細菌に関しても使用することがで
きる。本発明の使用は、たとえばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ
やＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどの生物の抗生物
質耐性株を迅速に同定する場合に有用であることが期待されており、任意にどの
抗体または抗体の組合せが患者の感染している細菌の特定株に感受性であるかを
決定することにも使用することが可能である。さらに、本発明は同一の臨床症状
を有するが原因病原体が異なり、好ましい治療方針が異なる可能性のある疾患を
区別する場合に有用であろう。

【００５２】３）真菌の同定本発明はまた、病原性および非病原性真菌の同定、ならびにどの薬剤が患者の
感染している真菌に対して有効であるか否かを決定する場合に有用であることが
期待される。真菌はヒトにおいて日和見感染および原発性の感染（「真菌症」）
の原因となる（「原発性」病原体とは正常な宿主において感染を確立することの
できる病原体のことである）。一般には、Ｓ．Ｂａｒｏｎ等著Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１９９１（ＣｈｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉ
ｎｇｓｔｏｎｅ、ニューヨーク）のＴ．Ｊ．ＷａｌｓｈおよびＤ．Ｄ．Ｄｉｘｏ
ｎ、ＳｐｅｃｔｒｕｍｏｆＭｙｃｏｓｅｓ（以後「Ｂａｒｏｎ」と称する、
Ｂａｒｏｎはそのまま本明細書に参考として援用している）を参照のこと。Ｈｉ
ｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕｌａｔｕｍのような原発性病原体およびＣａｎ
ｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓまたはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍ
ａｎｓによって生じる日和見真菌症による全身性「深在性」疾患は、命を脅かす
。本発明はこのような感染およびその他の真菌性感染の診断および適切な治療の
決定の一助となることが期待される。

【００５３】４）寄生虫感染本発明はまた、寄生虫感染に関して有用であることが期待される。単細胞原虫
および多細胞蠕虫による感染は毎年１０億例に及び、広範囲にわたる疾患の原因
となっている。本発明は、原虫寄生の少なくともいくつか、特に最終的診断に培
養を必要とするＮ．ｆｏｗｌｅｒｉなどの診断に有用であろう。本明細書でさら
に記載したように、ヌクレオチド類似体を摂取させ、細胞を溶解して結合剤によ
って捕獲される類似体を取り込んだ核酸を暴露するようにして培養することので
きる寄生虫による感染の、適切な治療の決定に広く有用であることが明らかとな
ろう。たとえば、年１００万から２００万のマラリアによる死亡例の大部分に関
連している生物、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、いくつかの
地域では治療で第１系統の薬剤であるクロロキノンに対して耐性となっている。
本発明は、それぞれに感染した寄生虫がどの薬剤に対して感受性であるかを決定
する場合に有用であろう。

【００５４】５）ウイルス感染本発明は、ウイルス感染の診断、ならびに特定のウイルスが感受性を示す薬剤
の決定に有用であろう。この点に関して、本発明はヌクレオチド類似体を取り込
ませるようにして培養することのできるウイルスによって感染したことを、診断
または確認する場合に有用であることが期待される。培地で生長できるウイルス
の例には、ＨＩＶなどのレンチウイルス、デング熱ウイルスおよび黄熱ウイルス
などのｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ、呼吸系発疹ウイルス、乳児に感染する重篤な病原
体、および単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ）、エプスタイン−バーウ
イルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、帯状疱疹および水痘の原
因病原体、およびサイトメガロウイルスが含まれる。

【００５５】Ｃ．新しい化学薬剤のスクリーニング前述のように、本発明は患者に感染している特定株の生物の化学薬剤に対する
感受性を決定するために使用することが可能である。しかし、本発明はまた、微
生物を殺すまたは生長を抑制する薬剤としての潜在的効力について、新規の化学
組成物および今まで抗生物質として使用されなかった化学組成物をスクリーニン
グする場合に、重要な用途を有する。これを使用することは、製薬会社および公
衆衛生機関が、病原体が既に使用されている薬剤に対して耐性を持つことができ
るよりも速く、新しい薬剤を開発しようと努力する場合に、非常に価値があると
期待される。

【００５６】一般に、本発明は、ヌクレオチド類似体の取り込みを可能とし、その後溶解し
て核酸類似体を取り込んだ核酸を捕獲することができ、適切なプライマの設計を
させるために十分な配列情報が得られるように培養することができる生物に関し
て、このようなスクリーニングのために使用することができる。本発明は、１回
は抗生物質存在下、もう１回は非存在下で行う一連の繰り返し段階によって実施
されるが、より一般にはスクリーニングは、生物の培養物を多数に等分すること
を含む。次いで関心のある化学組成物（試験する薬剤）を第１群の部分標本に注
入する。一方第２群の部分標本は試薬を添加しない対照とする。次いで、第１の
、試験群の各部分標本に取り込まれたヌクレオチド類似体の相対的な量を、第２
の対照群で薬剤を存在させて生長した生物に取り込まれた量と比較して、試験す
る薬剤の相対的効果を測定することができる。所望するならば、このアッセイは
また、現在知られている薬剤に対して新しい薬剤の効果を比較するために、問題
となっている生物に対して効果的であると考えられる一種または複数の現行の薬
剤を添加した部分標本をさらに伴って実施することができる。また、かなり大量
に培養することができる微生物については、数多くの部分標本を平行して培養し
検査して、一度に大量の可能性のある薬剤を試験することが可能である。この性
能は、このような試験の能率を上げ、費用を削減すると期待される。

【００５７】Ｄ．様々な生物の存在を検出する場合の使用本発明は、生きた病原体が存在するかどうかを検出する場合において重要な役
割を果たすことが期待される。このような使用の１つは、加工食品、特に挽肉お
よびその他の肉製品において、生きた細菌の正体を検出することである。有意の
汚染の存在を迅速に確認または反証することができると、たとえば汚染の可能性
があるが、問題となる肉またはその他の食品が試験時には生きた細菌で汚染され
ていないことが確実に示されない場合に、挽肉またはその他の食品の破棄または
回収の必要性を減じたり、または排除したりすることが可能である。本発明はま
た、食品加工工場、病院、研究所、およびその他の施設において、表面に病原体
がないかどうか、またはさらに厳重な滅菌または抑制方法が必要とされるかどう
かを決定するために、有用であることが明らかとなろう。

【００５８】Ｅ．公衆衛生監視前に示唆したように、浜辺沖の海におけるＥ．ｃｏｌｉなどの大腸菌の存在は
、しばしば処理していない下水の存在を示すマーカーとして使用される。本発明
は、まず試料中の種々の微生物を単離することなく、大腸菌が存在するかどうか
、および存在することが以前に発見されている場合は、生物が現在存在していな
いかどうかを決定する、水試料の一般的検査に有用であろう。

【００５９】他の利用では、本発明はまた、上水道におけるＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍの存在を決定するために使用することができる。免疫無防備状態の人の命を脅
かすことのできる生物の存在について、自治体の上水道を試験する重要性は、１
９９３年にミルウォーキーの上水道が汚染されて、その結果その発生が制御され
るまで何十万もの住人が飲み水を沸騰することを余儀なくされたことによって強
調された。本発明はまた、自治体の上水道およびその他の水を、その他の病原体
が存在することについて試験することができるようになるであろう。幸いにコレ
ラは米国ではあまり公衆衛生の問題となることはないが、本発明は、やはり試料
に存在する可能性のある種々の他の微生物から単離することなく、上水道でコレ
ラの原因菌であるＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅの存在を検出するために使用
することができる。

【００６０】ＩＶ．アッセイ形式特定のアッセイ形式の選択は本発明には重要ではなく、むしろ使用者の都合に
左右される。最も広範な使用では、本発明によるアッセイは、試料中の生物の生
存力を決定するために使用することができる。他の実施形態では、試料中の微生
物の公知の化学薬剤に対する感受性を試験するため、または可能性のある新しい
化学薬剤が、病原体などの特定の生物に対して抑制効果または生長抑止効果を有
するかどうかを決定するためにアッセイを使用することができる。

【００６１】一般的なアッセイ形式は、微生物の化学薬剤に対する感受性を決定することに
特に関連して記述することができる。説明を簡単にするために、微生物を細菌と
仮定するが、当業者が使い慣れた変更を加えて真菌、原生動物およびウイルスを
使用することができる。（たとえば、ウイルスは細胞内の寄生物であり、従って
一般的には水性培地よりも細胞培養物で生長する。さらに、個々のウイルスは細
胞としてよりもビリオンとして知られている。同様の修正が、真菌および原生動
物について必要である。当業者はこれらの相違に慣れており、生物のそれぞれの
部類に使用する場合の以下の記述を容易に適応できよう。）

【００６２】まず、微生物の１つの母集団を少なくとも２種の副集団に分割する（微生物の
生存力のみを決定し、薬剤に対する感受性を決定しない場合は、母集団を分割す
る必要はない）。次いでこの副集団を、生長維持培地および核酸を合成する細胞
の核酸に取り込ませることができ、類似体を含む核酸類似体によって捕獲される
標識ヌクレオシド類似体の存在下で培養する。次いで、抗生物質、潜在抗生物質
、または化学薬剤（以後まとめて「薬剤」と称する）を少なくとも一種の副集団
の培地に添加し、少なくとも一種の副集団は薬剤のないままにする。次いで、微
生物を溶解して核酸を暴露し、標識核酸をリガンドまたは標識ヌクレオチド類似
体を認識することのできるその他の薬剤によって捕獲して、一般的には捕獲して
いない核酸を溶出または洗浄することによってこの捕獲した核酸を捕獲していな
い核酸から分離して、分離して捕獲した核酸を選択的に増幅して、薬剤または潜
在的薬剤の存在下で生長した微生物から得た核酸の濃度を、薬剤非存在下で生長
した微生物のものと比較する。

【００６３】本発明は、微生物のＤＮＡ（またはＲＮＡウイルスの場合はＲＮＡ）合成は、
その複製に先立つと言う概念に基づいている。したがって、微生物の生長に対す
る特定の化学薬物の作用の高感度かつ迅速な尺度は、微生物によるＤＮＡ（また
はＲＮＡウイルスの場合はＲＮＡ）合成に対するその化学薬物の効果である。し
たがって、化学薬物が阻害剤の場合、すなわち微生物の生長を抑制または妨害す
る場合は、その効果はＤＮＡ（またはＲＮＡ）合成の抑制または妨害となって現
れる。逆に言えば、微生物の生長を援助または刺激する化学薬物の場合は、その
効果はＤＮＡ（またはＲＮＡ）合成の維持または増加となって現れる。

【００６４】この目的のために使用するとき、分析する標本、たとえば血液、尿、口腔また
は膣スワブ、または細菌または原生動物を含むと考えられる食品または水試料を
入手する。まだ水性懸濁液の形態になっていない場合は、通常標本を本発明のプ
ロセスを行う前に水性培地に懸濁する。実行しようとする方法を実施させるため
に、十分な微生物の数が得られると仮定するならば、試料の大きさは重要ではな
い。さらに、試験試料と対照試料との間に差違を検出する本発明の方法のために
十分な数の細菌が存在すると仮定するならば、水性懸濁液に存在する細菌の数は
狭義にはクリティカルでない。しかし、分析を実施するために必要な時間は、微
生物の濃度が増加するにつれて減じることができる。標本の細胞濃度が低すぎる
場合は、遠心分離または培養などの公知の技術によって濃縮しても良い。

【００６５】以下の実施例では、一般に生物は飽和培養物の使用を可能とするために一晩培
養して生長させた。しかし、重篤な病気の患者においてどの抗生物質を使用する
かを決定するなど、場合によっては時間的に一晩の培養が可能ではなく、このよ
うな場合は試料を短期間培養してその後使用することはありうるであろう。

【００６６】本発明の分析技法を行う水性の細菌懸濁液には、細菌の生長を維持できる栄養
物が含まれることが望ましい。したがって、細菌は液体培養培地、特に「完全」
培養培地として知られる培養培地に懸濁することが望ましい。このような液体培
養培地は当業者によく知られている。

【００６７】本発明の第１段階には、一部の試料を、活性を測定する化学薬物を含んだ完全
液体培養培地に添加すること、および試料の他の部分を、化学薬物を含まない対
照である培養培地に添加することを含む。この培養培地は、通常最初の試料を調
製する場合に使用したものと同一である。試験培地および対照培地中に検出可能
な生長を得るために十分な物質があると仮定するならば、得られた混合物の大き
さはさほど重要ではない。他方、物質を一定に保つために試料の大きさを最小限
に抑えることが望ましい。一般的に、約２５０マイクロリットルから約１から２
ミリリットルの範囲の用量を有する分析試料が有用である。このような試料を形
成する場合、細菌懸濁液を適切な容器に入れた培養培地に添加し、それによって
約１０から１００倍に細菌懸濁液を希釈することが好ましい。たとえば、細菌懸
濁液１００μｌ試料は、液体培養培地約１ｍｌで希釈して分析標本を作成する。

【００６８】試験試料はまた、活性を測定する化学薬物を含む。抗生物質に対する細菌の感
受性を確かめるためにこの試験を使用するときは、この化学薬物は公知の抗生物
質であり、または抗菌活性を研究することが可能な実験的化学物質であることが
可能である。対照試料よりも試験試料中でヌクレオチド類似体が多く取り込まれ
ることによって効果が検出される場合、この化学物質はまた、細菌の生長を刺激
できるものであることが可能である。

【００６９】試験標本および対照標本を形成した後、細菌の生長を維持するために適した条
件下でそれらをインキュベートする。インキュベーションの時間は、検出可能な
生長が得られるために十分な時間であり、細菌種および試料中の生物の濃度など
の要因に応じて異なる。異なる生物は、生長速度が異なる。さらに、高濃度の細
胞または高濃度のヌクレオチド類似体が試料中に存在する場合、試験標本と対照
標本との生長速度の差違はより容易に測定される。しかし、一般にインキュベー
ションは少なくとも約３０分にすべきである。細菌の抗生物質感受性を迅速に臨
床的に測定する場合最も重要なことは、できる限りインキュベーション時間を短
くする条件にすべきことである。実施例では、微生物は約１時間半で早期対数期
まで生長する。しかしＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど非常に生長の遅い細菌
では、数日以上の時間が必要となる可能性がある。実施例６は、Ｍ．ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ複合体の一例をＢｒｄＵと２日間インキュベートした後、検出で
きたことを示している。特定の生物を検出するために必要な培養時間は、選択し
たヌクレオシド類似体、たとえばＢｒｄＵを生物の培養物に添加し、指定された
間隔で試料を採取するという単純時間経過アッセイによって容易に決定すること
ができる。また、生物にかかわらず、迅速な測定がアッセイの目的に必要でない
場合は、もちろん長いインキュベーション時間を使用することができる。

【００７０】試験標本および対照標本を期間中インキュベーションした後、ヌクレオチド類
似体を標本と得られた試料の両方に添加して、次いでさらに時間を追加してイン
キュベートする。以下の実施例では、一般に試料はさらに１時間インキュベート
した。前述したように、両試料中の細菌は新たに合成されたＤＮＡ内にヌクレオ
チド類似体を取り込み、対照標本と試験標本との細菌の類似体取り込み速度の差
違によって、細菌増殖に対する試験化学薬物の効果が測定できる。すなわち、こ
の化学物質が効果的な抗生物質である場合は、試験標本中の細菌による取り込み
速度が対照に比べて遅い結果となる。逆に、化学物質が細菌生長を刺激する場合
は、試験標本における類似体の取り込みが増加する結果となる。

【００７１】類似体を添加する時間を選択する場合、試料標本と対照標本との間に検出され
る差違が最大になるようにすることが有用である。したがって、類似体の添加は
一般に薬剤の添加後いくらか遅らせる。類似体を過程中早期、試験薬剤が試験細
菌に対する有意な効果を表す前の時点、すなわち発生したそれぞれの細菌集団の
大きさの差が有意になる機会が到来する前に添加する場合、差違の測定がより困
難になるだろう。他方、生じる類似体取り込みの差違を測定可能にするためには
、類似体添加後十分な時間をかけなければならない。概して、類似体添加の後の
インキュベーションは少なくとも約５分から約１時間の範囲にするべきである。
もちろん、特に取り込み速度の遅いことが予想される生長の遅い生物の場合は、
もっと時間をかけることができる。以下の実施例では、一般に類似体取り込みは
１時間とした。

【００７２】類似体の存在下でのインキュベーションに次いで、微生物を溶解して核酸を暴
露し、類似体標識核酸を捕獲し選択的に増幅し、その後微生物のそれぞれの類似
体取り込みを測定するために分析する。一般に、増幅した生成物はプローブとハ
イブリッド形成する。ほとんどの場合、プローブはＤＮＡである。プローブとし
て使用されるＤＮＡは、特定の生物に特異的な配列とするように選択することが
でき、またはある群の多くの生物に共通した配列とハイブリッド形成するように
選択することができる。このようなプローブの設計は当業者にとって公知であり
、以下の増幅方法により詳細を記述する。一般に、このプローブは、その後発色
体、蛍光体、またはその他の反応の基質として働くことのできる第２抗体によっ
て認識されるように標識されている。たとえば、このプローブは３’ＤＩＧ・オ
リゴヌクレオチド標識キット（ベーリンガー・マンハイム、ドイツ）を使用して
ジゴキシゲニンで標識されることができる。次いで、試料をアルカリホスファタ
ーゼ−またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ−結合抗−ジゴキシゲニン抗体と
インキュベートし、その後アルカリホスファターゼ結合抗体に対してはｐ−ニト
ロフェニルホスフェート、またはペルオキシダーゼに対してはテトラメチルベン
ジジン（ＴＭＢ）などの標識に適した基質でインキュベートする。その後、マル
チタイタープレート上で適切な波長で吸光度を読み取る。このような測定を行う
１つの方法を以下の実施例に記述するが、当業界で公知のその他の方法も使用す
ることができる。

【００７３】Ｖ．培養方法本発明を実施するために、試料中に存在する一種または複数の微生物を培養し
なければならない。微生物を培養する様々な方法があり、これらの各群のほとん
どの生物のための温度範囲、必要な栄養、ｐＨ耐性、酸素必要量、およびその他
の生長要素を含む問題に関する総括的文献が存在する。たとえば、全て参考とし
て援用した前記のＢａｒｏｎ，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｌ．等Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，１９９０（Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ），Ｚｕｃｋｅ
ｒｍａｎ，Ａ．等著、ＣｌｉｎｉｃａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、１９９４
（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、イギリ
ス）、Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．ａｎｄＦｅｎｎｅｒ，Ｆ．，ＭｅｄｉｃａｌＶｉｒ
ｏｌｏｇｙ、第４版、１９９４（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、サンディエゴ
、カリフォルニア）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．，ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉ
ｍａｌＣｅｌｌｓ、第３版、１９９４（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク
）、およびＦｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ，Ｈ．ａｎｄＷａｎｇｅｒ，Ｒ．
Ｒ．（著）、ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＶｉｒｏｌｏｇｙ、Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９７９）を参照のこと。関心のある微生物または
微生物類の特定の培養方法の選択は、本発明の部分ではない。唯一必要なのは、
培養方法によって微生物が培養培地からヌクレオチド類似体を摂取し、それらを
核酸に取り込ませることである。

【００７４】培養に必要なものの短い概説が例示可能である。多くの細菌性病原体および共
生体ならびにその他の病原体または共生生物は、通常体内で発見される部位の状
態に近似の状態で最適な生長を示す。たとえば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓは３０〜３７℃で、Ｅ．ｃｏｌｉは３７℃で、Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは３５〜３６℃で、および原生動物Ｎ．ｆｏｗｌｅ
ｒｉおよびＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓはそれぞれ３５℃および３２〜３９℃で最適
に生長する。ｐＨに関しては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはｐＨ７〜７．５で最適に生長
し、Ｅ．ｃｏｌｉはｐＨ６〜７で最も良く生長し、女性の尿生殖路でコロニーを
形成する様々なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は膣をｐＨ４〜４．６に維持する
。ＢａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓのＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏ
ｃｃｉおよびその他はこのような低いｐＨで生長することができる。

【００７５】培養の酸素必要性は大きく変化する。たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ、耐性嫌気性菌は酸素が存在してもしなくても同様に生長し
、一方ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍおよびＢａｃｔｅｒｉｏｄｅｓは酸素が存在する
と死ぬ偏性嫌気性菌である。微生物の培養の酸素必要性は当業界でよく知られて
いる。

【００７６】栄養必要性もまた研究されている。たとえば、Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓは、葉酸
などの８種のビタミンを生長に必要とし、アッセイする一種以外の全てのビタミ
ン必要物を過剰量含み、アッセイする物質を添加した培地で生物が生長すること
によって、実際に基質のビタミン含量をアッセイするために使用することができ
る。

【００７７】一般にウイルスは関心のあるウイルスにとって適切な植物または動物細胞（「
許容」細胞）で培養する必要がある。ウイルス調製およびアッセイについての例
となる実験計画は、ＨＳＶを使用した前記のＦｒｅｓｈｎｅｙのｐｐ４０２〜４
０３に教示されている。Ｆｒｅｓｈｎｅｙはさらに、ＨＳＶは多くのヒトおよび
動物細胞型で複製する一方、他のウイルスは特定の細胞型を必要とすることを述
べている。たとえば、ＣＭＶはヒト繊維芽細胞においてのみ複製し、一方Ｂｕｎ
ｙａｖｉｒｉｄａｅは両生類細胞系で複製し、ポリオーマウイルスはマウス胚細
胞で複製することを述べている。その他のウイルスの培養に必要な細胞型は、前
記のＢａｒｏｎおよび前記のＷｈｉｔｅａｎｄＦｅｎｎｅｒに記載されてい
る。

【００７８】原生動物は多様なため、培養に必要なものが異なる。たとえば、マラリア原虫
は細胞培養で生長し、一方非寄生アメーバＮ．ｆｏｗｌｅｒｉおよびＡｃａｎｔ
ｈａｍｏｅｂａは、いずれも日本脳炎の原因となることができ、暖かい新鮮なお
湯で生長することができる。

【００７９】ＶＩ．ヌクレオチド類似体および結合メンバー本発明はヌクレオチド類似体の存在下に微生物を培養することを必要とする。
好ましくは、本発明で用いられるヌクレオチド類似体は、細胞性ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ中に検出可能な量取り込まれた時に非毒性であるヌクレオチド類似体である
。特に、ハロデオキシウリジンが好ましいチミジンの類似体である。より好まし
くは、５−クロロ−、５−ブロモ−、または５−ヨードデオキシウリジンがチミ
ジンの類似体として用いられる。そして最も好ましくは、５−ブロモ−２’−デ
オキシウリジン（ブロモ−デオキシウリジンまたはＢｒｄＵ）がチミジンの類似
体として用いられる。

【００８０】ＲＮＡ（下記に示すそれぞれの組み合わせの左側に示したもの）またはＤＮＡ
（下記に示すそれぞれの組み合わせの右側に示したもの）に取り込まれることが
知られている以下の核酸類似体も、本発明に用いることが好ましい。６−アザウリジンおよび６−アザ−２’−デオキシウリジン３−デアザウリジンおよび３−デアザ−２’−デオキシウリジン５−アザシチジンおよび５−アザ−２’−デオキシシチジン８−アザグアニンおよび８−アザ−２’−デオキシグアノシン６−チオグアニンおよび６−チオ−２’−デオキシグアノシン６−メルカプトプリンおよび６−メルカプトプリン−２’−デオキシリボシド４−チオウリジンおよび４−メルカプト−２’−デオキシウリジン

【００８１】チオ−およびメルカプト−ヌクレオチド類似体の場合、結合メンバーの好まし
い実施形態は、固定化パラクロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）等のチオ−特異
性試剤である。ハロデオキシウリジン等の多くのヌクレオチド類似体に関する好
ましい実施形態において、結合メンバーは特異的なヌクレオチド類似体を認識す
る抗体である。特に好ましい実施形態において、結合メンバーはＢｒｄＵを認識
する抗体である。最も好ましい実施形態において、抗体はＢｒｄＵを認識するモ
ノクローナル抗体である。

【００８２】ＶＩＩ．溶解方法異なる微生物の細胞を溶解する方法およびこれらの核酸を得るためにビリオン
を溶解する方法について、数多くの技術が知られている。一般的に、標的微生物
に対して適切な如何なる溶解方法も、捕捉媒体に添加する前かまたは媒体自体に
より添加する前の何れかの捕捉段階で用いられる媒体と溶解物とが適合する限り
、本発明と関連して用いることができる。例えば、細胞をＮａＯＨに溶解させる
と、適切量の酸かまたは緩衝媒体を添加することによりＮａＯＨを中和しなけれ
ばならないか、または捕捉媒体は捕捉段階と関連して用いられる溶解物の量に対
して充分な緩衝剤の許容能力を有していなければならない。以下の実施例は溶解
にＮａＯＨを用い、続いて捕捉段階において緩衝媒体を使用する例を示している
。

【００８３】バクテリアは通常遠心分離法により集菌され、煮沸、超音波処理、アルカリ溶
解、有機溶媒への暴露、イオン性または非イオン性洗剤への暴露、またはリゾチ
ームまたはプロテアーゼＫ等の溶菌酵素への暴露を含む多くの方法の１つにより
溶解することができる。典型的な方法は、Ａｔｌａｓ，ＲおよびＢｅｊ，Ａ「Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａｌＰａｔｈｏｇｅｎｓｉｎＥｎｖｉ
ｒｏｎｍｅｎｔａｌＷａｔｅｒＳａｍｐｌｅｓＢｙＵｓｉｎｇＰＣＲ
ａｎｄＧｅｎｅＰｒｏｂｅｓ」（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ等編、ＰＣＲＰｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ１９９０（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、サンジエゴ、カリフォ
ルニア州）（以降「Ｉｎｎｉｓ」とし、Ｉｎｎｉｓの全てが参照として本明細書
に組み込まれる。））に示されている。以下の実施例には本明細書に報告してい
る検討に用いた２種のプロトコルについて詳述している。

【００８４】菌類を溶解する典型的な方法は、液体窒素中乳鉢と乳棒で菌類をすりつぶすこ
とをまず最初に行う（Ｌｅｅ，ＳおよびＴａｙｌｏｒ，Ｊ「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆＤＮＡｆｒｏｍＦｕｎｇａｌＭｙｃｅｌｉａａｎｄＳｉｎｇ
ｌｅＳｐｏｒｅｓ」（上記Ｉｎｎｉｓ中））。プロトコルはＰＣＲまたは他の
方法で菌類からのＤＮＡの抽出を更に教示している。

【００８５】例えばこれらを水中で煮沸することにより、原生動物類を溶解することができ
る。細胞を最初にペレット化してホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄
し、ＰＢＳで再懸濁し、そして９５℃で加熱ブロック中または３〜５分間煮沸し
てインキュベートする（Ｓａｉｋｉ，Ｒ「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ」（上記Ｉｎｎｉｓ中））。ＰＣＲを増幅に用いると、
細胞片を遠心分離法によりペレット化することができる。

【００８６】最初に上澄みまたは血液を５分間５００ｘｇで遠心分離し、遠心分離した上澄
みを除去し、そして細胞片を除去するために１０分間１０，０００ｘｇで再び遠
心分離することにより、組織培養上澄みからまたは血液中でウィルスを集菌する
ことができる。そしてウィルスをペレット化する前にＳＷ５０．１中４５分間５
０，０００ｒｐｍで、得られた上澄みを遠心分離する。そしてウィルスを標準法
によりＰＣＲまたは他の方法用に調製することができる（例えば、Ｋａｗａｓａ
ｋｉ，Ｅ「ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｆｒｏｍＢｌｏｏｄ，Ｃ
ｅｌｌｓ，ａｎｄＯｔｈｅｒＦｌｕｉｄｓ」（上記Ｉｎｎｉｓ中）参照）。

【００８７】ＶＩＩＩ．捕捉および分離方法Ａ．抗体捕捉方法ヌクレオチド類似体を取り込んだ核酸を捕捉する便利な方法の１つは、ヌクレ
オチド類似体上に存在するが、通常ＤＮＡおよびＲＮＡを構成する天然由来のヌ
クレオチド上には存在しない抗原決定基を認識する抗体を用いることである。ヌ
クレオチド類似体に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）の両方が当技術分野で知られている。例えば、ＢｒｄＵ等のハロデオキシウ
リジンに対するＭＡｂが１９８０年代初頭から知られており（例えば、Ｇｒａｔ
ｚｎｅｒのＳｃｉｅｎｃｅ、２１８巻、４７４〜４７５頁、１９８２年、参照）
、市販されている。他のヌクレオチド類似体に対する抗体は、標準プロトコル（
例えば、上記、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ参照）に従って作成することができ、そ
して天然由来のヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチド類似体の両方に共通の
抗原決定基を認識する抗体を排除するために、天然由来のヌクレオチドのパネル
に対して試験することができる。

【００８８】これらの試験に合格する市販の抗体を本発明に用いることが適切であると期待
される。しかしながら、異なる業者から市販されている抗体は非標識ＤＮＡに結
合しているバックグランドの量が異なることを見出した。このようなバックグラ
ンドの差異は、相対的に多量のＤＮＡを用いるかまたはよりＰＣＲサイクル（ま
たは同様の増幅段階）を回すのが望ましい適応例において、検出感度を下げるこ
とが出来た。これらの適応例において、予定する使用に耐えうるレベルのバック
グランドを何れが与えるのかを決定するために、異なる業者から市販されている
抗体を（例えば、ＤＮＡの一連の異なる希釈下でそれぞれの抗体を用いて、標識
および非標識の大腸菌ＤＮＡを試験することにより）試験することが望ましい。
本発明者等の試験において、シグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）よ
り供給される抗ＢｒｄＵ抗体は、最低量のバックグランド結合を示し、それゆえ
に好ましい。

【００８９】当技術分野で知られている多くの方法でヌクレオチド類似体を捕捉するのに抗
体を用いることができる。例えば、抗体はビーズまたはカラム等の固体支持体に
共有結合的にまたは他の様式で結合することができる。固体支持体に抗体をカッ
プリングする多くの方法が知られている。例えば、プロテインＡは特に抗体のＦ
ｃ領域に結合し、従って抗体は特にタンパクＡビーズまたはカラムにかまたはタ
ンパクＡで被覆した表面に結合する。希釈タンパクＡで表面をインキュベートし
、そして使用前にブロック溶液を添加しそして除去することによりこのような被
覆が日常的に行われる。

【００９０】ビーズ、カラムまたは他の表面は、抗体に結合する反応性基を含有させて化学
的に活性化することもできる。このような活性化に通常用いられるのは、カルボ
ニルジイミダゾール、臭化シアンおよびグルタルアルデヒドである。更には、抗
体は、抗体上に反応性基を配置して、例えば、カルボジイミド、縮合剤またはグ
ルタルアルデヒドにより活性化し、そしてビーズ、カラムまたは選ばれた他の固
体表面に暴露することができる。もう１つの方法として、抗体をビオチン標識す
ることができる。ビオチンは高い親和性でストレプトアビジンまたはアビジンに
結合するので、これらの材料のビーズを用いることができ、またはビーズ、カラ
ム、チューブ、または他の固体表面を被覆するためにこれらの材料を用いること
ができる（上記、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ参照）。ポリアクリルアミド
、多糖類、アガロース、またはポリアクリル酸ビーズ、または抗体が結合できそ
して抗原（ヌクレオチド類似体）を含む溶液または混合物となる他のビーズまた
は材料で、カラムを充填することもできる。この時抗原は大部分の物質が抗体に
結合せずにカラムを通過する間結合した抗体と接触することになる。

【００９１】チューブの側面にプロテインＡまたは他の材料が被覆されている実施形態では
、ＤＮＡが捕捉のためのチューブの壁に拡散していることが必要である。それゆ
え、大表面積を有しＤＮＡが拡散するよう距離が減少しているビーズまたは他の
微粒子を用いるアッセイは、チューブアッセイより高感度である。更に、ビーズ
および微粒子実施形態において、多くのビーズまたは微粒子はアッセイの全許容
量を増加させるのに適切である。磁性ビーズを用いると後の分離段階がより簡便
になる。

【００９２】一旦選択した抗体を固体支持体に結合させると、結合される抗体により特異的
に認識される如何なる抗原も許容する材料溶解液に抗体を暴露することによりア
ッセイが行われる。抗体が結合する表面が固体表面であれば、溶解液を表面上に
ゆっくり注ぎ入れることにより容易に行うことができる。抗体がストレプトアビ
ジンビーズに結合するのであれば、溶解液をビーズと混合し緩やかに攪拌するこ
とができる。抗体により認識される類似体を取り込んでいる如何なる核酸も、抗
体と結合することにより捕捉される。適当な期間経過後、典型的にはビーズを洗
浄して抗体と結合していない核酸を結合している核酸から分離し、そして免疫複
合体（抗体に結合した抗原）を適切な溶離条件下で分裂させる。ビーズまたは他
の材料をカラムに充填させるのであれば、ヌクレオチド類似体と抗体との間に免
疫複合体が形成されるよう溶解混合物を単純にカラムに通過させ、その後結合し
ていない材料を適切な溶離条件下で免疫複合体を崩壊させる前にカラムを洗浄し
て分離する。

【００９３】以下に示す実施例において、タンパクＡで被覆したＰＣＲチューブに免疫複合
体が結合する場合、増幅段階は最初に免疫複合体を溶離させずに行うことができ
る。しかしながら、使用する方法に依存して、増幅前に複合体を溶離する必要が
ある場合もある。多くの与えられた抗体−抗原反応に関しての適切な溶離条件は
、通常経験的に決定される（例えば、上記、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ、
５４７頁参照）。通常溶離剤はｐＨ１１．５の１００ｍＭトリエチルアミン等の
高ｐＨ試剤、ｐＨ２．５の１００ｍＭグリシン等の低ｐＨ試剤、ｐＨ７．２の５
ＭのＬｉＣｌ、１０ｍＭの燐酸塩等の高塩類試剤、１％ＳＤＳ等のイオン性洗剤
、２Ｍ尿素等の解離剤、３Ｍチオシアン酸塩等のカオトロピック剤、または１０
％ジオキサン等の有機溶剤から選択される。それぞれのタイプのこれらおよび他
の試剤に関する溶離前洗剤および集菌緩衝溶液は当技術分野において知られてい
る（例えば、上記ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ、５４９頁参照）。

【００９４】好ましい実施形態において、ＢｒｄＵで標識された類似体は、タンパクＡ被覆
０．５ｍｌ微量遠心分離チューブにより捕捉された免疫複合体および抗−Ｂｒｄ
Ｕ抗体により捕捉された。タンパクＡの濃縮原液をＰＢＳで１００μｇ／ｍｌに
希釈し、そしてそれぞれの微量遠心分離チューブに１００μｌを添加することに
よりチューブを調製した。チューブを４℃で終夜インキュベートし、タンパクＡ
溶液をピペットにより除去し、ブロッキング溶液（１％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、０．２Ｍトリス、ｐＨ７．５、単一の標準ＤＮＡ５０μｇ／ｍｌ）２５
０μｌを少なくとも５分間、ただし１時間を越えない時間かけて添加した。この
ように調製されたチューブはすぐに用いるかまたは４℃で保存して用いることが
出来た。

【００９５】タンパクＡは抗ＢｒｄＵ抗体に対して直接結合するという利点を有しているの
で、抗体に結合することが当技術分野で知られている他の方法が本発明に作用す
ることを示すために、ストレプトアビジンも容器用被覆剤として検討した。スト
レプトアビジンは極めて高いビオチンへの結合性と並外れた安定性の両方を有し
、製造キットにまたは後に使用する材料を調製するのに価値があった。

【００９６】ストレプトアビジン標識チューブを用いて検討を行った。最初に、ＢｒｄＵ標
識ＤＮＡに抗ＢｒｄＵ抗体を吸着させた。そして抗マウス特異性を有するビオチ
ン化二次抗体を添加した。この段階は二次抗体「ブリッジ」を通して抗ＢｒｄＵ
抗体をビオチンで標識するのに効果的であった。最終的に全ての複合体は免疫結
合性捕捉およびＰＣＲとしてストレプトアビジン標識チューブに吸着された。本
システムが抗ＢｒｄＵ抗体により認識される標識核酸を結合するタンパクＡシス
テムと同様に効果的に作用することをこの結果は示した。

【００９７】最後に、表面への結合を含まない当技術分野で知られている方法によって、免
疫複合体を溶液から除去することができる。例えば、抗体は、磁性のまたは常磁
性の材料、および一方の面に磁性を与えることにより媒体中他の材料から分離さ
れた複合体に結合し、そして適当な時間の後磁性に対して転移しない材料を除去
することができる。

【００９８】Ｂ．非抗体ベースの捕捉方法使用したヌクレオチド類似体に依存して、ヌクレオチド類似体を取り込んでい
る核酸は抗体よりも他の方法で捕捉されうる。例えば、使用に選ばれたヌクレオ
チド類似体がチオ−またはメルカプト−類似体であると、パラクロロメルクリ安
息香酸（ＰＣＭＢ）により捕捉されうる。ＰＣＭＢは上述のようにビーズまたは
カラム等の固体支持体上に固定化され、洗浄して溶解液中結合していない核酸お
よび他の材料を、および類似体とＰＣＭＢ／類似体との間の結合を除去し、そし
てシステイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはメルカプトエタノール等の
過剰のチオール化剤により、分析用に結合類似体を遊離させるため分裂させた。

【００９９】Ｃ．分離プロセス多くの分離法が適用でき、また当技術分野でよく知られている。捕捉された核
酸を捕捉されてない核酸から分離する多くの方法、カラムからの溶離、捕捉され
た核酸が結合しているビーズまたは他の固体表面の洗浄、および磁性分離は既に
上述した。他の常法としては遠心分離による沈殿化および免疫性沈殿化が含まれ
る。使用する分離方法は重要ではないが、簡便であるべきである。好ましい分離
方法は以下の実施例に示す。

【０１００】ＩＸ．捕捉されたヌクレオチド類似体の増幅Ａ．導入一旦捕捉されると、ヌクレオチド類似体を取り込んだ核酸は検出前に増幅され
る。核酸増幅法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば欧州特許
第０３２０３０８号等のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、例えば欧州特許第０５２
５８８２号等の核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介複製（ＴＭＲ）
および例えば欧州特許第０６２３６８２号等のストランド置換増幅（ＳＤＡ）を
含む。

【０１０１】おそらく現行の最も一般的な核酸増幅法はＰＣＲである。ＰＣＲを行うための
熱サイクラーが多くの研究室に既にあり、試薬が広く市販されており、そして技
術者および他の病院や実験室の職員が既にそれを行うよう訓練されているので、
ＰＣＲは捕捉された核酸を増幅する好ましい方法である。ＰＣＲは核酸分子の指
数関数的複製を引き起こすため、ＤＮＡポリメラーゼ、反対の感覚のプライマー
分子、および熱循環のラウンドを利用する。この方法は例えばＭｕｌｌｉｓ等の
米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。

【０１０２】本発明を実施するに当たり用いることができる他の増幅方法の多くは、上述し
た方法を含み、核酸を複製するため触媒的にＲＮＡを利用する増幅方法（米国特
許第４，７８６，６００号）、ストランド置換に基づく増幅システム（Ｗａｌｋ
ｅｒらの欧州特許第０４９７２７２号参照）、および異なる転写ベースの増幅方
法である。Ｍａｌｅｋの国際特許第９１／０２８１８号、Ｋａｃｉａｎ等の米国
特許第５，３９９，４９１号、Ｋａｃｉａｎ等の欧州特許第０５８７２６６号、
およびＭｃＤｏｎｏｕｇｈ等の欧州特許第０５８７２９８号が後者のものである
。前述した全ては参照として組み込まれる。

【０１０３】これらの方法の多くもＲＮＡの増幅が可能である。例えば、参照として取り込
まれるＭａｒｓｈａｌｌの米国特許第５，６８６，２７２号にはＬＣＲを用いた
ＲＮＡ配列の増幅が記載されている。または、ＲＮＡはＤＮＡ中に逆転写され、
そしてＬＣＲ、ＰＣＲ、または他の方法により増幅される。ＲＮＡの逆転写を行
う典型的なプロトコルは米国特許第５，７０５，３６５号に示されている。ＲＮ
Ａの増幅またはＲＮＡから逆転写されたＤＮＡの増幅を、ＲＮＡゲノムを用いる
生存するウィルスの存在の検出、または現在または潜在的な抗ウィルス剤へのこ
の種のウィルスの応答の検出と関連させて本発明に用いると有用である。

【０１０４】前述のような増幅方法は試料中少数の核酸検体分子を検出できる。例えば、増
幅反応を行うことにより、そして増幅された反応生成物（単位複製配列）を検出
するために標識プローブで核酸ハイブリッド形成法を用いることにより、試料中
の少数の特異的な核酸の存在を決定することができる。これにより試料中の微生
物の種類を素早く決定することができる。

【０１０５】Ｂ．ＰＣＲおよびプライマーの設計と選択上述のように、ＰＣＲは本発明の方法で用いられる、捕捉された核酸を増幅す
る好ましい方法である。ＰＣＲを行う基本的な方法論やプロトコルはよく知られ
ている（例えば、ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆＰＣＲｓ」（上記Ｉｎｎｉｓ中））。ＰＣＲは、プライマーに補完的な
ＤＮＡの領域がテンプレートＤＮＡ中に存在するかどうかを決定するのに選択さ
れたテンプレートＤＮＡとプライマーを用いることを含む。プライマーの選択と
設計はアッセイの目的に依存して変わる。

【０１０６】効果的かつ特異的なプライマーを選択する一般的な指針は当技術分野において
知られており、例えば、Ｓａｉｋｉ「ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｅ
ｎｏｍｉｃＤＮＡ」およびＣｏｍｐｔｏｎ「ＤｅｇｅｎｅｒａｔｅＰｒｉｍ
ｅｒｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（共に上記Ｉｎｎｉｓ
等中）に記載されている。医者の選択で、プライマーは全遺伝子メンバー等の多
くの生物に共通の配列や特殊な種に特異的な配列を増幅するために設計すること
ができる。

【０１０７】多くの伝染病の一種に苦しむ患者から試料を採取すると、異なるプライマーの
パネルで平行して試験することにより、試料中の微生物の同定が素早く行われる
。多種の医薬に抵抗力のあるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の特異な病原体に
より患者が伝染しているのかどうかを決定することがアッセイの目的であれば、
特異な病原体からの配列を選択的に増幅するために、その生物に特異的なプライ
マーを用いることができる。もう１つの方法として、多数の一群の生物を増幅す
るよう変質したプライマーを選ぶことができ、または一連の微生物に共通した遺
伝子からの配列を増幅するようプライマーを選ぶことができる。そして存在する
特殊な微生物の同定は、ゲル電気泳動、サザン・ブロット法等の当技術分野で知
られている多くの方法の何れかによりあるいは個々の種または株に特異的な増幅
された、捕獲プローブを用いることにより決定することができる。

【０１０８】下記の実施例はこのような同定法を示す。多くのバクテリアで見られる遺伝子
を増幅する１組のプライマーは、腸内細菌、大腸菌、および２種の異なる経口バ
クテリアからの核酸を増幅するのに用いられる。特殊な生物に特異的であるＰＣ
Ｒ生成物中の配列とハイブリッド形成する捕捉プローブを用いて、培養液中の個
々の生物を同定した。プライマーおよび捕捉プローブがこれらの補完的な配列と
ハイブリッド形成する特異性は、培養された多種微生物を含む試料、および個々
の微生物の純粋な培養液を得るために種を最初にプレートアウトする必要なく同
定された多くの微生物にみられている。

【０１０９】多数の生物の配列を増幅するのに適切なプライマーが知られている。例えば、
ヒトパピローマウイルス、エンテロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ＨＴ
ＬＶ、およびＣＭＶを同定するための一般的で特異的な配列は上記Ｉｎｎｉｓ等
の３９から４４章に示されている。これらの生物において適切なプライマーが公
表されていない場合、生物のゲノムの配列部分からプライマーを選択することが
できる。特異的なプライマーの設計を行うために不充分だが配列情報が現在入手
できる比較的数少ない生物は、充分な配列情報が入手できるようになるよう本発
明の方法に用いることができる。

【０１１０】Ｃ．ＬＣＲＬＣＲはヌクレオチド類似体を取り込んでいる捕捉核酸を増幅するもう１つの
方法である。独特の方法で標的ＤＮＡ配列に２つの隣接するオリゴクレオチドプ
ローブの第１の組をアニーリングし、そして標的ＤＮＡ配列に向かい合う配列と
ハイブリッド形成する相補的なオリゴクレオチドプローブの第２の組をアニーリ
ングして、標的配列を含むＤＮＡテンプレートの加熱変性を繰り返し循環するこ
とによりＬＣＲが行われる。その後、熱安定性ＤＮＡリガーゼはそれぞれの対の
隣接するプローブを共有結合的にリンクし、２つの隣接するプローブの接合点で
相補的に完結している。一周期からのオリゴヌクレオチド生成物は次の周期に基
質として働くので、ＰＣＲ中としてシグナルは指数関数的に増幅される。ＬＣＲ
は、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等のＳｃｉｅｎｃｅ、２４１巻、１０７７〜１０８０頁
（１９８８年）、Ｗｕ等のＧｅｎｏｍｉｃｓ、４巻、５６０〜５６９頁（１９８
９年）、ＢａｒａｎｙのｉｎＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ、１巻、５〜１６頁（１９９１年）、およびＢａｒａｎｙのＰｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１８９〜１９３頁（１９９１
年）に広範囲に渡って記載されており、これら全ては参照として取り込まれる。
ＬＣＲの使用を示す典型的なプロトコルはこれらの引例に、また新規なリガーゼ
に関連して、米国特許第５，７００，６７２号に教示されており、これらも参照
として取り込まれる。

【０１１１】Ｘ．増幅された核酸の検出Ａ．概要一旦増幅されると、増幅された核酸は、実施者の好みにより、当技術分野にお
いて知られた多くの方法の何れかにより検出することができる。例としてＰＣＲ
を用いると、標識ヌクレオチドプライマーを用いることにより、またはもう１つ
の方法として適当に標識されたプローブへの生成物配列のハイブリッド化を検出
することにより、ＰＣＲ生成物を検出することができる。

【０１１２】Ｂ．プローブおよびプライマーの標識典型的には、プライマーはビオチンでまたは多くの蛍光染料の何れかで５’終
端を標識される。プローブは通常西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアル
カリ性ホスファターゼ等の酵素で標識される（ＬｅｖｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎ
ｇ「ＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙＬａｂｅｌｅｄＰｒｏｂｅｓａｎｄ
Ｐｒｉｍｅｒｓ」（上記Ｉｎｎｉｓ中）参照）が、例えばビオチン−ソラレン
でも標識される（例えばＨｅｌｍｕｔｈ「ＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃＤｅｔｅｃ
ｔｉｏｎｏｆＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔｓ」（上記Ｉｎｎｉｓ中）参照）。プ
ライマーを標識しそして酵素標識プローブを合成するプロトコルの詳細な例は、
上記ＬｅｖｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎｇに示されている。上記Ｈｅｌｍｕｔｈに
はＨＲＰでまたはビオチン−ソラレンで標識されたプローブとハイブリッド形成
されたＰＣＲ生成物の存在を検出するプロトコルが示されている。使用するオリ
ゴヌクレオチドプローブに適したハイブリッド化条件を如何に決定するかについ
て、および厳密性を含んで、そのプローブの使用に適したものに条件を如何に適
応するかの両方について、プロトコルは実施者に教示している。またはプローブ
は放射性同位体で標識することもできる。放射性的に標識されたＤＮＡおよびＲ
ＮＡプローブを合成する典型的なプロトコルは、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２
版、１９８９年（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＰｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に示されてお
り、ここに参照として取り込まれる。通常、³²ＰがＤＮＡおよびＲＮＡプローブ
を標識するのに用いられる。

【０１１３】Ｃ．ＰＣＲ生成物を検出する典型的なプロトコルＰＣＲ生成物を検出する多くの方法が知られており（例えば上記Ｈｅｌｍｕｔ
ｈ参照）、これは非同位体的に標識したプローブを用いてＰＣＲ生成物を検出す
るプロトコルを詳細に示している。一般的に、プローブとＰＣＲ生成物とのハイ
ブリッド化を許容する段階であり、その後検出を許容する１つまたはそれ以上の
発育段階となる。

【０１１４】例えば、ビオチン化ソラレンプローブを用いると、ハイブリッド化プローブは
ストレプトアビジンＨＲＰ接合体でインキュベートし、そしてテトラメチルベン
ジジン（ＴＭＢ）等の色原体でインキュベートする。もう１つの方法として、実
施者が放射性で標識されたプローブを用いることを選択すると、ＰＣＲ生成物を
プローブがハイブリッド化されることでオートラジオグラフィーにより検出する
ことができる。他の例として、ビオチン化ｄＵＴＰ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ
ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州）を増幅中に用いるこ
とができる。そして標識されたＰＣＲ生成物はアガロースゲル、サザンブロット
法でナイロンフィルタに適用でき、そして例えばストレプトアビジン／アルカリ
性ホスファターゼ検出システムにより検出することができる。取り込まれビオチ
ン化されたｄＵＴＰを検出するプロトコルは、例えばＬｏらの「Ｉｎｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄｄＵＴＰ」（上記Ｉｎｎｉｓ
中）に示されている。最終的に、ＰＣＲ生成物はアガロースゲルにおよび核酸を
特異的に認識する臭化エチジウム等の染料により検出された核酸に適用できる。

【０１１５】ＸＩ．キット本発明はキットを用いることにより簡便に実行することができる。キットは本
発明を実行するための部品を供給者の選択で含んでいてもよい。キットには、例
えば、培養皿、微量遠心分離チューブまたはＥＬＩＳＡプレート等の１つまたは
それ以上の容器を含んでいてもよい。類似体を取り込んでいる核酸および抗−類
似体抗体の免疫複合体を結合するための容器は、タンパクＡ、ストレプトアビジ
ン、または免疫複合体を容易に結合する他の材料で事前に被覆してもよい。例え
ば、ビオチン化抗体を用いると、容器をストレプトアビジンで事前被覆してもよ
い。更に、キットはスタヒロコッカス種等の微生物またはＳ．アウレウス等の特
殊な種の選択された群の存在を同定するためのプライマーを含んでいる。キット
は、増幅段階を行うための試剤等の、本発明に用いられる１つまたはそれ以上の
試剤を含んでもよい。おそらく、キットは、包装上または包装内の品目上のラベ
ルにかまたは折り込みとしての何れかで、本発明を実施するための取扱説明書を
含んでいる。

【０１１６】（実施例）以下の実施例は例示のためのものにすぎず、何ら制限を与えるものではない。
本質的に同様の結果が得られるよう変更または修正しうる多くの非臨界的なパラ
メータがあることは、当業者は容易に認識するであろう。

【０１１７】実施例１本実施例は、大腸菌によるＢｒｄＵの取り込みおよびＢｒｄＵで標識された核
酸を検出することができることを示すものである。読者にとって便利なように、
方法の略図を図１に示す。

【０１１８】Ａ．方法および結果大腸菌細胞（ＡＴＣＣ番号３３６９４、より一般的に文献で参照され、以降菌
株ＨＢ１０１とする）をＬ−培養液（ルリア培養液：１リットル中、バクト−ト
リプトン（ディフコ社、アンアーバー、ミシガン州）１０ｇ、イースト抽出物５
ｇ、ＮａＣｌ５ｇ）中成長させた。終夜で飽和に培養した後、細胞０．０４ｍ
ｌを新鮮なＬ−培養液４ｍｌに添加した。細胞を初期の対数期になるまで（大腸
菌では通常１から１．５時間）、３７℃で約９０分間振盪した。そして、１００
ｍＭのＢｒｄＵ０．０４ｍｌを添加し、濁度で決定したように、細胞は培養液が
飽和になるまで成長した。

【０１１９】ＤＮＡ精製を以下のように行った（このプロトコルは化学的分裂法として以下
の実施例に示している）。細胞を培養液２ｍｌから微量遠心管中で回転させた。
これをＴＥＮ（蒸留水中、トリスＨＣｌを５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡを５
０ｍＭ、ＮａＣｌを１００ｍＭ）１００μｌに再懸濁させた。ＴＥＮを１００μ
ｌとリゾチームを５ｍｇ／ｍｌとの混合物を添加し、得られた混合物を室温下５
分間培養し、この時点で更にＴＥＮを２００μｌとＳＤＳを２％添加した。懸濁
液は透明であり、極めて粘稠性になった。この時点で、３Ｍの酢酸ナトリウム０
．１容量（ｐＨ５．５）と等容量のフェノール／クロロホルムを添加し、穏やか
だが徹底的に混合して、懸濁液を得た。そして混合物を少なくとも２分間１３，
０００ｘｇで回転させた。上方の水相を取り除き、そこにＥｔＯＨを２．５容量
添加し、よく攪拌した。ＤＮＡは糸状の沈殿物を形成した。ＤＮＡを１３，００
０ｘｇで２分間回転させてＤＮＡをペレット化し、ペレットに１００％ＥｔＯＨ
０．５ｍｌを添加し、１３，０００ｘｇで２分間回転させ、デカントし、風乾
して、１００μｌまたはそれ以上の水に再懸濁させた。ＤＮＡの濃度を使用前、
分光光度的（１Ｏ．Ｄ．＝５０μｇ／ｍｌ）に５００μｇ／ｍｌに合わせた。

【０１２０】ＤＮＡ２μｌ（水で１０μｌに希釈）を熱湯浴中２分間加熱して変性させた。
ＤＮＡを直ちに１％ＢＳＡで１：２００に希釈した抗ＢｒｄＵ抗体１００μｌ（
ベーリンガーマンハイム社）を含むチューブに添加した。混合物を室温下１時間
インキュベートした。そしてこの混合物をタンパクＡで被覆されたチューブに添
加し、更に１５分から１時間インキュベートした。抗体／ＤＮＡ混合物をピペッ
トで取り除き、５００μｌ量の洗浄緩衝剤（０．１Ｍトリス、ｐＨ７．５、０．
１％ツイーン）を添加し、その後チューブを逆さにして、緩衝剤を注ぎだした。
この洗浄段階を１回繰り返した。洗浄緩衝剤で２回洗浄した後、５００μｌ量の
ＰＢＳを用いて同様の方法によりチューブを２回洗浄した。残った緩衝剤をピペ
ッターで取り除いた。

【０１２１】ＰＣＲマスター混合物は、全容量１００μｌ中に、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
４）を２０ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂を２ｍＭ、それぞれｄＮＴＰを２００μＭ、それぞれプライマーを１μＭ（プライマーの選択は下記実施例のセ
クションＢに記載する）、およびＴａｑ−ポリメラーゼを１ユニット（ライフテ
クノロジー社）含有させて調製した。チューブを洗浄後、マスター混合物１００
μｌを添加した。混合物を鉱油でオーバーレイし、パーキンエルマーセトゥスサ
ーモサイクラーに配置させた。使用したプログラムは９４℃で１分、４０℃で１
分、７２℃で１分を３５サイクル、続いて７２℃で５分延長し、４℃に浸した。
そしてそれぞれの試料７．５μｌをＴＡＥ（トリスアセテート４０ｍＭ、ｐＨ８
．３、ＥＤＴＡ１ｍＭ）中１．５％アガロースゲルに溶解させた。

【０１２２】結果を図２に示す。図２の最初のレーンはＤＮＡを含有しない負のバックグラ
ンドコントロールである。次の２つのレーン（ＰＣＲと示したもの）は、Ｂｒｄ
Ｕで標識したＤＮＡ（図中「＋」と示したもの）かまたはＢｒｄＵで標識してい
ないＤＮＡ（「−」と示したもの）の何れかのＰＣＲ反応である。結果としては
、ＢｒｄＵで標識したＤＮＡは標識していないＤＮＡと同様に効果的に増幅され
ていることが示されている。次の２つのレーンは、免疫捕捉をタンパクＡで被覆
されていない容器中で行ったものである。極めて薄いバックグランドのみが得ら
れており、これは期待通り、免疫複合体を保持するいくつかの方法が抗体を用い
てアッセイを行う際に望ましいことを示している。次の２つのレーンは、抗Ｂｒ
ｄＵを添加しない免疫捕捉である。再び、ほとんどか全くシグナルは得られてい
ず、これも期待通り、標識された核酸を捕捉するいくつかの方法が望ましいこと
を示している。完全（標識されたＤＮＡへのＰＣＲの使用、タンパクＡで被覆し
たチューブの使用、および抗ＢｒｄＵの使用を示す）とマークしたレーン中、正
確な大きさの強いバンドがＢｒｄＵで標識されたＤＮＡで得られているが、標識
されていないＤＮＡからは得られていない。この検討は、ＢｒｄＵの存在および
非存在下で成長する細胞間を区別するのに免疫捕捉／ＰＣＲシステムが利用でき
ることを示している。

【０１２３】Ｂ．これらの研究で用いたプライマーおよびプローブの設計これらの研究において、一般的な戦略は、大腸菌や経口バクテリアの両方を含
む多くのバクテリア種から生成物を産出できる１組のプライマーを設計すること
である。大腸菌は特殊な操作を必要としないので、ある程度システムの有効性を
示す検討には好ましい。経口バクテリアは、大腸菌を用いて示された結果が一般
的に適応可能であることを示すために、および本発明が経口バクテリア等の生物
、これらは配列情報がほとんど入手できないので、これらに関して有効であるこ
とを示すために一部選択される。この部分の検討戦略は、種特異的捕捉プローブ
を用いて種を明確に同定するよう設計することである。

【０１２４】ＧｒｏＥＬ遺伝子は、その遺伝子配列がそれぞれ３つの標的経口バクテリアか
らおよび大腸菌において得られているので、これを選択した。加えて、ＧｒｏＥ
Ｌ配列は標的生物の特異的な同定に関して充分な系統学的情報を含んでいる。設
計されたプライマーを表１に示す。これらのプライマーは大腸菌、Ｐ．ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓおよびＡ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓから特異
的なＰＣＲ生成物を産出する。これらのプライマーはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａに
は作用しないことを見出したので、１組のプライマーをＦｌｇＥ遺伝子に対して
向けられた生物に関して選択した。本検討に用いた捕捉プローブに対して用いた
配列も表に示した。

【０１２５】

【表１】

【０１２６】ＰＣＲプログラムに４０℃のハイブリッド化温度を用いると、示した大腸菌プ
ライマーは大腸菌、Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓおよびＰ
．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからのＧｒｏＥＬ配列を増幅し、２４２ｂｐの増幅生成
物を産出する。Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａを用いたＦｌｇＥプライマーは５４２ｂ
ｐサイズのフラグメントを産出する。プライマーがハイブリッド化する配列に隣
接する３種中の配列を増幅するのにＧｒｏＥＬプライマーを使用すると、この３
種のバクテリア種は、３つの種の間で異なる増幅された配列中の領域とハイブリ
ッド形成する、表に示した３種の「捕捉プローブ」の使用により互いに区別され
る。

【０１２７】表１において配列ＩＤ番号１と同定されたＰＣＲプライマーは、付けられたフ
ルオレセイン標識を用いて合成された。下記実施例２で示した方法において、ハ
イブリッド化プライマーの存在によりフルオレセインで標識し、捕捉されたＰＣ
Ｒ生成物を検出できるようにした。勿論もう１つの方法として、この方法は、標
識されたＰＣＲプライマーよりもむしろＰＣＲ生成物を検出できるよう、標識シ
グナルオリゴ（期待されるＰＣＲ生成物とハイブリッド形成でき、そして標識の
ために官能基を有するオリゴヌクレオチド）を用いて行うことができる。

【０１２８】実施例２本検討は、同じ微生物の異なる菌株間での抗生物質に対する感度の差を決定す
るための本発明の有用性を示している。

【０１２９】大腸菌のナリジクス酸耐性菌（ＡＴＣＣ番号２７３２５、通常文献には菌株Ｗ
３１１０として示されている）およびナリジクス酸耐性菌（ＡＴＣＣ番号４７０
５６、通常菌株ＮＫ５８３０として示されている）を別々の容器内Ｌ−培養液中
でインキュベートし、初期の対数期まで培養した（通常大腸菌の場合１から１．
５時間で到達する）。１．５時間で、２つの培養液を別々の系列の容器中でイン
キュベートした。そしてそれぞれの系列の容器をグループに分けた。ナリジクス
酸を最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようそれぞれの系列の最初のグループに
添加した。テトラサイクリンを最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようそれぞれ
の系列の第２のグループに添加した。それぞれの系列の第３のグループには何ら
抗生物質を添加せずに、コントロールとした。そしてそれぞれの系列の全ての培
養液を更に１時間インキュベートし、その後ＢｒｄＵ１００ｍＭを添加し、そし
て更に１時間培養液をインキュベートした。

【０１３０】上記実施例１に示した方法により精製したＤＮＡかまたは以下のように調製し
た粗製の水酸化ナトリウム溶解液かのどちらかを用いて、免疫捕捉システムによ
り培養液を分析した。この方法によって溶解させたそれぞれの培養液をリゾチー
ム５ｍｇ／ｍｌの容量の０．１と混合した。５分後、バクテリアを同時に溶解し
、ＤＮＡを変性するため、試料と０．４Ｍの容量のＮａＯＨを添加した。ＮａＯ
Ｈを中和するのに充分な緩衝能力が捕捉溶液にある限り、この溶解液を少量（２
〜１０μｌ）免疫捕捉システムに直接用いることができた。

【０１３１】図３はこの検討で用いた大腸菌の２つの菌株に関する成長曲線を示している。
野性株Ｗ３１１０は３時間で飽和に達するけれども、ナリジクス酸またはテトラ
サイクリンの何れかは成長を阻害している。２．５時間時にＢｒｄＵを添加して
も成長プロファイルは変化しなかった。対照的に、ナリジクス酸耐性菌ＮＫ５８
３０も３時間で飽和に達する（これらの細胞は野生株よりゆっくり成長している
）が、ナリジクス酸を添加しても何ら成長への阻害は引き起こさない。しかしな
がら、これらの細胞は、株Ｗ３１１０と同様テトラサイクリンに対しては同様の
感度を示した。

【０１３２】免疫捕捉研究の結果を図４に示す。図４中、最初の２つのレーンはＤＮＡを添
加していない（−）か、または添加している（＋）ＰＣＲコントロールである。
表題Ｗ３１１０下にコントロールとして示した次の２つのレーン、および表題Ｎ
Ｋ５８３０下の対応する２つのレーンは、抗生物質を添加していない免疫捕捉ア
ッセイコントロールである。それぞれこれら対のレーンの最初において「−」と
示した試料は、細胞成長中ＢｒｄＵを添加しなかった試料である。これらのレー
ンは何れの大腸菌株でも極めて低いバックグランドであることを示している。こ
れら対のそれぞれにおいて二番目の「＋」レーンは、コントロールから媒体中Ｂ
ｒｄＵの存在下に成長させたものである。これらのレーンは強いシグナルを示し
、ＢｒｄＵの存在下だが抗生物質の非存在下で細胞が活発に成長していることを
示している。

【０１３３】それぞれの表題下の次の２つのレーンは、ナリジクス酸（＋Ｎａｌ）またはテ
トラサイクリン（＋Ｔｅｔ）の何れかの存在下で成長させた試料を示している。
Ｗ３１１０において、ナリジクス酸の添加はＤＮＡ合成を抑制し、それゆえ免疫
捕捉におけるシグナルが消失している。対照的に、ＮＫ５８３０では強く明確な
シグナルが得られており、抗生物質に対するこの菌株の耐性と一致している。対
照的に、テトラサイクリンの存在下で成長させると両方の菌株とも著しく明確な
シグナルが得られる。

【０１３４】そしてＰＣＲ生成物を検出した。下記のリストに使用した段階と試剤とを示す
。それぞれの段階の時間はリストの後の本文に示す。全ての段階は一定の混合下
マイクロタイタープレートのウェル中で行った。それぞれの段階でのインキュベ
ーション時間を適切に延ばすことにより、試料を混合せずにアッセイを行うこと
もできる。以下のそれぞれの段階はウェルからウェルへとストレプトアビジン被
覆ディップスティックを移動させることによって行った。

【０１３５】段階番号段階名容量方法段階１捕捉オリゴ２００μｌアッセイ洗剤（リン酸ナトリウム０．１
Ｍ、ｐＨ８．０／０．５％ツウィーン−２０）中ビオチン標識捕捉オリゴ２００
ｎｇ／ｍｌを添加した。段階２試料ウェル２００μｌトリス（ｐＨ８．０／ＥＤＴＡ１０ｍＭ
／３％Ｎ−ラウリルサルコシン／０．３％ＳＤＳ）５０ｍＭの塩基性溶液中グア
ニジンチオシアネート２Ｍを添加した。段階３アッセイ洗剤２００μｌ段階４アッセイ洗剤２００μｌ段階５接合体２００μｌトリス（ｐＨ８．０）を５０ｍＭ／Ｎａ
Ｃｌを０．１Ｍ／０．５％トリトンＸ−１００／２．２％ゼラチン中の抗フルオ
レセイン−ＨＲＰ抗体接合体２μｇ／ｍｌを添加し、５分間インキュベートした
。段階６アッセイ洗剤２００μｌ段階７アッセイ洗剤２００μｌ段階８基質２００μｌ業者（リサーチディアグノスティックス
社、ニュージャージー州）より供給された、適切な緩衝剤中のＴＭＢを添加した
。

【０１３６】ＰＣＲ生成物後のそれぞれの試料１０μｌを２分間９５℃に加熱し、２Ｍのグ
アニジンチオシアネートを含むマイクロタイタープレートの最初のウェルに添加
した。大腸菌（配列ＩＤ番号３）に特異的な捕捉プローブをＰＣＲ生成物の存在
を検出するのに用いた。捕捉プローブを１０分間吸着させ、ハイブリッド化を１
０分間行い、そしてシグナルプローブハイブリッド化を１０分間行った。１分間
洗浄後、接合体を５分間吸着させた。更に２回洗浄後、基質の反応を８分間行っ
た。ウェル中の青色は６５０ｎｍであった。

【０１３７】結果を図５に示す。図４に示したゲル分析にほぼ追随している。ナリジクス酸
での結果は、効果的に生物の抗生物質に対する感度や耐性が本発明を用いて如何
に区別できるかを示している。

【０１３８】実施例３本実施例は本発明が同一種の抗生物質感受性生物を用いて、混合物中抗生物質
耐性の微生物を検出するのに用いることが出来ることを示している。

【０１３９】これらの検討において、ナリジクス酸−耐性大腸菌株ＮＫ５８３０を種々の割
合でナリジクス酸−感受性菌株Ｗ３１１０と混合した。混合した培養液を終夜で
飽和し、新鮮なＬ−培養液で１：１００に希釈し、全種菌容量を４０μｌとした
。そして細胞を１．５時間成長させ、ナリジクス酸を添加した。更に１時間イン
キュベートした後、ＢｒｄＵを添加し、成長を３０分間継続した。そして免疫捕
捉実験を精製ＤＮＡまたは粗製の水酸化ナトリウム溶解液の何れかで行った。

【０１４０】結果を図６に示す。最初の２つのレーンは再び、ＤＮＡを添加していない（−
）かまたはしている（＋）かの何れかでのＰＣＲコントロールである。次の２つ
のレーンはコントロールと示されており、何も添加していない免疫捕捉アッセイ
コントロールである。最初のコントロールレーンで「−」と標識されている試料
は、細胞成長の間ＢｒｄＵを添加していない。このレーンは非常に低いバックグ
ランドの存在を示している。二番目の＋レーンは媒体中ＢｒｄＵの存在下にコン
トロールから成長したものである。このレーンは強いシグナルを示し、これは抗
生物質が存在しないとＢｒｄＵの存在下活発に成長することを示している。

【０１４１】次のレーンは、ナリジクス酸感受性菌株と種々の割合で混合した時にナリジク
ス酸耐性菌株を検出するためにアッセイが有用であることを示している。結果は
耐性生物が０．４％でさえ検出できることを示しており、これが試験される最低
のレベルである。

【０１４２】本発明は多くの抗生物質に対する大腸菌の感度を決定するのにも用いられる。
これらのアッセイで大腸菌の成長に大きく影響することが示された抗生物質はナ
リジクス酸、リファンピシン、およびゲンタマイシンであった。クロラムフェニ
コールは、抗生物質の非存在下に同一期間成長するコントロールに比較して、成
長を極めて抑制することを示している。ストレプトマイシンおよびテトラサイク
リンはほとんどか全く効果がなかった。アンピシリンは大腸菌株Ｗ３１１０を溶
解する。それゆえ、アンピシリンの効果はコントロールと比較して検出可能なほ
どのＢｒｄＵがない時に示された。

【０１４３】実施例４本実施例は多くの抗生物質に対する経口バクテリアの感度を決定するために本
発明を使用することを示している。

【０１４４】Ａ．ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓでの検討嫌気的（窒素８５％／二酸化炭素５％／水素１０％）に成長させたｐｏｒｐｈ
ｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ番号３３２７７）の飽和培
養液にヘミンを添加して修飾したてのＥＴＳＢ媒体（Ｓｙｅｄ，Ｓ．ＡのＪ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１巻、５２２〜５２６頁（１９８０年）参照）
中で１：１０に希釈し、嫌気的に６時間インキュベートした。そして培養液を等
分量に分割した。適切な数の等分量をコントロールとして保存し、媒体に添加す
る抗生物質を用いずにインキュベートした。残りは試験等分量として次の３種の
抗生物質、メトロニダゾール、ナリジクス酸、またはテトラサイクリン、の１つ
を媒体に添加した。全ての等容量を嫌気的に更に２時間インキュベートした。

【０１４５】２時間インキュベートした後、ＢｒｄＵをそれぞれのチューブに添加し、イン
キュベートを更に２時間継続した。そしてバクテリア培養液を化学的分裂により
または上述した粗製のＮａＯＨ溶解液法により溶解させ、免疫捕捉を抗ＢｒｄＵ
抗体を用いて行った。そして上記の実施例に示したプロトコルに従いＰＣＲを行
った。表１に示すＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに特異的な捕捉プローブを用いて試
料を処理した。

【０１４６】結果を図７に示す。これらはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓがテトラサイクリンお
よびメトロニダゾールに感受性があるが、ナリジクス酸には耐性があることを示
している。本試験は、このＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌株がメトロニダゾール
感受性およびナリジクス酸耐性があることを明確に示している。メトロニダゾー
ルおよびナリジクス酸はＤＮＡ合成阻害剤であり、それぞれ異なる阻害機構を有
している。テトラサイクリン上で成長させた培養液は淡いシグナルを与え、生物
が抗生物質に対して（コントロールに比較して）感受性があるのか（淡い陽性が
得られたので）耐性があるのかをシグナルが示しているかどうかを決定するには
更に検討が必要である。

【０１４７】Ｂ．Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓでの検討Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓはヒト病原体であると報告
されており、若年性歯周病に関係している。これらの検討において、Ａ．ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（ＡＴＣＣ番号４３７１８）の培養液を
ヘミンを媒体に添加しなかった以外は上記パートＡと同様に、嫌気条件下で飽和
するまで成長させた。培養液を新鮮な媒体中で１：１０に希釈し、嫌気的条件下
で更に４時間成長させた。この時点で、培養液を等容量に分割し、ＢｒｄＵを添
加した後２時間インキュベーションを行い、引き続き４℃冷却下で終夜保存した
以外は、本実施例のパートＡで行ったように、同じ試験プロトコルを行った。翌
日等分量の培養液を上述したＮａＯＨ溶解プロトコルに溶解し、ＰＣＲを行い、
そしてこの生物に対して表１に示した捕捉プローブを利用した。

【０１４８】結果を図８に示す。これらのアッセイで、Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃ
ｏｍｉｔａｎｓはナリジクス酸およびテトラサイクリンに感受性があり、メトロ
ニダゾールに耐性があることを示した。これは文献と一致しており、この文献で
は本生物がメトロニダゾールの代謝活性に必要な酵素活性を有しないことを報告
している。

【０１４９】Ｃ．Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａでの検討Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａも本発明を用いて検討した。これら
の検討において、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣ番号３５４０５）の培養液
を新鮮な媒体中に取り込み、ＮＯＳ媒体（ＡＴＣＣ媒体製剤１４９４）中１日間
嫌気的に成長させた。培養液をＢｒｄＵの添加前に約８時間インキュベートし、
ＢｒｄＵの添加後終夜インキュベートし、そして翌日試料を分析した以外は、本
実施例のパートＡと同様に培養液を成長させた。ＧｒｏＥＬプライマーセットが
入手できなくて、代わりにＦｌｇＥ００１およびＦｌｇＥ００６と言われるＦｌ
ｇＥ遺伝子（エンドフラゲラーサブユニットタンパク）用のプライマーセットに
した以外は、上述した方法でＰＣＲを行った。これらのプライマーは５４２ｂｐ
ＰＣＲフラグメントを引き起こすことが期待された。

【０１５０】アッセイ結果を図９に示す。これらはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａはメトロニダゾ
ールおよびテトラサイクリンに感受性があるが、ナリジクス酸に耐性があること
を示している。実験の誤りのため、負の免疫捕捉コントロールは入手できなかっ
た。しかしながら、メトロニダゾールの結果はＢｒｄＵ取り込みレベルがバック
グランドであること、すなわち抗生物質の存在下生物は検出しうる成長を示さな
かったことを示している。対照的に、ナリジクス酸では陽性のコントロールと等
価であるシグナルが得られた。負の捕捉コントロールは本実験では入手できなか
ったので、テトラサイクリンの結果を判断することは困難である。しかしながら
、テトラサイクリンがＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａＤＮＡへのＢｒｄＵ取り込みに影
響することは明らかである。

【０１５１】本発明の方法により抗生物質に対するこの生物の感受性を検討することができ
るのは、標準法を用いたトレポネメスの感受性試験が困難であるので特に興味深
い。この成功は抗生物質の感受性試験において本発明の極めて強力な本質を反映
している。さらに、本検討は特殊な生物に関するアッセイを最適化せずにアッセ
イを行うことができることを示している。しかしながら、当業者はアッセイを行
うために必要な時間を、興味ある特異的な微生物に関して、抗生物質またはＢｒ
ｄＵの添加等の多くの段階を行う最適時間を決定することにより最短化すること
ができることを認識している。このような決定は当業者により容易に行うことが
できる。

【０１５２】実施例５この実施例は、より大多数の他のバクテリア種とともに混合培養液中少数存在
するバクテリアの存在を検出するために本発明を使用することを示している。

【０１５３】Ａ．大腸菌とともにある混合培養液中のＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓの検出この実験では、早成種が成長が早すぎるかどうか、そしてこれがより遅い成長
種の検出をできなくするかどうかを検討するために抗生物質は使用しなかった。
ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓを遅い成長種として選択した。当量のヌク
レオチドの取り込みはＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓの場合大腸菌の場合に比べて約２
．５倍より長い時間を必要とする。それゆえ、大腸菌で成長の早い培養液を調製
することは容易である。この実験では、大腸菌Ｃ６００およびＰ．ｍｉｒａｂｉ
ｌｉｓの終夜で飽和させた培養液を種々の割合（大腸菌：Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉ
ｓの容量比１００：１，５０：１，２５：１，１２．５：１，６：１，３：１，
１．５：１）でＬ−培養液中に接種した。これらを３７℃で９０分間振盪しなが
らインキュベートし（この条件下での９０分は、大腸菌の対数期成長に入ってい
る）、その後ＢｒｄＵを１ｍＭの濃度となるよう添加し、細胞を３０分間インキ
ュベートさせた。細胞１ｍｌをペレット化し、全ＤＮＡを抽出して水０．１ｍｌ
に再懸濁させた。

【０１５４】それぞれの試料中のＤＮＡ１０％を免疫捕捉アッセイに用いた。それぞれの試
料のレプリカが大腸菌ＧｒｏＥＬプライマーを用いて増幅された１セットととも
に行われ、他の試料はＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓのｌｐｐプライマーを用いた。Ｐ
．ｍｉｒａｂｉｌｉｓでは、大腸菌に対するＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓが１００：
１において淡いシグナルが検出でき、それゆえ１：１００で通常のアッセイ感度
である。他の比では、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓは大腸菌を越える強いシグナルで
同定された。

【０１５５】Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓのｌｐｐプライマーは大腸菌の存在下Ｐ．ｍｉｒａｂ
ｉｌｉｓを増幅するのに特異的であることをこの結果は示している。更に、この
結果から本発明は第２の生物が１％の濃度で混合培養液中に存在する場合にも標
的生物を検出できることを示している。更に、ＧｒｏＥＬプライマーは大腸菌と
同様Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓを増幅することをこの結果は示している。低％で存
在するＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓが検出できるかどうかは疑問であるので、これら
の検討結果には影響しなかった。しかしながら、興味のない生物の非特異的増幅
が結果の解釈を邪魔しないように、実験を設計するのが望ましいことをこれらの
結果は示している。これは注意深くプライマーを選択することにより部分的には
達成することができる。本検討に用いたＧｒｏＥＬプライマーを実施例１の表１
に示す。用いたｌｐｐプライマーは表２の下方に示す。

【０１５６】Ｂ．混合培養液中抗生物質耐性および抗生物質感受性の菌株を用いる検討感受性細胞を検出する本発明の有用性に対して多数の抗生物質耐性バクテリア
を有する効果をも測定し、大過剰のアンピシリン耐性菌株が存在すると、アンピ
シリン感受性種を成長させる許容条件を引き出すかどうかを決定した。これらの
検討に用いたＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ菌株は４００μｇ／ｍｌを超えるとアンピ
シリンに対する耐性があることが分かった。大腸菌（Ｃ６００）の菌株はアンピ
シリンに極めて過敏であり、これを選択した。

【０１５７】Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓおよび大腸菌の両方の終夜で飽和させた培養液を出発
物として、５０：１比（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓを１００μｌ＋大腸菌２μｌ）
を調製し、５，１０または２０μｇ／ｍｌのアンピシリンで補充したＬ−培養液
中に接種した。アンピシリンを添加しないコントロールも行った。２時間インキ
ュベーションした後、ＢｒｄＵを１ｍＭとなるよう添加し、そして更に１時間イ
ンキュベーションを継続させた。細胞を集菌し、それぞれの培養液１．５ｍｌか
らＤＮＡを精製し、水２００μｌに懸濁させた。懸濁液１０μｌを０．４ＭのＮ
ａＯＨ１０μｌで変性させた。この混合物１０μｌを希釈抗体２００μｌに添加
した。１５分後、抗体複合体１００μｌをタンパクＡで被覆したチューブに吸着
させた。チューブを洗浄後、ＦｌａＡ遺伝子としてＰＣＲプライマーを含むＰＣ
Ｒマスター混合物を添加した（用いたＦｌａＡプライマーは上記表２に示す）。

【０１５８】ＦｌａＡは両生物を増幅するが、大腸菌を増幅する場合ＰＣＲ生成物１Ｋｂを
、そしてＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓを増幅する場合ＰＣＲ生成物８００ｂｐを産出
する。大腸菌とＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓの両方の生成物を与える唯一の試料は、
アンピシリンの非存在下に生物を成長させた試料である。他のものは全てＰ．ｍ
ｉｒａｂｉｌｉｓＰＣＲ生成物のみを有していた。大過剰のアンピシリン耐性Ｐ
．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ細胞は、感受性の大腸菌株の抗生物質に対する感受性には
影響しなかったまたは感受性の株が生長するのに十分なアンピシリンを除去しな
かったことをこれらのデータは示している。

【０１５９】

【表２】

【０１６０】実施例６この実施例はミコバクテリア等のバクテリアの遅い成長を検討するのに本発明
を使用することを示している。

【０１６１】Ａ．ミコバクテリアによるＢｒｄＵの取り込みＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体中の細胞は、およそ２０〜３０時間程度
の倍加時間で非常にゆっくり成長する。ミコバクテリアに特有である高脂質で相
対的に不浸透性の細胞壁を与え、これらの細胞が適度な期間でＢｒｄＵを処理し
、取り込むかどうかを決定したい。

【０１６２】時間経過実験をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体の無毒性メンバーである
Ｍ．ボビスＢＣＧを用いて行った。初期の固定相培養液をアルブミン濃縮および
グリセロールとともにデュボス培養液を含む２つのフラスコに４倍に希釈した。
ＢｒｄＵを濃度が５ｍＭになるまでフラスコの１つに添加し、培養液を５％ＣＯ ₂ 下３７℃で振盪してインキュベートした。試料に直ちにＢｒｄＵを添加して０日目とし、続けて１，２，４および５日目にＢｒｄＵを添加した。試料を酵素法
により溶解し、その結果濃縮グアニジンチオシアネート中の溶解液とした。非フ
ェノール性イソクイックキット（ＯｒｃａＲｅｓｅａｒｃｈ、ボーテル、ワシ
ントン州）を用いてＤＮＡを凍結グアニジン溶解液から抽出した。抽出したＤＮ
Ａを加熱変性し、トリス−ＢＳＡ緩衝剤中抗ＢｒｄＵ抗体（ＳｉｇｍａＣｈｅ
ｍｉｃａｌＣｏ．、セントルイス、ミズーリ州）と混合した。室温で１５分間
インキュベートした後、混合物をタンパクＡで予め被覆したチューブに移液した
。１５分間の吸着段階の後、チューブをトリス／ツウィーン緩衝剤で２回、そし
てトリス０．１Ｍ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。１６ｓｒＲＮＡ遺伝子に対し
て関係するプライマーを含むＰＣＲマスター混合物をそれぞれのチューブに添加
した。熱循環後、１．５％アガロースゲルでのゲル電気泳動法により結果を可視
化した。

【０１６３】全ての試料がＤＮＡを有し、それぞれの免疫捕捉に作用するＤＮＡの量がほぼ
同じであることを示すために、全ての試料を免疫捕捉せずに増幅させた。免疫捕
捉実験の結果は、ＢｒｄＵで標識したＤＮＡがＢｒｄＵでの処理後わずか２日で
検出できたことを示している。標識されたＤＮＡの量が増加していることが４お
よび５日目からサンプル中に見られ、これはこれらの期間においてインキュベー
ションがより高感度で生物を検出することを示している。それゆえ、もしアッセ
イを行う特別な目的に対して速度が重要でなければ、インキュベーションをより
長くすることが好ましい。

【０１６４】Ｂ．抗生物質がミコバクテリアによりＢｒｄＵの取り込みが邪魔をされるかど
うかを決定するための本発明の有用性本発明者等はＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みに影響する多くの重要な抗生物質
の能力を試験した。抗生物質は、ミコール酸（細胞壁）合成阻害剤であるイソニ
アジド（商標）、ＤＮＡ複写に直接作用するキノロン薬剤であるシプロフロキサ
シン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリファンピン、および翻訳阻害剤である
ストレプトマイシンであった。４日間のプロトコルおよび７日間のプロトコルを
試験した。４日間のプロトコルにおいて、０日目にＭ．ボービスＢＣＧの静置培
養液を試験する抗生物質を含むデュボス培養液に希釈した。２日目にＢｒｄＵを
添加し、そして４日目に細胞を集菌した。７日間のプロトコルにおいて、０日目
に培養液を抗生物質とともにデュボスに希釈した。４日目にＢｒｄＵを添加し、
７日目に細胞を集菌した。コントロールは抗生物質を添加しないで成長させた培
養液である。コントロール実験において、試料全てにＤＮＡを有し、そしてそれ
ぞれの試料中にほぼ等量のＤＮＡがあることを確認するために試料を増幅した。

【０１６５】結果は、それぞれの抗生物質が４日目および７日目の両プロトコルにおいてＤ
ＮＡへのＢｒｄＵの取り込みを阻害したことを示した。７日目のプロトコルはよ
り暗いゲル帯を与えており、これは明らかに更に３日間成長させると培養液の細
胞量および標識の程度が増加したためである。もしアッセイの感度を増加するこ
とが所望であれば、免疫アッセイに対して培養液中のＤＮＡの割合をより高くし
て用い、そしてＰＣＲ混合物の割合をより高くして電気泳動法に用いられるゲル
へ標識することを、本発明者等は実験の最中にも決定した。

【０１６６】実施例７この実施例は洗剤の存在または非存在下にｐＨに対する捕捉緩衝剤のｐＨによ
り、および塩の濃度によりアッセイを変化させる効果を検討している。

【０１６７】Ａ．ｐＨを最適化する検討塩基性緩衝剤組成物を変化させる免疫捕捉緩衝剤を、免疫捕捉の効果およびバ
ックグランド結合のために調製し、試験した。結合緩衝剤を形成する塩基性緩衝
剤を、緩衝剤の当量点、すなわち化合物が最大緩衝能力を有するｐＨで、これを
基礎として選択する。トリスにおいて、このｐＨはおよそ８であり、有用な緩衝
剤の範囲は約ｐＨ７．５からｐＨ８．５である。燐酸塩緩衝溶液において、最大
緩衝能力は約ｐＨ６．８であり、有用な範囲は約ｐＨ７．５から約ｐＨ６．５の
範囲である。トリスをｐＨ８．３およびｐＨ７．５で試験し、そして燐酸塩緩衝
液をｐＨ７．０および６．５で試験した。ＤＮＡ（５００ｎｇ、５０ｎｇ、およ
び５ｎｇ）を０．２ＭのＮａＯＨ全容量５μｌで変性させた。ＤＮＡ溶液を試験
される塩基性緩衝剤（＋１％ボービン血清アルブミン＋２．５ｍＭのＥＤＴＡ＋
０．１％ツウィーン２０および抗ＢｒｄＵ抗体（シグマ社）の１：２００希釈液
）に添加した。結果は、ｐＨ８．３で多量のバックグランド結合が得られたこと
、すなわちＢｒｄＵで標識されたＤＮＡと標識されていないＤＮＡとの間にはほ
とんど区別がないことを示していた。ｐＨ７．０およびｐＨ６．５で、バックグ
ランドはより低いが、アッセイはより低感度であった。入力ＤＮＡの全てのレベ
ルにおいて、シグナル強度はより低かった。０．２Ｍトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５
）が最高の緩衝剤であることを結果は示している。

【０１６８】２．洗剤の存在を最適化するための検討免疫捕捉緩衝剤中に０．１％ツウィーン２０を含めるとバックグランドが大き
く減少した。

【０１６９】３．塩濃度を最適化するための方法結合緩衝剤を５０ｍＭ，１００ｍＭ，および２００ｍＭのＮａＣｌを含んで調
製した。塩基性緩衝剤は０．２Ｍトリス（ｐＨ７．５）であった。ＤＮＡ量は５
００ｎｇから５ｎｇに変化した。結果をバックグランドと感度とで評価した。シ
グナル強度は塩濃度に逆比例していた。５０ｍＭでは、バックグランドの大幅な
減少が観察されたが、感度は僅かにしか減少しなかった。最適の結合緩衝剤は、
０．２Ｍトリス（ｐＨ７．５）、１％ＢＳＡ、０．１％ツウィーン２０、２．５
ｍＭのＥＤＴＡ、および２５または５０ｍＭのＮａＣｌの組成を有していると結
論付けた。

【０１７０】本明細書中に示した全ての出版物および特許出願は、それぞれ個々の出版物お
よび特許出願が参照により取り込まれていることを特におよび個々に示している
限り、参照として本明細書に取り込まれる。

【０１７１】前述の発明について理解を明確にする目的で図示や実施例により詳細に説明し
たが、特許請求の範囲の精神および趣旨が逸脱することなく変更や修正を加える
ことができることは、本発明の教示を考慮すると当業者には容易に明確となるで
あろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】試料中の微生物が抗生物質に対して感受性であるか耐性であるかを検出する本
発明の実施方法を示す概略図である。

【図２】取り込まれたヌクレオチド類似体を有する核酸を検出する能力を示す免疫捕獲
アッセイの結果を示す写真であり、この場合、ＢｒｄＵはＥ．ｃｏｌｉ．のＤＮ
Ａに取り込まれている。

【図３】２種のＥ．ｃｏｌｉ．の生長曲線を表す図である。

【図４】抗体に対して異なる感受性および耐性を有する２種のＥ．ｃｏｌｉ．のＰＣＲ
後のＤＮＡのゲル電気泳動の結果を示す図である。

【図５】比色サンドイッチアッセイにおける２種のＥ．ｃｏｌｉのＰＣＲ生成物の比色
分析を示す図である。

【図６】同種の抗生物質耐性生物および抗生物質感受性生物が、耐性生物の割合を減じ
て培養中に混合した場合の研究結果を示す図である。

【図７】ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動によって口腔細菌Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生長に対する抗生物質の影響を示した図である。

【図８】ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動によって口腔細菌Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｔｅｍｃ
ｏｍｉｔａｎｓの生長に対する抗生物質の影響を示した図である。

【図９】ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動によって口腔細菌Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔ
ｉｃｏｌａの生長に対する抗生物質の影響を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ１２Ｐ 19/34 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ユーレン，ジャック・アールアメリカ合衆国・98034・ワシントン州・カークランド・111ティエイチプレイスノースイースト・12938 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ06 QQ07 QQ10 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QR66 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AF27 CA02 CC24 DA13 4C057 MM01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】混合培養物中の未知の微生物を同定するアッセイ法であって
、ｉ．水性培地で微生物を培養する段階であって、前記培地で未知の微生物以外
の一種または複数の微生物を培養することができ、前記培地が類似体特異的結合
剤によって認識され、未知の複製細胞またはビリオンの核酸に取り込まれる核酸
類似体を含む段階と、ｉｉ．未知の微生物の核酸を放出するために前記微生物、および存在する可能
性のあるその他の微生物を溶解する段階と、ｉｉｉ．前記類似体特異的結合剤を使用して類似体を取り込んだ核酸を捕獲す
る段階と、ｉｖ．捕獲されなかった核酸から捕獲された前記核酸を分離する段階と、ｖ．未知の微生物から生じた捕獲核酸を増幅する段階と、ｖｉ．捕獲され増幅された前記核酸が生じた微生物を同定する段階とを含むアッセイ法。
【請求項２】段階（ｖ）が捕獲された核酸のサブセットの選択的増幅であ
る請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項３】段階（ｖｉ）における微生物の正体が、捕獲され増幅された
前記核酸を種特異的核酸配列とハイブリッド形成することによって決定される請
求項１に記載のアッセイ法。
【請求項４】前記未知の微生物が細菌である請求項１に記載のアッセイ法
。
【請求項５】前記未知の微生物が病原体である請求項１に記載のアッセイ
法。
【請求項６】前記病原体が哺乳類の病原体である請求項５に記載のアッセ
イ法。
【請求項７】前記病原体がウイルスである請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項８】前記病原体が真菌である請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項９】前記病原体が原生動物である請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項１０】前記混合培養物が同一種の微生物の２種以上の株である請
求項１に記載のアッセイ法。
【請求項１１】前記類似体がブロモデオキシウリジンである請求項１に記
載のアッセイ法。
【請求項１２】前記特的結合剤が抗体である請求項１１に記載のアッセイ
法。
【請求項１３】前記水性培地がさらに抗生物質を含む請求項１に記載のア
ッセイ法。
【請求項１４】混合培養物で選択された微生物の化学薬剤の存在下での複
製能力を決定するアッセイ法であって、ｉ．水性培地または細胞培養物中の選択された微生物を培養する段階であって
、前記培地または細胞培養物が、選択された微生物以外の一種または複数の微生
物を培養することができ、類似体特異的結合剤によって認識され、選択された微
生物の複製細胞またはビリオンの核酸に取り込まれる核酸類似体を含む段階と、ｉｉ．選択された微生物の核酸を放出するために前記微生物、および存在する
可能性のあるその他の微生物を溶解する段階と、ｉｉｉ．前記類似体特異的結合剤を使用して類似体を取り込んだ核酸を捕獲す
る段階と、ｉｖ．捕獲されなかった前記核酸から捕獲された核酸を分離する段階と、ｖ．未知の微生物から生じた前記捕獲核酸を増幅する段階と、ｖｉ．捕獲された核酸の有無を検出する段階であって、前記一連の段階ｉ〜ｖ
ｉが少なくとも２回、培養培地に添加された化学薬剤を含む少なくとも１回の前
記一連の段階および培養培地に添加された化学薬剤を有さない少なくとも１回の
前記一連の段階で実施される段階とを含むアッセイ法。
【請求項１５】段階ｖがポリメラーゼ鎖反応による請求項１４に記載のア
ッセイ法。
【請求項１６】前記結合剤が固相支持体に付着している請求項１４に記載
のアッセイ法。
【請求項１７】混合培養物中の微生物を同定するキットであって、ｉ．類似体特異的結合剤によって認識され、微生物の核酸に取り込まれること
が可能なＤＮＡ類似体と、ｉｉ．前記ＤＮＡ類似体を取り込んだ核酸を捕獲するための類似体特異的結合
剤と、ｉｉｉ．関心のある正体の微生物から核酸を増幅するためのプライマーと、ｉｖ．微生物を同定するアッセイにおいてｉ、ｉｉ、およびｉｉｉの成分を使
用するための説明書とを含むキット。
【請求項１８】前記プライマーが関心のある種または株の微生物を増幅す
るために特異的である請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】種特異的核酸配列をさらに含む請求項１７に記載のキット
。
【請求項２０】前記ＤＮＡ類似体がブロモデオキシウリジンである請求項
１７に記載のキット。
【請求項２１】前記類似体特異的結合剤が抗体である請求項１７に記載の
キット。
【請求項２２】さらに抗生物質を含む請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】混合培養物中の微生物の複製能力を決定するキットであっ
て、ｉ．類似体特異的結合剤によって認識され、微生物の核酸に取り込まれことが
可能なＤＮＡ類似体と、ｉｉ．前記ＤＮＡ類似体を取り込んだ核酸を捕獲するための類似体特異的結合
剤と、ｉｉｉ．関心のある本体の微生物の核酸を増幅するためのプライマーと、ｉｖ．微生物の複製能力を決定するアッセイにおいてｉ、ｉｉ、およびｉｉｉ
の成分を使用するための説明書とを含むキット。
【請求項２４】前記プライマーが興味のある種または株の微生物を増幅す
るために特異的である請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】種特異的核酸配列をさらに含む請求項２３に記載のキット
。
【請求項２６】前記ＤＮＡ類似体がブロモデオキシウリジンである請求項
２３に記載のキット。
【請求項２７】前記類似体特異的結合剤が抗体である請求項２３に記載の
キット。
【請求項２８】さらに抗生物質を含む請求項２３に記載のキット。