JP2020533974A - 呼吸器合胞体ウイルス種のニッキング及び伸長増幅反応(near) - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、等温核酸増幅を用いて、生体試料中の標的核酸の有無を検出するための方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、生体試料中の呼吸器合胞体ウイルス標的核酸を検出することに関する。
特定の等温増幅方法は、数分以内に、微量レベルから非常に高い検出可能なレベルまで標的核酸を増幅することができる。そのような等温法、例えば、ニッキング及び伸長増幅反応(NEAR)は、使用者が微量で特定のヌクレオチド配列を検出すること、ポイントオブケア検査を容易にすること、診断の利用可能性及び速度を上げることを可能にする。
第1のリバーステンプレートの核酸配列は、配列番号2(AGACTCCACACGGAGTCTAGTTGACCAGGAATG)に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
減少を意味する。
本発明をさらに以下の実施例に記載するが、これは、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定するものではない。当業者なら、例示的なアッセイのために、反応の体積及びフォーマット、アッセイが行われる時間の長さ、及び各反応物の量に多くの変更を施すことができることを理解する。
標的の選択
複数のRSV株にわたって強い保存を示す一方でRSVに固有である、非構造遺伝子NS2及び遺伝子Nを標的にするNEARアッセイを開発した。最初のバイオインフォマティクス分析を、NCBFのヌクレオチドデータベース(http://www.ncbi.nltn.nih.gov/nuccore)及びゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome?db=genome)から利用可能な配列データを用いて行った。多重配列アラインメントを行って保存領域を特定した。相同性を示す全ての配列セグメントをBLAST分析に供してこれらの配列がRSVに固有であったかどうかを決定した。BLAST分析に続いて、RSVに固有と特定された全ての配列をテンプレートセットの生成に使用した(ヌクレオチドコレクション(nr/nt)データベースを用いて実行するBLAST分析)。テンプレートセットを、研究室内の自動化ソフトウェアツールを用いることによって、部分的に作製した。インシリコでのフィルタリングを次いで適用して、実験室でスクリーニングするためのテンプレートセットの選択を確定した。一般に、これらのフィルタリング基準は、NEARの性能並びにほとんどの核酸増幅技術に共通するパラメータに特異的に影響を与える可能性がある、研究室で特定したいくつかのパラメータを含む、アッセイ性能を低下させる可能性のある潜在的な相互作用についてテンプレートセットを分析することを含んだ。これらのフィルタリング基準を用いて、「RSV A」及び「RSV B」テンプレートのセットをスクリーニングのために選択した。
RSV NEARアッセイを、Alere(商標)i プラットフォーム上で実行するために開発した。Alere(商標)i プラットフォームは、加熱、混合及び自動化された結果出力での蛍光検出を提供するAlere(商標)i機器、並びに試料受器(そこに溶出/溶解緩衝液が保存される)、検査基材(凍結乾燥NEAR試薬の2本のチューブを含む)及びトランスファーカセット(検査基材中にある試料受器から凍結乾燥NEAR試薬を含む2本のチューブの各々に溶出試料の100μlアリコートを移すように設計される)からなる、使い捨てのセットからなる。
内部対照(IC)の存在は、POC診断装置の必須構成要素である。NEARについては、内部対照は、アッセイ試薬が適切に機能しており検査中に不活性化又は阻害されていないことの確証を提供する。これは、臨床試料が「陰性」と呼ばれていた場合に、特に重要である。「陰性」コールがアッセイの失敗によるものではなく、むしろ、標的生物が存在しないという事実に起因していることを確認するために、ICは不可欠である。RSV検査は2本のチューブの検査であり、RSV A検出が1本のチューブの中で生じ、RSV B検出が第2のチューブの中で生じる。各チューブ中に対照を組み込む代わりに、単一ICを、RSV Bアッセイを含むチューブに組み込んだ。ICシステムは、RSV Bアッセイによって共有されるテンプレート、固有の短いRNAオリゴヌクレオチド標的及びIC産物特異的分子ビーコンのセットからなる(表2)。RNAオリゴヌクレオチドは、標的テンプレートセットの認識領域に相補的であるが標的スペーサー領域と異なるスペーサー領域を有する、5’及び3’末端を含有する。簡単に説明すると、同じテンプレートセットが、標的とICの両方を増幅するために使用される。
実行可能なPOC技術を提供するために、RSV検出に使用する試薬は、周囲温度(最大30℃)で長期間(例えば、6ヶ月〜36ヶ月)、又は2〜8℃で保存される場合には、最小時間、安定であることが必要である。このレベルの安定性を提供するために、NEARアッセイ試薬は、凍結乾燥された後にパッケージ化されて水分と酸素の両方への試薬の曝露を最小限にする必要がある。
RSVの存在を検出するために、臨床試料を収集するために使用された拭き取り検体からのウイルスの溶出と、汎用輸送培地(UTM)中の溶出又は貯蔵後のそのウイルスの溶解、の2つの工程が標的の増幅及び検出に先行して、標的ウイルスRNAゲノムへのアクセスを可能にする。POC産物については、溶出及び溶解は、効率的で迅速かつ単純でなければならない。本発明者らは、拭き取り検体からRSVウイルスを効果的に取り出しウイルスシェルを迅速かつ効率的に溶解してNEAR増幅のためにウイルスゲノムRNAを暴露させる、酸系の溶出及び溶解緩衝液を開発した。緩衝液の組成を表5に示す。これらの試薬は、この文書の後の節に示されるように、感度の高いNEAR性能に十分な溶出及び溶解を提供する。
NEAR技術の1つの潜在的阻害物質はヒトgDNAである。鼻の拭き取り検体試料をRSV感染の症候を示す患者から採取する場合、ヒトgDNAも拭き取り検体中に採取される可能性がある(白血球などの免疫細胞から又は局所上皮細胞から)。ヒトgDNAがRSV A、RSV B及びRSV B+ICアッセイ性能に与える影響を評価するために、漸増量の精製ヒトgDNAを各アッセイに添加し標的とICの両方の検出を監視する、試験を行った(図3A〜D;図4A〜D、及び図5)。
RSV A反応性分析試験を、精製ウイルスRNAを用いてAlere(商標)i機器にて行ってアッセイの感度を評価した。精製ウイルスRNAを予熱した溶出/溶解緩衝液(3分の予熱工程を模倣するために、45℃に予熱した)に添加し、100μlアリコートを凍結乾燥反応に直ちに移して、増幅及び検出を開始した。各標的コピー数で、3つ組反応を行った。蛍光をリアルタイムで監視した。RSV Aについては、アッセイは、5コピーの精製RNAを検出できたが、2コピーの精製RNAで、ベースラインを上回る十分な蛍光シグナルを示した(図6)。これらのデータは、RSV Aアッセイについて5コピーの精製RNAの感度を示唆する。アッセイは、0.005pfuの精製ウイルスを検出できる一方で、0.002pfuでは、ほとんどの複製物は、バックグラウンド蛍光レベルを上回って検出された(図7)。これらのデータは、RSV Aアッセイについて0.005pfuの精製ウイルスの感度を示唆する。
RSV Aアッセイの感度を確認するために、検出限界(LOD)試験を行った。試験を、反応あたり0.005pfu(反応性分析検査中に決定される感度の限界、節hを参照されたい)で開始した。LODは、複製物の95%が検出され得る最小標的濃度として定義される。RSV A試験を、反応あたり0.005pfuで始めたが、20の複製物試験中、2つの複製物は陽性として検出されなかったので、標的濃度を0.01pfuに増加した(2倍増加)。0.01pfuでは、全ての複製物が陽性として検出され(図8)、したがってLODは、0.01pfu/反応の精製ウイルスRNA(株A2)である。
RSV B反応性分析試験を、精製ウイルスRNAを用いてAlere(商標)i機器にて行ってアッセイの感度を評価した。精製ウイルスRNAを予熱した溶出/溶解緩衝液(3分の予熱工程を模倣するために、45℃に予熱した)に添加し、100μlアリコートを凍結乾燥反応に直ちに移して、増幅及び検出を開始した。各標的コピー数で、3つ組反応を行った。蛍光をリアルタイムで監視した。
RSV Bアッセイの感度を確認するために、検出限界(LOD)試験を行った。試験を、反応あたり0.05pfu(反応性分析検査中に決定される感度の限界、節hを参照されたい)で開始した。LODは、19/20の複製物(95%)が検出され得る最小標的濃度として定義される。反応あたり0.05pfuで、20/20の複製物が陽性として検出され(図13)、したがって、LODは0.05pfu/反応の精製ウイルスRNA(株B1)である。IC性能もこの試験中に評価し、全ての場合において、堅牢な増幅/検出が提供され、全ての複製物についてシグナルは飽和していた(図14)。
RSVの標的がそれぞれの反応物中に存在しない場合にRSV A及びRSV Bアッセイが偽陽性の結果をもたらさないことを確認するために、NTC反復試験を行った。各アッセイについて、20のNTC反応を、蛍光をリアルタイムで監視してバックグラウンド蛍光レベルを超える増加が観察されたかどうかを決定しながら、Alere(商標)i機器にてスクリーニングした。図15にRSV Aの結果を示し、図16及び図17に、RSV B及びICアッセイの結果をそれぞれ示す。RSV AとRSV Bの両方のアッセイは、偽陽性を示すことができなかったことから、アッセイは安定であること、及び偽陽性は今後の予想される問題ではないことを示す。データはまた、全ての複製物が強い(飽和)IC増幅及び検出を示したので、ICシステムの再現性を示す。
RSV A及びRSV Bアッセイをそれぞれ、RSV株A2及びB1を用いて開発した。これらの株は、精製ウイルス又は精製RNAとして市販されており、開発作業に適し、かつ便利である。RSV A及びRSV Bアッセイが開発株以外の株で機能することを保証するために、追加のRSV株を購入し、検査した。RSV Aについては、LODは、開発株A2を使用した場合に5コピーの精製RNAであると決定された。株Aロングも5コピーの精製RNAで検査し、この標的コピー数での検出が堅牢であることが確認し、RSV AアッセイがRSV A株全体で機能できることを示唆する(図18)。RSV Bについては、LODは、開発株B1を使用した場合に0.5pfuの精製ウイルスであると決定された。菌株B 9320及びB 18537も0.5pfuの精製ウイルスでスクリーニングし、データはこの標的コピー数での検出が堅牢であることを確認し、RSV Bアッセイが複数のRSV B株全体で機能できることを示唆する(図19)。
RSV A及びRSV BアッセイがRSVに対する特異性を各々提供することを保証するために、一般的な呼吸器感染性病原体を用いて、一連の交差反応性実験を行った。インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス及び連鎖球菌A細菌(一般的な呼吸器疾患感染性病原体)を、高い標的濃度でスクリーニングした。使用した各標的の濃度は、最悪な場合のシナリオを模倣するために意図的に高くし、反応あたりの最終濃度を、各反応に2μlのストック材料を添加することに基づいて決定した。RSV A及びRSV Bアッセイを、6e5pfu/反応でインフルエンザAウイルスを、1e6pfu/反応でインフルエンザBウイルスを、及び8e6pfu/反応で連鎖球菌Aを用いてスクリーニングした。使用した各標的の濃度は、最悪な場合のシナリオを模倣するために意図的に高くし、反応あたりの最終濃度を、各反応に2μlのストック材料を添加することに基づいて決定した。各標的を、3つ組反応で検査し、結果を図20A〜Bに示す。RSV A又はRSV Bアッセイは、インフルエンザA、インフルエンザB又は連鎖球菌Aを検出せず、これらのアッセイは非RSV種に対して良好な特異性を提供することを示した。RSV Aについては、連鎖球菌Aの1つの複製物が飽和蛍光シグナルを示した。この試料をその後、ESI−MSによって分析し、それは、生じた生成物が、RSVゲノム(この配列は連鎖球菌Aゲノムに存在しない)の外れた増幅から生じる予想される生成物であったので、この反応にRSV標的/増幅物が混入していたことを確認した。
臨床マトリックスの存在下で検査した場合のRSV A及びBアッセイの性能に関する指標を提供するために、一連の匿名のドナーの拭き取り検体を、プールした試料として検査した。A、B&Cの3つのプールを作製し、各々はそれぞれ4人の個々の匿名ドナーの拭き取り検体からなる。各拭き取り検体を、拭き取り検体を10秒間旋回し搾り出した後に緩衝液から取り出すことにより、2.5mlの予熱した(3分)溶出緩衝液/溶解緩衝液中に溶出した。拭き取り検体溶出液をその後、組み合わせて、各10mlのプールを作製した。RSV A及びRSV Bアッセイを最初に、LODウイルス濃度を用いてスクリーニングし、3/3の複製物が「陽性」結果をもたらすまで、ウイルス濃度を増加させた。データは、臨床マトリックスがアッセイ性能に影響を与えることができ、影響は大きく変化することを示す。RSV Aアッセイは、プールAを負荷した場合に、0.01pfu/反応(臨床マトリックスが存在しないアッセイのLOD)を検出できなかったが、0.02にpfu/反応を倍増させると、再現可能な様式で良好な増幅及び検出が生じた。マトリックスプールBは、RSV Aアッセイが0.01pfu/反応で全複製物を容易に検出したので、最小限の阻害を提供した。図24に示すように、匿名ドナーの拭き取り検体プールCでスクリーニングしたRSV Aアッセイは、最も抑制性のプールであり、一貫性のある陽性の結果をもたらすためには、0.05pfu/反応(アッセイのLODを5倍上回る)の添加を必要とした。
RSV A、RSV B及びICアッセイが、臨床試料に対してどれくらい十分に機能するかを決定するために、−80℃で凍結保存した50種の直接臨床拭き取り検体試料及び−80℃で凍結保存した50種のUTM試料を使用した。試料は特徴付けられず、それは、たとえあったとしても、試料はRSV陽性であることが知られていなかったことを意味する。この試験の一環として、RSV A&B検査を臨床試料に対して行い、RSV qPCR(適切な場合に、RSV+/−状態及びコピー数を決定するために、「ゴールドスタンダード」として使用される)、RNアーゼP qPCR(ヒトgDNA含量を決定するため)及びRNアーゼ/DNアーゼヌクレアーゼ検査(RNアーゼ及びDNアーゼ活性のレベルを決定するため)を実行することによってさらに特徴付けた。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (52)
- i)呼吸器合胞体ウイルス(RSV)非構造NS2遺伝子のアンチセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を3’末端に含む第1のフォワードテンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域;並びに
ii)RSV非構造NS2遺伝子のセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を3’末端に含む第1のリバーステンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域;又は
iii)RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのアンチセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を3’末端に含む第2のフォワードテンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域;並びに
iv)RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を3’末端に含む第2のリバーステンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域
を含む組成物。 - 前記RSV非構造NS2遺伝子のアンチセンス鎖の3’末端に相補的である3’末端での認識領域は、長さが8〜30ヌクレオチドであり、かつ/又は
前記RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのアンチセンス鎖の3’末端に相補的である3’末端での認識領域は、長さが8〜30ヌクレオチドである、
請求項1に記載の組成物。 - 前記RSV非構造NS2遺伝子のセンス鎖の3’末端に相補的である3’末端での認識領域は、長さが8〜30ヌクレオチドであり、かつ/又は
前記RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのセンス鎖の3’末端に相補的である3’末端での認識領域は、長さが8〜30ヌクレオチドである、
請求項1又は請求項2のいずれか一項に記載の組成物。 - i)及びii)を含む前記組成物が、RSV非構造NS2遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- iii)及びiv)を含む組成物が、RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1のフォワードテンプレートの核酸配列が、配列番号1(CGACTCACACGAGTCGAAAACTTGATGAAAGA)に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み;かつ
前記第1のリバーステンプレートの核酸配列が、配列番号2(AGACTCCACACGGAGTCTAGTTGACCAGGAATG)に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。 - i)及びii)を含む前記組成物が、配列番号3(ACCAGGAATGTAAATGTGGCCTGGT)に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項2〜4及び請求項6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2のフォワードテンプレートの核酸配列が、配列番号6(GACTCGCACACGAGTCACGTAGTACAGGAGATAA)に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み;
前記第2のリバーステンプレートの核酸配列が、配列番号7(GACTCCACACGGAGTCGCTTTTGCACATCATAA)に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項1〜3及び請求項5のいずれか一項に記載の組成物。 - iii)及びiv)を含む前記組成物が、配列番号8(TGACACATCATAATTGGGAGTGTCA)に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜3、請求項5及び請求項8のいずれか一項に記載の組成物。
- DNAポリメラーゼ、1以上のニッキング酵素、dNTP又はdNTPとddNTPの混合物の1以上をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記DNAポリメラーゼが、ゲオバチルス・ボアジチ(Geobacillus bogazici)DNAポリメラーゼ、Bst(巨大断片)、エクソDNAポリメラーゼ、Manta 1.0 DNAポリメラーゼ(Enzymatics(登録商標))からなる群から選択される、請求項10に記載の組成物。
- 前記1以上のニッキング酵素が、Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BpulOI、Nt.BpulOI及びN.BspD61からなる群から選択される、請求項10に記載の組成物。
- 前記組成物が、凍結乾燥される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記プローブが、検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項4、請求項5、請求項7又は請求項9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項14に記載の組成物。
- 前記第1のフォワードテンプレート、前記第1のリバーステンプレート、前記第2のフォワードテンプレート又は前記第2のリバーステンプレートの1以上が、1以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、2’修飾を含む、請求項16に記載の組成物。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、2’−0−メチルを含む、請求項17に記載の組成物。
- 生体試料中のRSVの有無の検出のための方法であって、
i)RSV非構造NS2遺伝子のアンチセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を3’末端に含む第1のフォワードテンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域;
ii)RSV非構造NS2遺伝子のセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を3’末端に含む第1のリバーステンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域;
iii)少なくとも1つのニッキング酵素;及び
iv)DNAポリメラーゼ
を含む組成物と前記生体試料を接触させること;
核酸増幅反応で前記標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること;並びに
前記増幅産物の有無を検出すること
を含む、方法。 - 前記少なくとも1つのニッキング酵素が、
前記第1のフォワードテンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能であり、かつRSV非構造NS2遺伝子のアンチセンス鎖内ではニッキングしない第1のニッキング酵素、並びに/又は
前記第1のリバーステンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能でありかつRSV非構造NS2遺伝子のセンス鎖内ではニッキングしない第2のニッキング酵素
を含み、前記第1のニッキング酵素及び前記第2のニッキング酵素が、同一であっても又は異なっていてもよい、請求項19に記載の方法。 - 前記組成物が、前記RSV非構造NS2遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項19〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 生体試料中のRSVの有無の検出のための方法であって、
i)RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのアンチセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を3’末端に含む第2のフォワードテンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域;
ii)RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのセンス鎖の3’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を3’末端に含む第2のリバーステンプレート;前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位;及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域;
iii)少なくとも1つのニッキング酵素;及び
iv)DNAポリメラーゼ
を含む組成物と前記生体試料を接触させること;
核酸増幅反応で前記標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること;並びに
前記増幅産物の有無を検出すること
を含む、方法。 - 前記少なくとも1つのニッキング酵素が、
前記第2のフォワードテンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能であり、かつRSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのアンチセンス鎖内ではニッキングしない第1のニッキング酵素、並びに/又は
前記第2のリバーステンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能でありかつ前記ヌクレオキャプシド遺伝子Nのセンス鎖内ではニッキングしない第2のニッキング酵素
を含み、前記第1のニッキング酵素及び前記第2のニッキング酵素が、同一であっても又は異なっていてもよい、請求項22に記載の方法。 - 前記組成物が、RSVヌクレオキャプシド遺伝子Nのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項22〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が、基本的に等温条件下で行われる、請求項19〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のフォワードテンプレートの前記核酸配列が、配列番号1に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み;かつ
前記第1のリバーステンプレートの前記核酸配列が、配列番号2に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項19〜21及び請求項25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号3に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項19〜21、請求項26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のフォワードテンプレートの前記核酸配列が、配列番号6に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み;かつ
前記第2のリバーステンプレートの前記核酸配列が、配列番号7に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号8に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項22〜24及び請求項28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、dNTP又はdNTPとddNTPの混合物をさらに含む、請求項19〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、ゲオバチルス・ボアジチのDNAポリメラーゼ、Bst(巨大断片)、エクソDNAポリメラーゼ、Manta 1.0 DNAポリメラーゼ(Enzymatics(登録商標))からなる群から選択される、請求項19〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のフォワードテンプレート及び第1のリバーステンプレート前記第2のフォワードテンプレート及び第2のリバーステンプレートが、前記同じ少なくとも1つのニッキング酵素によって認識されるニッキング酵素結合部位を含む、請求項19〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのニッキング酵素が、Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BpulOI、Nt.BpulOI及びN.SBspD61からなる群から選択される、請求項19〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブが、検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項21、請求項24、請求項27又は請求項29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのニッキング酵素が、前記ニッキング酵素結合部位の下流でニッキングする、請求項19〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅前に前記生体試料から核酸を抽出/単離することを必要に応じて含む、請求項19〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が、糞便、口腔/咽喉の拭き取り検体、唾液、膿、痰、血液、及び尿から選択される、又は前記生体試料が、感染組織若しくは非感染組織からである、請求項19〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のフォワードテンプレート、前記第1のリバーステンプレート、前記第2のフォワードテンプレート又は前記第2のリバーステンプレートの1以上が、1以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む、請求項19〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、2’修飾を含む、請求項39に記載の方法。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、2’− 0−メチルを含む、請求項40に記載の方法。
- (a)配列番号1に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第1のフォワードテンプレート;及び配列番号2に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第1のリバーステンプレート;又は
(b)配列番号6に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する第2のフォワードテンプレート;及び配列番号7に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチドを含む第2のリバーステンプレート
からなる群から選択されるテンプレートオリゴヌクレオチド
を含むキット。 - (a)が、配列番号3に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項42に記載のキット。
- (b)が、配列番号8に少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項42に記載のキット。
- 拭き取り検体をさらに含む、請求項42に記載のキット。
- 前記キットを使用するための取り扱い説明書をさらに含む、請求項42に記載のキット。
- dNTP又はdNTPとddNTPの混合物の1以上をさらに含む、請求項42に記載のキット。
- 生体試料から核酸を抽出/単離するための試薬を必要に応じて含む、請求項42に記載のキット。
- 前記テンプレートオリゴヌクレオチドが、1以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む、請求項42〜48のいずれか一項に記載のキット。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、2’修飾を含む、請求項49に記載のキット。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドが、2’− 0−メチルを含む、請求項50に記載のキット。
- ポリメラーゼをさらに含む、請求項42に記載のキット。
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