ES2313793T3

ES2313793T3 - Identificacion de microorganismos que causan las infecciones agudas del tracto respiratorio.

Info

Publication number: ES2313793T3
Application number: ES99948833T
Authority: ES
Inventors: Geert Jannes; Heinz-Josef Schmitt
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2019-09-22
Also published as: JP4503844B2; ZA200102182B; WO2000017391A1; AU772689B2; AU6194999A; EP1115885A1; DK1115885T3; BR9913893A; HK1042323A1; EP1115885B1; BRPI9913893B1; CA2339035A1; DE69939388D1; US20090148830A1; JP2002526088A; ATE405674T1; CA2339035C; HK1042323B

Abstract

Método para la detección de la infección aguda del tracto respiratorio que comprende la amplificación simultánea de diversas secuencias de nucleótidos blanco presentes en una muestra biológica mediante una mezcla de cebador que comprende al menos un juego de cebador para cada una de las siguientes regiones génicas: - la subunidad F1 del gen de la gliproteína de fusión para RSV, - el gen de la hemaglutininneuraminidasa para PIV-1, - la región no codificadora 5'' del gen de la proteína de fusión para PIV-3, - la secuencia del ARNr 16S para M. pneumoniae, - la secuencia del ARNr 16S para C. pneumoniae, - la región no codificadora 5'' para enterovirus, - el gen de la proteína no-estructural para influenza A, - el gen de la proteína no-estructural para influenza B, y, - el gen hexon para adenovirus.

Description

Identificación de microorganismos que causan las infecciones agudas del tracto respiratorio.

La presente invención se refiere al campo de la detección de microorganismos, más particularmente la detección de infecciones agudas del tracto respiratorio.

Las infecciones agudas del tracto respiratorio (ARI) son la causa más común de morbilidad y mortalidad infantil a nivel mundial, estimándose aproximadamente el 30% de todas las muertes infantiles en el mundo en desarrollo (Hinman y otros, 1998). Aunque raramente causan la muerte en países industrializados, las ARI causan enormes gastos directos e indirectos en los cuidados de salud (Garenne y otros, 1992; UNICEF, 1993; Dixon, 1985). Los agentes causales de las ARI engloban una amplia variedad de microorganismos. Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis (Barlett y Mundy, 1995) son las bacterias más comúnmente encontradas. Como comensales del tracto respiratorio superior las muestras de esputos aspirados y exudados nasofaríngeos, usualmente se contaminan, y de ese modo es difícil demostrar su papel etiológico en las ARI a través del muestreo en el tracto respiratorio superior, a menos que sean usadas técnicas invasivas (punción lumbar) (Trolfors y Claesson, 1997; Nohynek y otros, 1995).

En contraste con estas bacterias, la detección de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y también la detección de virus en un niño con síntomas respiratorios es usualmente considerada como evidencia de infección aguda. Los métodos actuales para identificar estos agentes incluyen la cultura de células, los ensayos de detección rápida de antígenos, serología (indirectamente) y recientemente la PCR (Trolfors y Claesson, 1997; Saikku, 1997). Las técnicas de cultura celular requieren laboratorios especializados, son caras, consumen tiempo y laboriosas. Los ensayos rápidos para antígenos están disponibles solamente para unos pocos microorganismos (influenza A y RSV en la mayoría de los países). La serología usualmente requiere la documentación de un levantamiento de la concentración de anticuerpos en la muestra de sangre desde la fase aguda hasta la convaleciente y de este modo los resultados de la prueba llegan demasiado tarde para ser de relevancia en el tratamiento de la enfermedad aguda. Aunque actualmente método no rápido para el diagnóstico microbiológico de la ARI está disponible para el uso de rutina, la disponibilidad de tal prueba resultaría en más o menos las terapias de antibióticos precisamente a la medida, resultando en costos reducidos, menos efectos colaterales así como en una reducción de la emergencia de la resistencia (Woo y otros, 1997).

Actualmente las técnicas de amplificación del ácido nucleico como la PCR (Saiki y otros, 1988) y la PCR-RT son técnicas altamente sensibles para la detección de las secuencias de ácido nucleicos de virus y bacteria en especimenes clínicos (Saiki, 1990; Kawasaki, 1990). Estas técnicas de amplificación son particularmente ventajosas para la detección de organismos fastidiosos o "difícil para cultivar" como el virus sincitial respiratorio (Paton y otros, 1992) o M. pneumoniae (Van Kuppeveld y otros, 1992).

Estudios previos usando PCR y PCR-RT para el diagnóstico de las ARI se han focalizado en la detección un único virus o bacteria; sin embargo, la utilidad diagnóstica de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos para un único agente infeccioso es limitada por la incapacidad para establecer una etiología específica siempre que el resultado sea negativo y por la incapacidad para documentar infecciones simultáneas involucrando más de un organismo
infeccioso.

Ensayos de PCR múltiple publicados para la detección simultánea de patógenos (Hassan-King y otros, 1996, 1998; Messmer y otros, 1997) y un panel de PCR-RT múltiple para especimenes respiratorios como es descrito por Gilbert y otros (1996) tiene la desventaja de condiciones diferentes y tiempo de consumo para el ensayo de cada organismo detectado y el uso de diversos tubos para una muestra, entonces aumenta los riesgos de contaminación cruzada.

Nuestra estrategia para superar estas limitaciones fue el uso de un protocolo de PCR-RT múltiple que admita la detección simultánea de patógenos respiratorios dentro de un día de trabajo que incluye los virus-ARN (enterovirus, virus influenza A y B, virus parainfluenza tipo 1 y 3, virus sincitial respiratorio), un virus-ADN (adenovirus) y las bacterias (C. pneumoniae, M. pneumoniae) que usualmente no colonizan el tracto respiratorio superior de los
niños.

El objetivo de la presente invención es proporcionar métodos y kits para la detección de las infecciones agudas del tracto respiratorio.

Más particularmente es un objetivo de la presente invención proporcionar un método de PCR múltiple y kit para la detección de las infecciones agudas del tracto respiratorio.

Es también un objetivo de la presente invención proporcionar las mezclas de cebadores y las mezclas de sondas útiles para la detección de las infecciones agudas del tracto respiratorio.

Más particularmente la presente invención se refiere a la detección de las infecciones agudas del tracto respiratorio que comprende la amplificación simultánea de diversas secuencias nucleótidas blanco presentes en una muestra biológica mediante una mezcla de cebador que comprende al menos un cebador seleccionado a partir de cada una de las regiones génicas siguientes:

-: la subunidad F1 del gen de la gliproteína de fusión para RSV,

-: el gen de la hemaglutininneuraminidasa para PIV-1,

-: la región no codificadora 5' del gen de la proteína de fusión para PIV-3,

-: la secuencia del ARNr 16S para M. pneumoniae,

-: la secuencia del ARNr 16S para C. pneumoniae,

-: la región no codificadora 5' para enterovirus,

-: el gen de la proteína no-estructural para influenza A,

-: el gen de la proteína no-estructural para influenza B, y,

-: el gen hexon para adenovirus.

Este método de PCR-RT múltiple es particularmente preferido debido a que permite determinar en un paso de amplificación la presencia de los siguientes microorganismos que infectan el tracto respiratorio principalmente de los niños: RSV, virus parainfluenza, M. pneumoniae, C. pneumoniae, enterovirus, influenza A y B y adenovirus.

De acuerdo a la realización preferida, la presente invención se refiere al método como definido anteriormente donde dichos cebadores 16S ARNm son sustituidos por cebadores a partir de la región espaciadora entre las secuencias de ARNr 16s y 23s.

De acuerdo a otra realización, la presente invención se refiere a un método como es definido anteriormente donde además también al menos un par cebador para la detección específica de B. pertussis y B parapertussis son usados, con dichos cebadores siendo preferiblemente de la región espaciadora entre las secuencias del ARNr 16s y 23s.

De acuerdo a otra realización, la presente invención se refiere a un método como es definido anteriormente donde dichos cebadores son seleccionados a partir de la Tabla 2 o la Tabla 4.

De acuerdo a otra realización, la presente invención se refiere a un método como es definido anteriormente donde dichos productos amplificados son posteriormente detectados usando una sonda, con dicha sonda siendo preferiblemente seleccionada de la Tabla 3, Tabla 4 o Tabla 5.

De acuerdo a otra realización, la presente invención se refiere a una mezcla de cebador que contiene al menos nueve juegos de cebadores seleccionados a partir del grupo compuesto de las SEQ ID NOs 17,18,19,20,21,22,23 y las secuencias de cebadores de la Tabla 2, por lo cual la mezcla contiene al menos un conjunto cebador para cada una región génica enumerada anteriormente.

De acuerdo a otra realización, la presente invención se relaciona con una mezcla de sonda que contiene al menos nueve sondas seleccionadas a partir de SEQ ID Nos 5,6,7,8, 9,10 ,11 ,12 ,13 ,14 ,13, 16, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 y 34 y su forma complementaria y su forma ARN donde T es sustituido por U, por lo cual la mezcla contiene para cada una de las regiones génicas enumeradas anteriormente al menos una sonda específica, para la detección simultánea de patógenos respiratorios.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de la infección aguda del tracto respiratorio que comprende una mezcla de cebadores como es definido anteriormente para realizar un método como es definido anteriormente. Además de dichos cebadores, tal kit también puede contener sondas así como los tampones necesarios para lograr la amplificación y las reacciones posibles de hibridación así como un inserto en el kit.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un kit para la detección de la infección aguda del tracto respiratorio que comprende una mezcla de sondas para realizar un método como es definido anteriormente. Además de dichas sondas, tal kit también puede contener cebadores así como los tampones necesarios para lograr la hibridación y las reacciones posibles de amplificación así como un inserto en el kit.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un kit como es definido anteriormente, donde dichas sondas son aplicadas como líneas paralelas sobre un soporte sólido, preferiblemente sobre membrana de nylon, preferiblemente un kit LiPA (ver la sección de los ejemplos y posterior).

Diferentes técnicas pueden ser aplicadas para realizar los métodos de la presente invención. Estas técnicas pueden comprender la inmovilización de los ácidos polinucleicos blanco, después la amplificación, en un soporte sólido y la realización de la hibridación con sondas de oligonucleótidos marcados. Alternativamente, las sondas pueden ser inmovilizadas sobre un soporte sólido y la hibridación puede realizarse con los ácidos polinucleicos blanco, posiblemente después de la amplificación. Esta técnica es denominada hibridación inversa. Una técnica de hibridación inversa conveniente es el ensayo por sonda lineal (LiPA, Innogenetics, Bélgica). Este ensayo usa sondas del oligonucleótido inmovilizado como líneas paralelas sobre una tira como soporte sólido. Alternativamente las sondas pueden estar presentes en formato de arreglos o micro-arreglos. Las sondas pueden ser manchadas sobre este arreglo o sintetizadas in situ sobre el arreglo (Lockhart y otros, 1996) en localizaciones discretas. Se entiende que cualquier otra técnica para la detección de las secuencias blanco co-amplificadas anteriormente mencionadas será también cubierta por la presente invención. Tal técnica puede involucrar secuenciación u otros métodos de arreglos conocidos en el arte.

Las siguientes definiciones y explicaciones permitirán un mejor entendimiento de la presente invención.

El material blanco en las muestras a ser analizadas puede ser cualquier ADN o ARN, por ejemplo ADN genómico, ARN mensajero o versiones amplificadas de estos. Estas moléculas en esta solicitud son también denominadas "ácidos polinucleicos".

Procedimientos de extracción y purificación bien conocidos están disponibles para el aislamiento del ARN o ADN a partir de una muestra (por ejemplo en Sambrook y otros, 1989).

El término "sonda" de acuerdo con la presente invención se refiere a un oligonucleótido de simple cadena que es designado específicamente para híbridar los ácidos polinucleicos blanco. Preferiblemente, las sondas de la invención son aproximadamente de 5 a 50 nucleótidos largos, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos. Particularmente preferidas las longitudes de las sondas incluyen 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. Los nucleótidos que son usados en la presente invención pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y nucleótidos modificados como inosina o nucleótidos que contienen grupos modificados que esencialmente no alteran sus características de hibridación.

El término "cebador" se refiere a una secuencia del oligonucleótido de simple cadena capaz de actuar como un punto de iniciación para la síntesis del producto de extensión del cebador que es complementario a la cadena de ácido nucleico a ser copiada. La longitud y la secuencia del cebador debe ser tal que estos permiten cebar la síntesis de los productos de extensión. Preferiblemente el cebador es aproximadamente de 5-50 nucleótidos de largo. La longitud específica y la secuencia dependerá de la complejidad del ADN y ARN blanco requerido, así como de las condiciones en las que el cebador es usado, como temperatura y fuerza iónica. Se entiende que los cebadores de la presente invención pueden ser usados como sondas y viceversa, proporcionando que se adapten a las condiciones experimentales.

La expresión "par de cebador adecuado" en esta invención se refiere a un par de cebadores que permiten la amplificación específica de un fragmento blanco específico del ácido polinucleico.

El término "región blanco" de una sonda o de un cebador de acuerdo con la presente invención es una secuencia dentro de los ácidos polinucleicos a ser detectada para la que la sonda o el cebador sea totalmente complementario o parcialmente complementario (por ejemplo con algún grado de error en la replicación). Se entiende que el complemento de dicha secuencia blanco es también en algunos casos una secuencia blanco adecuada.

"Hibridación específica" de una sonda para una región blanco de un ácido polinucleico significa que dicha sonda forma un duplex con parte de esta región o con la región entera bajo las condiciones experimentales usadas, y que bajo esas condiciones dicha sonda no forma un duplex con otras regiones de los ácidos polinucleicos presentes en la muestra a ser analizada.

"Hibridación específica" de un cebador para una región blanco de un ácido polinucleico significa que, durante el paso de amplificación, dicho cebador forma un duplex con parte de esta región o con la región entera bajo las condiciones experimentales usadas y que bajo esas condiciones dicho cebador no forma un duplex con otras regiones de ácidos polinucleicos presente en la muestra a ser analizada. Se entiende que el "duplex" como usado por la presente, significa un duplex que conducirá a la amplificación específica.

El hecho de que los cebadores de la amplificación no tengan que aparearse exactamente a la secuencia blanco correspondiente en el molde para garantizar la amplificación apropiada es ampliamente documentada en la literatura (Kwok y otros, 1990). Sin embargo, cuando los cebadores no son totalmente complementarios a su secuencia blanco, debería tomarse en cuenta que los fragmentos amplificados tendrán la secuencia de los cebadores y no la secuencia blanco. Los cebadores pueden ser marcados con un marcador de selección (por ejemplo biotina). El método de amplificación usado puede ser cualquier reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki y otros, 1988), reacción en cadena de la ligasa (LCR; Landgren y otros, 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), amplificación de secuencia basada en el ácido nucleico (NASBA; Guatelli y otros, 1990; Compton, 1991), sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS; Kwoh y otros, 1989), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA: Duck, 1990) o amplificación por medio de replicasa QB (Lomeli y otros, 1989) o cualquier otro método adecuado para amplificar las moléculas de ácido nucleico conocidas en el arte.

Las secuencias de sonda y cebador son representadas durante la específicación como oligonucleótidos de ADN de simple cadena desde el extremo 5' al 3'. Es obvio para un hombre experto en el arte que cualquiera de las sondas abajo especificadas pueden ser usadas como tales, o en su forma complementaria, o en su forma de ARN (donde T es sustituida por U).

Las sondas de acuerdo con la invención pueden ser preparadas por clonación de los plásmidos recombinantes que contienen insertos que incluyen las secuencias de nucleótidos correspondientes, si es necesario por escisión de éstas a partir de los plásmidos clonados mediante el uso de nucleasas adecuadas y el recobrado de ellas, por ejemplo por fraccionamiento de acuerdo con el peso molecular. Las sondas de acuerdo con la presente invención pueden también ser sintetizadas químicamente, por ejemplo por el método convencional del fosfotriéster.

Los oligonucleótidos usados como cebadores o sondas pueden también comprender análogos de nucleótidos como los fosforotiatos (Matsukura y otros, 1987), alquilfosforotiatos (Miller y otros, 1979) o péptido de ácidos nucleicos (Nielsen y otros, 1991, 1993) o pueden contener agentes intercalantes (Asseline y otros, 1984). Como la mayoría de otras variaciones o modificaciones introducidas en las secuencias de ADN originales de la invención estas variaciones necesitarán adaptaciones con respecto a las condiciones bajo las que el oligonucleótido debe ser usado para obtener la especificidad y sensibilidad requerida. Sin embargo los resultados finales de hibridación serán esencialmente iguales a aquellos obtenidos con los oligonucleótidos no modificados. La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa para influir positivamente en las características como cinética de hibridación, reversibilidad de la formación del híbrido, estabilidad biológica de las moléculas de oligonucleótidos, etc.

El término "soporte sólido" puede referirse a cualquier sustrato para el cual una sonda de oligonucleótido puede ser acoplada, proporcionando que esta retenga sus características de hibridación y proporcionando que el nivel de fondo de la hibridación permanezca bajo. Usualmente el sustrato sólido será una placa de microtitulación, una membrana (por ejemplo de nylon o nitrocelulosa) o una microesfera (perla) o un circuito. Previo a la aplicación a la membrana o fijación a esta puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico para facilitar la fijación o mejorar la eficiencia de la hibridación. Tales modificaciones pueden abarcar cola de homopolímeros, acoplamiento con diferentes grupos reactivos como grupos alifáticos, grupos NH_{2}, grupos SH, grupos carboxílicos, o acoplamiento con biotina, haptenos o proteínas.

El término "marcado" se refiere al uso de ácidos nucleicos marcados. El marcaje puede ser llevado a cabo por el uso de nucleótidos marcados incorporados durante el paso de la polimerasa en la amplificación como ilustrado por Saiki y otros (1988) o Bej y otros (1990) o cebadores marcados, o por cualquier otro método conocido por la persona experta
en el arte. La naturaleza del marcador puede ser isotópica (^{32}P, ^{35}S, etc.) o no-isotópica (biotina, digoxigenina, etc.).

El término "muestra biológica o muestra" se refiere a por ejemplo aspirados nasofaríngeos, garganta, o exudados nasofaríngeos, lavados nasofaríngeos, aspirados traqueales u otra muestra del tracto respiratorio que comprenda ADN o ARN.

Para el diseño de las sondas con características deseadas, las siguientes directrices útiles conocidas por la persona experta en el arte pueden ser aplicadas.

Debido a que la extensión y especificidad de las reacciones de hibridación como aquellas descritas en este documento son afectadas por un número de factores, la manipulación de uno o más de aquellos factores que determinarán la sensibilidad y especificidad exacta de una sonda en particular, si es perfectamente complementaria a su blanco o no. La importancia y efecto de diversas condiciones del ensayo son explicadas además en este documento.

La estabilidad del híbrido de ácido nucleico con la [sonda:blanco] debe ser seleccionada para que sea compatible con las condiciones de ensayo. Esto puede ser logrado evitando largas secuencias ricas en AT, terminando los híbridos con pares de base G:C, y diseñando la sonda con un Tm apropiado. Los puntos iniciales y finales de una sonda deben ser seleccionados hasta que la longitud y el %GC en un Tm resulten aproximadamente de 2-10ºC más elevado que la temperatura a la que el ensayo final será realizado. La composición de la base de la sonda es importante debido a que los pares de base G-C exhiben gran estabilidad cuando se comparan con los pares de base A-T debido a enlaces adicionales de hidrógeno. Entonces, la hibridación que involucra los ácidos nucleicos complementarios de elevado contenido en G-C será más estable a elevadas temperaturas.

Condiciones tales como la fuerza iónica y la temperatura de incubación bajo las que una sonda será usada deben también ser tomadas en cuenta cuando se diseña una sonda. Es sabido que el grado de hibridación se incrementará como la fuerza iónica de una mezcla de reacción se incrementa, y que la estabilidad térmica de los híbridos se incrementará con el incremento de la fuerza iónica. Por otro lado, los reactivos químicos, como formamida, urea, DMSO y alcoholes, que afectan los enlaces de hidrógeno, incrementarán el rigor de la hibridación. La desestabilización de los enlaces de hidrógeno por tales reactivos pueden reducir grandemente la Tm. En general, la hibridación óptima para las sondas de oligonucleótidos sintéticos de aproximadamente 10-50 bases de longitud ocurre aproximadamente 5ºC por debajo de la temperatura de fusión para un determinado duplex. La incubación a temperaturas por debajo de la óptima puede permitir secuencias de bases con errores de replicación para híbridar y pueden por lo tanto resultar en una especificidad reducida.

Es deseable tener sondas que híbriden sólo bajo las condiciones de elevado rigor. Bajo condiciones de elevado rigor sólo los híbridos de ácido nucleico elevadamente complementarios se formarán; los híbridos sin un grado suficiente de complementariedad no se formarán. De acuerdo con el rigor de las condiciones del ensayo se determina la cantidad de complementariedad necesaria entre dos cadenas de ácidos nucleicos que forman un híbrido. El grado de rigor es seleccionado como para maximizar la diferencia en la estabilidad entre el híbrido formado con el blanco y el ácido nucleico no-blanco.

Las regiones en el ADN o ARN blanco que son conocidas por formar estructuras internas fuertes que inhiben la hibridación son menos preferidas. Igualmente, deben evitarse las sondas con una extensa auto-complementariedad. Como se explicó anteriormente, la hibridación es la asociación de dos cadenas simples de ácidos nucleicos complementarios para formar una doble cadena enlazada por hidrógeno. Está implícito que si una de las dos cadenas está totalmente o parcialmente involucrada en un híbrido será menos capaz de participar en la formación de un nuevo híbrido. Pueden haber híbridos intramolecular e intermoleculares formados dentro de las moléculas de un tipo de sonda si hay auto complementariedad suficiente. Tales estructuras pueden ser evitadas mediante un diseño de sonda cuidadoso. Al diseñar una sonda de manera que una alícuota sustancial de la secuencia de interés sea una simple cadena, la velocidad y extensión de la hibridación pueden ser grandemente aumentadas. Los programas computarizados están disponibles para la búsqueda de este tipo de interacción. Sin embargo, en ciertos ejemplos, no puede ser posible evitar este tipo de interacción.

Las condiciones estándares de hibridación y lavado se divulgan en la sección de Materiales & Métodos de los Ejemplos. Otras condiciones son por ejemplo 3X SSC (Citrato Salino de Sodio), 20% FA deionizado (Formamida) a 50ºC. Otras soluciones (SSPE (EDTA fosfato salino de Sodio), TMAC (Cloruro de tetrametil Amonio), etc.) y las temperaturas también pueden ser usadas proporcionando que se mantenga la especificidad y sensibilidad de las sondas. Cuando se necesite, ligeras modificaciones en la longitud o en la secuencia de las sondas tienen que ser realizadas para mantener la especificidad y la sensibilidad requeridas bajo las circunstancias determinadas.

El término de "tampón de hibridación" significa un tampón que permite una reacción de hibridación entre las sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o de los productos amplificados, bajo condiciones de rigor apropiadas.

El término "solución de lavado" significa una solución que posibilita el lavado de los híbridos bajo las condiciones de rigor apropiadas.

La invención, siendo generalmente descrita ahora, será fácilmente entendida por referencia a los siguientes ejemplos y figuras, que son simplemente incluidos con el propósito de ejemplificar ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención y que de ninguna manera están siendo interpretados como limitativos de la presente invención.

Breve descripción de las figuras y tablas

Figura 1. Separación de los productos de la PCR-RT-m en gel de agarosa. 10 \mul de los productos de la PCR-RT-m fueron separados en 2% de gel de agarosa. La PCR-RT-m fue realizada usando como molde 1 \mul de ácido nucleico viral o bacteriano como descrito en material y métodos. Las longitudes esperadas de los productos se determinan en el texto. El tamaño del fragmento de ADN patrón (0.7 \mug de Mspl digerido por pUCl9) en pares de base (bp) es 1:501 bp; 2:404 bp; 3:331 bp; 4:242 bp; 5:190 bp; 6:147 bp; 7:110 bp.

Figura 2. Proporción de resultados positivos de la PCR-RT-m. El número de resultados positivos de la PCR-RT-m y el total de muestras está determinado en el eje y. La escala de tiempo en el eje x es desde Noviembre del 1995 hasta Abril de 1998.

Figura 3. Frecuencia de resultados positivos del ELISA-PCR-RT-m en especimenes clínicos. El número de resultados positivos de la PCR-RT-m para cada uno de los nueve organismos es determinado en el eje y. La escala de tiempo en el eje x es desde Noviembre de 1995 hasta Abril de 1998.

Figura 4. El porciento de los organismos que causan infecciones. La cantidad de organismos que causan infecciones respiratorias está determinado por el porciento del total de organismos de acuerdo con la enfermedad que causan. Los organismos que no se incluyen en esta prueba no se muestran en la figura.

La Figura 5 muestra en un gel de agarosa al 2% la separación de los amplicones obtenidos después de la PCR-RT múltiple en el material de referencia mostrando bandas discretas de los tamaños esperados para todos los organismos probados.

La Figura 6 muestra los resultados de la hibridación de estos amplicones con las tiras de LiPA así como de un control negativo. Estos resultados claramente demuestran que todas las sondas en las tiras reaccionan específicamente con sus amplicones correspondientes y no se observa hibridación cruzada entre los diferentes organismos probados.

La Tabla 1 muestra los resultados a partir de un estudio comparativo entre el ELISA-PCR-RT-m y un EIA comercial.

La Tabla 2 muestra las secuencias de cebadores usados en el Ejemplo 1.

La Tabla 3 resume las diferentes sondas para los organismos identificados como originalmente descritos y sus versiones adaptadas para el uso en el LiPA.

La Tabla 4 resume las secuencias de los cebadores y las sondas, derivadas de la región espaciadora del ARNr 16s-23s para patógenos bacterianos.

La Tabla 5 muestra las secuencias de los cebadores usados para RSV en el Ejemplo 3.

La Tabla 6 muestra una comparación de los resultados del cultivo y el LiPA para una serie a ciegas de 36 muestras, realizadas en el Ejemplo 3.

La Tabla 7. muestra una comparación de los resultados del cultivo y el LiPA para una serie a ciegas de 30 especimenes para el cultivo de Mycoplasma pneumoniae usando la PCR-RT múltiple y el LiPA, realizado en el Ejemplo 3.

Ejemplos Ejemplo 1 Abreviaturas

Infección aguda del tracto respiratorio (ARI); transcripción reversa combinada con PCR (PCR-RT); PCR-RT múltiple (PCR-RT-m); PCR-RT-m combinada con el ensayo de hibridación en microcavidades (ELISA-PCR-RT-m); virus influenza tipo A (influenza A o InfA); virus influenza tipo B (influenza B o InfB); virus parainfluenza tipo 1 (PIV-1); virus parainfluenza tipo 3 (PIV-3); virus sincitial respiratorio (RSV).

Materiales y métodos 1. Muestras de Pacientes

Aspirados nasofaríngeos fueron obtenidos de niños hospitalizados con ARI en nuestra institución en el período entre Noviembre 1995 hasta Abril 1998. El diagnóstico incluía neumonía, bronquitis espasmódica, bronquitis, laringotraqueítis (ésta engloba laringitis, laringo-traqueo-bronquitis y (pseudo-) crup), faringitis, amigdalitis, rinitis, conjuntivitis, otitis media y que fueron obtenidos del diagnóstico descargado de la base de datos computadorizada del hospital. Aunque la colección del espécimen no fue total durante la primera estación invernal (noviembre de 1995 a abril de 1996), fue >95% del total en el período restante hasta el 1ero de octubre, 1996. Los especimenes fueron colectados el primer día de trabajo siguiente a la hospitalización, directamente traído al laboratorio, inicialmente guardado a 4ºC, preparado para la prueba y después o para mucho más tiempo el almacenamiento congelado a menos 70ºC. Las muestras fueron separadas con las precauciones apropiadas para evitar la contaminación y una alícuota fue usada directamente para la detección de RSV y el antígeno de la influenza tipo A mediante el uso de un ensayo immunoenzimático (EIA) (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Una segunda alícuota fue usada para la PCR-RT-m seguido por la electroforesis en gel de agarosa y la específicación en un ensayo de hibridación en microcavidades.

2. Extracción del ácido nucleico

Las muestras recibidas desde Noviembre de 1995 hasta Julio de 1997 fueron preparadas como sigue. Los ácidos nucleicos totales fueron obtenidos de 100 \mul de especimenes respiratorios diluidos con 100 \mul de una solución NaCl al 0,9%. Sulfato de dodecilsodio fue adicionado a la concentración final de 0,1%. La extracción de ácido nucleico fue lograda una vez con 1 volumen de 1:1 de la mezcla fenol cloroformo y una vez con 1 volumen de cloroformo y precipitado con 0,3 M de acetato de amonio y etanol. Los precipitados del ácido nucleico fueron secados y resuspendidos en 15 \mul de agua bidestilada tratada con dietilpirocarbonato. Los especimenes recibidos desde Agosto de 1997 hasta Abril de 1998 fueron preparados usando el "kit de ácido nucleico viral altamente puro" de la Boehringer siguiendo las instrucciones del comprador (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania).

Los controles del procedimiento de preparación fueron como siguen: una muestra negativa (esputos de las personas saludables) fue incluido en cada serie de 5-10 muestras para supervisar el potencial de contaminación cruzada. En caso de un resultado falso positivo en el control negativo, la PCR-RT-m fue repetida en todas las muestras clínicas positivas de esa serie con otra alícuota del espécimen clínico. Los controles positivos del cultivo (influenza A, influenza B, PIV-1, PIV-3 o RSV respectivamente) fueron usados en cada prueba para documentar la eficiencia del procedimiento para la preparación. Las muestras preparadas fueron usada inmediatamente para la PCR-RT-m y las alícuotas restantes fueron almacenadas a menos 70ºC.

3. PCR-RT múltiple

Las secuencias blanco fueron las regiones que codifican/no-codifican, respectivamente, de: subunidad F1 del gen de la glicoproteína de fusión para RSV, el gen de la hemaglutininneuraminidasa para PIV-1, la región 5' que no codifica del gen de la proteína de fusión de PIV-3, la secuencia de nucleótido del ARN ribosomal 16s para M. pneumoniae, la secuencia de nucleótido del ARN ribosomal 16s para C. pneumoniae, la secuencia de nucleótido del ARN ribosomal 16s para C. pneumoniae, una región 5' altamente conservada entre los enterovirus que no codifica para los enterovirus, el gen de una proteína no estructural de influenza A e influenza B y la secuencia de un gen hexon para adenovirus. Las secuencias fueron seleccionadas a partir de procedimientos descritos previamente (Paton y otros, 1992; Karron y otros, 1992; Fan y Henrickson, 1996; Rotbart, 1990; Gaydos y otros, 1992: Van Kuppeveld y otros, 1992; Claas y otros, 1992; Hierholzer y otros 1993). Para adenovirus la secuencia de la sonda A fue usada como segundo cebador de la amplificación en lugar del cebador 2 (Hierholzer, 1993).

Cinco de seis \mul de las preparaciones nucleicas a partir de especimenes clínicos fueron incluidos en la reacción de la transcripción reversa (RT) en un volumen final de 20 \mul. La RT fue realizada durante 60 minutos a 37ºC con la siguiente composición de tampón: 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM MgCl_{2}, 10 mM de (cada) desoxinucleosidos trifosfatos (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 0,2 pg/\mul de la mezcla de hexanucleótido (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 20 U ARNsin (Promega. Madison, Wisconsin USA) y 10 U de transcriptasa reversa del virus de leucemia murina Moloney (Eurogentec, Seraing, Bélgica).

Después de la inactivación por calentamiento de la transcriptasa reversa a 90ºC durante 5 minutos, un total de 20 \mul la mezcla de reacción de la RT fue usada para la PCR múltiple en un volumen total de 80 \mul. La composición del tampón (sin consideración del tampón de la RT) fue de 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,001% de gelatina, 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,2 mM dTTP, 0,01 mM digoxigenin-ll-dUTP (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). 1 \muM de (cada) cebador (Eurogentec. Seraing, Bélgica), y 5 U de polimerasa AmpliTaq-Oro (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ, USA). La PCR fue realizado en un Termociclador PE 9600 (Perkin. Elmer, Branchburg, NJ, USA) como sigue: 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos (10 minutos durante el ciclo 1), hibridación a 50ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos (7 minutos durante el ciclo 40).

Como control negativo un reactivo de banco que contenía H_{2}O fue usado en lugar de ácido nucleico. Como control m-RT-PCR positivo ácido nucleico celular total extraído de los depósitos de virus y/o bacterias fue usado.

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4. Prevención de la contaminación remanente

Para prevenir la contaminación remanente dentro del laboratorio, fueron tomadas las siguientes precauciones: Todos los reactivos comprados fueron divididos en alícuotas pequeñas. La preparación de los reactivos de la PCR, la extracción de los ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas y el paso de amplificación fueron conducidas en tres salas diferentes puntas equipadas con filtros sellados (safesealtip de BIOzym, Hess. Oldendorf, Alemania) fueron usadas para pipetear los reactivos introducidos en la PCR y todas las áreas y equipamientos fueron descontaminados con hipoclorito de sodio y Bacillol (un alcohol desinfectante de: Bode Chernie, Hamburg, Alemania) previo a y después del pipeteo.

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5. Electroforesis en gel de agarosa

La separación electroforética de los productos de PCR (10 \mul) fue realizada durante 30 minutos a 130 total 160 mA en agarosa 2% en tampón de TBE 0,5 x (0,045M de Tris-borato, 0,001 M de EDTA), coloreado con el bromuro de etidio y productos de PCR fueron visualizados con iluminación UV como descrito por el Sambrook y otros (Sambrook y otros, 1989). Para el control de las longitudes de los fragmentos, 0,6-0,8 \mug de ADN pUC19 digerido con Mspl fue aplicado como marcador.

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6. Análisis de la hibridación en microcavidades

Este ensayo fue realizado usando el sistema ELISA-PCR de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Nueve cavidades de una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina fueron llenadas cada una con 5 \mul del producto de PCR y desnaturalizada adicionando 25 \mul de NaOH 0,2 N para cada cavidad. Después de 5 minutos 200 \mul de tampón de hibridación que contiene 2 pmol de la respectiva sonda de captura biotinilada fue adicionado. Las sondas de captura fueron específicas para las secuencias blanco amplificadas (ver anteriormente) y las secuencias de los cebadores para enterovirus, influenza A, influenza B, PIV-1, adenovirus (cebador B) y M. pneumoniae(Gpo1) fueron idénticas a las secuencias previamente reportadas (Rotbart, 1990; Claas y otros, 1992; Van Kuppenveld y otros, 1992; Hierholzer y otros, 1993; Fan y Hendricksom, 1996). Las secuencias de cebadores usadas para los otros son 5'-CCT GCA TTA ACA CTA AAT TC-3' (SEQ ID NO 1 ) para RSV; 5'-TCT TGC TAC CTT CTG TAC TAA-3' (SEQ ID NO 2) para C. pneumonia y 5'-AAA ATT CCA AAA GAG ACC GGC3' (SEQ ID NO 4) para PIV-3. Todas las sondas de captura fueron 3'-biotiniladas y compradas por Eurogentec (Seraing, Bélgica). La captura fue permitida para continuar durante 1 h a 37ºC y después las cavidades fueron lavadas cuatro veces con 200 \mul de la solución de lavado (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) a temperatura ambiente. Para cada cavidad 200 \mul de peroxidasa anti-DIG (10 mU/ml, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) diluido 1/1,000 en un buffer que contiene 100 mM Tris-HCl, fue adicionado 150 mM NaCl (pH 7,5). Las placas fueron incubadas durante 30 minutos a 37ºC y las cavidades fueron lavadas cuatro veces con solución de lavado. 200 \mul de solución de sustrato ABTS® (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) fue adicionado, y las cavidades fueron incubadas durante 30 minutos a 37ºC. La densidad óptica (DO) fue leída en un lector DIAS (Laboratorios Dynatech, Guernsey, Islas del Canal) a 405 nm (filtro de referencia 492 nm). La corrida fue considerada válida, si todos los valores de control negativo fueran menores que 0,2 unidades de DO y el control positivo fuera superior a 1,0 unidades de DO. Las muestras fueron clasificadas como positivas o negativas al PCR de acuerdo con el valor de corte de la DO de 0,5 y por comparación con los resultados de la electroforesis en gel. Las muestras con lecturas iniciales entre 0,2 y 0,5 fueron consideradas en el límite y fueron clasificadas como positivas o negativas sólo después del rechequeo con el juego de cebador simple. Los controles positivos de la hibridación fueron incluidos en cada ensayo de hibridación en microcavidades. Ellos consistieron en productos de PCR derivados de los controles positivos que fueron incluidos en la PCR-RT-m.

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7. Administración de los datos

Todos los datos obtenidos fueron administrados en la base de datos Microsoft Access. Esta base de datos incluye toda la información disponible sobre los pacientes así como todos los datos del diagnóstico y resultados del Elisa-PCR-RT-m, y en caso de la influenza A y RSV los datos del EIA.

8. Cepas bacterianas y virales

Cepas bacterianas y virales usadas como control positivo fueron gentilmente facilitadas por las personas siguientes: B. Schweiger y E. Schreier, (el Instituto Robert Koch, Berlín) enterovirus, influenza A e influenza B; K.M. Edwards (Universidad de Vanderbilt. Tennessee, U.S.) RSV, PIV-1, PIV-3; A. Strecker (Instituto para Virología. Bochum) RSV-largo, PIV-3; R. Krausse y P. Rautenberg (Instituto para la Microbiología Médica, Kiel), M. pneumoniae, C. pneumoniae, y adenovirus.

El número exacto de virus o bacteria dentro de estas muestras no se conoce y fue asumido siendo al menos 10^{8}/ml como indicado por B. Schweiger y P. Rautenberg (comunicación personal). Para probar preliminarmente la sensibilidad de las PCR-RT-m diluciones consecutivas (pasos de 10 veces) de los ácidos nucleicos preparados a partir de estos cultivos fueron usados como molde para la PCR-RT-m y para la amplificación con juegos de cebadores simples.

Debido a que la información sobre el número exacto de virus o bacteria no está disponible la cantidad probable de ácidos nucleicos que serían suficientes para resultar en un producto de amplificación fue calculada basado en el número de partícula asumido (muestra sin diluir 10^{8}/ml). Para detectar la posible reactividad cruzada entre los organismos un \mul de ácido nucleico sin diluir de cada organismo fue usado en una PCR-RT-m.

Resultados 1. PCR múltiple en ácidos nucleicos bacteriano y viral

El procedimiento del ELISA-PCR-RT-m fue probado con ácidos nucleicos preparados a partir de las soluciones madres como es descrito en materiales y métodos. Como puede verse en la figura 1 sólo un producto de amplificación específico podría ser observado en cada carril. Los tamaños pronosticados de los productos de amplificación (C. pneumoniae, 463 bp; M. pneumoniae, 277 bp; influenza B, 249 bp; RSV, 239 bp; PIV-3,205 bp; influenza A, 190 bp; PIV-1, 179 bp; enterovirus 154 bp; adenovirus, 134 bp) estuvieron de acuerdo con los tamaños calculados de los fragmentos a partir del gel de agarosa (Figura 1). Esto sugiere que las PCR-RT-m rindieron los productos específicos. Sin embargo, la diferenciación de la influenza A y el PIV-3 mediante el tamaño del fragmento por la electroforesis en gel sólo se dificultan, aunque los valores de absorbancia obtenidos por la prueba del ELISA-PCR confirmaron esta especificidad. Los cebadores sin consumir están visibles en el fondo del gel.

Para estimar la sensibilidad de la PCR-RT-m soluciones madres de virus concentrado fueron diluidas consecutivamente en pasos de 10 veces y probados con pares de cebadores específicos para producir los productos de la amplificación visibles en el gel de azarosa que fueron específicos en el ELISA-PCR. Asumiendo que el máximo de 10^{8} por ml de los microorganismos respectivos estuviera presente en la solución madre original, fue calculado que el método fue capaz de detectar 1 secuencia blanco de M. pneumoniae y 1 secuencia blanco de C. pneumoniae, 10 copias de ADN de adenovirus y ARN de enterovirus, 100 copias de ARN de PIV-1, PIV-3, influenza A, influenza B and RSV en la reacción análoga de la PCR-RT-m.

2. Comparación del Ensayo inmunoenzimático (EIA) con el ELISA-PCR-RT-m

Para recibir la información sobre la calidad del ELISA-PCR-RT-m se compararon los resultados obtenidos con aquellos a partir del EIA comercial. Con este EIA fueron probados 940 especimenes clínicos para la presencia de influenza A y 1.031 especimenes clínicos para la presencia de RSV. Los resultados se resumen en la tabla 1. La concordancia total de los resultados dla PCR con aquéllos obtenidos por EIA fue del 95% para RSV (con 140 especimenes positivos + 891 negativos en el EIA como referencia= 100%). 25 especimenes fueron identificados como RSV positivo sólo por el ELISA-PCR, 24 como RSV positivo sólo por EIA. En el caso de la influenza A la concordancia total de la PCR con el EIA fue de 98% (con 53 positivo + 887 negativo en el EIA como referencia= 100%) con 1 espécimen positivo sólo por el EIA y 14 especimenes positivos sólo por el ELISA-PCR.

3. Resultados del ELISA-PCR-RT-m con especimenes clínicos

Un total de 1.118 muestras fueron probadas por ELISA-PCR-RT-m. El número de muestras probadas en el tiempo y la proporción de resultados de PCR positivos pueden ser tomados de la figura 2. La cantidad de especimenes aumentó periódicamente durante todas las estaciones frías (de noviembre a abril) y esto se correlacionó con el número aumentado de resultados de PCR positivos. Durante la estación invernal 1996/1997 el número máximo de muestras de los pacientes (n=l06) fue recibido en Febrero y la detección de al menos un microorganismo por la PCR-RT-m fue lograda en un 48%. El más bajo número de especimenes en el invierno de 1995/1996 fue debido a la recolección incompleta de muestra temprano al principio durante nuestra series pruebas. Los resultados para los diferentes microorganismos se muestran en detalle en la figura 3. Un total de 723 (65%) de los especimenes fueron negativos y 395 (35%) fueron positivos para al menos uno de los organismos incluidos en la prueba. De los aislados 37,5% fueron RSV, 20,0% influenza A, 12,9% adenovirus, 10,6% enterovirus, 8,1% M. pneumoniae, 4,3% PIV-3, 3,5% PIV-1, 2,8% influenza B y 0,2% C. pneumoniae, (basado en el total positivo del ELISA-PCR-RT-m). Principalmente RSV e influenza A fueron detectados de diciembre a mayo. Para la influenza B (de febrero a abril del 1997) y para PIV-1 (de septiembre a diciembre del 1997) sólo un pico principal fue observado. La infección con el adenovirus, enterovirus, PIV-3 y M. pneumoniae fue detectada más o menos constantemente durante el tiempo. C. pneumoniae fue detectado sólo una vez en Enero de 1997.

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4. Detección simultánea de dos organismos

Las PCR-RT-m revelaron evidencia de infección simultánea con dos organismos en 20 casos (1,8% del total o 5% de los especimenes positivos). La co-amplificación de la secuencia de ácido nucleico del adenovirus ocurrió con C. pneumoniae (1x), enterovirus (1x), influenza A(1x) y RSV (5x). Infecciones dobles que involucran enterovirus fueron detectadas con adenovirus (1x), influenza A (3x), influenza B (1x), PIV-3 (3x), M.pneumoniae (1x) y con RSV (3x).

Además el ácido nucleico de la influenza B fue co-amplificado con RSV y M. pneumoniae con cada PIV-1 en un espécimen.

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5. Datos clínicos

Los datos clínicos estaban disponibles a partir de febrero del 1995 con 861/1.061 pares de paciente-muestra siendo excluidas las segundas muestras o siguientes a la misma de la admisión del paciente en el hospital. De estos 861 pacientes, 550 estaban entre 0 a 2 años de edad, 153 estaban entre 2 a 5 años de edad y 158 eran mayores que 5 años. En 62% de esos especimenes ningún ácido nucleico bacteriano o viral pudo ser detectado por la PCR-RT-m. El diagnóstico más frecuente en este estudio basado en el hospital fue la neumonía (309 casos o 36%). Esta fue más comúnmente causada por RSV (n=59), influenza A (n=17), M. pneumoniae (n=16) y adenovirus (n=15). Enterovirus, PIV-3, PIV-1 e influenza B fueron asociados cada uno con menos de 10 casos de neumonía. Entre los 167 pacientes con la bronquitis espasmódica (19% de 861 especimenes) el RSV fue detectado en 45 casos, adenovirus, en 16 y enterovirus, influenza A, influenza B, PIV-1, PIV-3 y M. pneumoniae en menos de 10 casos cada uno. La bronquitis fue observada en un total de 95 pacientes (11% de 861 especimenes) y los organismos detectados fueron RSV (13 casos), enterovirus e influenza A (4 casos cada uno), adenovirus (3 casos). La rinitis fue diagnosticada en 7,1%, la laringotraqueítis en 6,2%, y la faringitis, otitis media, amigdalitis y conjuntivitis en menos del 5% de cada uno de los 861 especimenes probados con la detección de un microorganismo por la PCR-RT-m en menos de 10 casos. Otras enfermedades fueron diagnosticadas en 9,1% de los pacientes.

La frecuencia de detección de uno de los nueve organismos en la PCR para una enfermedad respiratoria dada se muestra en la figura 4. El RSV fue el más comúnmente asociado con la neumonía, la bronquitis espasmódica, la otitis media o faringitis. La influenza A fue asociada con más de 5% de otitis media, amigdalitis, faringitis, laringotraqueítis, neumonía,; los enteroviruses fueron entonces asociados con más del 5% de los casos de amigdalitis, faringitis; los adenovirus fueron asociados con faringitis, bronquitis espasmódica, conjuntivitis y amigdalitis; M. pneumoniae más comúnmente asociada con neumonía, mientras que PIV-1 fue principalmente asociada con laringotraqueítis y PIV-3 con laringotraqueítis y conjuntivitis. C. pneumoniae fue detectado sólo en un paciente con
bronquitis.

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Ejemplo 2 Aplicación de LIPA para las infecciones agudas del tracto respiratorio 1. Diseño de las sonda de oligonucleótidos para la aplicación en LiPA

Algunas de las sondas de oligonucleótidos usadas en el Ejemplo 1 fueron adaptadas para obtener buenas especificidades y sensibilidades para los organismos diferentes cuando usadas en un ensayo LiPA (Ensayo por Sonda Lineal, WO 94112670). La tabla 3 resume las diferentes sondas para los organismos identificados como originalmente descritos y sus versiones adaptadas para el uso en LiPA.

Sondas optimizadas fueron proporcionadas enzimáticamente con una cola poly-T usando la transferasa desoxinucleotidil terminal (Phamacia) en un tampón estándar de reacción. Después de una hora de incubación, la reacción fue detenida y las sondas de cola fueron precipitadas y lavadas con etanol helado. Las sondas fueron disueltas en 6% SSC a sus concentraciones específicas respectivamente y aplicadas como líneas horizontales en las tiras de membrana. El ADN biotinilado fue aplicado al lado del control positivo. Los oligonucleótidos fueron fijados a la membrana por horneado a 80ºC durante 12 horas. La membrana entonces fue cortada en tiras de 4 mm.

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2. Preparación del ácido nucleico y amplificación por PCR

Cultivos de las cepas bacterianas y virales fueron usados como material de referencia. El ácido nucleico fue extraído de acuerdo con los procedimientos estándares como descrito anteriormente

Uno a cinco \mul de la preparación de ácido nucleico fue usada en la PCR-RT-múltiple como descrito previamente, con la excepción que el número de ciclo fue reducido a 35 y el marcaje de los amplicones fue hecho usando los cebadores biotinilados en lugar de la incorporación de dUTP-11-digoxigenina.

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3. Realización de la prueba LiPA

Volúmenes iguales (5 a 10 \mul) de los fragmentos de PCR biotinilados y de la solución del desnaturalización (400 mM NaOH/10 mM EDTA) fueron mezclados en los depósitos de prueba e incubado a la temperatura ambiente durante 5 min. Entonces, 2 ml de la solución de hibridación pre-calentada a 50ºC (2xSSC/0,1% de SDS) fue adicionada seguida por la adición de una tira por depósito de prueba. La hibridación ocurrió durante 1 hora a 50ºC en un baño de agua cerrado con agitación. Las tiras se lavaron dos veces con 2 ml de solución de lavado drástico (2xSSC/0,1% de SDS) a la temperatura ambiente durante 20 segundos, y una vez a 50ºC durante 15 min. Siguiente a este lavado drástico, las tiras fueron enjuagadas dos veces con 2 ml de la Solución de Enjuague estándar de Innogenetics (RS). Las tiras fueron incubadas en una plataforma de rotación con el conjugado de fosfatasa alcalina marcada con estreptavidina, diluido en la Solución de Conjugado estándar durante 3 minutos a la temperatura ambiente. Las tiras fueron entonces lavadas dos veces con 2 ml de RS y una vez con el Tampón de Sustrato estándar (SB), y la reacción de color fue iniciada por la adición de BCIP y NBT al SB. Después de 30 minutos a la temperatura ambiente, la reacción de color fue detenida reemplazando los compuestos de color por el agua destilada. Inmediatamente después de secar, las tiras fueron interpretadas. El procedimiento completo descrito anteriormente también puede sustituirse por el aparato automatizado de Inno-LiPA estándar (Auto-LiPA, Innogenetics, Zwijnaarde, Bélgica).

Como puede verse en Figura 5, la separación en un gel de azarosa 2% de los amplicones obtenidos después de la PCR-RT-múltiple en el material de referencia muestra bandas discretas del tamaño esperado para todos los organismos probados.

La Figura 6 muestra los resultados de hibridación de estos amplicones con las tiras LiPA así como de un control negativo. Estos resultados demuestran claramente que todas las sondas en la tira reaccionan específicamente con sus amplicones correspondientes y no se observa hibridación cruzada entre los diferentes organismos probados.

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4. Nueva sonda desarrollada para C. pneumoniae, M. pneumoniae, B. pertussis y B. parapertussis

Para sustituir los cebadores y sondas (ARNr 16s) usados en la PCR-RT-múltiple para la detección de M. pneumoniae y C. pneumoniae, un nuevo juego de cebadores y sondas fue desarrollada para estos organismos derivados de la región espaciadora 16s-23s del ARNr. También fueron desarrollados cebadores y sondas para la detección específica de B. pertussis y B. parapertussis o B. bronchiseptica para adicionarlos a la PCR-RT-múltiple.

En la Tabla 4, se resumen las secuencias de los cebadores y las sondas, derivadas de la región espaciadora 16s-23s del ARNr para estos patógenos bacterianos.

Los experimentos de PCR demostraron que todos los juegos de cebadores seleccionados amplificaron específicamente los organismos correspondientes y no fueron obtenidos amplicones usando los ácidos nucleicos derivados de los organismos filogenéticamente relacionados o cualquiera de los otros agentes infecciosos detectados en la PCR-RT-múltiple.

Los cebadores universales biotinilados derivados del extremo 3' del ARNr 16s y la parte 5' del ARNr 23s fueron usados para amplificar la región espaciadora 16s-23s del ARNr de la bacteria de interés y sus familiares cercanos.

La hibridación reversa en tiras LiPA en 2x SSC/0,1% de SDS a 50ºC mostró que todas las sondas seleccionadas reaccionan específicamente con los organismos de interés y no fue observada reacción cruzada con los amplicones derivados de la PCR-RT-múltiple previamente descrita.

Experimentos iniciales demostraron que los cebadores y las sondas (derivados del espaciador ribosomal) puede ser implementados en la PCR-RT-múltiple para sustituir los cebadores y las sondas actualmente usados para M. pneumoniae y C. pneumoniae y que el ensayo puede extenderse adicionando los cebadores y las sondas para Bordetella spp. involucrada en las infecciones del tracto respiratorio.

A partir de estos resultados es anticipado que este juego puede ser además extendido con sondas (más particularmente de la región espaciadora 16s-23s del ARNr) para otros patógenos relevantes como Legionella pneumophilia.

Ejemplo 3 PCR-RT-m e hibridación por LiPA en sobrenadantes de cultivo

Para verificar la exactitud y especificidad de la PCR-RT-múltiple y de la hibridación por LiPA, un número de cultivos a ciegas fueron analizados con el ensayo de LiPA.

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1. Preparación de la muestra y PCR

La preparación del ácido nucleico fue hecha en los sobrenadantes de cultivo usando el "Kit del Ácido Nucleico Viral altamente Puro" de Boehringer-Mannheim como descrito por el fabricante. La PCR-RT-m involucró la transcripción reversa del ARN a partir del ARN de los organismos (RSV, PIV1, PIV3. InfA, InfB, enterovirus) seguido por una amplificación de PCR del ADNc y ADN correspondiente del adenovirus, M. pneumoniae, C. pneumoniae, B. pertussis y B. parapertussis como descrito en los ejemplos anteriores.

Los cebadores fueron seleccionados a partir de las secuencias blanco altamente conservadas previamente publicadas, excepto que para la amplificación de las especies bacterianas, son usados los cebadores siguientes: para M. pneumoniae SEQ ID NO 17 y SEQ ID NO 19; para C. pneumoniae SEQ ID NO 20 y SEQ ID NO 21 y para ambas especies de Bordetella las SEQ ID NO 22 y SEQ ID NO 23.

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2. Hibridación por LiPA

Cinco de 10 \mul del producto de PCR híbridado por tiras de LiPA que contienen sondas específicas para los diferentes organismos, como descrito en la Tabla 3 para enterovirus, influenza A y B, adenovirus y virus parainfluenza, y en la Tabla 4 para las especies bacterianas. Para RSV, son usadas las sondas descritas en la Tabla 5.

La hibridación fue hecha como descrito en el ejemplo 2.

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3. Resultados

La comparación del cultivo y los resultados del LiPA para una primera serie de las 36 muestras a ciegas se resume en la Tabla 6.

Los resultados del LiPA concuerdan con los resultados del cultivo en la mayoría de los casos. En dos de los casos, pruebas múltiples revelaron la presencia de infecciones dobles, donde los resultados del cultivo sólo detectaron uno de los dos organismos presentes.

Resultados negativos en el LiPA fueron observados con los sobrenadantes de cultivo viejos, muy posiblemente debido a la degradación del material de ácido nucleico.

En un segundo experimento, muestras a ciegas para el cultivo de Mycoplasma pneumoniae fueron evaluadas usando la PCR-RT-múltiple y posteriormente la hibridación por LiPA. Los resultados de los 30 especímenes a ciegas están resumidos en la Tabla 7.

Los resultados en la prueba del LiPA concordaron 100% con los resultados obtenidos en el cultivo.

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TABLA 1 Comparación de EIA y el ELISA-PCR-RT-m

1

TABLA 2 Secuencias de cebadores usadas en el Ejemplo 1

2

TABLA 3

3

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TABLA 4 Secuencias de los cebadores y sondas, derivados de la región espaciadora 16s-23s del ARNr

4

TABLA 4 (continuación)

5

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TABLA 5 Secuencias de los cebadores para RSV, usados en el ejemplo 3

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TABLA 6 Resultados del cultivo y de LiPA para una serie de 36 muestras a ciegas

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TABLA 6 (continuación)

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TABLA 7 Resultados de 30 especimenes a ciegas para el cultivo de Mycoplasma pneumoniae

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Claims

1. Método para la detección de la infección aguda del tracto respiratorio que comprende la amplificación simultánea de diversas secuencias de nucleótidos blanco presentes en una muestra biológica mediante una mezcla de cebador que comprende al menos un juego de cebador para cada una de las siguientes regiones génicas:

-: la subunidad F1 del gen de la gliproteína de fusión para RSV,

-: el gen de la hemaglutininneuraminidasa para PIV-1,

-: la secuencia del ARNr 16S para M. pneumoniae,

-: la secuencia del ARNr 16S para C. pneumoniae,

-: la región no codificadora 5' para enterovirus,

-: el gen de la proteína no-estructural para influenza A,

-: el gen de la proteína no-estructural para influenza B, y,

-: el gen hexon para adenovirus.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 donde dichos cebadores de ARNr 16s son sustituidos por cebadores de la región espaciadora entre las secuencias 16s y 23s del ARNr.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 donde además también al menos se usan un par cebador para la detección específica de B. pertussis y B. parapertussis.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3 donde dichos cebadores son seleccionados de la Tabla 2 o Tabla 4.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4 donde dichos productos amplificados son posteriormente detectados usando una sonda, con dicho cebador siendo preferiblemente seleccionado de la Tabla 3, Tabla 4 o Tabla 5.

6. La mezcla de cebador que contiene al menos nueve juegos de cebadores seleccionados del grupo compuesto de las SEQ ID NOS 17. 18, 19. 20, 21, 22, 23 y las secuencias de cebador de la Tabla 2, por lo cual la mezcla contiene al menos un juego de cebador de cada una de las regiones génicas enumeradas en la reivindicación 1.

7. La mezcla de sonda que contiene al menos nueve sondas seleccionadas a partir de SEQ ID Nos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 y 34 y su forma complementaria y su forma ARN donde T es sustituido por U, por lo cual la mezcla contiene para cada una de las regiones génicas enumeradas anteriormente en la reivindicación 1 al menos una sonda específica, para la detección simultánea de patógenos respiratorios.

8. El kit para la detección de la infección aguda del tracto respiratorio que comprende una mezcla de cebador como es identificado en la reivindicación 6 para realizar el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. El kit para la detección de la infección aguda del tracto respiratorio que comprende una mezcla de cebador como identificado en la reivindicación 7 para realizar el método de acuerdo con la reivindicación 5.

10. El kit de acuerdo con la reivindicación 9, donde dichas sondas son aplicadas como líneas paralelas sobre un soporte sólido, preferiblemente sobre una membrana de nylon.