CN109837274B - 一种人线粒体基因组文库构建的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人线粒体基因组文库构建的方法及应用。针对线粒体基因组的特点，对新旧样本采用两段法来扩增整条线粒体DNA；具有重叠特性的两条线粒体DNA扩增引物把线粒体全长扩增，增加其保真性，然后3个反应池的多重PCR所需要的探针组分，每个反应池的探针数分别为33对进行线粒体全基因组捕获，利用不同样本进行生物素标记的线粒体通用接头的特异性芯片，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的线粒体DNA探针文库。本发明实现了利用高通量筛查方法及应用，较单独进行位点一代测序的检测更快速、经济、简便，且对设备及环境要求低，利于推广和应用，适用于耳聋相关人群的大规模筛查和预防性检查。
Description
技术领域
本发明属于生命科学与生物技术领域，具体涉及一种人线粒体基因组文库构建的方法及应用。
背景技术
线粒体是真核细胞中的一种细胞器，直径范围从0.5到10微米(μm)。线粒体能产生供应细胞作为化学能量的绝大多数三磷酸腺苷(ATP)，因此，有细胞“动力工厂”之称。除了提供细胞能量，线粒体还参与了一系列其他细胞功能，如信号传导、细胞分化、细胞凋亡以及细胞周期和细胞生长的调控。线粒体同时也是细胞内产生自由基的主要场所。线粒体功能缺陷与多种人类疾病相关，例如：母系遗传性疾病(如母系遗传性耳聋、Leber遗传性视神经病变和其他神经肌肉疾病等)和复杂性疾病(如癌症、帕金森病、糖尿病、高血压等)。
目前发现了大量的与人类线粒体疾病相关的mtDNA突变位点。近几年来又发现大量核基因编码线粒体蛋白的突变和线粒体缺陷与神经退行性疾病、衰老和肿瘤相关。而线粒体遗传变异(由mtDNA突变)导致氧化磷酸化功能的缺陷是引起神经肌肉疾病；导致记忆、视力、听力丧失和体力下降；造成心血管病、糖尿病、肠胃病、酒精中毒症、神经退行性疾病阿尔采默氏病，帕金森氏病以及肿瘤等多种疾病的重要病因。
近年来，除常规的sanger测序方法外，国内相继报道了线粒体DNA突变其检测方法，以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利(专利号：200510006097.8)，该发明是根据90％以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变(G11778A、G3460A和T14484C)，设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA的3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA中G11778A位点突变的新方法(专利号：200610003429.1)。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时,需要设计一条特异性延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基,其在DNA聚合酶的作用下开始延伸,带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP)被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。
本研究发明中所采取的技术是基于多重PCR技术标记目标检测区域序列，采用芯片技术进行突变位点检测，通过杂交信号值的判读检测突变位点。通过该技术不仅能够对于多个突变位点进行筛查检测，同时能够极大的提高特异性检测。
发明内容
本发明的目的是针对目前检测线粒体DNA突变位点的方法所存在的缺点，提供一种人线粒体基因组文库构建的方法，是一种具有快速、高通量特点，更好的有利于高效、快速、便捷、经济的进行线粒体DNA全序文库的构建方法。
本发明提供的一种人线粒体基因组文库构建的方法，由一步法进行扩增的线粒体DNA全序为两段的特异性引物、3个反应池的多重PCR所需要的探针组分、进行线粒体通用接头的特异性芯片共3个组分构成。具体步骤如下：
(1)线粒体DNA的SNP检测前需要扩增整个线粒体DNA全长，由于新鲜样本、陈旧样本的原因导致不能完全扩增，我们采用两段法来扩增整条线粒体DNA；具有重叠特性的两条线粒体DNA扩增引物序列分别为：样本前向引物1：AAATCTTACCCCGCCTGTTT(SEQ:NO.1),反向引物1：AATTAGGCTGTGGGTGGTTG(SEQ:NO.2)；前向引物2：GCCATACTAGTCTTTGCCGC(SEQ:NO.3)，反向引物2：GGCAGGTCAATTTCACTGGT(SEQ:NO.4)；
(2)3个反应池的多重PCR所需要的探针组分，每个反应池的探针数分别为33对，第一反应池的探针序列为(SEQ:NO.5-70，具体见实施例表1)，第二反应池的探针序列为(SEQ:NO.71-136，具体见序列表)，第三反应池的探针序列为(SEQ:NO.137-202，具体见序列表)，这包含了重叠的线粒体DNA序列，确保线粒体DNA的完整性；所述探针序列的长度为16～35bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp～80bp的重叠；
(3)连接接头特异性反应探针序列分别按照96次反应探针设计，标记为PE1.0和PE2.0；所述标记是水溶性维生素B的生物素标记；
(4)多重探针反应液和连接接头的反应液，包括5×多重缓冲液，dNTP(10mM)，引物(1E)，多重聚合酶(2U/μl)等。
其中步骤(2)中使用3个反应池是避免引物直接形成二聚体，保证了扩增线粒体的保真度。
本发明的另一个目的是提供所构建的人线粒体基因组文库在制备全面检测线粒体DNA的SNP位点的试剂盒中的应用，通过以下步骤实现：
第1步：采用两段法来扩增整条线粒体DNA，提纯；
第2步：多重PCR探针反应：将向三个反应池T1里分别加入对应的探针(SEQ:NO.5-70，具体见实施例表1)，第二反应池T2的探针序列为(SEQ:NO.71-136，具体见序列表)，第三反应池T3的探针序列为(SEQ:NO.137-202，进行如下PCR反应；
第3步：进行第一次磁珠纯化；
第4步：反应池里分别加入接头探针，进行如下反应：(1)反应体系去离子水5μl，5×多重缓冲液5μl，dNTP(10mM)0.5μl，PE1.0(10μM)1μl，PE2.0(10μM)1μl，DNA模板12μl，多重聚合酶(2U/μl)0.5μl；(2)反应条件为：预变性温度与时间95℃，时间3min30s，变性温度与时间98℃ 20s，退火温度与时间66℃ 3min30s，延伸温度与时间72℃ 30s，共计6个循环；终延伸温度与时间72℃ 5min；
第6步：进行第2轮磁珠纯化：
第7步：取2μl文库使用核酸分析仪进行文库浓度测定，记录文库浓度。
第8步：取1μl文库样本使用全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在260bp-400bp之间；有微量170bp左右的杂带；在600bp以后存在峰值很低的小峰，不影响文库数据表现。本发明的特征在于是提供一种能够扩增线粒体DNA序列为两段的特异性引物；这两对引物能够迅速、便捷的扩增人线粒体DNA全序，并能够保真，确保线粒体DNA的纯度，为进行线粒体DNA测序提供精确的模板。
本发明提供一种能够利用高通量测序的文库构建探针芯片，该芯片包括针对3个反应池的99条线粒体DNA片段，可以弥补检测位点较少，所带来的漏诊现象，更好的有利于线粒体DNA的大样本筛查，具有快速高通量的特点。其特征为：所述的线粒体基因具有多个突变SNP位点，每个突变SNP位点根据其SNP突变位点以及相邻突变的碱基位点情况设计一条或若干条的检测探针序列，通过一组或者多组检测信号判断SNP位点。
本发明的提供的进行线粒体通用接头的特异性芯片，该芯片包括针对96个，这样保证能一次构建96个样本，实现一次性测定96个样本；
在本发明中，芯片检出结果情况，采集的病例经过传统克隆测序已经明确已知的SNP位点。通过对于这些样本的芯片检测，判读结果均符合预期。
本发明通过一步法将线粒体DNA扩增为两段、多重PCR扩增线粒体DNA全序的芯片、接头连接芯片、探针以及相关的检测试剂盒。本发明主要提供了：(1)扩增线粒体DNA全长为两段的引物，确保线粒体DNA的保真度；(2)提供线粒体DNA全序扩增为3个反应池的SNP检测芯片，提供检测SNP位点的探针的制备引物；(3)提供进行接头连接的芯片；(4)一种用于线粒体DNA全序二代测序文库构建的方法及试剂盒。
用本发明的方法及其制备的检测线粒体基因mtDNA突变试剂盒具有以下特点：
1.传统上检测遗传性视神经病变患者基因组DNA的方法是用普通的测序方法来直接测序、分析。这种检测方法给使用的样本量大，扩增的次数多和时间长，并且还存在很多扩增效果不理想的结果。本发明提供遗传性视神经病变基因SNP检测的固相芯片的方法来检测，该方法不仅解决了传统上从遗传性视神经病变患者因为直接测序使用样本量大而采血样多，减轻被检者的痛苦；而且还解决了扩增时间长、次数繁多等问题，从而节省了患者得知结果的时间。
2.目前国内外有几种线粒体相关的母系遗传性疾病基因诊断方法，如直接测序法荧光定量PCR检测方法、酶切方法等，由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较，本发明提供遗传性视神经病变基因SNP检测的固相芯片的方法则结合了特异性PCR技术及酶切技术两者的优点，经过高通量测定。另外值得一提的是，本方法所用的引物和探针均经过仔细设计。避免了像酶切技术那样存在假阳性和假阴性的问题。
3.应用本发明提供的试剂盒进行mtDNA突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；适合在一般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行遗传性视神经病变相关的mtDNA突变的大规模筛查和预防性检查。
附图说明
图1是本发明的线粒体DNA文库构建示意图。
图2是本发明提供的线粒体DNA文库构建质控图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1一种人线粒体基因组文库构建的方法及试剂盒
本发明提供的芯片试剂盒，由一步法进行扩增的线粒体DNA全序为两段的特异性引物、3个反应池的多重PCR所需要的探针组分、进行线粒体通用接头的特异性芯片共3个组分构成。其中，
(1)线粒体DNA的SNP检测前需要扩增整个线粒体DNA全长，由于新鲜样本、陈旧样本的原因导致不能完全扩增，我们采用两段法来扩增整条线粒体DNA；具有重叠特性的两条线粒体DNA扩增引物分别为：样本前向引物1：AAATCTTACCCCGCCTGTTT(SEQ:NO.1),反向引物1：AATTAGGCTGTGGGTGGTTG(SEQ:NO.2)；前向引物2：GCCATACTAGTCTTTGCCGC(SEQ:NO.3)，反向引物2：GGCAGGTCAATTTCACTGGT(SEQ:NO.4)；
(2)3个反应池的多重PCR所需要的探针组分，每个反应池的探针数分别为33对，第一反应池的探针序列为(SEQ:NO.5-70，具体见实施例表1)，第二反应池的探针序列为(SEQ:NO.71-136，具体见序列表)，第三反应池的探针序列为SEQ:NO.137-202，，具体见序列表)，这包含了重叠的线粒体DNA序列，确保线粒体DNA的完整性；
(3)连接接头特异性反应探针序列分别按照96次反应探针设计，标记为PE1.0和PE2.0；
(4)多重探针反应液和连接接头的反应液，包括5×多重缓冲液，dNTP(10mM)，
引物(1E)，多重聚合酶(2U/μl)等。
实施例2线粒体文库芯片制作和分析
按照图1所示的示意图，进行线粒体DNA全序测定前的文库构建制备，具体如下：.
第1步：线粒体序列扩增，提纯：采用两段法来扩增整条线粒体DNA；具有重叠特性的两条线粒体DNA扩增引物进行如下反应：(1)反应体系为：反应体系为：ddH2O(10.25-x)μl；2X高GC-Melt LA缓冲液12.5μl，dNTP(10mM)1μl，引物(F/R)0.5μl，gDNA(100ng/μl)xμl，高GC Genomic LA聚合酶(5units/ml)0.25μl；(2)反应条件为：预变性温度与时间94℃，时间1min，变性温度与时间94℃ 30s，退火温度与时间56℃ 30s，延伸温度与时间72℃ 9min，共计30个循环；终延伸温度与时间72℃ 5min；
第2步：多重PCR探针反应：将向三个反应池T1里分别加入对应的探针(SEQ:NO.5-70，具体见实施例表1)，第二反应池T2的探针序列为(SEQ:NO.71-136，具体见序列表)，第三反应池T3的探针序列为(SEQ:NO.137-202，进行如下反应：(1)反应体系为：去离子水16μl；5×多重缓冲液5μl，dNTP(10mM)0.5μl，引物(1E)2，gDNA(20ng/μl)
1μl，多重聚合酶(2U/μl)0.5μl；(2)反应条件为：预变性温度与时间95℃，时间3min30s，变性温度与时间98℃ 20s，退火温度与时间61℃ 3min30s，延伸温度与时间72℃30s，共计14个循环；终延伸温度与时间72℃ 5min；
第3步：产物合并：Tube-1，Tube-2和Tube-3各取μl体积进行合并，总体积为30μl。
第4步：第1轮磁珠纯化
(1)向30μl PCR合并产物加入30μl室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；
(2)室温孵育10min后，将PCR管置于磁力架上3min；
(3)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
(4)移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
(5)室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；
(6)将PCR管从磁力架取下，加入20μl去离子水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；
(7)将PCR管重新置于磁力架上，静置4min；
(8)用移液器吸取18μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为合并后的多重PCR产物。
第5步：反应池里分别加入接头探针，进行如下反应：(1)反应体系去离子水5μl，5×多重缓冲液5μl，dNTP(10mM)0.5μl，PE1.0(10μM)1μl，PE2.0(10μM)1μl，DNA模板12μl，多重聚合酶(2U/μl)0.5μl；(2)反应条件为：预变性温度与时间95℃，时间3min30s，变性温度与时间98℃ 20s，退火温度与时间66℃ 3min30s，延伸温度与时间72℃ 30s，共计6个循环；终延伸温度与时间72℃ 5min；
第6步：第2轮磁珠纯化：
(1)向25μl PCR反应体系内加入23μl室温平衡后的磁珠，用移液器吸打混匀数次；
(2)室温孵育10min后，将PCR管置于磁力架上3min；
(3)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
(4)移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
(5)室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；
(6)将离心管从磁力架取下，加入22μl洗脱液，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；
(7)将PCR管重新置于磁力架上，静置4min；
(8)用移液器吸取20μl上清液，转移到新的0.6ml的离心管中，管中液体为制备好的多重PCR文库。
第7步：取2μl文库使用核酸分析仪进行文库浓度测定，记录文库浓度。
第8步：取1μl文库样本使用全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在260bp-400bp之间；有微量170bp左右的杂带；在600bp以后存在峰值很低的小峰，不影响文库数据表现，如图2所示。
6.可靠性的检验
用本发明的基因芯片方法检测的结果，同时进一步将这些标本的PCR扩增产物进行测序分析，测序结果与基因芯片结果相吻合，说明使用本发明方法检测线粒体DNA突变的可具有靠性和稳定性。
基因芯片技术与荧光定量PCR技术、测序及酶切等技术相比具有如下优点(见表1)。
表1本发明与其他相关技术指标对照
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种人线粒体基因组文库构建的方法及应用
<160> 202
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
aaatcttacc ccgcctgttt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 2
aattaggctg tgggtggttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 3
gccatactag tctttgccgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 4
ggcaggtcaa tttcactggt 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 5
cgctttccac acagacatca taac 24
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 6
tgggtaggat gggcggg 17
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 7
ctgaaaatgt ttagacgggc tcac 24
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 8
agtatagctt agttaaactt tcgtttattg ct 32
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 9
agcgcgtaca caccgc 16
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 10
tggtagtaag gtggagtggg tt 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 11
tagcaaggac taacccctat acctt 25
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 12
ttctgtgggc aaatttaaag ttgaacta 28
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 13
agtaggccta aaagcagcca c 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 14
gggttgacag tgagggtaat aatga 25
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 15
gttcaacgat taaagtccta cgtgatc 27
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 16
ggaattgaac ctctgactgt aaagtttt 28
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 17
ccaacgttgt aggcccctac 20
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 18
gctagaggtg gctagaataa ataggag 27
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 19
atcaacatta ctaataagtg gctcctttaa c 31
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 20
aataatgttt gtgtattcgg ctatgaagaa 30
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 21
aataatagga gcttaaaccc ccttatttct a 31
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 22
gatgacgggt tgggccag 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 23
aaccctcgtt ccacagaagc 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 24
tcatgtgaga agaagcaggc c 21
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 25
aaatttaggt taaatacaga ccaagagcc 29
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 26
gggagaagta gattgaagcc agtt 24
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 27
tcaatatgaa aatcacctcg gagct 25
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 28
ctagaaggtt gcctggctgg 20
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 29
cgtttccccg cataaacaac ataa 24
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 30
tgatgaaatt gatggcccct aagat 25
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 31
agccctagga ttcatctttc ttttca 26
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 32
gaaagttaga tttacgccga tgaatatga 29
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 33
ccgatgcata caccacatga aac 23
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 34
attttatgta tacgggttct tcgaatgtg 29
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 35
acactcacaa caaaactaac taatactaac atc 33
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 36
cgtagtcggt gtactcgtag gt 22
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 37
cgagtagtac tcccgattga agc 23
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 38
aaatacgggc cctatttcaa agattttt 28
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 39
tctttacagt gaaatgcccc aacta 25
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 40
tcattttggt tctcagggtt tgttataatt 30
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 41
tagccatggc catcccctta 20
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 42
agggaaggtt aatggttgat attgcta 27
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 43
tctaattcta ctgactatcc tagaaatcgc 30
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 44
ctagtatgag gagcgttatg gagtg 25
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 45
gatgtggttt gactatttct gtatgtctc 29
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 46
gtcgaagccg cactcgtaa 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 47
acccctacca tgagccctac 20
<210> 48
<211> 34
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 48
tatactagta ttcctagaag tgagatggta aatg 34
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 49
ccctcttagc caatattgtg cctat 25
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 50
aataattagg ctgtgggtgg ttgt 24
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 51
gggtcaatag tacttgccgc a 21
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 52
actgcgccgg tgaagc 16
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 53
acttctagca agcctcgcta ac 22
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 54
tgttttctcg tgtgaatgag ggt 23
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 55
caacagaggc ttacgacccc 20
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 56
agggtggtaa ggatggggg 19
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 57
cctgactccc ctcagccata 20
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 58
tgtaactatt atgagtccta gttgacttga a 31
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 59
tccacaacct taacaatgaa caagatattc 30
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 60
agaattattc gagtgctata ggcgc 25
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 61
aacatttccc ccgcatccc 19
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 62
gaggagtagg ggcaggtttt g 21
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 63
aaaaccccac aaaccccatt acta 24
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 64
ttcatcatgc ggagatgttg gat 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 65
cccacatcac tcgagacgta aat 23
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 66
gtaattactg tggcccctca gaat 24
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 67
gattctttac ctttcacttc atcttaccc 29
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 68
ttaaggggtt ggctagggta taattg 26
<210> 69
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 69
taccataaat acttgaccac ctgtagtac 29
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 70
ggggacgaga agggatttga c 21
<210> 71
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 71
tgtctttgat tcctgcctca ttctat 26
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 72
gagatgtgtt taagtgctgt ggc 23
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 73
caccccctcc ccaataaagc 20
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 74
ctagagggat atgaagcacc gc 22
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 75
aaaccctgat gaaggctaca aagt 24
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 76
ggggttttag ttaaatgtcc tttgaagt 28
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 77
cttaggagat ttcaacttaa cttgaccg 28
<210> 78
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 78
tctccttgca aagttatttc tagttaattc at 32
<210> 79
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 79
ctctagcatc accagtatta gaggc 25
<210> 80
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 80
ggtttgttag gtactgtttg cattaataaa tt 32
<210> 81
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 81
agcgaactac tatactcaat tgatccaa 28
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 82
cgtacaggga ggaatttgaa gtagat 26
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 83
acccacaccc acccaaga 18
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 84
gcgtcagcga agggttgta 19
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 85
tcaccaagac cctacttcta acct 24
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 86
gggggtttaa gctcctatta tttactct 28
<210> 87
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 87
cataccccga aaatgttggt tatacc 26
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 88
aggattatgg atgcggttgc tt 22
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 89
tctgagtccc agaggttacc c 21
<210> 90
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 90
gggttgtacg gtagaactgc tatt 24
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 91
tatctcgcac ctgaaacaag ctaa 24
<210> 92
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 92
attttatttt tacgttgtta gatatgggga gt 32
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 93
ttaattaagc taagccctta ctagaccaa 29
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 94
actgtaaatc taaagacagg ggttagg 27
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 95
catcactata ctactaacag accgcaa 27
<210> 96
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 96
aaaccctagg aagccaattg atatcata 28
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 97
gcatatttca cctccgctac ca 22
<210> 98
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 98
attgatagga catagtggaa gtgagc 26
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 99
cctagaccaa acctacgcca aaa 23
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 100
gcgaaggctt ctcaaatcat gaaaa 25
<210> 101
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 101
gaagaacccg tatacataaa atctagacaa aa 32
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 102
gagggcgtga tcatgaaagg t 21
<210> 103
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 103
atactacggt caatgctctg aaatct 26
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 104
gggggtaatt atggtgggcc 20
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 105
aaacacaaac taccacctac ctcc 24
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 106
tgttttgagg ttagtttgat tagtcattgt 30
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 107
cctcggactc ctgcctca 18
<210> 108
<211> 31
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 108
atggtttcga taataactag tatggggata a 31
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 109
ccacacacca cctgtccaaa 20
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 110
tagactatgg tgagctcagg tgat 24
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 111
cggcatctac ggctcaacat 20
<210> 112
<211> 35
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 112
gttaacggta ctatttatac taaaagagta agacc 35
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 113
taccacaact caacggctac atag 24
<210> 114
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 114
gctaggatga tgattaataa gagggatga 29
<210> 115
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 115
tacccctcac aatcatggca ag 22
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 116
aataggaagt atgtgcctgc gtt 23
<210> 117
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 117
gctcactaaa cattctacta ctcactct 28
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 118
tgttttgtca gggggttgag aat 23
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 119
cgtagtaaca gccattctca tcca 24
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 120
acagagagtt ctcccagtag gttaa 25
<210> 121
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 121
caagaagtta ttatctcgaa ctgacactg 29
<210> 122
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 122
cgatgaacag ttggaatagg ttgttag 27
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 123
ccgtatcggc gatatcggtt t 21
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 124
gctacaacta tagtgcttga gtgga 25
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 125
agtctgcgcc cttacacaaa at 22
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 126
tggtgaggga ggttgaagtg a 21
<210> 127
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 127
caaaaaggca taattaaact ttacttcctc tc 32
<210> 128
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 128
gtggtaaact ttaatagtgt aggaagctg 29
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 129
ggatactcct caatagccat cgc 23
<210> 130
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 130
aatgatgtat gctttgtttc tgttgagt 28
<210> 131
<211> 34
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 131
attaaccccc taataaaatt aattaaccac tcat 34
<210> 132
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 132
attggcgtga aggtagcgg 19
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 133
ataatcccca tcctccatat atccaaac 28
<210> 134
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 134
tatactacaa ggacaggccc atttg 25
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 135
atggggaagc agatttgggt ac 22
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 136
gcagttgatg tgtgatagtt gaagg 25
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 137
ttcccctccc actcccatac 20
<210> 138
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 138
taatcttact aagagctaat agaaaggcta gg 32
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 139
tagcctagcc acaccccc 18
<210> 140
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 140
agatatgtta aagccacttt cgtagtcta 29
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 141
agaacactac gagccacagc 20
<210> 142
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 142
gctatcgtag ttttctgggg tagaa 25
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 143
ggtgatagct ggttgtccaa gat 23
<210> 144
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 144
aattgggtgt gaggagttca gttatat 27
<210> 145
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 145
agatcaaaac actgaactga caattaaca 29
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 146
ggtaccgcgg ccgttaaa 18
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 147
cgggcatgac acagcaaga 19
<210> 148
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 148
ctgttatccc tagggtaact tgttcc 26
<210> 149
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 149
accccctggt caacctcaa 19
<210> 150
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 150
tcagaggtgt tcttgtgttg tgat 24
<210> 151
<211> 17
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 151
ccccttcgac cttgccg 17
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 152
ggaatcgggg gtatgctgtt 20
<210> 153
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 153
attccccctc aaacctaaga aatatgt 27
<210> 154
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 154
ggggattaat tagtacggga aggg 24
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 155
gattaaacca aacccagcta cgc 23
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 156
ggagaggagg gtggatggaa 20
<210> 157
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 157
aacctctact tctacctacg cctaa 25
<210> 158
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 158
tgcagaaatt aagtattgca acttactga 29
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 159
ctggagtcct aggcacagc 19
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 160
gagtaggaga gagggaggta agag 24
<210> 161
<211> 27
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 161
gtagacctaa ccatcttctc cttacac 27
<210> 162
<211> 15
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 162
ctccggcggg gtcga 15
<210> 163
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 163
cccatattgt aacttactac tccggaaa 28
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 164
agagcactgc agcagatcat tt 22
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 165
tttcatgatt tgagaagcct tcgc 24
<210> 166
<211> 35
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 166
aaagttatga aatggttttt ctaatacctt tttga 35
<210> 167
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 167
taggctaaat cctatatatc ttaatggcac at 32
<210> 168
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 168
gggagggcga tgaggact 18
<210> 169
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 169
gatccctccc ttaccatcaa atcaa 25
<210> 170
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 170
ggggacagct catgagtgc 19
<210> 171
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 171
caaatatctc atcaacaacc gactaatca 29
<210> 172
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 172
cgctcataag gggatggcc 19
<210> 173
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 173
caccccttat ccccatacta gttattatc 29
<210> 174
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 174
aggcttacta gaagtgtgaa aacgt 25
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 175
atagtaaaac ccagcccatg acc 23
<210> 176
<211> 31
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 176
cttctgaggt aataaatagg attatcccgt a 31
<210> 177
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 177
aacacatccg tattactcgc atca 24
<210> 178
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 178
gaggaaagtt gagccaataa tgacg 25
<210> 179
<211> 31
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 179
ttatgataat catatttacc aaatgcccct c 31
<210> 180
<211> 18
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 180
cgcaggcggc aaagacta 18
<210> 181
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 181
actaccactg acatgacttt ccaaa 25
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 182
ttcgtgatag tggttcgctg g 21
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 183
ccacacttat ccccaccttg g 21
<210> 184
<211> 35
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 184
gtatctttac tataaaagct attgtgtaag ctagt 35
<210> 185
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 185
ctctacatat ttaccacaac acaatggg 28
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 186
tgagttagca gttcttgtga gctt 24
<210> 187
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 187
catgcacact actataacca ccctaa 26
<210> 188
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 188
tatggagaag tagtctagtt tgaagcttag 30
<210> 189
<211> 35
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 189
atcagttctt caaatatcta ctcattttcc taatt 35
<210> 190
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 190
agttggagtg taggataaat catgctaa 28
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 191
cacaaacgcc tgagccctat 20
<210> 192
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 192
ttttaggtag agggggattg ttgttt 26
<210> 193
<211> 25
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 193
tccaacatac tcggattcta cccta 25
<210> 194
<211> 28
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 194
gggaataggt tatgtgatta ggagtagg 28
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 195
ccctgacccc tctccttcat 20
<210> 196
<211> 30
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 196
ttaatttatt tagggggaat gatggttgtc 30
<210> 197
<211> 22
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 197
ttcataggct atgtcctccc gt 22
<210> 198
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 198
ctagggggtt gtttgatccc g 21
<210> 199
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 199
caccagacct cctaggcga 19
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 200
tgattggctt agtgggcgaa ata 23
<210> 201
<211> 32
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 201
ctaatcctaa taccaactat ctccctaatt ga 32
<210> 202
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 202
tagcggttgt tgatgggtga g 21
Claims (3)
1.一种人线粒体基因组文库构建的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）线粒体DNA的SNP检测前扩增整个线粒体DNA全长，采用两段法扩增整条线粒体DNA，具有重叠特性的两条线粒体DNA扩增引物序列分别为：样本前向引物1：AAATCTTACCCCGCCTGTTT，反向引物1：AATTAGGCTGTGGGTGGTTG；前向引物2：GCCATACTAGTCTTTGCCGC，反向引物2：GGCAGGTCAATTTCACTGGT；
（2）分3个反应池进行多重PCR反应，3个反应池的多重PCR所需要的探针组分为：每个反应池的探针数分别为33对，第一反应池的探针序列如SEQ:NO.5-70所示，第二反应池的探针序列如SEQ:NO.71-136所示，第三反应池的探针序列如SEQ:NO.137-202所示；所述探针序列的长度为16~35bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp~80bp的重叠；
（3）连接接头特异性标记反应探针序列分别按照96次反应探针设计，标记为PE1.0和PE2.0；
（4）连接接头序列，其中，使用的多重探针反应液和连接接头的反应液，包括5×多重缓冲液，10mM dNTP，引物，2U/μl多重聚合酶。
2.根据权利要求1所述的一种人线粒体基因组文库构建的方法，其特征在于，步骤（3）中的所述标记是水溶性维生素B的生物素标记。
3.根据权利要求1所述方法构建的人线粒体基因组文库在制备全面检测线粒体DNA的SNP位点的试剂盒中的应用。
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