ES2262166T3 - Sintesis de proteinas o polipeptidos codificados por un secuencia nucleotidica vih-1, vih-2 o siv. - Google Patents

Sintesis de proteinas o polipeptidos codificados por un secuencia nucleotidica vih-1, vih-2 o siv.

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ES2262166T3 ES97110543T ES97110543T ES2262166T3 ES 2262166 T3 ES2262166 T3 ES 2262166T3 ES 97110543 T ES97110543 T ES 97110543T ES 97110543 T ES97110543 T ES 97110543T ES 2262166 T3 ES2262166 T3 ES 2262166T3
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Abstract

Procedimiento de síntesis de una proteína o de un polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica del virus VIH-1, , VIH-2 o SIV caracterizado por comprende las siguientes etapas: a. síntesis de la secuencia nucleotídicas por un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleotídicas de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o SIV, con la ayuda de al menos dos cebadores oligonucleotídicos cuyas secuencias consisten cada una en i. una secuencia específicas del gen gag elegida en una región conservada entre los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac capaces de hibridar a una temperatura de 60ºC ñ 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac o ii. Una secuencia complementaria de una secuencia tal como la definida en i.; y b. Recuperación de la secuencia nucleotídica así como amplificada y traducción en proteína.

Description

Síntesis de proteínas o polipéptidos codificados por una secuencia nucleotídica VIH-1, VIH-2 o SIV.
La presente invención se refiere a las secuencias nucleotídicas utilizables para la realización de técnicas de amplificación de secuencias nucleicas específicas de los retrovirus de la inmunodeficiencia humana del tipo VIH o del retrovirus de inmunodeficiencia del mono del tipo SIV.
El aislamiento y caracterización de los retrovirus agrupados bajos los nombres VIH-1 y VIH-2 han sido descritos en las solicitudes de patente europea nº 85/905.513.9 (VIH-1)y nº 87/400.151.4 y EP 0269520 (VIH-2. Estos retrovirus se han aislado en muchos enfermos que presentan síntomas de linfoadenopatía o de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Los retrovirus del tipo VIH-2 y del tipo VIH-1 se caracterizan por un tropismo por los linfocitos T4 humanos y por un efecto citopatógeno respecto a estos linfocitos mientras que se multiplican produciendo entre otras, poliadenopatías generalizadas y persistentes o SIDA.
Otro retrovirus, denominado SIV-1, esta denominación sustituye a la denominación anterior conocida como STLV-III, ha sido aislado del mono macaco rhesus (M.D. DANIEL et al. Science, 228, 1201 (1985); N.L. LETWIN et al. Science, 230, 71 (1985) bajo el nombre de "STLV-IIImac").
Otro retrovirus, denominado "STLV-III_{AGM}" (o SIV_{AGM}) ha sido aislado de los monos verdes salvajes. Pero al contrario de lo que sucede con los virus presentes en el mono macaco rhesus, la presencia del STLV-III_{AGM} no parece inducir una enfermedad del tipo SIDA en el mono verde africano.
Por comodidad estos virus se denominarán en los sucesivo con la expresión SIV (la expresión SIV es la abreviatura inglesa de "Simian Inmunodeficiency Virus" (Virus de inmunodeficiencia del mono) eventualmente seguida de una abreviatura que designan la especie de mono en la que están presentes, por ejemplo "Mac" para el macaco o "AGM" para el mono verde africano (abreviatura de "African Green Monkey").
Una cepa de retrovirus SIV-1Mac ha sido depositada en el C.N.C.M. el 7 de febrero de 1986 bajo el número I-521.
El objetivo del estudio de los retrovirus VIH-1 y VIH-2 ha conducido igualmente a la obtención de secuencias de ADN complementarias (ADNc) del ARN de su genoma. La secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-2 (VIH-2 Rod) ha sido depositada el 21-2-1986 en el C.N.C.M. bajo el número nº I-522, bajo el nombre de referencia LAV-2 Rod.
Igualmente, WAIN HOBSON, SONIGO, COLE, DANOS y ALIZON en Cell (enero de 1985) han descrito la secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-1.
Igualmente por comodidad, los virus del tipo VIH-1 y VIH-2 se designarán a veces en lo sucesivo con la expresión VIH.
Los procedimientos de diagnóstico in vitro de las infecciones con los virus del tipo VIH-1 o VIH-2 que actualmente existen se basan en la detección de anticuerpos ANTI-VIH-1 o ANTI-VIH-2 eventualmente presentes en una muestra biológica (biopsia) o en un fluido biológico, por ejemplo en un suero obtenido, a partir del paciente de estudio, poniendo en contacto este fluido biológico con extractos o antígenos del VIH-1 o del VIH-2, en condiciones que permiten la producción eventual de una reacción inmunológica de estos extractos o antígenos con estos anticuerpos.
Tales procedimientos de diagnóstico tienen el riesgo de dar falsos negativos, concretamente en el caso de una infección reciente de un individuo con el virus del tipo VIH.
Las técnicas de amplificación génica representan una ayuda considerable para la puesta a punto de procedimientos diagnósticos in vitro especialmente sensibles de enfermedades virales. Entre estas técnicas de amplificación génica, se puede citar la técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa), como la descrita en las solicitudes de patente europea nº 86/302.298.4 de 27-3-1986 y nº 87/300.203.4 del 9-1-1987 o incluso la técnica citada "Q\betareplicasa" descrita en Biotechonology, vol. 6, página 1197 (octubre 1988) y la que funciona mediante una ARN polimerasa (T7RNA polimerasa) descrita en la solicitud de patente internacional nº WO89/01050. Estas técnicas permiten mejorar la sensibilidad de detección de los ácidos nucleicos de los virus y requieren de la utilización de cebadores de síntesis
específicos.
Para la búsqueda de virus del tipo VIH la selección de cebadores constituye un problema. En efecto, debido al hecho de la gran variabilidad de secuencias nucleotídicas del genoma viral, un cebador para una secuencia conocida de un aislado dado de un virus del tipo VIH puede fallar en la amplificación de determinadas variantes virales del tipo VIH. Por otra parte, incluso si se elige un cebador en una región conservada del genoma de un virus VIH para otra, su "buen funcionamiento" no está asegurado y puede dar lugar a malos rendimientos de amplificación.
La presente invención proporciona precisamente cebadores oligonucleotídicos que permiten, entre otros, la amplificación de todos los virus del tipo VIH y SIV, con rendimientos considerados como máximos en el estado actual de la técnica y, sobre todo, evitándose la presencia de numerosas bandas específicas.
Los cebadores utilizados en la presente invención son a la vez específicas de los virus del genoma VIH-1 y/o de los virus de los grupos VIH-2 y SIV y son insensibles a las variaciones del genoma de estos virus.
La presente invención tiene por objeto la utilización de los cebadores oligonucleotídicos de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, utilizables para la amplificación genómica de los virus del tipo VIH-1 y/o del tipo VIH-2 y SIV.
La invención aplica toda secuencia nucleotídica caracterizada porque su secuencia:
- o se elige entre aquellas que están contenidas en una de las secuencias nucleotídicas que comprenden el gen gag de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac, y más particularmente entre aquellos contenidos en las secuencias nucleotídicas definidas a continuación,
- o (especialmente por las secuencias más largas) contiene una de las secuencias nucleotídicas anteriormente citadas procedentes del VIH-1 Bru o VIH-1 Mal o VIH-1 Eli o VIH-2 Rod o SIVMac, o contiene una secuencia nucleotídicas complementaria de una de estas últimas secuencias, entendiéndose que los nucleótidos suplementarios eventuales que "desbordan" la secuencia nucleotídicas del género en cuestión, en el lado de los extremos 3' o 5', coinciden preferentemente con aquellos que se encuentran situados en los extremos 5' o 3' correspondientes al mismo sentido mismo de la secuencia completa de los virus de tipo VIH-1, VIH-2 o del VIS Mac, anteriormente mencionados,
- o si esta secuencia nucleotídica no es idéntica a una de las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas, o no es complementaria de una de estas secuencias, es al menos susceptible de hibridar con una secuencia nucleotídica procedente del virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli y/o con una secuencia nucleotídica procedente del virus VIH-2 Rod o SIV Mac anteriormente mencionada. La hibridación se puede efectuar a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC, (preferentemente 60ºC \pm 0,5ºC) para un rendimiento máximo.
La numeración de los nucleótidos mencionados posteriormente corresponde a la utilizada en el manual de referencia "Human Retrovirus and AIDS 1989" editado por el "Los Alamos National Laboratory New Mexico, USA".
Las secuencias de los virus VIH-1 Mal y VIH-1 Eli han sido descritas por MONTAIGNER, SONIGO, WAIN-HOBSON y ALIZON en la solicitud de patente europea nº EP 0 253 701.
Las secuencias de la invención se sintetizan en un sintetizador comercializado por Applied Biosystems (procedimiento fosforamidita) y en cualquier otro aparato que utilice un procedimiento similar.
La invención se refiere más especialmente a la utilización de las secuencias nucleotídicas caracterizadas por los encadenamientos nucleotídicos siguientes (representados en los sentidos 5' -> 3'; las iniciales "S" y "AS" indican si el oligonucleótido es sentido o antisentido, es decir, si el oligonucleótido está orientado respectivamente en el sentido 5' o -> 3' o en el sentido 3' o -> 5'):
1º) las secuencias comunes a los genomas del virus VIH-1, VIH-2 y SIV (las series de cifras espaciadas con un trazo indican la posición de los nucleótidos sobre los genomas correspondientes a los virus VIH-1, Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV):
\bullet
secuencias específicas del gen gag del genoma de los virus anteriormente mencionados (gen que codifica para un grupo de antígenos específicos del nucleoide de estos virus).
Pueden introducirse determinadas variantes sobre determinadas posiciones de las secuencias nucleotídicas citadas posteriormente, sin que las propiedades de hibridación de estas secuencias nucleotídicas con los genes de los virus del tipo VIH y/o SIV se vean afectadas. Las secuencias nucleotídicas que llevan estas variantes están representadas debajo de las secuencias nucleotídicas iniciales de las cuales derivan por sustitución de una o varias bases. Las bases modificadas en relación a las de las secuencias nucleotídicas iniciales están indicadas en mayúscula en vertical con las posiciones correspondientes a las bases que han sido sustituidas en estas secuencias iniciales, mientras que las bases de las secuencias iniciales que no han podido ser reemplazadas en las secuencias que llevan estas variantes están indicadas por puntos.
La síntesis de cebadores se hace utilizando todas las variantes simultáneamente. En los ensayos se utiliza la mezcla de todas las variantes para una secuencia dada.
100
La invención tiene igualmente por objeto la utilización en el procedimiento de síntesis de las secuencias (o cebadores) que poseen una estructura nucleotídica complementaria a las de los cebadores definidos a continuación.
La invención se refiere igualmente a la utilización en el procedimiento de síntesis de las secuencias nucleotídicas que presentan determinadas mutaciones en relación a las definidas anteriormente sin que las propiedades de hibridación, como las definidas anteriormente, de estas secuencias se modifiquen. El porcentaje de nucleótidos diferentes de los que constituyen las secuencias descritas anteriormente, sin afectar a las propiedades de hibridación de las secuencias de la invención, puede llegar hasta el 40%.
De forma general, en el caso de un cebador (primer) en sentido (S), se tolerarán un mayor número de mutaciones en el extremo 5' que en el extremo 3' del cebador, debiéndose hibridar perfectamente el extremo 3' con una hebra determinada de una secuencia nucleotídica para permitir la amplificación de esta secuencia. En el caso de un cebador antisentido (AS), la tolerancia está permitida en el extremo 3'.
Los cebadores como los definidos anteriormente pueden comprender una conservación de al menos 5 bases de cada lado, siendo la parte intermedia la que lleva las modificaciones, sin que las propiedades de hibridación anteriores se vean modificadas.
Una de las características de los cebadores oligonucleotídicos utilizados en la invención es dar una banda de amplificación clara, desprovista generalmente de bandas no específicas, utilizando las indicaciones técnicas de utilización descritas en la presente invención. Este hecho es debido a la longitud los cebadores, los cuales pueden tener hasta 27 bases, lo que aumenta la especificidad de hibridación, así como las condiciones drásticas de utilización que permiten eliminar las asociaciones parásitas. La especificidad para cada tipo de virus es función, además del porcentaje de homología con la matriz de referencia, de la longitud de los cebadores, pudiendo llegar hasta 40 bases para un rendimiento aceptable.
La invención se refiere igualmente a la utilización de los cebadores como los descritos anteriormente unidos a nivel de su extremo 5' a un promotor para la realización de un procedimiento de amplificación genómica mediante la síntesis de múltiples copias de ADN o ARN, como la descrita en la solicitud de patente europea nº 88/307.102.9 de 1-8-1988.
La invención tiene claramente por objeto la utilización de los cebadores descritos anteriormente para la realización de un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2, y/o SIV. El procedimiento de amplificación génica comprende principalmente las siguientes etapas:
- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar que pertenece al genoma del virus del tipo VIH-1, VIH-2 o SIV eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente mencionada, y dado el caso, una etapa de tratamiento mediante una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico, si éste último está en forma de ARN, con el fin de obtener un ácido nucleico de doble hebra (designándose esta última etapa como etapa de retrotranscripción del ARN viral),
- un ciclo que comprende las etapas siguientes:
\bullet
desnaturalización del ácido nucleico de doble hebra a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico de hebra simple,
\bullet
hibridación de cada una de las hebras de ácido nucleico, obtenidas durante la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un cebador según la invención, mediante la puesta en contacto de las hebras anteriormente mencionadas con al menos una par de cebadores según la invención en las condiciones de hibridación definidas más abajo,
\bullet
la formación a partir de los cebadores de los ADN complementarios de las hebras sobre las cuales hibridan en presencia de un agente de polimerización (ADN polimerasa) y de cuatro nucleósidos trifosfato (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos de doble hebra a detectar que en la etapa de desnaturalización precedente, repitiéndose este ciclo un número de veces determinado para obtener dicha secuencia nucleica a detectar, eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección.
La etapa de hibridación descrita anteriormente se realiza ventajosamente a 60ºC durante 1 minuto y 30 segundos en tampón "10 X buffer", cuya composición (en concentración final de utilización) se indica posteriormente.
En efecto, los genomas de los virus VIH y SIV se presentan en forma de ARN o de ADN en función de la localización del virus en el organismo.
Cuando el virus está situado en el interior de las células del organismo, concretamente en el interior de las células sanguíneas, su ARN se vuelve a copiar en ADN mediante una transcriptasa inversa. Por el contrario, el genoma del virus de tipo VIH en medio extracelular, concretamente en la sangre, está en forma de ARN.
La etapa de extracción del ADN viral contenido en las células de la muestra biológica preconizada por los inventores, distinta del procedimiento clásico del fenol cloroformo, presenta las etapas siguientes:
\bullet suspensión del residuo celular en 0,5 ml de agua pirolizada en un chupón Potter.
\bullet ruptura de las células por "ida y vuelta",
\bullet adición de Triton X100 para 1 concentración final de 0,1%,
\bullet desnaturalización con calor durante 15 a 25 minutos a 100ºC,
\bullet centrifugación corta para eliminar los desechos celulares,
\newpage
\bullet precipitación del ADN durante la noche a -20ºC añadiendo 2,5 volúmenes de etanol absoluto y 10% del volumen final de acetato sódico 3 molar. A continuación el ADN se recupera, después se resuspende en agua y después de haber sido lavado 2 veces con etanol a 70ºC conjuntamente el ADN y el ARN, lo que permite la detección del mensaje genómico de los virus de los tipos VIH y VIS utilizando el procedimiento denominado "PCR directe ADN" o por el denominado "PCR-ARN".
La etapa de extracción del ARN viral se realiza generalmente según el procedimiento clásico conocido por el experto en la técnica.
Después de la extracción del ARN, es necesario llevar a cabo una etapa suplementaria de transformación del ARN monohebra en ADN de doble hebra, mientras que el diagnóstico in vitro de la invención se realiza a partir de muestras biológicas que contienen los virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV, cuyos genomas están en forma de ARN.
Esta transformación del ARN en ADN se realiza mediante tratamiento del ARN obtenido después de la extracción de la muestra biológica, especialmente del suero, en un medio apropiado mediante una transcriptasa inversa.
La etapa de retrotranscripción del ARN viral se realiza de la manera siguiente:
- 10 \mug del ARN extraído resuspendido en agua se pone en presencia de un par de cebadores con una concentración de 40 \muM cada uno de ellos, en un volumen final de 40 \mul.
El conjunto se desnaturaliza a 100ºC durante 10 minutos, después se sumerge en agua helada,
- se añaden 10 \mul de la mezcla siguiente: 5 \mul del tampón "10 X buffer" descrito posteriormente + 1 unidad de transcriptasa inversa (de AMV (Avian Myeloblastosis Virus) o del MuMLV (Moloney Leukemia Virus)) + 1 unidad de Taq polimerasa + 1 \mul de mezcla de los 4 dNTP, a razón de 25 mM cada uno + agua c.s.p. 10 \mul. El volumen final es de 50 \mul.
Esta reacción tiene lugar en dos etapas:
- a) primera etapa: fabricación del ADNc por acción de la transcriptasa inversa a 42ºC durante 13 minutos,
- b) segunda etapa: amplificación génica clásica: se calienta a 95ºC durante 3 minutos para destruir la transcriptasa inversa y permitir la etapa de deshibridación/hibridación, a continuación se inicia el ciclo descrito anteriormente para la amplificación génica.
La etapa de desnaturalización se realiza en presencia de un cebador(es) (o primers) de la invención. En efecto, como se ha precisado anteriormente, una de las características de los oligonucléotidos (o primers) de la invención es dar una banda de amplificación clara, desprovista generalmente de bandas específicas, utilizándose éstas en las condiciones siguientes:
- hibridación: los cebadores (1 \mul de una solución de 40 \mumolar) de cada cebador) se ponen en presencia del ADN molde (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, a continuación se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de ADN-molde y los cebadores en el agua con hielo con el fin de aumentar la tasa de reasociación del ADN molde/cebadores. Los cebadores deben utilizarse en una concentración final en la etapa de amplificación siguiente de 0,8 \mum cada uno.
- amplificación: se añade al medio anterior los 4 dNTP, cada uno de ellos a 0,5 \mumolar en solución final (50 \mul) y una unidad de Taq-polimerasa para un medio de reacción de 50 \mul; esta etapa se realiza en un tampón de amplificación de la presente invención generalmente denominado "10 X buffer", cuya composición (cuando está diluida a 1/10) es la siguiente: Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM; (NH_{4})_{2}SO_{4}: 15 mM; MgCl_{2}: 5 mM; \beta-mercapto-etanol: 10 mM, gelatina: 0,25 mg/ml. Se añaden 5 \mul de este tampón y agua c.s.p. 50 \mul al medio anterior.
Los ciclos de amplificación se realizan de la manera siguiente: 30 a 40 ciclos compuestos de:
94ºC durante 10 segundos (desnaturalización),
60ºC durante 1 minuto 30 (hibridación),
78ºC durante 1 minuto 30 (elongación).
A todo ello le sigue un ciclo único a 78ºC durante 15 minutos.
La precisión de las temperaturas indicadas a aproximadamente \pm 0,3ºC, así como su estabilidad durante los diferentes ciclos, representan condiciones esenciales para la obtención de rendimientos máximos, así como la ausencia de bandas específicas.
\newpage
La concentración óptima de ADN es de 100 a 300 ng para el ADN genómico extraído de las células (de pacientes o en cultivo, de mamíferos o de otros).
Se sobrentiende que las condiciones anteriores representan condiciones óptimas para un medio de reacción final de 50 \mul y que estas condiciones pueden modificarse en función del volumen final del medio de reacción.
El agente de polimerización utilizado en la etapa de elongación del ciclo es una ADN polimerasa termoestable, concretamente la Taq polimerasa, la amplificasa de la empresa Appligéne como ADN polimerasa termoestable disponible comercialmente.
De manera general, el ciclo del procedimiento de amplificación génica de la invención se repite entre 30 y 40 veces.
Las parejas de cebadores utilizables a título de ejemplo para el procedimiento de amplificación génicas son las siguientes:
- MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy4bis-MMy28bis para el gen gag.
En cualquier caso, las combinaciones entre cebadores "S" y "AS" descritos anteriormente no representan limitaciones y pueden variarse según el deseo del usuario.
En la siguiente tabla, a título de ejemplo, se indican las dimensiones de los fragmentos nucleotídicos sintetizados con la ayuda de las parejas de cebadores anteriormente mencionados.
(las cifras indicadas en las tablas siguientes representan el número de nucleótidos de los fragmentos sintetizados y "las rayas" indican que las parejas de cebadores ensayados no permiten la caracterización de las cepas virales correspondientes.
TABLA I
gag gag
:MMy1-MMy3:MMy1-MMy4:MMy2-MMy4:MMy4bis-MMy28bis:
HIV1-BRU: 265 750 532 671
HIV1-MAL: 282 785 556 671
HIV1-ELI: 265 750 538 674
HIV2-ROD: 354 845 544 663
SIV: 343 844 544 668
La invención tiene igualmente por objeto la aplicación de los oligonucleótidos como los descritos anteriormente y que incluyen azúcares en conformación \alpha. Dichos oligonucleótidos presentan la característica de invertir el sentido de la doble hélice formada con el molde (hebra de genoma del virus), pasando así esta doble hélice del estado "S" al estado "AS".
La invención se refiere igualmente a la aplicación de los oligonucleótidos descritos anteriormente, entre los cuales algunos nucleótidos están metilados y/o tienen uno o varios átomos de azufre, concretamente sobre las adeninas. Tales oligonucléotidos poseen la característica de aumentar la estabilidad de la doble hélice y, por consiguiente, se hibridan mejor con la hebra de ADN a amplificar.
La invención se refiere igualmente a la aplicación de los oligonucléotidos como los descritos anteriormente y que están en la forma conocida como "de bases modificadas", que poseen nucleótidos sobre las cuales están unidos de forma covalente agentes cromóforos (moléculas aromáticas planas, como el naranja acridina), concretamente según el procedimiento descrito en el artículo de C. Hélène publicado en "La vie des Sciences", serie general, tomo 4, nº 1, página 17-37. Dichos oligonucleótidos poseen la característica de ser fácilmente detectables, concretamente por fluorescencia.
La invención se refiere también a la utilización de los cebadores de la invención indicados anteriormente para la realización de un procedimiento de síntesis de proteínas codificadas por las secuencias nucleotídicas amplificadas mediante la ayuda de estos cebadores.
\newpage
El procedimiento de síntesis de una proteína o de un polipétido codificado por una secuencia nucleotídica del virus VIH-1, VIH-2 o SIV según la invención se caracteriza porque comprende las siguientes etapas:
a.
síntesis de la secuencia nucleotídicas por un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleotídicas de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o SIV, con la ayuda de al menos dos cebadores ligonucleotídicos cuyas secuencias consisten cada una en
i.
una secuencia específicas del gen gag elegida en una región conservada entre los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac capaces de hibridar a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac o
ii.
Una secuencia complementaria de una secuencia tal como la definida en i.; y
b.
Recuperación de la secuencia nucleotídica así como amplificada y traducción en proteína.
Un procedimiento de síntesis particular es el aquel en el cual la secuencia de los cebadores tiene al menos el 60% de identidad con la secuencia del gen gag de un virus VIH-1 Bru, o VIH-1 Mal, o VIH-1 Eli, o VIH-2 Rod o SIV
Mac.
Otro procedimiento de síntesis particular según la invención está caracterizado porque los cebadores oligonucleotídicos comprenden una conservación de al menos 5 bases de cada lado del cebador respecto de la secuencia del gen gag de un virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, o VIH-2 Rod o SIV Mac, y guardan las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac.
Otro procedimiento según la invención se caracteriza porque el procedimiento de amplificación génica comprende las siguientes etapas:
a. una etapa de extracción del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus del tipo VIH-1, VIH-2 o SIV, y eventualmente una etapa de tratamiento mediante una transcriptasa reversa de dicho ácido nucleico, si éste último está en forma de ARN.
b. un ciclo que comprende las etapas siguientes:
i.-
desnaturalización del ácido nucleico de doble hebra a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico de hebra simple,
ii.-
hibridación de cada una de las hebras de ácido nucleico, obtenidas durante la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un cebador nucleotídico mediante la puesta en contacto de las hebras anteriormente mencionadas con al menos un par de cebadores según una de las reivindicaciones 1 o 2,
iii.-
formación a partir de los cebadores, de los ADN complementarios de las hebras sobre las cuales dichos cebadores hibridan en presencia de un ADN polimerasa y de cuatro nucleósidos trifosfato (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos de doble hebra que en la etapa de desnaturalización precedente,
repitiéndose este ciclo un número de veces determinado para obtener dicha secuencia nucleica en una proporción suficiente para permitir su detección.
Otro procedimiento según la invención se caracteriza porque los al menos dos cebadores oligonucleotídicos tienen secuencias que consisten cada una en:
\newpage
i.-
al menos una secuencia elegida en el siguiente grupo de las secuencias sentido:
\vskip1.000000\baselineskip
1
y al menos una secuencia elegida en el siguiente grupo de las secuencias antisentido:
2
ii.-
una secuencia complementaria de una secuencia tal como la definida en i.; o
iii.-
una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con una de las secuencias definida en i o ii y capaz de hibridar a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac.
Otro procedimiento según la invención se caracteriza porque al menos dos de las siguientes mezclas de cebadores se utilizan para la amplificación:
MMy1: Mezcla constituida por cebadores
3 
\newpage
MMy2: Mezcla constituida por cebadores
4
MMy3: Mezcla constituida por cebadores
5
MMy4: Mezcla constituida por cebadores
6
MMy4B: Mezcla constituida por cebador
7
MMy4Bbis: Mezcla constituida por cebador
8
MMy28: Mezcla constituida por cebador
9
MMy28bis: Mezcla constituida por cebador
10 
\newpage
Otro procedimiento según la invención 12 está caracterizado porque se realiza en las condiciones siguientes:
- para la etapa de hibridación: 1 \mul de una solución de 40 \mumolar de cada cebador se pone en presencia de 100 a 300 ng de ADN-molde para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, y a continuación se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de ADN-molde y los cebadores en el agua con hielo, utilizándose los cebadores en una concentración final en la etapa de amplificación siguiente de 0,8 \mum cada uno.
- para la etapa de amplificación: se añade al medio anterior los 4 dNTP, cada uno de ellos utilizado a 0,5 \mumolar en 50\mul de solución final y una unidad de Taq-polimerasa para un medio de reacción de 50 \mul; esta etapa se realiza en el tampón de amplificación denominado "10 X buffer", que comprende cuando está diluido al 1/10 en la solución final: Tris-HCl, pH = 8,9: 50 mM; (NH_{4})_{2}SO_{4}; 15 mM; MgCl_{2}; 5 mM; \beta-mercaptoetanol; 10 mM; gelatina: 0,25
mg/ml.
Otro procedimiento según la invención se caracteriza porque la etapa de traducción se realiza por transformación de células hospedadoras apropiadas mediante vectores que contienen dichas secuencias amplificadas y recuperación de las proteínas producidas en estas células hospedadoras.
Otro procedimiento según la invención se caracteriza porque los cebadores oligonucleotídicos se eligen entre los siguientes pares de mezclas de cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
a. MMy1-MMy4
MMy1: Mezcla constituida por cebadores
11
MMy4: Mezcla constituida por cebadores
12 
\vskip1.000000\baselineskip
b. MMy2-Mmy4
MMy2: Mezcla constituida por cebadores
13
MMy4: Mezcla constituida por cebadores
14 
\newpage
c. MMy1-MMy3
MMy1: Mezcla constituida por cebadores
15
MMy3: Mezcla constituida por cebadores
16 
\vskip1.000000\baselineskip
d. MMy4Bbis-MMy28bis
MMy4B: Mezcla constituida por cebador
17
MMy28bis: Mezcla constituida por cebador
18
La última etapa de traducción se realiza especialmente por transformación de células hospedadoras apropiadas con la ayuda de vectores que contienen dichas secuencias amplificadas, y recuperación de las proteínas producidas en estas células hospedadoras.
La invención concierne igualmente a los polipéptidos obtenidos de la traducción de las secuencias (o cebadores) nucleotídicos de la invención.
La presente solicitud describe igualmente las composiciones inmunógenas que contienen uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas según los procedimientos descritos anteriormente a partir de los cebadores definidos según la invención, productos de traducción asociados a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente solicitud describe los anticuerpos dirigidos contra uno o varios de los productos de traducción descritos anteriormente (o en otros términos, susceptibles de formar una reacción inmunológica con uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas según la invención, o incluso uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas a partir de los cebadores definidos según la invención).
Un procedimiento de preparación de las secuencias o (cebadores) nucleotídicas descritas anteriormente comprende las siguientes etapas:
- incubación del ADN genómico, aislado a partir de uno de los virus del tipo VIH o SIV anteriormente mencionados, con la ADNasa I, seguida de adición de EDTA y purificación mediante extracción en la mezcla fenol/cloroformo/
alcohol isoamílico (25/24 1) y después en éter,
\newpage
- tratamiento del ADN así extraído con la Eco R1 metilasa en presencia de DTT y purificación por extracción como la descrita anteriormente,
- incubación del ADN así purificado con los 4 desoxinucleótidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP en presencia de ADN polimerasa T4 y de ADN ligasa de E. coli, seguida de purificación según el procedimiento descrito anteriormente,
- la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico investigado mediante una sonda apropiada.
Un procedimiento de preparación especialmente ventajoso de las secuencias nucleotídicas de la invención comprende las etapas siguientes:
- la síntesis de ADN utilizando el procedimiento automatizado de la \beta-cianetil fosforamidita descrita en Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986),
- la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico por hibridación con una sonda apropiada.
Otro procedimiento de preparación de las secuencias nucleotídicas de la invención comprende las siguientes etapas:
- el ensamblaje de los oligonucleótidos sintetizados químicamente, provistos en sus extremos de sitios de restricción diferentes, siendo las secuencias compatibles con el encadenamiento de aminoácidos del polipéptido natural según el principio descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 7461-7465 (1983),
- la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico investigado por hibridación con una sonda apropiada.

Claims (9)

1. Procedimiento de síntesis de una proteína o de un polipéptido codificado por una secuencia nucleotídica del virus VIH-1, VIH-2 o SIV caracterizado por comprende las siguientes etapas:
a.
síntesis de la secuencia nucleotídicas por un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleotídicas de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o SIV, con la ayuda de al menos dos cebadores oligonucleotídicos cuyas secuencias consisten cada una en
i.
una secuencia específicas del gen gag elegida en una región conservada entre los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac capaces de hibridar a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac o
ii.
Una secuencia complementaria de una secuencia tal como la definida en i.; y
b.
Recuperación de la secuencia nucleotídica así como amplificada y traducción en proteína.
2. Procedimiento de síntesis según la reivindicación 1, en el cual la secuencia de los cebadores tiene al menos el 60% de identidad con la secuencia del gen gag de un virus VIH-1 Bru, o VIH-1 Mal, o VIH-1 Eli, o VIH-2 Rod o SIV Mac.
3. Procedimiento de síntesis según la reivindicación 1, caracterizado porque los cebadores oligonucleotídicos comprenden una conservación de al menos 5 bases de cada lado del cebador respecto de la secuencia del gen gag de un virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, o VIH-2 Rod o SIV Mac.; y comprenden en su parte mediana modificaciones, y guardan las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el procedimiento de amplificación génica comprende las siguientes etapas:
a. una etapa de extracción del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus del tipo VIH-1, VIH-2 o SIV, y eventualmente una etapa de tratamiento mediante una transcriptasa reversa de dicho ácido nucleico, si éste último está en forma de ARN.
b. un ciclo que comprende las etapas siguientes:
i.-
desnaturalización del ácido nucleico de doble hebra a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico de hebra simple,
ii.-
hibridación de cada una de las hebras de ácido nucleico, obtenidas durante la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un cebador nucleotídico mediante la puesta en contacto de las hebras anteriormente mencionadas con al menos un par de cebadores según una de las reivindicaciones 1 ó 2,
iii.
formación a partir de los cebadores, de los ADN complementarios de las hebras sobre las cuales dichos cebadores hibridan en presencia de una ADN polimerasa y de cuatro nucleósidos trifosfato (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos de doble hebra que en la etapa de desnaturalización precedente,
repitiéndose este ciclo un número de veces determinado para obtener dicha secuencia nucleica en una proporción suficiente para permitir su detección.
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los al menos dos cebadores oligonucleotídicos tienen secuencias que consisten cada una en:
\newpage
i.-
al menos una secuencia elegida en el siguiente grupo de las secuencias sentido:
19
y al menos una secuencia elegida en el siguiente grupo de las secuencias antisentido:
20
ii.-
una secuencia complementaria de una secuencia tal como la definida en i.; o
iii.-
una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad con una de las secuencias definida en i o ii y capaz de hibridar a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque al menos dos de las siguientes mezclas de cebadores se utilizan para la amplificación:
MMy1: Mezcla constituida por cebadores
21 
\newpage
MMy2: Mezcla constituida por cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
22
MMy3: Mezcla constituida por cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
23
MMy4: Mezcla constituida por cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
24
MMy4B: Mezcla constituida por cebador
25
MMy4Bbis: Mezcla constituida por cebador
\vskip1.000000\baselineskip
26
MMy28: Mezcla constituida por cebador
27
MMy28bis: Mezcla constituida por cebador
28 
\newpage
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque se realiza en las condiciones siguientes:
- para la etapa de hibridación: 1 \mul de una solución de 40 \mumolar de cada cebador se pone en presencia de 100 a 300 ng de ADN-molde para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, y a continuación se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de ADN-molde y los cebadores en el agua con hielo, utilizándose los cebadores en una concentración final en la etapa de amplificación siguiente de 0,8 \mum cada uno.
- para la etapa de amplificación: se añade al medio anterior los 4 dNTP, cada uno de ellos utilizado a 0,5 \mumolar en 50\mul de solución final y una unidad de Taq-polimerasa para un medio de reacción de 50 \mul; esta etapa se realiza en el tampón de amplificación denominado "10 X buffer", que comprende cuando está diluido al 1/10 en la solución final: Tris-HCl, pH = 8,9: 50 mM; (NH_{4})_{2}SO_{4}; 15 mM; MgCl_{2}; 5 mM; \beta-mercaptoetanol; 10 mM; gelatina: 0,25 mg/ml.
8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa de traducción se realiza por transformación de células hospedadoras apropiadas mediante vectores que contienen dichas secuencias amplificadas y recuperación de las proteínas producidas en estas células hospedadoras.
9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los cebadores oligonucleotídicos se eligen entre los siguientes pares de mezclas de cebadores:
a. MMy1-MMy4
\vskip1.000000\baselineskip
MMy1: Mezcla constituida por cebadores
29 
\vskip1.000000\baselineskip
MMy4: Mezcla constituida por cebadores
30 
\vskip1.000000\baselineskip
b. MMy2-MMy4
\vskip1.000000\baselineskip
MMy2: Mezcla constituida por cebadores
31 
\vskip1.000000\baselineskip
MMy4: Mezcla constituida por cebadores
32 
\vskip1.000000\baselineskip
c. MMy1-MMy3
\vskip1.000000\baselineskip
MMy1: Mezcla constituida por cebadores
33 
\vskip1.000000\baselineskip
MMy3: Mezcla constituida por cebadores
34 
\vskip1.000000\baselineskip
d. MMy4Bbis-MMy28bis
\vskip1.000000\baselineskip
MMy4B: Mezcla constituida por cebador
35 
\vskip1.000000\baselineskip
MMy28bis: Mezcla constituida por cebador
36
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