JP2003250589A - 呼吸器系ウイルスの検出 - Google Patents
呼吸器系ウイルスの検出Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ヒトで呼吸器系感染症を起こす７つの最もあり
ふれたウイルス、すなわち、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−１、ヒト・パラインフルエンザウイルス−
２、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３、呼吸器細
胞融合性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、イン
フルエンザウイルスＢ型、およびアデノウイルスの同時
検出のための特異的な核酸配列、及び方法の提供。 【解決手段】前記方法は、検出されるべきウイルスを含
むことが疑われるサンプルから調製された核酸を提供す
ること、前記７つのウイルスの１または２以上に特異的
なプライマーのセットで前記核酸を増幅すること、増幅
産物を検出することを含む。前記７つのウイルスのいず
れか１つに特異的な増幅産物を検出することは、その特
定のウイルスが存在することを表す。
ふれたウイルス、すなわち、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−１、ヒト・パラインフルエンザウイルス−
２、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３、呼吸器細
胞融合性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、イン
フルエンザウイルスＢ型、およびアデノウイルスの同時
検出のための特異的な核酸配列、及び方法の提供。 【解決手段】前記方法は、検出されるべきウイルスを含
むことが疑われるサンプルから調製された核酸を提供す
ること、前記７つのウイルスの１または２以上に特異的
なプライマーのセットで前記核酸を増幅すること、増幅
産物を検出することを含む。前記７つのウイルスのいず
れか１つに特異的な増幅産物を検出することは、その特
定のウイルスが存在することを表す。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト・パラインフ
ルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融合性ウイルス（ｒ
ｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕ
ｓ）、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウ
イルスＢ型およびアデノウイルスを含む複数の呼吸器ウ
イルスを同時に検出するための、特異的な核酸配列に関
する。
ルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融合性ウイルス（ｒ
ｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕ
ｓ）、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウ
イルスＢ型およびアデノウイルスを含む複数の呼吸器ウ
イルスを同時に検出するための、特異的な核酸配列に関
する。
【０００２】
【従来の技術】呼吸器気管の感染は、米国における感染
症による死亡原因の半数近くを占める（ウエイ（Ｗｅ
ｉ）ら、オブステリクス・アンド・ジネコロジー・クリ
ニック・オブ・ノース・アメリカ（Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙ
ｎｅｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ）、２８巻、
（２号）、２８３−３０４頁、２００１年）。急性呼吸
器疾患の約７５％はウイルスが原因である。ヒト・パラ
インフルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融合性ウイル
ス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイ
ルスＢ型およびアデノウイルスが、小児および成人の両
方で呼吸器感染症を起こす最もありふれたウイルスであ
る。これらのウイルスの検出は、呼吸器疾患の診断、予
防および治療に必須である。
症による死亡原因の半数近くを占める（ウエイ（Ｗｅ
ｉ）ら、オブステリクス・アンド・ジネコロジー・クリ
ニック・オブ・ノース・アメリカ（Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙ
ｎｅｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ）、２８巻、
（２号）、２８３−３０４頁、２００１年）。急性呼吸
器疾患の約７５％はウイルスが原因である。ヒト・パラ
インフルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融合性ウイル
ス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイ
ルスＢ型およびアデノウイルスが、小児および成人の両
方で呼吸器感染症を起こす最もありふれたウイルスであ
る。これらのウイルスの検出は、呼吸器疾患の診断、予
防および治療に必須である。
【０００３】発明の概要
１の局面では、本発明は、ヒト・パラインフルエンザウ
イルス−２およびアデノウイルスという２つの呼吸器系
ウイルスを検出するための２つのプライマーの対を含む
ＰＣＲのプライマーのセットを特長とする。前記ヒト・
パラインフルエンザウイルス−２のプライマーの１つ
は、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
（例えば、配列番号５または６）から選択されたオリゴ
ヌクレオチドを含み、他のプライマーは、前記領域と同
じ領域から選択された別のオリゴヌクレオチド（例え
ば、配列番号７）を含む。前記アデノウイルスのプライ
マーの１つはヘクソン（ｈｅｘｏｎ）遺伝子の領域から
選択されたオリゴヌクレオチドを含み、他のプライマー
は前記領域と同じ領域から選択された別のオリゴヌクレ
オチドを含む。例えば、アデノウイルスのある１つのプ
ライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、配列番
号２４および２６、配列番号２４および２７、または、
配列番号２５および２７であってもよい。それぞれのオ
リゴヌクレオチドは、１４〜４０個（例えば、１４〜３
５個か、１４〜３０個か、１４〜２５個か、１４〜２０
個か）の長さのヌクレオチドを有する。
イルス−２およびアデノウイルスという２つの呼吸器系
ウイルスを検出するための２つのプライマーの対を含む
ＰＣＲのプライマーのセットを特長とする。前記ヒト・
パラインフルエンザウイルス−２のプライマーの１つ
は、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
（例えば、配列番号５または６）から選択されたオリゴ
ヌクレオチドを含み、他のプライマーは、前記領域と同
じ領域から選択された別のオリゴヌクレオチド（例え
ば、配列番号７）を含む。前記アデノウイルスのプライ
マーの１つはヘクソン（ｈｅｘｏｎ）遺伝子の領域から
選択されたオリゴヌクレオチドを含み、他のプライマー
は前記領域と同じ領域から選択された別のオリゴヌクレ
オチドを含む。例えば、アデノウイルスのある１つのプ
ライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、配列番
号２４および２６、配列番号２４および２７、または、
配列番号２５および２７であってもよい。それぞれのオ
リゴヌクレオチドは、１４〜４０個（例えば、１４〜３
５個か、１４〜３０個か、１４〜２５個か、１４〜２０
個か）の長さのヌクレオチドを有する。
【０００４】本発明のＰＣＲプライマーのセットは、さ
らに、他の呼吸器系ウイルスを検出するための追加の特
異的な１または２以上のプライマーの対を含むことがで
きる。例えば、以下の５つのプライマーの対のうちの１
または２以上が、（これらのいかなる組み合わせも含め
て、）前記ＰＣＲプライマーのセットに含まれていても
よい。 （１）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、ヒ
ト・パラインフルエンザウイルス−１のプライマーの
対。例えば、ヒト・パラインフルエンザウイルス−１の
プライマーの対は、それぞれ、配列番号１および３、配
列番号２および３、または、配列番号１および４であっ
てもよい。 （２）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、ヒ
ト・パラインフルエンザウイルス−３のプライマーの
対。例えば、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３の
プライマーの対は、それぞれ、配列番号８および１０、
配列番号８および１１、または、配列番号９および１１
であってもよい。 （３）非構造タンパク−２遺伝子の領域から選択された
オリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、呼吸器細胞融合性
ウイルスのプライマーの対。例えば、呼吸器細胞融合性
ウイルスのプライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチ
ドは、それぞれ、配列番号１２および１４、または、配
列番号１３および１５であってもよい。 （４）非構造タンパク遺伝子の領域から選択されたオリ
ゴヌクレオチドをそれぞれ含む、インフルエンザウイル
スＡ型のプライマーの対。例えば、インフルエンザウイ
ルスＡ型のプライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチ
ドは、それぞれ、配列番号１６および１８、または、配
列番号１７および１９であってもよい。 （５）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたインフルエンザウイルスＢ型のプライマ
ーの対。例えば、インフルエンザウイルスＢ型のプライ
マーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、それぞれ、
配列番号２０および２２、または、配列番号２１および
２３であってもよい。
らに、他の呼吸器系ウイルスを検出するための追加の特
異的な１または２以上のプライマーの対を含むことがで
きる。例えば、以下の５つのプライマーの対のうちの１
または２以上が、（これらのいかなる組み合わせも含め
て、）前記ＰＣＲプライマーのセットに含まれていても
よい。 （１）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、ヒ
ト・パラインフルエンザウイルス−１のプライマーの
対。例えば、ヒト・パラインフルエンザウイルス−１の
プライマーの対は、それぞれ、配列番号１および３、配
列番号２および３、または、配列番号１および４であっ
てもよい。 （２）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、ヒ
ト・パラインフルエンザウイルス−３のプライマーの
対。例えば、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３の
プライマーの対は、それぞれ、配列番号８および１０、
配列番号８および１１、または、配列番号９および１１
であってもよい。 （３）非構造タンパク−２遺伝子の領域から選択された
オリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、呼吸器細胞融合性
ウイルスのプライマーの対。例えば、呼吸器細胞融合性
ウイルスのプライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチ
ドは、それぞれ、配列番号１２および１４、または、配
列番号１３および１５であってもよい。 （４）非構造タンパク遺伝子の領域から選択されたオリ
ゴヌクレオチドをそれぞれ含む、インフルエンザウイル
スＡ型のプライマーの対。例えば、インフルエンザウイ
ルスＡ型のプライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチ
ドは、それぞれ、配列番号１６および１８、または、配
列番号１７および１９であってもよい。 （５）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたインフルエンザウイルスＢ型のプライマ
ーの対。例えば、インフルエンザウイルスＢ型のプライ
マーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、それぞれ、
配列番号２０および２２、または、配列番号２１および
２３であってもよい。
【０００５】別の局面では、本発明は、上記の１つのＰ
ＣＲプライマーのセットで呼吸器系ウイルスの核酸のテ
ンプレートの１つのグループを増幅することにより得ら
れる、１または２以上の核酸を含む核酸のセットを特長
とする。前記核酸のテンプレートの１つのグループは、
上記の７つのウイルスのうちの１または２以上から調製
される。これら増幅産物は、ウイルス検出のためのハイ
ブリダイゼーション用のプローブとして使用することが
できる。
ＣＲプライマーのセットで呼吸器系ウイルスの核酸のテ
ンプレートの１つのグループを増幅することにより得ら
れる、１または２以上の核酸を含む核酸のセットを特長
とする。前記核酸のテンプレートの１つのグループは、
上記の７つのウイルスのうちの１または２以上から調製
される。これら増幅産物は、ウイルス検出のためのハイ
ブリダイゼーション用のプローブとして使用することが
できる。
【０００６】さらに別の局面では、本発明は、上記の７
つの呼吸器系ウイルスを検出するために使用することが
できる、プローブのセットを特長とする。それぞれのプ
ローブは、２０〜１，０００個（例えば、２０〜５００
個か、２０〜２００個か、２０〜５０個）の長さのヌク
レオチドを有する。前記プローブのセットは、以下の１
または２以上を含む。 （１）非構造タンパク−２遺伝子の領域から選択された
オリゴヌクレオチドを含む、呼吸器細胞融合性ウイルス
のプローブ。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、配列
番号４０〜４６のうちの１つか、その相補体の配列かで
あってもよい。 （２）非構造タンパク遺伝子の領域から選択されたオリ
ゴヌクレオチドを含む、インフルエンザウイルスＡ型の
プローブ。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番
号４７〜４９のうちの１つ、または、その相補体の配列
であってもよい。 （３）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたオリゴヌクレオチドを含む、インフルエ
ンザウイルスＢ型のプローブ。例えば、前記オリゴヌク
レオチドは、配列番号５０〜５２のうちのうちの１つ、
または、その相補体の配列であってもよい。
つの呼吸器系ウイルスを検出するために使用することが
できる、プローブのセットを特長とする。それぞれのプ
ローブは、２０〜１，０００個（例えば、２０〜５００
個か、２０〜２００個か、２０〜５０個）の長さのヌク
レオチドを有する。前記プローブのセットは、以下の１
または２以上を含む。 （１）非構造タンパク−２遺伝子の領域から選択された
オリゴヌクレオチドを含む、呼吸器細胞融合性ウイルス
のプローブ。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、配列
番号４０〜４６のうちの１つか、その相補体の配列かで
あってもよい。 （２）非構造タンパク遺伝子の領域から選択されたオリ
ゴヌクレオチドを含む、インフルエンザウイルスＡ型の
プローブ。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、配列番
号４７〜４９のうちの１つ、または、その相補体の配列
であってもよい。 （３）ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択されたオリゴヌクレオチドを含む、インフルエ
ンザウイルスＢ型のプローブ。例えば、前記オリゴヌク
レオチドは、配列番号５０〜５２のうちのうちの１つ、
または、その相補体の配列であってもよい。
【０００７】本発明のプローブのセットは、さらに、以
下の１または２以上を含むことがあってもよい。 （１）ヒト・パラインフルエンザウイルス−１のプロー
ブ、例えば、配列番号２８〜３３のオリゴヌクレオチド
のうちの１つ、または、その相補体の配列を含むプロー
ブ。 （２）ヒト・パラインフルエンザウイルス−２のプロー
ブ、例えば、配列番号３４〜３６のオリゴヌクレオチド
のうちの１つ、または、その相補体の配列を含むプロー
ブ。 （３）ヒト・パラインフルエンザウイルス−３のプロー
ブ、例えば、配列番号３７〜３９のうちの１つ、また
は、その相補体の配列を含むプローブ。 （４）アデノウイルスのプローブ、例えば、配列番号５
３〜５７のオリゴヌクレオチドのうちの１つ、または、
その相補体の配列を含むプローブ。
下の１または２以上を含むことがあってもよい。 （１）ヒト・パラインフルエンザウイルス−１のプロー
ブ、例えば、配列番号２８〜３３のオリゴヌクレオチド
のうちの１つ、または、その相補体の配列を含むプロー
ブ。 （２）ヒト・パラインフルエンザウイルス−２のプロー
ブ、例えば、配列番号３４〜３６のオリゴヌクレオチド
のうちの１つ、または、その相補体の配列を含むプロー
ブ。 （３）ヒト・パラインフルエンザウイルス−３のプロー
ブ、例えば、配列番号３７〜３９のうちの１つ、また
は、その相補体の配列を含むプローブ。 （４）アデノウイルスのプローブ、例えば、配列番号５
３〜５７のオリゴヌクレオチドのうちの１つ、または、
その相補体の配列を含むプローブ。
【０００８】本発明の範囲には、ＰＣＲプライマーのセ
ットか、増幅された核酸のセットか、上記のプローブの
セットかを使用して、呼吸器系のウイルスを同時に検出
する方法が含まれる。検出されるべきウイルスの中に
は、ヒト・パラインフルエンザウイルス−２およびアデ
ノウイルスと、任意的に、ヒト・パラインフルエンザウ
イルス−１、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３、
呼吸器細胞融合性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ
型およびインフルエンザウイルスＢ型のうちの１または
２以上のウイルスとがある。前記方法は、（１）検出さ
れるべきウイルスを含むことが疑われるサンプル由来の
核酸を提供すること、（２）上記のＰＣＲプライマーの
セットのうちの１つで前記核酸を増幅すること、（３）
増幅産物を検出することを含む。標的ウイルスに特異的
な増幅産物を検出することは、前記標的ウイルスが存在
することを示す。そして、標的ウイルスに特異的な増幅
産物を検出することは、上記のプローブのセットのうち
の１つを前記増幅産物に対してハイブリダイゼーション
することにより達成される。
ットか、増幅された核酸のセットか、上記のプローブの
セットかを使用して、呼吸器系のウイルスを同時に検出
する方法が含まれる。検出されるべきウイルスの中に
は、ヒト・パラインフルエンザウイルス−２およびアデ
ノウイルスと、任意的に、ヒト・パラインフルエンザウ
イルス−１、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３、
呼吸器細胞融合性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ
型およびインフルエンザウイルスＢ型のうちの１または
２以上のウイルスとがある。前記方法は、（１）検出さ
れるべきウイルスを含むことが疑われるサンプル由来の
核酸を提供すること、（２）上記のＰＣＲプライマーの
セットのうちの１つで前記核酸を増幅すること、（３）
増幅産物を検出することを含む。標的ウイルスに特異的
な増幅産物を検出することは、前記標的ウイルスが存在
することを示す。そして、標的ウイルスに特異的な増幅
産物を検出することは、上記のプローブのセットのうち
の１つを前記増幅産物に対してハイブリダイゼーション
することにより達成される。
【０００９】本発明の範囲内には、さらに、ヒト・パラ
インフルエンザウイルス−２およびアデノウイルスと、
任意的に、ヒト・パラインフルエンザウイルス−１、ヒ
ト・パラインフルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融合
性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ型およびインフ
ルエンザウイルスＢ型のうちの１または２以上のウイル
スとを含む、呼吸器系のウイルスを同時に検出するため
のキットがある。前記キットは、ＰＣＲプライマーのセ
ットか、増幅された核酸のセットか、上記のプローブの
セットか、これらのなんらかの組み合わせかを含む。そ
れは、ＤＮＡポリメラーゼか、ＰＣＲバッファーか、１
または２以上の特異的なプローブが固定される固体の支
持物（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）かのような他の構
成要素を含む場合がある。
インフルエンザウイルス−２およびアデノウイルスと、
任意的に、ヒト・パラインフルエンザウイルス−１、ヒ
ト・パラインフルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融合
性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ型およびインフ
ルエンザウイルスＢ型のうちの１または２以上のウイル
スとを含む、呼吸器系のウイルスを同時に検出するため
のキットがある。前記キットは、ＰＣＲプライマーのセ
ットか、増幅された核酸のセットか、上記のプローブの
セットか、これらのなんらかの組み合わせかを含む。そ
れは、ＤＮＡポリメラーゼか、ＰＣＲバッファーか、１
または２以上の特異的なプローブが固定される固体の支
持物（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）かのような他の構
成要素を含む場合がある。
【００１０】本発明は、７つまでのありふれた呼吸器系
ウイルスを同時に検出することを可能にする。本発明の
１または２以上の実施態様の詳細は、以下の説明に列挙
される。その他の本発明の利点、特長および対象は、前
記説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
ウイルスを同時に検出することを可能にする。本発明の
１または２以上の実施態様の詳細は、以下の説明に列挙
される。その他の本発明の利点、特長および対象は、前
記説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１１】発明の詳細な説明
本発明は、ヒト・パラインフルエンザウイルス−２およ
びアデノウイルスという、２つの呼吸器系ウイルスの同
時検出に関する。具体的には、ヒト・パラインフルエン
ザウイルス−２、または、アデノウイルスを含むと疑わ
れるサンプルから調製された核酸テンプレートがＰＣＲ
プライマーのセットで増幅され、該セットは、ヒト・パ
ラインフルエンザウイルス−２プライマーと、アデノウ
イルスプライマーとを含む。増幅産物がある場合には、
ゲル電気泳動および染色か、プローブのハイブリダイゼ
ーションかによって検出される。ヒト・パラインフルエ
ンザウイルス−２、または、アデノウイルスに特異的な
増幅産物の検出は、前記サンプル中にそのウイルスが存
在することを示す。任意的には、ＰＣＲプライマーの前
記セットは、ヒト・パラインフルエンザウイルス−１、
ヒト・パラインフルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融
合性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、およびイ
ンフルエンザウイルスＢ型のような、他の呼吸器系ウイ
ルスを検出するための１または２以上の追加のプライマ
ーの対を含むことができる。
びアデノウイルスという、２つの呼吸器系ウイルスの同
時検出に関する。具体的には、ヒト・パラインフルエン
ザウイルス−２、または、アデノウイルスを含むと疑わ
れるサンプルから調製された核酸テンプレートがＰＣＲ
プライマーのセットで増幅され、該セットは、ヒト・パ
ラインフルエンザウイルス−２プライマーと、アデノウ
イルスプライマーとを含む。増幅産物がある場合には、
ゲル電気泳動および染色か、プローブのハイブリダイゼ
ーションかによって検出される。ヒト・パラインフルエ
ンザウイルス−２、または、アデノウイルスに特異的な
増幅産物の検出は、前記サンプル中にそのウイルスが存
在することを示す。任意的には、ＰＣＲプライマーの前
記セットは、ヒト・パラインフルエンザウイルス−１、
ヒト・パラインフルエンザウイルス−３、呼吸器細胞融
合性ウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、およびイ
ンフルエンザウイルスＢ型のような、他の呼吸器系ウイ
ルスを検出するための１または２以上の追加のプライマ
ーの対を含むことができる。
【００１２】前記核酸テンプレートは、精製済または未
精製の、ＤＮＡ（例えば、ゲノム断片、または、制限酵
素消化断片）またはＲＮＡであってもよい。これは、例
えば、呼吸器系感染症の徴候を示す患者由来の検体のよ
うな生物学的なサンプルから得られるものであってもよ
い。
精製の、ＤＮＡ（例えば、ゲノム断片、または、制限酵
素消化断片）またはＲＮＡであってもよい。これは、例
えば、呼吸器系感染症の徴候を示す患者由来の検体のよ
うな生物学的なサンプルから得られるものであってもよ
い。
【００１３】本発明は、上記の７つの呼吸器系ウイルス
を同時に検出するために用いられるＰＣＲプライマーの
対を特長とする。それぞれのウイルスについてのプライ
マーの対は、ＤＮＡスター（ＤＮＡｓｔａｒ、ＤＮＡＳ
ＴＡＲ、Ｉｎｃ．社、マジソン、ウィスコンシン州５３
７１５、米国）というプログラムを用いて、ＧｅｎＢａ
ｎｋのウイルス配列を解析することにより選択される。
保存された領域が最初に同定され、続いて、この領域か
らのプライマーの対の選択される。それぞれのプライマ
ーの対は、特異的な増幅産物が産生されることを確かめ
るために、検出されるべきウイルスで感染していると診
断された患者から調製された核酸テンプレートを用いる
ＰＣＲでテストすることができる。あるプライマーの対
が複数のウイルスの同時検出のために他のプライマーの
対と組み合わせられるとき、そのプライマーの対の特異
性は他のプライマーの対の存在によって影響を受けるこ
と、すなわち、同一の増幅産物が産生されることがあっ
てはならない。さらに、１のウイルスについて選択され
たプライマーの対は、他のウイルスから調製された核酸
テンプレートの非特異的な増幅を起こさないことが好ま
しく、異なるウイルスに特異的な増幅産物は異なる長さ
であるべきである。
を同時に検出するために用いられるＰＣＲプライマーの
対を特長とする。それぞれのウイルスについてのプライ
マーの対は、ＤＮＡスター（ＤＮＡｓｔａｒ、ＤＮＡＳ
ＴＡＲ、Ｉｎｃ．社、マジソン、ウィスコンシン州５３
７１５、米国）というプログラムを用いて、ＧｅｎＢａ
ｎｋのウイルス配列を解析することにより選択される。
保存された領域が最初に同定され、続いて、この領域か
らのプライマーの対の選択される。それぞれのプライマ
ーの対は、特異的な増幅産物が産生されることを確かめ
るために、検出されるべきウイルスで感染していると診
断された患者から調製された核酸テンプレートを用いる
ＰＣＲでテストすることができる。あるプライマーの対
が複数のウイルスの同時検出のために他のプライマーの
対と組み合わせられるとき、そのプライマーの対の特異
性は他のプライマーの対の存在によって影響を受けるこ
と、すなわち、同一の増幅産物が産生されることがあっ
てはならない。さらに、１のウイルスについて選択され
たプライマーの対は、他のウイルスから調製された核酸
テンプレートの非特異的な増幅を起こさないことが好ま
しく、異なるウイルスに特異的な増幅産物は異なる長さ
であるべきである。
【００１４】上記の７つの呼吸器系ウイルスを同時に検
出するために用いられるＰＣＲプライマーの対の例は以
下のとおりである。 （１）保存されたヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺
伝子の領域から選択された、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−１プライマーの対。例えば、順方向プライマ
ーＰＩＶ１−ｆ８３４および逆方向プライマーＰＩＶ１
−ｒ１０４９と、順方向プライマーＰＩＶ１−ｆ８４９
および逆方向プライマーＰＩＶ１−ｒ１０４９と、順方
向プライマーＰＩＶ１−ｆ８３４および逆方向プライマ
ーＰＩＶ１−ｒ１０９９とである。 （２）保存されたヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺
伝子の領域から選択された、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−２のプライマーの対。例えば、順方向プライ
マーＰＩＶ２−ｆ９２９および逆方向プライマーＰＩＶ
２−ｒ１１８２と、順方向プライマーＰＩＶ２−ｆ１０
１５および逆方向プライマーＰＩＶ２−ｒ１１８２とで
ある。 （３）保存されたヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺
伝子の領域から選択された、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−３のプライマーの対。例えば、順方向プライ
マーＰＩＶ３−ｆ７７４および逆方向プライマーＰＩＶ
３−ｒ９６０と、順方向プライマーＰＩＶ３−ｆ７７４
および逆方向プライマーＰＩＶ３−ｒ１０５９と、順方
向プライマーＰＩＶ３−ｆ９０４および逆方向プライマ
ーＰＩＶ３−ｒ１０５９とである。 （４）保存された非構造タンパク−２遺伝子の領域から
選択された、呼吸器細胞融合性ウイルスのプライマーの
対。例えば、順方向プライマーＲＳＶ−ｆ４１７および
逆方向プライマーＲＳＶ−ｒ６４１と、順方向プライマ
ーＲＳＶ−ｆ１３５１および逆方向プライマーＲＳＶ−
ｒ１５４０とである。 （５）保存されたに記載の非構造タンパク遺伝子の領域
から選択された、インフルエンザウイルスＡ型のプライ
マーの対。例えば、順方向プライマーＩＮＦＡ−ｆ１お
よび逆方向プライマーＩＮＦＡ−ｒ１と、順方向プライ
マーＩＮＦＡ−ｆ２および逆方向プライマーＩＮＦＡ−
ｒ２と、順方向プライマーＩＮＦＡ−ｆ１および逆方向
プライマーＩＮＦＡ−ｒ２とである。 （６）保存されたヘマグルチニンタンパク遺伝子の領域
から選択された、インフルエンザウイルスＢ型のプライ
マーの対。例えば、順方向プライマーＩＮＦＢ−９２ｆ
および逆方向プライマーＩＮＦＢ−３８４ｒと、順方向
プライマーＩＮＦＢ−５４０ｆおよび逆方向プライマー
ＩＮＦＢ−８２０ｒとである。 （７）保存されたヘクソンタンパク遺伝子の領域から選
択された、アデノウイルスのプライマーの対。例えば、
順方向プライマーＡＤＶ−ｆ１および逆方向プライマー
ＡＤＶ−ｒ２と、順方向プライマーＡＤＶ−ｆ２および
逆方向プライマーＡＤＶ−ｒ１とである。
出するために用いられるＰＣＲプライマーの対の例は以
下のとおりである。 （１）保存されたヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺
伝子の領域から選択された、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−１プライマーの対。例えば、順方向プライマ
ーＰＩＶ１−ｆ８３４および逆方向プライマーＰＩＶ１
−ｒ１０４９と、順方向プライマーＰＩＶ１−ｆ８４９
および逆方向プライマーＰＩＶ１−ｒ１０４９と、順方
向プライマーＰＩＶ１−ｆ８３４および逆方向プライマ
ーＰＩＶ１−ｒ１０９９とである。 （２）保存されたヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺
伝子の領域から選択された、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−２のプライマーの対。例えば、順方向プライ
マーＰＩＶ２−ｆ９２９および逆方向プライマーＰＩＶ
２−ｒ１１８２と、順方向プライマーＰＩＶ２−ｆ１０
１５および逆方向プライマーＰＩＶ２−ｒ１１８２とで
ある。 （３）保存されたヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺
伝子の領域から選択された、ヒト・パラインフルエンザ
ウイルス−３のプライマーの対。例えば、順方向プライ
マーＰＩＶ３−ｆ７７４および逆方向プライマーＰＩＶ
３−ｒ９６０と、順方向プライマーＰＩＶ３−ｆ７７４
および逆方向プライマーＰＩＶ３−ｒ１０５９と、順方
向プライマーＰＩＶ３−ｆ９０４および逆方向プライマ
ーＰＩＶ３−ｒ１０５９とである。 （４）保存された非構造タンパク−２遺伝子の領域から
選択された、呼吸器細胞融合性ウイルスのプライマーの
対。例えば、順方向プライマーＲＳＶ−ｆ４１７および
逆方向プライマーＲＳＶ−ｒ６４１と、順方向プライマ
ーＲＳＶ−ｆ１３５１および逆方向プライマーＲＳＶ−
ｒ１５４０とである。 （５）保存されたに記載の非構造タンパク遺伝子の領域
から選択された、インフルエンザウイルスＡ型のプライ
マーの対。例えば、順方向プライマーＩＮＦＡ−ｆ１お
よび逆方向プライマーＩＮＦＡ−ｒ１と、順方向プライ
マーＩＮＦＡ−ｆ２および逆方向プライマーＩＮＦＡ−
ｒ２と、順方向プライマーＩＮＦＡ−ｆ１および逆方向
プライマーＩＮＦＡ−ｒ２とである。 （６）保存されたヘマグルチニンタンパク遺伝子の領域
から選択された、インフルエンザウイルスＢ型のプライ
マーの対。例えば、順方向プライマーＩＮＦＢ−９２ｆ
および逆方向プライマーＩＮＦＢ−３８４ｒと、順方向
プライマーＩＮＦＢ−５４０ｆおよび逆方向プライマー
ＩＮＦＢ−８２０ｒとである。 （７）保存されたヘクソンタンパク遺伝子の領域から選
択された、アデノウイルスのプライマーの対。例えば、
順方向プライマーＡＤＶ−ｆ１および逆方向プライマー
ＡＤＶ−ｒ２と、順方向プライマーＡＤＶ−ｆ２および
逆方向プライマーＡＤＶ−ｒ１とである。
【００１５】それぞれのプライマーの配列は実施例１の
表１に列挙されている。典型的には、プライマーは１４
〜４０個の長さのヌクレオチドである（ＰＣＲアプリケ
ーション・マニュアル、べーリンガー・マンハイム、１
９９５年、３７頁）。本発明では、特異的なウイルス配
列は、それぞれのプライマーの５'末端か３'末端かのい
ずれかに追加されてもよく、非特異的な配列がそれぞれ
のプライマーの５'末端に追加されてもよい。非特異的
な配列の例は、制限酵素認識部位を含む配列である。か
かる配列を追加することは、増幅産物のクローン化を容
易にする。
表１に列挙されている。典型的には、プライマーは１４
〜４０個の長さのヌクレオチドである（ＰＣＲアプリケ
ーション・マニュアル、べーリンガー・マンハイム、１
９９５年、３７頁）。本発明では、特異的なウイルス配
列は、それぞれのプライマーの５'末端か３'末端かのい
ずれかに追加されてもよく、非特異的な配列がそれぞれ
のプライマーの５'末端に追加されてもよい。非特異的
な配列の例は、制限酵素認識部位を含む配列である。か
かる配列を追加することは、増幅産物のクローン化を容
易にする。
【００１６】本発明は、前記ＤＮＡスタープログラムを
使用して上記のプライマーの対で増幅された領域から選
ばれたプローブをも特長とする。前記プローブの例は、
以下のとおりである。 （１）ヒト・パラインフルエンザウイルス−１のプロー
ブである、Ｐ１−１、Ｐ１−２、Ｐ１−３、ＰＩＶ１−
Ｐ４、ＰＩＶ１−Ｐ５およびＰＩＶ１−Ｐ６。 （２）ヒト・パラインフルエンザウイルス−２のプロー
ブである、Ｐ２−１、Ｐ２−２およびＰ２−３。 （３）ヒト・パラインフルエンザウイルス−３のプロー
ブである、Ｐ３−１、Ｐ３−２およびＰ３−３。 （４）呼吸器細胞融合性ウイルスのプローブである、Ｒ
−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｒ−１０、Ｒ−４、Ｒ−７１お
よびＲ−７２。 （５）インフルエンザウイルスＡ型のプローブである、
Ａ１、Ａ２およびＡ３。 （６）インフルエンザウイルスＢ型のプローブである、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３。 （７）アデノウイルスのプローブである、Ｄ−１、Ｄ−
２、Ｄ−３、ＡＤＶ−Ｐ４およびＡＤＶ−Ｐ５。
使用して上記のプライマーの対で増幅された領域から選
ばれたプローブをも特長とする。前記プローブの例は、
以下のとおりである。 （１）ヒト・パラインフルエンザウイルス−１のプロー
ブである、Ｐ１−１、Ｐ１−２、Ｐ１−３、ＰＩＶ１−
Ｐ４、ＰＩＶ１−Ｐ５およびＰＩＶ１−Ｐ６。 （２）ヒト・パラインフルエンザウイルス−２のプロー
ブである、Ｐ２−１、Ｐ２−２およびＰ２−３。 （３）ヒト・パラインフルエンザウイルス−３のプロー
ブである、Ｐ３−１、Ｐ３−２およびＰ３−３。 （４）呼吸器細胞融合性ウイルスのプローブである、Ｒ
−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｒ−１０、Ｒ−４、Ｒ−７１お
よびＲ−７２。 （５）インフルエンザウイルスＡ型のプローブである、
Ａ１、Ａ２およびＡ３。 （６）インフルエンザウイルスＢ型のプローブである、
Ｂ１、Ｂ２およびＢ３。 （７）アデノウイルスのプローブである、Ｄ−１、Ｄ−
２、Ｄ−３、ＡＤＶ−Ｐ４およびＡＤＶ−Ｐ５。
【００１７】それぞれのプローブの配列は実施例３の表
３に列挙されている。これらのプローブと、これらを含
み、２０−１０００個（例えば、２０−５００個、２０
−２００個および２０−５０個）の長さのヌクレオチド
を有する、より長いプローブとは、増幅されない標的ウ
イルスの核酸か、上記のプライマーの対で増幅された標
的ウイルスの核酸かに対してハイブリダイゼーションを
することによって、上記の７つのウイルスを検出するた
めに用いることができる。例えば、上記の増幅産物は、
かかるより長いプローブの例である。ＧｅｎＢａｎｋの
検索は、上記のプライマーの対で増幅された核酸配列が
前記７つのウイルスに特異的であることを示す。複数の
ウイルスの同時検出のためにあるプローブを他のプロー
ブと組み合わせるとき、そのプローブの特異性は他のプ
ローブの存在によって影響を受けるべきではない、すな
わち、そのプローブは、他のプローブが存在していて
も、前記標的ウイルス核酸に対してハイブリダイゼーシ
ョンをする。好ましくは、１のウイルスについて選択さ
れたプローブは、他のウイルスから調製された核酸に対
してハイブリダイゼーションをしない。
３に列挙されている。これらのプローブと、これらを含
み、２０−１０００個（例えば、２０−５００個、２０
−２００個および２０−５０個）の長さのヌクレオチド
を有する、より長いプローブとは、増幅されない標的ウ
イルスの核酸か、上記のプライマーの対で増幅された標
的ウイルスの核酸かに対してハイブリダイゼーションを
することによって、上記の７つのウイルスを検出するた
めに用いることができる。例えば、上記の増幅産物は、
かかるより長いプローブの例である。ＧｅｎＢａｎｋの
検索は、上記のプライマーの対で増幅された核酸配列が
前記７つのウイルスに特異的であることを示す。複数の
ウイルスの同時検出のためにあるプローブを他のプロー
ブと組み合わせるとき、そのプローブの特異性は他のプ
ローブの存在によって影響を受けるべきではない、すな
わち、そのプローブは、他のプローブが存在していて
も、前記標的ウイルス核酸に対してハイブリダイゼーシ
ョンをする。好ましくは、１のウイルスについて選択さ
れたプローブは、他のウイルスから調製された核酸に対
してハイブリダイゼーションをしない。
【００１８】前記プローブは、膜（ナイロンメンブレ
ン、または、ニトロセルロースメンブレン）か、ガラス
か、プラスチックポリマーかのような固体の支持物の表
面に固定されてもよい。プローブの膜への固定化は、８
０℃でベーキング（ｂａｋｉｎｇ）すること、または、
ＵＶクロスリンキングすることによって達成されること
もある。前記プローブは、ガラスの表面にコーティング
された（例えばポリ−リジンのような）物質に共有結合
で連結されることもある。さらに、プラスチックポリマ
ーにプローブを固定化する新規な方法が最近開発され
た。米国特許出願第０９／９０６，２０７号明細書を参
照せよ。あるいは、前記プローブは、固体基質の上の正
確な位置に新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成される場合も
ある。シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、サイエンス、２７
０巻、４６７頁、１９９５年、コザール（Ｋｏｚａｌ）
ら、ネイチャー・メディシン、２巻、（７号）、７５３
頁、１９９６年、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、ニュークレ
イック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．）、２４巻、（２号）、３８０頁、１９
９６年、リプシュッツ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ）ら、バイオ
テクニック（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９巻、
（３号）、４４２頁、１９９５年、ピース（Ｐｅａｓ
ｅ）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド
・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９１巻、５０２２頁、１９
９４年、フォドール（Ｆｏｄｏｒ）ら、ネイチャー、３
６４巻、５５５頁、１９９３年、およびフォドールら、
ＷＯ ９２／１００９２を参照せよ。
ン、または、ニトロセルロースメンブレン）か、ガラス
か、プラスチックポリマーかのような固体の支持物の表
面に固定されてもよい。プローブの膜への固定化は、８
０℃でベーキング（ｂａｋｉｎｇ）すること、または、
ＵＶクロスリンキングすることによって達成されること
もある。前記プローブは、ガラスの表面にコーティング
された（例えばポリ−リジンのような）物質に共有結合
で連結されることもある。さらに、プラスチックポリマ
ーにプローブを固定化する新規な方法が最近開発され
た。米国特許出願第０９／９０６，２０７号明細書を参
照せよ。あるいは、前記プローブは、固体基質の上の正
確な位置に新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成される場合も
ある。シェーナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、サイエンス、２７
０巻、４６７頁、１９９５年、コザール（Ｋｏｚａｌ）
ら、ネイチャー・メディシン、２巻、（７号）、７５３
頁、１９９６年、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、ニュークレ
イック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．）、２４巻、（２号）、３８０頁、１９
９６年、リプシュッツ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ）ら、バイオ
テクニック（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９巻、
（３号）、４４２頁、１９９５年、ピース（Ｐｅａｓ
ｅ）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド
・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９１巻、５０２２頁、１９
９４年、フォドール（Ｆｏｄｏｒ）ら、ネイチャー、３
６４巻、５５５頁、１９９３年、およびフォドールら、
ＷＯ ９２／１００９２を参照せよ。
【００１９】上記の標的増幅産物は、固定化されたプロ
ーブと結合されることによって検出することができる。
検出を容易にするために、標識された増幅産物は、標識
された増幅用プライマーを用いて作成することができ
る。あるいは、標識は増幅の後で、化学的に、または、
酵素的に行うことができる。標識試薬の例は、蛍光分子
（例えばフルオレセインおよびローダミン）、放射性同
位元素（例えば３２Ｐ、または、１２５Ｉ）、発色試薬
および化学発光試薬を含むが、これらに限定されない。
ビオチンおよびジゴキシジェニン（ｄｉｇｏｘｇｅｎｉ
ｎ）は、しばしば、膜、または、プラスチックポリマー
の上での発色検出に使用される。Ｃｙ３およびＣｙ５の
ような蛍光標識はガラスの上での検出に広く使用され
る。さらに、人工的なタグ付けテール（ｔａｇｇｉｎｇ
ｔａｉｌｓ、例えば、タンパク質、または、その抗
体）は、前記プライマーの５'末端か、前記プローブの
いずれかの末端かにコンジュゲーションすることができ
る。シュテツェンコ（Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏ）およびゲイ
ト（Ｇａｉｔ）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケ
ミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．）、６５巻、
（１６号）、４９００頁、２０００年を参照せよ。
ーブと結合されることによって検出することができる。
検出を容易にするために、標識された増幅産物は、標識
された増幅用プライマーを用いて作成することができ
る。あるいは、標識は増幅の後で、化学的に、または、
酵素的に行うことができる。標識試薬の例は、蛍光分子
（例えばフルオレセインおよびローダミン）、放射性同
位元素（例えば３２Ｐ、または、１２５Ｉ）、発色試薬
および化学発光試薬を含むが、これらに限定されない。
ビオチンおよびジゴキシジェニン（ｄｉｇｏｘｇｅｎｉ
ｎ）は、しばしば、膜、または、プラスチックポリマー
の上での発色検出に使用される。Ｃｙ３およびＣｙ５の
ような蛍光標識はガラスの上での検出に広く使用され
る。さらに、人工的なタグ付けテール（ｔａｇｇｉｎｇ
ｔａｉｌｓ、例えば、タンパク質、または、その抗
体）は、前記プライマーの５'末端か、前記プローブの
いずれかの末端かにコンジュゲーションすることができ
る。シュテツェンコ（Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏ）およびゲイ
ト（Ｇａｉｔ）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケ
ミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．）、６５巻、
（１６号）、４９００頁、２０００年を参照せよ。
【００２０】本発明のウイルス検出方法の特異性は予想
外に高い。異なるウイルスに特異性なプライマーの対が
前記ウイルスの同時検出のためにいっしょに混合された
とき、それぞれの核酸テンプレートは、その特定のウイ
ルスについて選択されたプライマーの対でだけ増幅され
る。他のプライマーの対が存在するために起こる非特異
的な増幅はない。同様に、異なるウイルスに特異的なプ
ローブが前記ウイルスの同時検出のためにいっしょに混
合されるとき、それぞれの標的ウイルス核酸はその特定
のウイルスについて選択されたプローブに対してだけハ
イブリダイゼーションをする。標的ウイルス核酸と他の
ウイルスについて選択されたプローブとの間での非特異
的なハイブリダイゼーションはない。
外に高い。異なるウイルスに特異性なプライマーの対が
前記ウイルスの同時検出のためにいっしょに混合された
とき、それぞれの核酸テンプレートは、その特定のウイ
ルスについて選択されたプライマーの対でだけ増幅され
る。他のプライマーの対が存在するために起こる非特異
的な増幅はない。同様に、異なるウイルスに特異的なプ
ローブが前記ウイルスの同時検出のためにいっしょに混
合されるとき、それぞれの標的ウイルス核酸はその特定
のウイルスについて選択されたプローブに対してだけハ
イブリダイゼーションをする。標的ウイルス核酸と他の
ウイルスについて選択されたプローブとの間での非特異
的なハイブリダイゼーションはない。
【００２１】また、さらに多くの微生物の同時同定のた
めに、前記７つのウイルスについて特異的な配列を他の
種特異的核酸配列との組み合わせで使用することも本発
明の範囲内にある。
めに、前記７つのウイルスについて特異的な配列を他の
種特異的核酸配列との組み合わせで使用することも本発
明の範囲内にある。
【００２２】さらに、単一ヌクレオチド多型性が生じる
部位では、ヌクレオチドの変異が本発明のプライマーお
よびプローブに許される。単一ヌクレオチド多型性は特
定の遺伝子型、または、表現型と関連するかもしれない
ので、これらのプライマーおよびプローブは異なるウイ
ルス株を区別し分類するために使用することができる。
部位では、ヌクレオチドの変異が本発明のプライマーお
よびプローブに許される。単一ヌクレオチド多型性は特
定の遺伝子型、または、表現型と関連するかもしれない
ので、これらのプライマーおよびプローブは異なるウイ
ルス株を区別し分類するために使用することができる。
【００２３】以下の実施例は単に例示として解釈される
べきであって、いかなる意味でもまったく残りの開示を
制限すると解釈されるべきではない。さらなる骨折りな
しに、当業者はここの説明に基づいて本発明のその最大
限まで使用することができると信じられている。このに
列挙された全ての刊行物は引用によりその全体がここに
取り込まれている。
べきであって、いかなる意味でもまったく残りの開示を
制限すると解釈されるべきではない。さらなる骨折りな
しに、当業者はここの説明に基づいて本発明のその最大
限まで使用することができると信じられている。このに
列挙された全ての刊行物は引用によりその全体がここに
取り込まれている。
【００２４】
【実施例】実施例１ 特異的な呼吸器系ウイルスの増幅
および検出 Ａ．プライマーの設計 （１）ヒト・パラインフルエンザウイルス−１（ＨＰＩ
Ｖ１）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｕ０１０７５、ａ
ｆ０１６２８１、ｍ３１２２８、ｍ８６７８０、ｍ８６
７８１、ｍ８６７８３、ｍ８６７８５、ｍ８６７８７、
ｍ８６７９１、ｍ９１６４８、ｕ０１０７３、ｕ０１０
７４、ａｆ０１６２８０、ｕ７０９４８、ｕ０１０７
９、ｕ０１０８１、ｕ０１０８３、ｕ０１０８５、ｕ７
０９３６、ｕ１０９３８、ｕ７０９４０、ｕ７０９４
２、ｕ７０９４４、ｕ７０９４６およびｕ０１０７７か
らのＨＰＩＶ１の配列がＤＮＡスタープログラムを使用
して解析された。保存された領域がヘマグルチニン−ノ
イラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子の領域において同定され
た。２本の順方向プライマー（ＰＩＶ１−ｆ８３４およ
びＰＩＶ１−ｆ８４９）および２本の逆方向プライマー
（ＰＩＶ１−ｒ１０４９およびＰＩＶ１−ｒ１０９９）
がこの保存された領域から選択された（表１）。
および検出 Ａ．プライマーの設計 （１）ヒト・パラインフルエンザウイルス−１（ＨＰＩ
Ｖ１）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｕ０１０７５、ａ
ｆ０１６２８１、ｍ３１２２８、ｍ８６７８０、ｍ８６
７８１、ｍ８６７８３、ｍ８６７８５、ｍ８６７８７、
ｍ８６７９１、ｍ９１６４８、ｕ０１０７３、ｕ０１０
７４、ａｆ０１６２８０、ｕ７０９４８、ｕ０１０７
９、ｕ０１０８１、ｕ０１０８３、ｕ０１０８５、ｕ７
０９３６、ｕ１０９３８、ｕ７０９４０、ｕ７０９４
２、ｕ７０９４４、ｕ７０９４６およびｕ０１０７７か
らのＨＰＩＶ１の配列がＤＮＡスタープログラムを使用
して解析された。保存された領域がヘマグルチニン−ノ
イラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子の領域において同定され
た。２本の順方向プライマー（ＰＩＶ１−ｆ８３４およ
びＰＩＶ１−ｆ８４９）および２本の逆方向プライマー
（ＰＩＶ１−ｒ１０４９およびＰＩＶ１−ｒ１０９９）
がこの保存された領域から選択された（表１）。
【００２５】ヒト・パラインフルエンザウイルス−２
（ＨＰＩＶ２）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ａｆ０３９９３
０、ａｆ０３９９３１、ａｆ０３９９３２、ａｆ０３９
９３４、ａｆ０３９９３７、ｘ５７５５９、ａｆ２１３
３５３、ａｆ２１３３５４、ｄ００８６５およびａｆ２
１３３５２からのＨＰＩＶ２の配列がＤＮＡスタープロ
グラムを使用して解析された。２本の順方向プライマー
（ＰＩＶ２−ｆ９２９およびＰＩＶ２−ｆ１０１５）
と、１本の逆方向プライマー（ＰＩＶ２−ｒ１１８２）
とがこの保存された領域から選択された（表１）。
（ＨＰＩＶ２）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ａｆ０３９９３
０、ａｆ０３９９３１、ａｆ０３９９３２、ａｆ０３９
９３４、ａｆ０３９９３７、ｘ５７５５９、ａｆ２１３
３５３、ａｆ２１３３５４、ｄ００８６５およびａｆ２
１３３５２からのＨＰＩＶ２の配列がＤＮＡスタープロ
グラムを使用して解析された。２本の順方向プライマー
（ＰＩＶ２−ｆ９２９およびＰＩＶ２−ｆ１０１５）
と、１本の逆方向プライマー（ＰＩＶ２−ｒ１１８２）
とがこの保存された領域から選択された（表１）。
【００２６】ヒト・パラインフルエンザウイルス−３
（ＨＰＩＶ３）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｚ２６５３２、Ｌ
２５３５０、Ｍ１７６４１、Ｍ１８７５９、Ｍ１８７６
０、Ｍ１８７６１、Ｍ１８７６２、Ｍ１８７６３、Ｍ１
８７６４、Ｍ２０４０２、Ｍ２１６４９、ＮＣ＿００１
７９６、Ｕ５１１１６、Ｚ１１５７５、ａＢ０１２１３
２、ａｆ０３９９２２、ＡＦ０３９９２４、ＡＦ０３９
９２５、ＡＦ０３９９２６、ＡＦ０３９９２７、ＡＦ０
３９９２９、ＡＦ０３９９３３およびＡＦ０３９９３６
からのＨＰＩＶ３配列がＤＮＡスタープログラムを使用
して解析された。保存された領域が前記ＨＮ遺伝子の領
域に同定された。２本の順方向プライマー（ＰＩＶ３−
ｆ７７４およびＰＩＶ３−ｆ９０４）および２本の逆方
向プライマー（ＰＩＶ３−ｒ９６０およびＰＩＶ３−ｒ
１０５９）がこの保存された領域から選択された（表
１）。
（ＨＰＩＶ３）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｚ２６５３２、Ｌ
２５３５０、Ｍ１７６４１、Ｍ１８７５９、Ｍ１８７６
０、Ｍ１８７６１、Ｍ１８７６２、Ｍ１８７６３、Ｍ１
８７６４、Ｍ２０４０２、Ｍ２１６４９、ＮＣ＿００１
７９６、Ｕ５１１１６、Ｚ１１５７５、ａＢ０１２１３
２、ａｆ０３９９２２、ＡＦ０３９９２４、ＡＦ０３９
９２５、ＡＦ０３９９２６、ＡＦ０３９９２７、ＡＦ０
３９９２９、ＡＦ０３９９３３およびＡＦ０３９９３６
からのＨＰＩＶ３配列がＤＮＡスタープログラムを使用
して解析された。保存された領域が前記ＨＮ遺伝子の領
域に同定された。２本の順方向プライマー（ＰＩＶ３−
ｆ７７４およびＰＩＶ３−ｆ９０４）および２本の逆方
向プライマー（ＰＩＶ３−ｒ９６０およびＰＩＶ３−ｒ
１０５９）がこの保存された領域から選択された（表
１）。
【００２７】（４）呼吸器細胞融合性ウイルス（ＲＳ
Ｖ）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ａｆ０３５００
６、６３６４４、５０３６２、５０３６３、１１４８
６、７４５６８、Ｃ＿００１８０３、３９６６１、３９
６６２、００００１、ｆ０１３２５５、Ｃ＿００１７８
１、Ｆ０１３２５４および００７３６からのＲＳＶ配列
がＤＮＡスタープログラムを使用して解析された。保存
された領域が非構造タンパク−２（ＮＳ２）遺伝子の領
域に同定された。２本の順方向プライマー（ＲＳＶ−ｆ
４１７およびＲＳＶ−ｆ１３５１）および２本の逆方向
プライマー（ＲＳＶ−ｒ６４１およびＲＳＶ−ｒ１５４
０）がこの保存された領域から選択された（表１）。
Ｖ）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ａｆ０３５００
６、６３６４４、５０３６２、５０３６３、１１４８
６、７４５６８、Ｃ＿００１８０３、３９６６１、３９
６６２、００００１、ｆ０１３２５５、Ｃ＿００１７８
１、Ｆ０１３２５４および００７３６からのＲＳＶ配列
がＤＮＡスタープログラムを使用して解析された。保存
された領域が非構造タンパク−２（ＮＳ２）遺伝子の領
域に同定された。２本の順方向プライマー（ＲＳＶ−ｆ
４１７およびＲＳＶ−ｆ１３５１）および２本の逆方向
プライマー（ＲＳＶ−ｒ６４１およびＲＳＶ−ｒ１５４
０）がこの保存された領域から選択された（表１）。
【００２８】インフルエンザウイルスＡ型（ＩＮＦ−
Ａ）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｍ１２５９４、ｋ
００５７６、ｍ１２５９２、ｍ１２５９０、ｄ３０６７
３、ｊ０２１５０、ｘ５２１４６、ｕ０８８６２、ｕ６
５６７４およびｕ６５６７０からのＩＮＦ−Ａ配列が、
ＤＮＡスタープログラムを使用して解析された。保存さ
れた領域が非構造タンパク（ＮＳ）遺伝子の領域におい
て同定された。２本の順方向プライマー（ＩＮＦＡ−ｆ
１およびＩＮＦＡ−ｆ２）および２本の逆方向プライマ
ー（ＩＮＦＡ−ｒ１およびＩＮＦＡ−ｒ２）がこの保存
された領域から選択された（表１）。
Ａ）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｍ１２５９４、ｋ
００５７６、ｍ１２５９２、ｍ１２５９０、ｄ３０６７
３、ｊ０２１５０、ｘ５２１４６、ｕ０８８６２、ｕ６
５６７４およびｕ６５６７０からのＩＮＦ−Ａ配列が、
ＤＮＡスタープログラムを使用して解析された。保存さ
れた領域が非構造タンパク（ＮＳ）遺伝子の領域におい
て同定された。２本の順方向プライマー（ＩＮＦＡ−ｆ
１およびＩＮＦＡ−ｆ２）および２本の逆方向プライマ
ー（ＩＮＦＡ−ｒ１およびＩＮＦＡ−ｒ２）がこの保存
された領域から選択された（表１）。
【００２９】インフルエンザウイルスＢ型（ＩＮＦ−
Ｂ）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｘ１３５５２、ｘ
００８９７、ｍ１８３８４、ｕ７０３８４、ｘ１３５５
０、ａｆ１０１０７１、ｍ５８４２２、ｍ５８４２１、
ｍ６５１７０，およびｋ０２７１３からのＩＮＦ−Ｂ配
列が、ＤＮＡスタープログラムを使用して解析された。
保存された領域がヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子の領域
に同定された。２本の順方向プライマー（ＩＮＦＢ−９
２ｆおよびＩＮＦＢ−５４０ｆ）および２本の逆方向プ
ライマー（ＩＮＦＢ−３８４ｒおよびＩＮＦＢ−８２０
ｒ）がこの保存された領域から選択された（表１）。
Ｂ）プライマー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｘ１３５５２、ｘ
００８９７、ｍ１８３８４、ｕ７０３８４、ｘ１３５５
０、ａｆ１０１０７１、ｍ５８４２２、ｍ５８４２１、
ｍ６５１７０，およびｋ０２７１３からのＩＮＦ−Ｂ配
列が、ＤＮＡスタープログラムを使用して解析された。
保存された領域がヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子の領域
に同定された。２本の順方向プライマー（ＩＮＦＢ−９
２ｆおよびＩＮＦＢ−５４０ｆ）および２本の逆方向プ
ライマー（ＩＮＦＢ−３８４ｒおよびＩＮＦＢ−８２０
ｒ）がこの保存された領域から選択された（表１）。
【００３０】（７）アデノウイルス（ＡＤＶ）プライマ
ー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｘ６７７０９、ａ
ｂ０５３１６６、ｘ７６５４９、ｘ８４６４６、ａｆ０
６５０６６、ｊ０１９１７およびｊ０１９６６からのＡ
ＤＶ配列が、ＤＮＡスタープログラムを使用して解析さ
れた。保存された領域がヘクソンタンパク（Ｈｅｘ）遺
伝子の領域に同定された。２本の順方向プライマー（Ａ
ＤＶ−ｆ１およびＡＤＶ−ｆ２）および２本の逆方向プ
ライマー（ＡＤＶ−ｒ１およびＡＤＶ−ｒ２）がこの保
存された領域から選択された（表１）。
ー ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｘ６７７０９、ａ
ｂ０５３１６６、ｘ７６５４９、ｘ８４６４６、ａｆ０
６５０６６、ｊ０１９１７およびｊ０１９６６からのＡ
ＤＶ配列が、ＤＮＡスタープログラムを使用して解析さ
れた。保存された領域がヘクソンタンパク（Ｈｅｘ）遺
伝子の領域に同定された。２本の順方向プライマー（Ａ
ＤＶ−ｆ１およびＡＤＶ−ｆ２）および２本の逆方向プ
ライマー（ＡＤＶ−ｒ１およびＡＤＶ−ｒ２）がこの保
存された領域から選択された（表１）。
【００３１】
【表１】プライマー配列
【００３２】Ｂ．ウイルス培養の調製
ＨＰＩＶ１（サンプル番号５８０および４０５６）、Ｈ
ＰＩＶ２（サンプル番号４８５５および５０８８）、Ｈ
ＰＩＶ３（サンプル番号３１１６および３２２９）、Ｒ
ＳＶ（サンプル番号３１１６および３２２９）、ＩＮＦ
−Ａ（サンプル番号ＮＳＷ、ＰＣ，およびＤＲ）、ＩＮ
Ｆ−Ｂ（サンプル番号９５、９６、９７、９８、０１）
およびＡＤＶ（サンプル番号５４５６、６０８および８
１９）の臨床サンプルは、シン・ルー・シー（Ｓｈｉｎ
Ｒｕ Ｓｈｉｈ）博士（長庚大学(Ｃｈａｎｇ Ｇｕ
ｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ)、台湾、桃園（Ｔａｏ
Ｙｕａｎ））から厚意により提供を受けた。
ＰＩＶ２（サンプル番号４８５５および５０８８）、Ｈ
ＰＩＶ３（サンプル番号３１１６および３２２９）、Ｒ
ＳＶ（サンプル番号３１１６および３２２９）、ＩＮＦ
−Ａ（サンプル番号ＮＳＷ、ＰＣ，およびＤＲ）、ＩＮ
Ｆ−Ｂ（サンプル番号９５、９６、９７、９８、０１）
およびＡＤＶ（サンプル番号５４５６、６０８および８
１９）の臨床サンプルは、シン・ルー・シー（Ｓｈｉｎ
Ｒｕ Ｓｈｉｈ）博士（長庚大学(Ｃｈａｎｇ Ｇｕ
ｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ)、台湾、桃園（Ｔａｏ
Ｙｕａｎ））から厚意により提供を受けた。
【００３３】咽頭ぬぐい（ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ）検
体がウイルス感染の徴候を示す患者から採取され、０．
２％ＢＰＡ（ｐ−ボロノ−Ｌ−フェニルアラニン（ｐ−
ｂｏｒｏｎｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ））、
１００ユニットのペニシリン、１００μｇのストレプト
マイシンおよび１．２５μｇのファンギゾンを含むハン
クス溶液に移された。サンプルは室温で０．５−３時間
救急室で保存された後、４℃、または、８０℃で冷蔵さ
れた。
体がウイルス感染の徴候を示す患者から採取され、０．
２％ＢＰＡ（ｐ−ボロノ−Ｌ−フェニルアラニン（ｐ−
ｂｏｒｏｎｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ））、
１００ユニットのペニシリン、１００μｇのストレプト
マイシンおよび１．２５μｇのファンギゾンを含むハン
クス溶液に移された。サンプルは室温で０．５−３時間
救急室で保存された後、４℃、または、８０℃で冷蔵さ
れた。
【００３４】モンキー・キドニー（Ｍｏｎｋｅｙ Ｋｉ
ｄｎｅｙ）−２細胞が、２％ＦＢＳ−ＭＥＭ、１００ユ
ニットのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン
および１．２５μｇファンギゾンを含む細胞培養液で培
養された。１００μｌずつの臨床検体が前記細胞培養液
に接種され、３７℃で７〜１０日間ＣＯ２を加えてイン
キュベーションされた。
ｄｎｅｙ）−２細胞が、２％ＦＢＳ−ＭＥＭ、１００ユ
ニットのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン
および１．２５μｇファンギゾンを含む細胞培養液で培
養された。１００μｌずつの臨床検体が前記細胞培養液
に接種され、３７℃で７〜１０日間ＣＯ２を加えてイン
キュベーションされた。
【００３５】Ｃ．核酸抽出およびＲＴ−ＰＣＲ
ウイルス培養は遠心された。核酸が前記検体５０μｌか
らハイ・ピュア・核酸精製キット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ
Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ロシュ）を使用して単離さ
れ、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に懸濁された。
らハイ・ピュア・核酸精製キット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ
Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ロシュ）を使用して単離さ
れ、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に懸濁された。
【００３６】２μｌの前記核酸溶液が１μｌのランダム
プライマーＰｄＮ（Ｎ）６（ロシュ、５μｇ／μｌ）と
混合された。前記混合液は７２℃で１０分間インキュベ
ーションされて、４℃で保存された。
プライマーＰｄＮ（Ｎ）６（ロシュ、５μｇ／μｌ）と
混合された。前記混合液は７２℃で１０分間インキュベ
ーションされて、４℃で保存された。
【００３７】レディ・ツー・ゴー（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−
Ｇｏ）ＲＴ−ＰＣＲビーズ（アマシャム・ファルマシア
・バイオテク・インク社、米国）が、３５μｌのＤＥＰ
Ｃ処理水に溶解された。この溶液の７μｌが、上記の前
処理された核酸混合液に添加された。最終混合液は、４
２℃で４５分間インキュベーションされた。ＡＤＶはＤ
ＮＡウイルスであるから、逆転写は適用できないことに
注意すべきである。
Ｇｏ）ＲＴ−ＰＣＲビーズ（アマシャム・ファルマシア
・バイオテク・インク社、米国）が、３５μｌのＤＥＰ
Ｃ処理水に溶解された。この溶液の７μｌが、上記の前
処理された核酸混合液に添加された。最終混合液は、４
２℃で４５分間インキュベーションされた。ＡＤＶはＤ
ＮＡウイルスであるから、逆転写は適用できないことに
注意すべきである。
【００３８】それぞれのＰＣＲ用試験管は１μｌの１０
ｘ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー、０．３μｌ
の２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．８μｌの２．５ｍＭ ｄ
ＮＴＰｓ（プロメガ、米国、ウィスコンシン州、マジソ
ン）、０．２μｌの１００μＭ順方向プライマー、０．
２μｌの１００μＭ逆方向プライマー、０．２μｌホル
ムアミド、５μｌの逆転写混合液および０．１μｌのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μｌ）。最終体
積が１０μｌになるようにｄＨ２Ｏが前記混合液に添加
された。
ｘ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼバッファー、０．３μｌ
の２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．８μｌの２．５ｍＭ ｄ
ＮＴＰｓ（プロメガ、米国、ウィスコンシン州、マジソ
ン）、０．２μｌの１００μＭ順方向プライマー、０．
２μｌの１００μＭ逆方向プライマー、０．２μｌホル
ムアミド、５μｌの逆転写混合液および０．１μｌのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μｌ）。最終体
積が１０μｌになるようにｄＨ２Ｏが前記混合液に添加
された。
【００３９】増幅は、ペルチエ効果のサーマル・サイク
ラー（ＰＴＣ−１００、ＭＪリサーチ・インク、米国、
マサチューセッツ州）を使用して、９５℃５分間の後、
９５℃４０秒間と、５０℃４０秒間と、７２℃４０秒間
との繰り返しを３５回行い、最後の伸長反応を７２℃５
分間行うという条件で実施された。
ラー（ＰＴＣ−１００、ＭＪリサーチ・インク、米国、
マサチューセッツ州）を使用して、９５℃５分間の後、
９５℃４０秒間と、５０℃４０秒間と、７２℃４０秒間
との繰り返しを３５回行い、最後の伸長反応を７２℃５
分間行うという条件で実施された。
【００４０】Ｄ．増幅産物の検出
増幅産物５μｌが、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）バッファー中の２％アガロ
ースゲルでの電気泳動で解析された。増幅産物は前記ア
ガロースゲルをエチジウムブロミドで染色することによ
り検出された。
８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）バッファー中の２％アガロ
ースゲルでの電気泳動で解析された。増幅産物は前記ア
ガロースゲルをエチジウムブロミドで染色することによ
り検出された。
【００４１】予想外のことに、特異的な増幅産物が以下
のとおり検出された。 （１）ＨＰＩＶ１について、ｆ８３４およびｒ１０４９
のプライマーセットでの増幅からは２１８塩基対の断
片、ｆ８４９およびｒ１０４９のプライマーセットでの
増幅からは２０１塩基対の断片、ｆ８３４およびｒ１０
９９のプライマーセットでの増幅からは２６８塩基対の
断片であった。ｆ８４９およびｒ１０９９のプライマー
セットでの増幅は２５１塩基対の非特異的な断片を生成
した。 （２）ＨＰＩＶ２については、ｆ９２９およびｒ１１８
２のプライマーセットでの増幅からは２５４塩基対の断
片、ｆ１０１５およびｒ１１８２のプライマーセットで
の増幅からは１６８塩基対の断片であった。 （３）ｆ７７４およびｒ９６０のプライマーセットでの
増幅からは１８７塩基対の断片、ｆ７７４およびｒ１０
５９のプライマーセットでの増幅からは２８６塩基対の
断片、そして、ｆ９０４およびｒ１０５９のプライマー
セットでの増幅からは１５６塩基対の断片であった。ｆ
９０４およびｒ９６０のプライマーセットでの増幅は５
７塩基対の断片を生成することができなかった。 （４）ＲＳＶについては、ｆ４１７およびｒ６４１のプ
ライマーセットでの増幅からは２２２塩基対の断片、ｆ
１３５１およびｒ１５４０のプライマーセットでの増幅
からは１９４塩基対の断片であった。 （５）ＩＮＦ−Ａについては、ＩＮＦＡ−ｆ１およびＩ
ＮＦＡ−ｒ１のプライマーセットでの増幅からは２６８
塩基対の断片、ＩＮＦＡ−ｆ２およびＩＮＦＡ−ｒ２の
プライマーセットでの増幅からは２５２塩基対の断片、
そして、ＩＮＦＡ−ｆ１およびＩＮＦＡ−ｒ２のプライ
マーセットでの増幅からは４９９塩基対の断片であっ
た。 （６）ＩＮＦ−Ｂについては、９２ｆおよび３８４ｒの
プライマーセットでの増幅からは２９３塩基対の断片、
５４０ｆおよび８２０ｒのプライマーセットでの増幅か
らは２７５塩基対の断片であった。しかし、前記２７５
塩基対のバンドは前記２９３塩基対のバンドほど濃くは
なかった。 （７）ＡＤＶについては、ＡＤＶ−ｆ１およびＡＤＶ−
ｒ１のプライマーセットでの増幅からは５５６塩基対の
断片、ＡＤＶ−ｆ２およびＡＤＶ−ｒ１のプライマーセ
ットでの増幅からは１２８塩基対の断片であった。
のとおり検出された。 （１）ＨＰＩＶ１について、ｆ８３４およびｒ１０４９
のプライマーセットでの増幅からは２１８塩基対の断
片、ｆ８４９およびｒ１０４９のプライマーセットでの
増幅からは２０１塩基対の断片、ｆ８３４およびｒ１０
９９のプライマーセットでの増幅からは２６８塩基対の
断片であった。ｆ８４９およびｒ１０９９のプライマー
セットでの増幅は２５１塩基対の非特異的な断片を生成
した。 （２）ＨＰＩＶ２については、ｆ９２９およびｒ１１８
２のプライマーセットでの増幅からは２５４塩基対の断
片、ｆ１０１５およびｒ１１８２のプライマーセットで
の増幅からは１６８塩基対の断片であった。 （３）ｆ７７４およびｒ９６０のプライマーセットでの
増幅からは１８７塩基対の断片、ｆ７７４およびｒ１０
５９のプライマーセットでの増幅からは２８６塩基対の
断片、そして、ｆ９０４およびｒ１０５９のプライマー
セットでの増幅からは１５６塩基対の断片であった。ｆ
９０４およびｒ９６０のプライマーセットでの増幅は５
７塩基対の断片を生成することができなかった。 （４）ＲＳＶについては、ｆ４１７およびｒ６４１のプ
ライマーセットでの増幅からは２２２塩基対の断片、ｆ
１３５１およびｒ１５４０のプライマーセットでの増幅
からは１９４塩基対の断片であった。 （５）ＩＮＦ−Ａについては、ＩＮＦＡ−ｆ１およびＩ
ＮＦＡ−ｒ１のプライマーセットでの増幅からは２６８
塩基対の断片、ＩＮＦＡ−ｆ２およびＩＮＦＡ−ｒ２の
プライマーセットでの増幅からは２５２塩基対の断片、
そして、ＩＮＦＡ−ｆ１およびＩＮＦＡ−ｒ２のプライ
マーセットでの増幅からは４９９塩基対の断片であっ
た。 （６）ＩＮＦ−Ｂについては、９２ｆおよび３８４ｒの
プライマーセットでの増幅からは２９３塩基対の断片、
５４０ｆおよび８２０ｒのプライマーセットでの増幅か
らは２７５塩基対の断片であった。しかし、前記２７５
塩基対のバンドは前記２９３塩基対のバンドほど濃くは
なかった。 （７）ＡＤＶについては、ＡＤＶ−ｆ１およびＡＤＶ−
ｒ１のプライマーセットでの増幅からは５５６塩基対の
断片、ＡＤＶ−ｆ２およびＡＤＶ−ｒ１のプライマーセ
ットでの増幅からは１２８塩基対の断片であった。
【００４２】本実施例に使用された臨床サンプルは、シ
ン・ルー・シー博士（長庚大学、台湾、桃園）から提供
を受けた、ＰＩＶ１番号５８０、ＰＩＶ２番号５１２
９、ＰＩＶ３番号１０５７、ＲＳＶ番号３１６７、ＩＮ
Ｆ−Ａ番号ＤＲ、ＩＮＦ−Ｂ番号０１およびＡＤＶ番号
５４５６であった。
ン・ルー・シー博士（長庚大学、台湾、桃園）から提供
を受けた、ＰＩＶ１番号５８０、ＰＩＶ２番号５１２
９、ＰＩＶ３番号１０５７、ＲＳＶ番号３１６７、ＩＮ
Ｆ−Ａ番号ＤＲ、ＩＮＦ−Ｂ番号０１およびＡＤＶ番号
５４５６であった。
【００４３】すべてのステップは、オリゴヌクレオチド
プライマー混合液がプライマーの単一の対の代わりに使
用されたことを除いて、実施例１に記載のとおりに実施
された。前記オリゴヌクレオチドプライマー混合液は、
前記７つのウイルスのそれぞれについて１つずつプライ
マー７対を含んでいた（表２）。それぞれのプライマー
の最終濃度は１μＭであった。
プライマー混合液がプライマーの単一の対の代わりに使
用されたことを除いて、実施例１に記載のとおりに実施
された。前記オリゴヌクレオチドプライマー混合液は、
前記７つのウイルスのそれぞれについて１つずつプライ
マー７対を含んでいた（表２）。それぞれのプライマー
の最終濃度は１μＭであった。
【００４４】
【表２】複合ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）用
のプライマー
のプライマー
【００４５】予想外のことに、特異的な増幅産物がそれ
ぞれのサンプルで検出された。すなわち、（１）ＨＰＩ
Ｖ１のテンプレートのｆ８３４およびｒ１０９９のプラ
イマーセットでの増幅からは２６８塩基対の断片、
（２）ＨＰＩＶ２のｆ１０１５およびｒ１１８２ｆのプ
ライマーセットでの増幅からの１６８塩基対の断片、
（３）ＨＰＩＶ２のテンプレートのｆ９０４およびｒ１
０５９のプライマーセットでの増幅からは１５６塩基対
の断片、（４）ＲＳＶのテンプレートのｆ４１７および
ｒ６４１のプライマーセットでの増幅からは２２２塩基
対の断片、（５）ＩＮＦ−ＡのテンプレートのＩＮＦＡ
−ｆ２およびＩＮＦＡ−ｒ２のプライマーセットでの増
幅からは２５２塩基対の断片、（６）ＩＮＦ−Ｂのテン
プレートの９２ｆおよび３８４ｒのプライマーセットで
の増幅からは２９３塩基対の断片、そして（７）ＡＤＶ
のテンプレートのＡＤＶ−ｆ１およびＡＤＶ−ｒ１のプ
ライマーセットでの増幅からは５５６塩基対の断片が検
出された。
ぞれのサンプルで検出された。すなわち、（１）ＨＰＩ
Ｖ１のテンプレートのｆ８３４およびｒ１０９９のプラ
イマーセットでの増幅からは２６８塩基対の断片、
（２）ＨＰＩＶ２のｆ１０１５およびｒ１１８２ｆのプ
ライマーセットでの増幅からの１６８塩基対の断片、
（３）ＨＰＩＶ２のテンプレートのｆ９０４およびｒ１
０５９のプライマーセットでの増幅からは１５６塩基対
の断片、（４）ＲＳＶのテンプレートのｆ４１７および
ｒ６４１のプライマーセットでの増幅からは２２２塩基
対の断片、（５）ＩＮＦ−ＡのテンプレートのＩＮＦＡ
−ｆ２およびＩＮＦＡ−ｒ２のプライマーセットでの増
幅からは２５２塩基対の断片、（６）ＩＮＦ−Ｂのテン
プレートの９２ｆおよび３８４ｒのプライマーセットで
の増幅からは２９３塩基対の断片、そして（７）ＡＤＶ
のテンプレートのＡＤＶ−ｆ１およびＡＤＶ−ｒ１のプ
ライマーセットでの増幅からは５５６塩基対の断片が検
出された。
【００４６】実施例３ アレイチップの上での７つの呼
吸器系ウイルスの同時検出 サンプルの調製およびＲＴ−ＰＣＲは、全てのプライマ
ーが、５'末端でビオチン標識されたことを除いて、実
施例２に記載のとおりに実施された。増幅産物は以下に
説明するアレイチップの上で検出された。さまざまなタ
イプのチップが上記のとおり説明されていることに留意
すべきである。段落番号００１８の段落（原文明細書第
６頁から第７頁にかけてのパラグラフ）を参照せよ。
吸器系ウイルスの同時検出 サンプルの調製およびＲＴ−ＰＣＲは、全てのプライマ
ーが、５'末端でビオチン標識されたことを除いて、実
施例２に記載のとおりに実施された。増幅産物は以下に
説明するアレイチップの上で検出された。さまざまなタ
イプのチップが上記のとおり説明されていることに留意
すべきである。段落番号００１８の段落（原文明細書第
６頁から第７頁にかけてのパラグラフ）を参照せよ。
【００４７】Ａ．プローブの設計
プローブは、ＤＮＡスタープログラムを使用して、それ
ぞれのウイルスのゲノムの増幅された領域から選択され
た（表３）。
ぞれのウイルスのゲノムの増幅された領域から選択され
た（表３）。
【００４８】
【表３】プローブの配列
（続き）
【００４９】Ｂ．スポッティングおよびハイブリダイゼ
ーション プローブは、ドクター・ポリマー（ＤＲ．Ｐｏｌｙｍｅ
ｒ、登録商標）チップの上にスポッティングされた。ス
ポッティングの前に、それぞれのプローブに追加の５な
いし２０個が重合したチミジンの重合体（ｐｏｌｙ−
Ｔ）が結合された。プローブは、ドクター・ポリマー
（登録商標）チップの表面にＵＶ−クロスリンキングさ
れた。４つの検出陽性の対照と、４つのＰＣＲ陽性の対
照と、４つのハイブリダイゼーション陽性の対照と、４
つの陰性の対照とが前記ポリマーチップの上にスポッテ
ィングされた。
ーション プローブは、ドクター・ポリマー（ＤＲ．Ｐｏｌｙｍｅ
ｒ、登録商標）チップの上にスポッティングされた。ス
ポッティングの前に、それぞれのプローブに追加の５な
いし２０個が重合したチミジンの重合体（ｐｏｌｙ−
Ｔ）が結合された。プローブは、ドクター・ポリマー
（登録商標）チップの表面にＵＶ−クロスリンキングさ
れた。４つの検出陽性の対照と、４つのＰＣＲ陽性の対
照と、４つのハイブリダイゼーション陽性の対照と、４
つの陰性の対照とが前記ポリマーチップの上にスポッテ
ィングされた。
【００５０】ハイブリダイゼーションの前に、ＰＣＲ産
物の８μｌが５分間変性され、３９２μｌのドクター・
ハイブ（ＤＲ．Ｈｙｂ、登録商標）ハイブリダイゼーシ
ョン用バッファー−Ｅと混合された。この混合液がハイ
ブリダイゼーション用チャンバーの中の前記ドクター・
ポリマー（登録商標）チップに添加され、５０℃で１時
間インキュベーションされた。前記チップは、その後５
００μｌのドクター・ウオッシュバッファーで５回洗浄
された。
物の８μｌが５分間変性され、３９２μｌのドクター・
ハイブ（ＤＲ．Ｈｙｂ、登録商標）ハイブリダイゼーシ
ョン用バッファー−Ｅと混合された。この混合液がハイ
ブリダイゼーション用チャンバーの中の前記ドクター・
ポリマー（登録商標）チップに添加され、５０℃で１時
間インキュベーションされた。前記チップは、その後５
００μｌのドクター・ウオッシュバッファーで５回洗浄
された。
【００５１】Ｃ．検出
４００μｌのドクター・ブロックバッファーが０．２μ
ｌのストレプトアビジン−ＡＰ（アルカリフォスファタ
ーゼ）と混合された。この混合液が、ハイブリダイゼー
ション用チャンバーの中の前記ドクター・ポリマー（登
録商標）チップに添加され、室温で３０分間インキュベ
ーションされた。前記チップは、その後ドクター・ウオ
ッシュバッファーで５回洗浄された。
ｌのストレプトアビジン−ＡＰ（アルカリフォスファタ
ーゼ）と混合された。この混合液が、ハイブリダイゼー
ション用チャンバーの中の前記ドクター・ポリマー（登
録商標）チップに添加され、室温で３０分間インキュベ
ーションされた。前記チップは、その後ドクター・ウオ
ッシュバッファーで５回洗浄された。
【００５２】３９２μｌのドクター・デテクション（Ｄ
Ｒ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）バッファーが８μｌのＮＢＴ
／ＣＢＣＩＰと混合された。この混合液が、ハイブリダ
イゼーション用チャンバーの中の前記ドクター・ポリマ
ー（登録商標）チップに添加され、１０分間暗室でイン
キュベーションされた。前記チップは、その後、発色の
前にドクター・ウオッシュバッファーで２回洗浄され
た。
Ｒ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）バッファーが８μｌのＮＢＴ
／ＣＢＣＩＰと混合された。この混合液が、ハイブリダ
イゼーション用チャンバーの中の前記ドクター・ポリマ
ー（登録商標）チップに添加され、１０分間暗室でイン
キュベーションされた。前記チップは、その後、発色の
前にドクター・ウオッシュバッファーで２回洗浄され
た。
【００５３】予想外のことに、特定のウイルスについて
特異的に設計されたそれぞれのプローブは、以下の標的
ウイルスサンプルから単離されたテンプレートから生成
された増幅産物を捕捉することができた。すなわち、
（１）プローブがＨＰＩＶ−１の増幅産物に対してハイ
ブリダイゼーションされたときＰＩ−１、ＰＩ−２、Ｐ
Ｉ−３、ＰＩ−４、ＰＩＶ１−Ｐ４、ＰＩＶ１−Ｐ５お
よびＰＩＶ１−Ｐ６のスポットで発色した。（２）プロ
ーブがＰＩＶ−２の増幅産物に対してハイブリダイゼー
ションされたときＰ２−１、Ｐ２−２およびＰ２−３の
スポットで発色した。（３）ＨＰＩＶ−３の増幅産物に
対してハイブリダイゼーションされたときＰ３−１、Ｐ
３−２およびＰ３−３のスポットで発色した。（４）Ｒ
ＳＶの増幅産物に対してハイブリダイゼーションされた
ときＲ−ｌと、Ｒ−２と、Ｒ−３と、Ｒ−１０と、Ｒ−
４と、Ｒ−７１およびＲ−７２の混合物とのスポットで
発色した。（５）ＩＮＦ−Ａの増幅産物に対してハイブ
リダイゼーションされたときＡ１、Ａ２およびＡ３のス
ポットで発色した。（６）ＩＮＦ−Ｂの増幅産物に対し
てハイブリダイゼーションされたときＢ １、Ｂ２およ
びＢ３のスポットで発色した。（７）ＡＤＶの増幅産物
に対してハイブリダイゼーションされたときＤ−１、Ｄ
−２、Ｄ−３、ＡＤＶ−Ｐ４およびＡＤＶ−Ｐ５のスポ
ットで発色した。
特異的に設計されたそれぞれのプローブは、以下の標的
ウイルスサンプルから単離されたテンプレートから生成
された増幅産物を捕捉することができた。すなわち、
（１）プローブがＨＰＩＶ−１の増幅産物に対してハイ
ブリダイゼーションされたときＰＩ−１、ＰＩ−２、Ｐ
Ｉ−３、ＰＩ−４、ＰＩＶ１−Ｐ４、ＰＩＶ１−Ｐ５お
よびＰＩＶ１−Ｐ６のスポットで発色した。（２）プロ
ーブがＰＩＶ−２の増幅産物に対してハイブリダイゼー
ションされたときＰ２−１、Ｐ２−２およびＰ２−３の
スポットで発色した。（３）ＨＰＩＶ−３の増幅産物に
対してハイブリダイゼーションされたときＰ３−１、Ｐ
３−２およびＰ３−３のスポットで発色した。（４）Ｒ
ＳＶの増幅産物に対してハイブリダイゼーションされた
ときＲ−ｌと、Ｒ−２と、Ｒ−３と、Ｒ−１０と、Ｒ−
４と、Ｒ−７１およびＲ−７２の混合物とのスポットで
発色した。（５）ＩＮＦ−Ａの増幅産物に対してハイブ
リダイゼーションされたときＡ１、Ａ２およびＡ３のス
ポットで発色した。（６）ＩＮＦ−Ｂの増幅産物に対し
てハイブリダイゼーションされたときＢ １、Ｂ２およ
びＢ３のスポットで発色した。（７）ＡＤＶの増幅産物
に対してハイブリダイゼーションされたときＤ−１、Ｄ
−２、Ｄ−３、ＡＤＶ−Ｐ４およびＡＤＶ−Ｐ５のスポ
ットで発色した。
【００５４】他の実施態様本明細書に開示された発明の
特長の全てが、いずれかの組み合わせで結合される場合
がある。本明細書に開示されたそれぞれの特長は、同一
の目的か、均等な目的か、類似の目的かに役立つ代替的
な特長で置換される場合がある。それゆえ、それ以外の
ことをわざわざ主張しない限り、開示されたそれぞれの
特長は、包括的な一連の均等、または、類似の特長の一
例示にすぎない。
特長の全てが、いずれかの組み合わせで結合される場合
がある。本明細書に開示されたそれぞれの特長は、同一
の目的か、均等な目的か、類似の目的かに役立つ代替的
な特長で置換される場合がある。それゆえ、それ以外の
ことをわざわざ主張しない限り、開示されたそれぞれの
特長は、包括的な一連の均等、または、類似の特長の一
例示にすぎない。
【００５５】上記の説明から、当業者は本発明の必須の
特長を容易に確認することができ、その趣旨および範囲
を逸脱することなく、本発明をさまざまな用途および条
件に適合させるために、本発明の変更および改変を行う
ことができる。したがって、他の実施態様も添付する特
許請求の範囲に含まれる。
特長を容易に確認することができ、その趣旨および範囲
を逸脱することなく、本発明をさまざまな用途および条
件に適合させるために、本発明の変更および改変を行う
ことができる。したがって、他の実施態様も添付する特
許請求の範囲に含まれる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ
33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｆターム(参考） 4B024 AA14 CA02 CA09 CA20 HA11
HA13 HA14
4B063 QA01 QA18 QA19 QQ10 QQ35
QQ43 QQ79 QR08 QR32 QR35
QR39 QR42 QR56 QR62 QS16
QS25 QS34 QS36 QX01 QX02
Claims (26)
- 【請求項１】 ヒト・パラインフルエンザウイルス−２
のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域から
選択されたオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー
の対と、アデノウイルスのヘクソン遺伝子の領域から選
択されたオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマーの
対とを含み、前記オリゴヌクレオチドのそれぞれは１４
〜４０個の長さのヌクレオチドを有する、核酸のセッ
ト。 - 【請求項２】 第３のプライマーの対か、第４のプライ
マーの対か、第５のプライマーの対か、第６のプライマ
ーの対か、第７のプライマーの対か、あるいは、これら
の組み合わせかを含む、請求項１に記載の核酸のセット
であって、前記第３のプライマーの対は、それぞれ、ヒ
ト・パラインフルエンザウイルス−１に特異的なオリゴ
ヌクレオチドを含み、前記第４のプライマーの対は、そ
れぞれ、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３に特異
的なオリゴヌクレオチドを含み、前記第５のプライマー
の対は、それぞれ、呼吸器細胞融合性ウイルスに特異的
なオリゴヌクレオチドを含み、前記第６のプライマーの
対は、それぞれ、インフルエンザウイルスＡ型に特異的
なオリゴヌクレオチドを含み、前記第７のプライマーの
対は、それぞれ、インフルエンザウイルスＢ型に特異的
なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸の
セット。 - 【請求項３】 前記第３のプライマーの対に含まれるオ
リゴヌクレオチドは、ヒト・パラインフルエンザウイル
ス−１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領
域から選択され、前記第４のプライマーの対に含まれる
オリゴヌクレオチドは、ヒト・パラインフルエンザウイ
ルス−３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の
領域から選択され、前記第５のプライマーの対に含まれ
るオリゴヌクレオチドは、呼吸器細胞融合性ウイルスの
非構造タンパク−２遺伝子の領域から選択され、前記第
６のプライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、
インフルエンザウイルスＡ型の非構造タンパク遺伝子の
領域から選択され、前記第７のプライマーの対に含まれ
るオリゴヌクレオチドは、インフルエンザウイルスＢ型
のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域から
選択される、請求項２に記載の核酸のセット。 - 【請求項４】 前記第１のプライマーの対に含まれるオ
リゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５および７、
または、配列番号６および７であり、前記第２のプライ
マーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、それぞれ、
配列番号２４および２６、配列番号２４および２７、ま
たは、配列番号２５および２７である、請求項１に記載
の核酸のセット。 - 【請求項５】 第３のプライマーの対、第４のプライマ
ーの対、第５のプライマーの対、第６のプライマーの
対、第７のプライマーの対、または、これらの組み合わ
せを含む、請求項４に記載の核酸のセットであって、前
記第３のプライマーの対は、それぞれ、配列番号１およ
び３、配列番号２および３、または、配列番号１および
４のオリゴヌクレオチドを含み、前記第４のプライマー
の対は、それぞれ、配列番号８および１０、配列番号８
および１１、または、配列番号９および１１のオリゴヌ
クレオチドを含み、前記第５のプライマーの対は、それ
ぞれ、配列番号１２および１４、または、配列番号１３
および１５のオリゴヌクレオチドを含み、前記第６のプ
ライマーの対は、それぞれ、配列番号１６および１８、
または、配列番号１７および１９のオリゴヌクレオチド
を含み、前記第７のプライマーの対は、それぞれ、配列
番号２０および２２、または、配列番号２１および２３
のオリゴヌクレオチドを含む、請求項４に記載の核酸の
セット。 - 【請求項６】 第１のプライマーの対をもちいる呼吸器
細胞融合性ウイルスの核酸のテンプレートの増幅から得
られる第１の核酸か、第２のプライマーの対をもちいる
インフルエンザウイルスＡ型の核酸のテンプレートの増
幅から得られる第２の核酸か、第３のプライマーの対を
もちいるインフルエンザウイルスＢ型の核酸のテンプレ
ートの増幅から得られる第３の核酸か、あるいは、これ
らの組み合わせかを含む核酸のセットであって、前記第
１のプライマーの対は、それぞれ、呼吸器細胞融合性ウ
イルスの非構造タンパク−２遺伝子の領域から選択され
たオリゴヌクレオチドを含み、前記第２のプライマーの
対は、それぞれ、インフルエンザウイルスＡ型の非構造
タンパク遺伝子の領域から選択されたオリゴヌクレオチ
ドを含み、前記第３のプライマーの対は、それぞれ、イ
ンフルエンザウイルスＢ型のヘマグルチニン−ノイラミ
ニダーゼ遺伝子の領域から選択されたオリゴヌクレオチ
ドを含み、前記オリゴヌクレオチドのそれぞれは１４〜
４０個の長さのヌクレオチドを有する、核酸のセット。 - 【請求項７】 前記第１のプライマーの対に含まれるオ
リゴヌクレオチドは、配列番号１２および１４、また
は、配列番号１３および１５であり、前記第２のプライ
マーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、配列番号１
６および１８、または、配列番号１７および１９であ
り、前記第３のプライマーの対に含まれるオリゴヌクレ
オチドは、配列番号２０および２２、または、配列番号
２１および２３である、請求項６に記載の核酸のセッ
ト。 - 【請求項８】 第４のプライマーの対をもちいるヒト・
パラインフルエンザウイルス−１の核酸のテンプレート
の増幅から得られる第４の核酸か、第５のプライマーの
対をもちいるヒト・パラインフルエンザウイルス−２の
核酸のテンプレートの増幅から得られる第５の核酸か、
第６のプライマーの対をもちいるヒト・パラインフルエ
ンザウイルス−３の核酸のテンプレートの増幅から得ら
れる第６の核酸か、第７のプライマーの対をもちいるア
デノウイルスの核酸のテンプレートの増幅から得られる
第７の核酸か、あるいは、これらの組み合わせかを含
む、請求項７に記載の核酸のセットであって、前記第４
のプライマーの対は、それぞれ、配列番号１および３、
配列番号２および３、または、配列番号１および４のオ
リゴヌクレオチドを含み、前記第５のプライマーの対
は、それぞれ、配列番号５および７、または、配列番号
６および７のオリゴヌクレオチドを含み、前記第６のプ
ライマーの対は、それぞれ、配列番号８および１０、配
列番号８および１１、または、配列番号９および１１の
オリゴヌクレオチドを含み、前記第７のプライマーの対
は、それぞれ、配列番号２４および２６、配列番号２４
および２７、または、配列番号２５および２７のオリゴ
ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の核酸のセット。 - 【請求項９】 呼吸器細胞融合性ウイルスの非構造タン
パク−２遺伝子の領域から選択された第１のオリゴヌク
レオチドを含む第１の核酸か、インフルエンザウイルス
Ａ型の非構造タンパク遺伝子の領域から選択された第２
のオリゴヌクレオチドを含む第２の核酸か、インフルエ
ンザウイルスＢ型のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ
遺伝子の領域から選択された第３のオリゴヌクレオチド
を含む第３の核酸か、あるいは、これらの組み合わせか
を含み、前記核酸のそれぞれは２０〜１０００個の長さ
のヌクレオチドを有する、核酸のセット。 - 【請求項１０】 前記核酸のそれぞれは２０〜５００個
の長さのヌクレオチドを有する、請求項９に記載の核酸
のセット。 - 【請求項１１】 前記核酸のそれぞれは２０〜５０個の
長さのヌクレオチドを有する、請求項１０に記載の核酸
のセット。 - 【請求項１２】 前記オリゴヌクレオチドのそれぞれ
は、配列番号４０〜５２と、これらに相補的な配列とか
らなるグループから選択される、請求項９に記載の核酸
のセット。 - 【請求項１３】 前記核酸のそれぞれは２０〜５００個
の長さのヌクレオチドを有する、請求項１２に記載の核
酸のセット。 - 【請求項１４】 前記核酸のそれぞれは２０〜５０個の
長さのヌクレオチドを有する、請求項１３に記載の核酸
のセット。 - 【請求項１５】 配列番号２８〜３９と、これらに相補
的な配列とからなるグループから選択されるオリゴヌク
レオチドを含む核酸を含む、請求項１２に記載の核酸の
セット。 - 【請求項１６】 前記核酸のそれぞれは２０〜５００個
の長さのヌクレオチドを有する、請求項１５に記載の核
酸のセット。 - 【請求項１７】 前記核酸のそれぞれは２０〜５０個の
長さのヌクレオチドを有する、請求項１６に記載の核酸
のセット。 - 【請求項１８】 検出されるべきウイルスを含むことが
疑われるサンプルからの核酸を提供するステップと、標
的ウイルスのグループに特異的なプライマーのセットを
もちいて、前記核酸を増幅するステップであって、前記
プライマーのセットは、第１のプライマーの対および第
２のプライマーの対を含み、前記第１のプライマーの対
は、それぞれ、ヒト・パラインフルエンザウイルス−２
のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域から
選択されたオリゴヌクレオチドを有し、前記第２のプラ
イマーの対は、それぞれ、アデノウイルスのヘクソン遺
伝子の領域から選択されたオリゴヌクレオチドを有し、
前記オリゴヌクレオチドのそれぞれは１４〜４０個の長
さのヌクレオチドを有する、前記核酸を増幅するステッ
プと、増幅産物を検出するステップとを含み、標的ウイ
ルスに特異的な増幅産物を検出することが前記標的ウイ
ルスが存在することを示す、呼吸器系感染症を起こすウ
イルスを同時に検出する方法。 - 【請求項１９】 前記増幅するステップにおいて、前記
プライマーのセットは、第３のプライマーの対、第４の
プライマーの対、第５のプライマーの対、第６のプライ
マーの対、第７のプライマーの対、または、これらの組
み合わせを含み、前記第３のプライマーの対は、それぞ
れ、ヒト・パラインフルエンザウイルス−１に特異的な
オリゴヌクレオチドを含み、前記第４のプライマーの対
は、それぞれ、ヒト・パラインフルエンザウイルス−３
に特異的なオリゴヌクレオチドを含み、第５のプライマ
ーの対は、それぞれ、呼吸器細胞融合性ウイルスに特異
的なオリゴヌクレオチドを含み、前記第６のプライマー
の対は、それぞれ、インフルエンザウイルスＡ型に特異
的なオリゴヌクレオチドを含み、前記第７のプライマー
の対は、それぞれ、インフルエンザウイルスＢ型に特異
的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の方
法。 - 【請求項２０】 前記第３のプライマーの対に含まれる
オリゴヌクレオチドは、ヒト・パラインフルエンザウイ
ルス−１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の
領域から選択され、前記第４のプライマーの対に含まれ
るオリゴヌクレオチドは、ヒト・パラインフルエンザウ
イルス−３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子
の領域から選択され、前記第５のプライマーの対に含ま
れるオリゴヌクレオチドは、呼吸器細胞融合性ウイルス
の非構造タンパク−２遺伝子の領域から選択され、前記
第６のプライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチド
は、インフルエンザウイルスＡ型の非構造タンパク遺伝
子の領域から選択され、前記第７のプライマーの対に含
まれるオリゴヌクレオチドは、インフルエンザウイルス
Ｂ型のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ遺伝子の領域
から選択される、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記第１のプライマーの対に含まれる
オリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５および
７、または、配列番号６および７であり、前記第２のプ
ライマーの対に含まれるオリゴヌクレオチドは、それぞ
れ、配列番号２４および２６、配列番号２４および２
７、または、配列番号２５および２７である、請求項１
８に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記プライマーのセットは、さらに、
第３のプライマーの対、第４のプライマーの対、第５の
プライマーの対、第６のプライマーの対、第７のプライ
マーの対、または、これらの組み合わせを含み、前記第
３のプライマーの対は、それぞれ、配列番号１および
３、配列番号２および３、または、配列番号１および４
のオリゴヌクレオチドを含み、前記第４のプライマーの
対は、それぞれ、配列番号８および１０、配列番号８お
よび１１、または、配列番号９および１１のオリゴヌク
レオチドを含み、前記第５のプライマーの対は、それぞ
れ、配列番号１２および１４、または、配列番号１３お
よび１５のオリゴヌクレオチドを含み、前記第６のプラ
イマーの対は、それぞれ、配列番号１６および１８、ま
たは、配列番号１７および１９のオリゴヌクレオチドを
含み、前記第７のプライマーの対は、それぞれ、配列番
号２０および２２、または、配列番号２１および２３の
オリゴヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記検出するステップは、プローブの
セットを前記増幅産物に対してハイブリダイゼーション
することを含み、前記プローブのセットは、ヒト・パラ
インフルエンザウイルス−２のヘマグルチニン−ノイラ
ミニダーゼ遺伝子の領域から選択された第１の核酸を有
する第１のプローブと、アデノウイルスのヘクソン遺伝
子の領域から選択された第２の核酸を有する第２のプロ
ーブとを含み、前記プローブのそれぞれは２０〜２００
０個の長さのヌクレオチドを有する、請求項１８に記載
の方法。 - 【請求項２４】 前記核酸のそれぞれは、配列番号３４
〜３６および５３〜５７からなるグループから選択され
る、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記検出するステップはプローブのセ
ットに対して前記増幅産物をハイブリダイゼーションす
ることを含み、前記プローブのセットは、ヒト・パライ
ンフルエンザウイルス−２のヘマグルチニン−ノイラミ
ニダーゼ遺伝子の領域から選択される第１の核酸を有す
る第１のプローブと、アデノウイルスのヘクソン遺伝子
の領域から選択される第２の核酸を有する第２のプロー
ブとを含み、前記プローブのセットは、ヒト・パライン
フルエンザウイルス−１に特異的な第３の核酸を有する
第３のプローブか、ヒト・パラインフルエンザウイルス
−３に特異的な第４の核酸を有する第４のプローブか、
呼吸器細胞融合性ウイルスに特異的な第５の核酸を有す
る第５のプローブか、インフルエンザウイルスＡ型に特
異的な第６の核酸を有する第６のプローブか、インフル
エンザウイルスＢ型に特異的な第７の核酸を有する第７
のプローブか、あるいは、これらの組み合わせかをさら
に含み、前記プローブのそれぞれは２０〜２０００個の
長さのヌクレオチドを有する、請求項１９に記載の方
法。 - 【請求項２６】 前記プローブのそれぞれは、配列番号
２８〜５７からなるグループから選択される、請求項２
５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10/038,835 US6881835B2 (en) | 2002-01-04 | 2002-01-04 | Detection of respiratory viruses |
| US10/038,835 | 2002-01-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003250589A true JP2003250589A (ja) | 2003-09-09 |
| JP2003250589A5 JP2003250589A5 (ja) | 2005-12-22 |
Family
ID=21902169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002376303A Pending JP2003250589A (ja) | 2002-01-04 | 2002-12-26 | 呼吸器系ウイルスの検出 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6881835B2 (ja) |
| EP (1) | EP1327691A3 (ja) |
| JP (1) | JP2003250589A (ja) |
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