ES2275451T1 - Secuencias nucleotidicas de genoma de retrovirus de tipo vih-1, vih-2 y vis y su aplicacion en particular para la amplificacion de genomas de dichos retrovirus y para el diagnostico in vitro de infecciones debidas a dichos virus. - Google Patents

Secuencias nucleotidicas de genoma de retrovirus de tipo vih-1, vih-2 y vis y su aplicacion en particular para la amplificacion de genomas de dichos retrovirus y para el diagnostico in vitro de infecciones debidas a dichos virus. Download PDF

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Abstract

Oligonucleótido caracterizado porque su secuencia consiste en: i) una secuencia específica del gen gag o del gen pol, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºCñ1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, o ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i.

Claims (18)

1. Oligonucleótido caracterizado porque su secuencia consiste en:
i) una secuencia específica del gen gag o del gen pol, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºC\pm1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, o
ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i.
2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque su secuencia nucleotídica está modificada con relación a la secuencia del gen gag o del gen pol de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac.
3. Oligonucleótido que comprende una conservación de al menos 5 bases de cada lado del cebador con relación a la secuencia de un cebador oligonucleotídico tal como se describe en la reivindicación 1 ó 2, y que comprende en su parte media modificaciones con relación a la secuencia de un cebador oligonucleotídico según la reivindicación 1 ó 2, y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac.
4. Oligonucleótido específico del gen gag según la reivindicación 1, elegido entre:
1
5. Oligonucleótido específico del gen pol según la reivindicación 1, elegido entre:
3
6. Par de cebadores oligonucleotídicos para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag o del gel pol de virus del tipo VIH-1, VIH-2 y VIS, consistiendo cada uno de los cebadores en:
i) una secuencia específica del gen gag o del gen pol, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºC\pm1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, o
ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i.
7. Par de cebadores según la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de al menos un cebador oligonucleotídico está modificada con respecto a la secuencia del gen gag o del gen pol de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac.
8. Par de cebadores según la reivindicación 6 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o SIV, consistiendo los cebadores en:
i. al menos una mezcla elegida del grupo de mezclas de secuencias codificantes siguientes:
Mmy1: mezcla constituida por las secuencias 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3', 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3'
MMy2: mezcla constituida por las secuencias 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' y 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3', 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3',
MMy4bis: mezcla constituida por las secuencias 5'-CAT CAA GCA GCC AGT CAA AG-3', 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3',
MMy28: mezcla constituida por las secuencias 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3', 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3',
\vskip1.000000\baselineskip
y al menos una mezcla elegida del grupo de mezclas de secuencias no codificantes siguiente:
MMy3: mezcla constituida por las secuencias 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5', 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5',
MMy4: mezcla constituida por las secuencias 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5', 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5',
MMy4B: mezcla constituida por las secuencias: 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5', 3'-CTC TGC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5',
MMy28bis: mezcla constituida por las secuencias 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5', 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5', 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'.
9. Par de cebadores según la reivindicación 8 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
10. Par de cebadores según la reivindicación 6 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen pol de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, consistiendo los cebadores en:
i. al menos una mezcla elegida del grupo de mezclas de secuencias codificantes siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
y al menos una mezcla elegida del grupo de mezclas de secuencias no codificantes siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
11. Par de cebadores según la reivindicación 10 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen pol de virus de tipo VIH-1, VIH-2 y VIS, consistente en:
9
12. Oligonucleótido o par de cebadores según la reivindicación 1 a 11 susceptible de hibridar con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac en un tampón de composición Tris-HCl 50 mM, pH 8,9, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, MgCl_{2} 5 mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM, gelatina 0,25 mg/ml.
13. Procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag o del gen pol de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS, realizado a partir de una muestra biológica, comprendiendo este procedimiento principalmente las etapas siguientes:
a) una etapa de extracción del ácido nucleico que se va a detectar perteneciente al genoma de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente citada y, llegado el caso, una etapa de tratamiento con ayuda de una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN,
b) un ciclo que comprende las etapas siguientes:
desnaturalización del ácido nucleico bicatenario que se va a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico monocatenario,
- hibridación de cada una de las cadenas de ácido nucleico obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente con al menos un cebador o un par de cebadores según una de las reivindicaciones 1 a 12, mediante la puesta en contacto de las cadenas anteriormente citadas con al menos un par de los cebadores anteriormente citados,
- formación a partir de los cebadores de ADN complementarios con las cadenas con las que hibridan en presencia de una ADN polimerasa y de cuatro trifosfatos de nucleósidos (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos bicatenarios que se van a detectar que en la etapa de desnaturalización precedente,
repitiéndose este ciclo una serie de veces determinada para obtener dicha secuencia nucleica que se va a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección,
c) una etapa de detección de la presencia eventual del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 y/o VIS en la muestra biológica.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la etapa de desnaturalización se realiza en presencia de un(os) par(es) de cebadores según una de las reivindicaciones 7 a 12.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque se realiza en las condiciones siguientes:
a) hibridación: se ponen los cebadores (1 \mul de una solución 40 \muM de cada cebador) en presencia de matriz de ADN (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, después se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de matriz de ADN y de cebadores en agua que contiene hielo. Los cebadores deben utilizarse a una concentración final en la etapa de amplificación siguiente de 0,8 \muM cada uno;
b) amplificación: se añaden al medio precedente los 4 dNTP, utilizándose cada uno a 0,5 \muM en la solución final (50 \mul), y una unidad de polimerasa Taq para un medio de reacción de 50 \mul.
16. Aplicación del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 en el diagnóstico in vitro de infección de un individuo por un virus de tipo VIH-1, VIH-2 o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, VIS).
17. Kit para la puesta en práctica de un procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende:
i) al menos un cebador o un par de cebadores oligonucleotídicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
ii) reactivos apropiados para la utilización del ciclo de operaciones de amplificación, especialmente ADN polimerasa, cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y tampón 10 x tal como se describe en la reivindicación 12,
iii) una (o más) sondas, que puede estar marcada, capaz de hibridar con la(s) secuencia(s) de ácido nucleico amplificada(s) que se van a detectar.
18. Utilización de al menos un cebador o de un par de cebadores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag o del gen pol de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS.
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