CN116121355A - 一种快速的hla分型方法 - Google Patents

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CN116121355A CN202210773284.2A CN202210773284A CN116121355A CN 116121355 A CN116121355 A CN 116121355A CN 202210773284 A CN202210773284 A CN 202210773284A CN 116121355 A CN116121355 A CN 116121355A
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周超强
吴群峰
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Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及快速的HLA分型方法。本发明公开了一种快速的HLA分型方法，包含下列步骤：S1.线性化克隆载体的制备，纯化获得线性化克隆载体；S2.分别采用不同HLA基因外显子的特异性引物对进行样本PCR扩增，纯化获得各自的HLA基因外显子PCR扩增产物；S3.分别构建不同HLA基因外显子的重组载体；S4.转化重组载体；S5.阳性菌株筛选；S6.测序并与HLA基因外显子在数据库中的标准序列进行对比，确定HLA基因的型别；其特征在于所述S4转化重组载体中，按照最接近感受态细胞个数/重组载体DNA摩尔数＝20:1～10:1的比例进行转化。本发明所述方法可在10小时内获得样本的HLA序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，成本显著降低。

Description

一种快速的HLA分型方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种快速的HLA分型方法。
背景技术
人类白细胞抗原(liuman Leukocyte Antigen，HLA)是位于人类第6号染色体短臂上一组紧密连锁的基因群，是目前人体中最具有多态性的遗传系统，由三类基因组成，即Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因，可以作为一个遗传单位或单倍型(haplotype)而遗传给下一代，属共显性等位基因[1]。人类白细胞抗原(HLA)系统是机体免疫系统的重要组成部分，在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用。HLA基因与人类多种疾病的发生、发展和预后密切相关。人类的I类基因位点命名为HLA-A、HLA-B、HLA-C，分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引起移植后排斥反应发生的主要抗原。Ⅱ类基因则命名为HLA-D，HLA-D又分为HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等亚区，主要分布于免疫细胞上，它们可以作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用，在免疫应答反应中发挥重要作用。Ⅲ类基因区位于HLA-I、Ⅱ类基因区之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。这些基因在机体的免疫及机体对外界环境的适应性方面均有重要作用。准确的HLA抗原分型技术无疑在基础研究和临床应用上都有很重要的意义。
HLA分型主要应用于组织配型、输血配型、疾病相关等位基因检测及遗传进化分析等方面。二十世纪七八十年代的HLA配型方法主要采用微量淋巴细胞毒实验方法，当PCR技术发明以后，开始进入HLA的DNA分型时代，而且建立了DNA等位基因型与血清型的对应关系。目前，主流的HLA分型技术是以DNA测序为基础的HLA分型技术(sequencing-basedtyping,简称SBT)。
由于HLA基因的多态性，HLA基因座为杂合子时，不同等位基因组合的序列可能会呈现出同一种分型组合结果，测序时会出现双峰现象，SBT会受测序准确性与杂合子难分型的影响；且对于等位基因多态性位于测序区域外的地方，会出现漏检测情况造成结果误判容易出现模棱两可的结果。对于该问题的解决通常为结合SBT、PCR-SSO/PCR-SSP等多种方法配合进行样本检测，但均费时、费力。因此，需要研究一种新的快速、高效、高分辨率、低廉价格的HLA分型方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速的HLA分型方法，已解决现有技术存在杂合子难分型和耗时长等问题。
本发明公开了快速的HLA分型方法，包含下列步骤：
S1.线性化克隆载体的制备，纯化获得线性化克隆载体；
S2.分别采用不同HLA基因外显子的特异性引物对进行样本PCR扩增，纯化获得各自的HLA基因外显子PCR扩增产物；
S3.分别构建不同HLA基因外显子的重组载体；
S4.转化重组载体；
S5.阳性菌株筛选；
S6.测序并与HLA基因外显子在数据库中的标准序列进行对比，确定HLA基因的型别；
其特征在于，所述S4转化重组载体中，按照最接近感受态细胞个数/重组载体DNA摩尔数＝20:1～10:1的比例进行转化。
本发明创新原理在于通过对HLA基因进行比对分析，对不同的HLA类型分别设计特异性扩增引物，并进行优化，可对HLA所有类型的等位基因进行有效扩增出特异性目的测序条带；对HLA基因全长序列进行扩增测序，可有效解决模棱两可，达到绝对高分；根据血清学家系设计的组特异性扩增引物可避免发生漏检；对于父母双方的基因型，摸索出合适的转化比例，使父母双方基因型进行分离，达到单倍型测序的目的，使测序结果为单峰一目了然，对样本分型结果更准确。对于感受态细胞，选择生长快速、转化效率高的细胞进行转化，显著缩短分型所需的时间，尽可能的让每一个感受态中只有一条DNA进去，确保父母双方的序列能分开。
在一优选实施例中，所述步骤S1线性化克隆载体的制备为单酶切线性化、双酶切线性化或PCR扩增线性化；在一实施例中，步骤S1线性化克隆载体的制备，克隆载体为pUC19质粒，PCR扩增时引物对序列分别为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28。
在一优选实施例中，所述步骤S2中，特异性引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(A2)、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4(A3)、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.6(B2)、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8(B3)、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10(C2)、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12(C3)、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14(DPA)、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16(DPB)、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18(DQA)、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20(DQB)、SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22(DR)、SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.24,SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26(DR345)。
在一优选实施例中，所述步骤S2中，所述样品为生物样品或生物样品提取而来的基因组DNA，所述生物样品为淋巴细胞、全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含基因组DNA的任何其它样品。
在一优选实施例中，所述步骤S3中，所述线性化克隆载体与HLA基因外显子PCR扩增产物摩尔比为1:2-1:3。
在一优选实施例中，所述步骤S4中，所述感受态细胞和所述重组载体的相对比例为：0.1ng/ul重组载体转化到50ul感受态细胞中，感受态细胞个数/重组载体DNA摩尔数＝20:1～10:1的比例进行转化。
在一优选实施例中，所述步骤S4中，所述感受态细胞为Turbo感受态细胞。
在一优选实施例中，所述步骤S5中，所述数据库为IMGT数据库。
本发明所述方法可在10小时内获得样本的HLA序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时还可以通过测序的方式，发现新的等位基因，以及在测序结果方面，相较以前的方法，峰形更加的单一，从而对型别的判定更加合理和准确。因此，本发明方法在检测效率、成本控制、数据质量等方面都有质的飞跃。应用这种新技术进行高分辨配型，成本显著降低，且本发明得到的数据更加可靠、真实。
附图说明
图1载体pUC19线性化PCR扩增电泳图。
图2样本HLA特异性PCR扩增电泳图。
图3阳性菌落PCR鉴定电泳图。
图4普通的Sanger测序方法的峰形图。
图5优化HLA单分子测序方法的峰形图。
图6普通的Sanger测序方法的峰形图套峰分析。
图7优化HLA单分子测序方法的峰形图分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
如本文使用的，“生物样品”可以是例如淋巴细胞、全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含基因组DNA的任何其它样品。尽管对于分子基因分型而言可以使用几乎任何组织来源，但最常使用的是例如来自外周血的淋巴细胞。也可以使用通过非侵入性方法获得的样品，例如通过基于脸颊拭子或唾液的DNA收集。
“DNA”是指本领域中所知道的各种形式的脱氧核糖核酸，如基因组DNA。从这些来源提取DNA的多种适合的方法是本领域已知的。这些方法的范围从有机溶剂提取到二氧化硅包覆的珠及阳离子交换柱的吸附。DNA自动提取系统也是商业可得的且可提供高质量、高纯度的DNA。
如本文使用的，“聚合酶链式反应”或PCR是核酸的扩增，由以下步骤组成：起始变性步骤，其分离双链核酸样品的链，然后通过重复(i)退火步骤，允许扩增引物与靶序列的旁侧位置特异性退火；(ii)延伸步骤，其使引物以5’至3’方向延伸因而形成与靶序列互补的扩增子多核苷酸，和(iii)变性步骤，其引起扩增子从靶序列上分离(Mullis等人编辑，The Polymerase Chain Reaction，BirkHauser，Boston，Mass.(1994)。每个上面的步骤可以在不同的温度下进行，优选使用自动化的热循环仪(Applied Biosystems LLC，LifeTechnologies Corporation，Foster City，CA.的一个部门)。如果需要，可以通过本领域技术人员已知的方法将RNA样品转换成DNA/RNA异型双链或双链cDNA。PCR方法还包括逆转录酶-PCR和遵循PCR原理的其它反应。
如本文使用的，“扩增”是指线性地或指数地增加多核苷酸序列的广泛的技术。示例性扩增技术包括但不限于PCR或任何其它应用引物延伸步骤的方法。扩增的其它非限制性例子包括但不限于连接酶检测反应(LDR)和连接酶链式反应(LCR)。扩增方法可以包括热循环或可以等温进行。在各种具体实施方案中，术语“扩增产物”包括来自任何扩增反应循环数目的产物。
在某些具体实施方案中，扩增方法包括至少一个扩增循环，例如但不限于以下的连续过程：将引物杂交至靶序列的引物特异性部分或扩增来自任何扩增反应循环数目的产物；使用聚合酶以依赖模板的方式合成核苷酸的链；和将新形成的核酸双链变性从而分离链。循环可以重复或可以不重复。
有许多已知的扩增核酸序列的方法，包括例如PCR。见例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification(编辑H.A.Erlich，FreemanPress，NY，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(编辑Innis等人，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Mattila等人，Nucleic AcidsRes.19，4967(1991)；Eckert等人，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(编辑McPherson等人，IRL Press，Oxford)；和美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,1594,965,188和5,333,675，为了所有的目的其中的每个通过引用以其全部并入本文。
根据扩增方法的温度需要传统地将核酸扩增技术归类。等温扩增在恒定的温度下进行，与需要高和低温度之间循环的扩增相反。等温扩增技术的例子是：链置换扩增(Strand Displacement Amplification)(SDA；Walker等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392396；Walker等人，1992，Nuc.Acids.Res.20：1691 1696；和EP 0 497 272，所有的都通过引用并入本文)，自主序列复制(self-sustained sequencereplication)(3SR；Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874 1878)，Q.beta.复制酶系统(Lizardi等人，1988，BioTechnology 6：1197 1202)，和WO 90/10064和WO 91/03573中公开的技术。
“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的具体实施方案。但是，在相同的或其它的情况下其它的具体实施方案也可以是优选的。另外，对一个或多个优选的具体实施方案的详述不意味着其它的具体实施方案是没有用途的，不用于从本发明的范围中排除其它的具体实施方案。
术语“含有”和其变体在这些术语出现在说明书和权利要求中的地方不具有限制性意思。
还在本文，通过端点详述的数值范围包括所有包括在该范围内的数值。术语“和/或”意思是一个或所有列出的元素或任何两个或两个以上列出元素的组合。
实施例1.克隆载体PCR扩增
(1)、以本实验室自存的pUC19质粒为模板，使用载体扩增引物对，其反应组成体系如下：
试剂组分 用量
Water,nuclease-free 22.5ul
5x SuperFi Buffer 10ul
10mM dNTP mix 1ul
10uM引物混合物 5ul
DNA(10ng/ul) 1ul
5X SuperFi GC Enhancer 10ul
Platinum SuperFi DNA Polymerase(2U/ul) 0.5ul
pUC19-F GACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGC，SEQ ID NO.27；
pUC19-R GACGAAAGGGCCTCGTGATACGCC，SEQ ID NO.28。
(2)、设置好PCR反应体系后，所有反应均在PCR仪中用一种扩增条件进行同步扩增，循环参数如下：
(3)、对获得的PCR扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果显示：从电泳图1上看本发明设计的引物均得到较为单一的条带，且条带明亮，可见获得足够的DNA量。即经上述设计的特异性引物对pUC19进行扩增，获得大小为2428bp的基因扩增片段，且电泳条带具有显著单一条带的优良特点。
(4)、用胶回收试剂盒(AXYGEN)对产物进行切胶回收，并用Nanodrop测定浓度。
(5)、得到的胶回收纯化产物，每孔加入1ul Dpn1消化酶+CutStartsamartbuffer，37℃反应1h，得到的产物作为酶切的质粒片段。
实施例2.样本PCR扩增
(1)、根据编排好的样本顺序，取200ul血样于对应标记好的1.5mL离心管中。于离心机，6000rpm离心5min。离心后去掉上层血清，保留下层血浆。
(2)、根据编排好的样本顺序，按照对应的样本标记在PCR反应的生工96孔板(即反应板，其命名规则为“实验日期-样本标号-位点信息)或生工200ul反应管。用移液器按顺序从离心后保留的血浆样品管中转移1ul，根据需要做的位点数转移相应的次数(每个样本每个位点一个反应)。样本应加到反应孔底部，若加样过程中，样品为加到反应孔底部，则加样完成后要短暂离心，封口待用。
(3)、分别使用不同的引物对，引物对名称和编号见下表。使用不同的引物对进行扩增时，其扩增过程和反应体系均是相似的。
我们从IMGT/HLA数据库进行序列收集，建立HLA序列的数据库，基因HLA多态性高，比对分析数据难度大，通过自主开发的HLA保守序列分析软件，找到待优化的HLA特异性引物，通过样本测试和筛选，对引物进行优化，找到合适的引物序列扩增序列。使其能满足：对各类的HLA类型均能有效扩增，能得到特异性的扩增条带；非特异性扩增少等优良的特点。最后选择的引物序列信息如下
(4)、PCR反应体系如下：
试剂组分 用量
KOD One Master Mix 10
10μM forward primer 0.6
10μM reverse primer 0.6
人全血 1
Water,nuclease-free 7.8
(5)、设置好PCR反应体系后，所有反应均在同一型号的PCR仪中用一种扩增条件进行同步扩增，循环参数如下：
(6)、对获得的PCR扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果显示：从电泳图2上看本发明设计的引物均得到较为单一的条带，且条带明亮，可见获得足够的DNA量。即经上述设计的特异性引物对血液样本进行扩增，电泳条带具有显著单一条带的优良特点。
实施例3.构建重组载体
(1)、对上述实施例1制备的克隆载体PCR扩增和实施例2制备的样本扩增的产物，用翊圣无缝克隆产品(货号为：10911)，按如下反应体系进行配置：
组分 样本组 阴性对照 阳性对照
ddH2O Up to 20ul Up to 20ul 8ul
2×Hieff Clone Enzyme Premix 10ul 0ul 10ul
线性化载体 X ul X ul 1ul
目的基因 Y ul 0ul 1ul
注：重组反应体系最适载体使用量为0.03pmol；最适载体与插入片段摩尔比为1:2-1:3，即最适插入片段使用量为0.06-0.09pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适载体使用量＝[0.02×载体碱基对数]ng(0.03pmol)；
最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)或＝[0.06×插入片段碱基对数]ng(0.09pmol)；
例如，将长度为2kb的插入片段克隆至长度为5kb的载体时，载体的最适使用量应为：0.02×5000＝100ng；插入片段最适使用量应为：0.04×2000＝80ng或0.06×2000＝120ng。
(2)、配置好反应体系后，所有反应均在同一型号的PCR仪中，用50℃反应30min。
实施例4.转化重组载体
转化条件优化：
1、对于转染的比例：
为了探究一个合适的转染比例，理论上按照细菌个数/DNA摩尔数＝100:1的比例进行转化，其目的主要是尽可能的让每一个感受态中只有一条DNA进去，确保父母双方的序列能分开。
因此分别进行2ng/ul、0.1ng/ul(连接产物稀释20倍)、0.005ng/ul(连接产物稀释400倍)、0.00025ng/ul(连接产物稀释8000倍)连接产物(转化体积为2ul)转化到50ul的Top10感受态细胞中。
(1)、将样本组连接产物、阴性、阳性对照加入50ul Top10感受态细胞(生工生物，货号为：B528412-0010)中，冰浴30min。(注：加入的转化样本按照上述浓度进行稀释，每一个对应浓度的转化体积为2ul)
(2)、在金属浴上42℃热激90s，2分钟后加入350ul LB培养基。
(3)、于摇床上37℃，220rpm孵育45min。
(4)、7000rpm离心1min，吸取300ul上清弃去。
(5)、将剩余的50ul培养基，用移液器反复吸打混匀后涂布在预先37℃预热的SB培养基上。
(6)、将平板置于37℃的培养箱中培养约14h。
(7)、得到的平板如下：
对于平板上的感受态菌株的数量，原倍的感受态菌株数量过多，会存在一个菌株中有多条DNA片段转化。对于稀释20倍的连接产物，其对应平板上的菌株量适宜；对于稀释400倍、8000倍的转化产物，其平板上的菌株数目过少，且挑取菌落鉴定为假阳性。
对于稀释20倍的连接产物进行转化，挑取的菌株测序鉴定，其序列符合要求。2、感受态细胞(选择Turbo感受态细胞)
对比不同的感受态细胞的转化效率以及生长时间，以期望得到转化效率高、生长时间快速的感受态细胞，因此查阅文献资料，了解到对于Turbo感受态细胞涂布于琼脂糖平板上6h后可见菌落进行单克隆挑取鉴定，因此对该快速生长的感受态进行转化条件优化。
将上述样本组连接产物、阴性、阳性对照加入50ul Turbo感受态细胞(庄盟生物，货号为：ZC1026-1)中，冰浴30min。(注：加入的转化样本稀释至0.1ng/ul的浓度，转化2ul体积)
(2)、在金属浴上42℃热激90s，2分钟后加入350ul 37℃预热的SOC培养基。
(3)、于摇床上37℃，220rpm孵育45min。
(4)、7000rpm离心1min，吸取300ul上清弃去。
(5)、将剩余的50ul培养基，用移液器反复吸打混匀后涂布在预先37℃预热的SB培养基上。
(6)、将平板置于37℃的培养箱中培养6-7h。
(7)、得到的平板如下：(放大镜下观看，放大30倍)
对该平板进行单克隆菌株挑取，摇菌进行PCR鉴定，选取有阳性PCR产物的阳性菌株进行测序鉴定。测序结果符合要求。因此选择此生长快速的感受态细胞进行转化。
实施例5.菌落鉴定和测序分析
(1)、先在超净工作台内取2ul LB培养基至无菌PCR管中。
(2)、使用10ul移液器吸头，从各个不同样本对应的转化的平板上，各挑取6个单克隆至5ul LB液体培养基中，静置3min左右。
(3)、使用测序引物对进行菌落PCR，验证挑取的单克隆菌株是否为阳性菌株，PCR反应体系如下：
试剂组分 用量
KOD One Master Mix 10ul
10μM forward primer 0.6ul
10μM reverse primer 0.6ul
菌落样本 1ul
Water,nuclease-free 7.8ul
Seq-F TAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACA
Seq-R TCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCC
(4)、配置好PCR反应体系后，所有反应均在同型号的PCR仪中用一种扩增条件进行同步扩增，循环参数如下：
(5)、扩增完成后，取5ul PCR产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果显示：从电泳图3上看本发明设计的引物均得到较为单一的条带，且条带明亮，可见获得足够的DNA量。即经上述设计的特异性引物对菌落PCR进行扩增，获得目的大小的基因扩增片段，且电泳条带具有显著单一条带的优良特点。
(6)、将剩下的对应各样本挑取的含有4ul LB培养基的单克隆菌株，转接含有2mL灭菌LB培养及2ul氨苄母液的12mL的离心管中，于摇床上37℃，220rpm孵育4h。并做好对应的标记。
(7)、将对应的菌落PCR扩增鉴定的阳性菌落，外送进行测序，得到测序后单峰清晰，无背景杂峰，导入序列分析软件可得到清晰的HLA序列结果。
实施例6.对比试验
仪器和试剂：
分别用普通HLA分型测序方法1，2和本发明HLA分型测序方法对HLA样本进行测序分析，本发明方法所用的试剂如上述所示，采用同样的测序仪器为ABI3730高通量分析仪进行测序。
二者的试剂的主要区别为普通HLA分型测序方法无父本和母本分离的步骤，会导致测序出现套峰的情况；对于HLA单分子测序方法，优化出合适的分离方法，可将亲本的两条序列进行分离，从而得到正确的HLA分型结果。
实验过程：同一样品，分别采用本发明方法(实施例1-5)和普通HLA分型测序方法进行HLA分型；
结果：
对于普通的Sanger测序方法(图4、图6)：会出现套峰，干扰分析结果，测序结果会存在差异，存在在同一位点有套峰，不能正确判断该位点的碱基，存在误判的情况
本发明方法(图5、图7)：测序得到的条带为单一，背景干净的序列，对于HLA单分子测序：样本测序结果均为单峰，可以正确得到样本的分型序列，对样本的分型结果进行正确的判断。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (10)

1.一种快速的HLA分型方法，包含下列步骤：
S1.线性化克隆载体的制备，纯化获得线性化克隆载体；
S2.分别采用不同HLA基因外显子的特异性引物对进行样本PCR扩增，纯化获得各自的HLA基因外显子PCR扩增产物；
S3.分别构建不同HLA基因外显子的重组载体；
S4.转化重组载体；
S5.阳性菌株筛选；
S6.测序并与HLA基因外显子在数据库中的标准序列进行对比，确定HLA基因的型别；
其特征在于，所述S4转化重组载体中，按照最接近感受态细胞个数/重组载体DNA摩尔数＝20:1～10:1的比例进行转化。
2.如权利要求1所述的HLA分型方法，其特征在于，所述步骤S2中，特异性引物对为SEQID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23,SEQ ID NO.24,SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26。
3.如权利要求1所述的HLA分型方法，其特征在于，所述步骤S1线性化克隆载体的制备为单酶切线性化、双酶切线性化或PCR扩增线性化。
4.如权利要求3所述的HLA分型方法，其特征在于，步骤S1线性化克隆载体的制备，克隆载体为pUC19质粒，PCR扩增时引物对序列分别为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28。
5.如权利要求1所述的HLA分型方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述样品为生物样品或生物样品提取而来的基因组DNA。
6.如权利要求5所述的HLA分型方法，其特征在于，所述生物样品为淋巴细胞、全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含基因组DNA的任何其它样品。
7.如权利要求1所述的HLA分型方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述样品为血浆。
8.如权利要求1所述的HLA分型方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述线性化克隆载体与HLA基因外显子PCR扩增产物摩尔比为1:2-1:3。
9.如权利要求1所述的HLA分型方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述感受态细胞为Turbo感受态细胞。
10.如权利要求1所述的HLA分型方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述数据库为IMGT数据库。
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