DE05014676T1 - Nukleotid-Sequenzen von HIV-1, HIV-2 und SIV Retrovirusgenomen, ihre Verwendung zur Amplifizierung von diesen Retroviren und zur In Vitro Diagnostik von diesen Viren verursachten Infektionen - Google Patents

Nukleotid-Sequenzen von HIV-1, HIV-2 und SIV Retrovirusgenomen, ihre Verwendung zur Amplifizierung von diesen Retroviren und zur In Vitro Diagnostik von diesen Viren verursachten Infektionen Download PDF

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Abstract

Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz besteht aus:
i) einer spezifischen Sequenz des Gens gag oder des Gens pol, und geeignet ist, bei einer Temperatur von 60°C ± 1°C an die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac zu hybridisieren, oder
ii) einer Komplementärsequenz einer Sequenz, wie sie unter i) definiert ist.

Claims (18)

  1. Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz besteht aus: i) einer spezifischen Sequenz des Gens gag oder des Gens pol, und geeignet ist, bei einer Temperatur von 60°C ± 1°C an die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac zu hybridisieren, oder ii) einer Komplementärsequenz einer Sequenz, wie sie unter i) definiert ist.
  2. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass seine Nukleotidsequenz modifiziert ist bezogen auf die Sequenz des Gens gag oder des Gens pol der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac, und die Hybridisierungseigenschaften an die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac behält.
  3. Oligonukleotid, das eine Konservierung von mindestens 5 Basen an jeder Seite des Starters aufweist, bezogen auf die Sequenz eines Oligonukleotidstarters wie er in Anspruch 1 oder 2 beschrieben ist, und das in seinem mittleren Teil Modifikationen bezogen auf die Sequenz eines Oligonukleotidstarters gemäß Anspruch 1 oder 2 aufweist, und die Hybridisierungseigenschaften an die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac behält.
  4. Spezifisches Oligonukleotid des Gens gag gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus:
    Figure 00010001
    Figure 00020001
  5. Spezifisches Oligonukleotid des Gens pol gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus:
    Figure 00020002
    Figure 00030001
  6. Oligonukleotidstarterpaar zur Durchführung einer Genamplifikation des Gens gag oder des Gens pol von Virus vom Typ HIV-1, HIV-2 und SIV, wobei jeder der Starter besteht aus: i) einer spezifischen Sequenz des Gens gag oder des Gens pol, und geeignet ist, bei einer Temperatur von 60°C ± 1°C an die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac zu hybridisieren, ii) einer Komplementärsequenz einer Sequenz, wie sie unter i) definiert ist.
  7. Starterpaar gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz von mindestens einem Oligonukleotidstarter modifiziert ist bezogen auf die Sequenz des Gens gag oder des Gens pol der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac, und die Hybridisierungseigenschaften an die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac behält.
  8. Starterpaar gemäß Anspruch 6 zur Durchführung einer Genamplifikation des Gens gag von Virus vom Typ HIV-1, HIV-2 oder SIV, wobei die Starter bestehen aus: i. mindestens einer Mischung, die ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe von Mischungen von sense-Sequenzen MMy1: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' MMy2: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' MMy4Bbis: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' MMy28: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3' und mindestens einer Mischung, die ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe von Mischungen von antisense-Sequenzen: MMy3: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' MMy4: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' MMy4B: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5' Mmy28bis: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
  9. Starterpaar gemäß Anspruch 8 zur Durchführung einer Genamplifikation des Gens gag von Virus vom Typ HIV-1, HIV-2 oder SIV, bestehend aus: i) MMy1-MMy3: 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' ii) MMy1-MMy4: 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' iii) MMy2-MMy4: 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' iv) MMy4Bbis-MMy28bis: 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
  10. Starterpaar gemäß Anspruch 6 zur Durchführung einer Genamplifikation des Gens pol von Virus vom Typ HIV-1, HIV-2 oder SIV, wobei die Starter bestehen aus: i. mindestens einer Mischung, die ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe von Mischungen der sense-Sequenzen: Mmy29: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3' 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3' Mmy30: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAG AA-3' 5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAG AA-3' Mmy31: Mischung, die gebildet ist aus der Sequenz 5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACA AAG G-3' Mmy32: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 5'-TGG AAA GGT GAA GGG GCA GT-3' 5'-TGG AAA GGT GAA GGA GCA GT-3' und mindestens einer Mischung, die ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe von Mischungen von antisense-Sequenzen: Mmy29bis: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 3'-TTG GGC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5' 3'-TTG GTC CAT CCA TTC CTG GCT TTA-5' Mmy30bis: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5' 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5' Mmy31bis: Mischung, die gebildet ist aus der Sequenz 3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5' Mmy32bis: Mischung, die gebildet ist aus den Sequenzen 3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5' 3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5' 3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'
  11. Starterpaar gemäß Anspruch 10 zur Durchführung einer Genamplifikation des Gens pol von Virus vom Typ HIV-1, HIV-2 und SIV, bestehend aus: i) Mmy29-Mmy30bis 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA-3' 5'-TAA AGC CAG GAA TGG ATG GAC CAA-3' 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACA GTC CA-5' 3'-TTC TGT ATG TCA TTG ACT GTC CA-5' ii) Mmy30-Mmy31bis 5'-TGG ACT GTC AAT GAC ATA CAG AA-3' 5'-TGG ACT GTC AAT GAT ATA CAG AA-3' 3'-CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G-5' iii) Mmy31-Mmy32bis: 5'-CAT GGG TAC CAG CAC ACA AAG G-3' 3'-ACT GCC CCT TCA CCT TTC CA-5' 3'-ACT GCC CCT TCT CCT TTC CA-5' 3'-ACT GCC CCT TCC CCT TTC CA-5'
  12. Oligonukleotid oder Starterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, das geeignet ist, an die Genome der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac zu hybridisieren in einem Puffer der Zusammensetzung Tris-HCl, pH = 8,9 : 50mM; (NH4)2 SO4: 15 mM; MgCl2: 5mM; β-Mercaptoethanol: 10 mM; Gelatine: 0,25 mg/ml.
  13. Genamplifikationsverfahren von Nukleinsäuresequenzen des Gens gag oder des Gens pol von Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV, durchgeführt anhand einer biologischen Probe, wobei dieses Verfahren hauptsächlich die folgenden Schritte umfasst: a) einen Schritt der Extraktion von zu detektierender Nukleinsäure, die zum Genom von Virus vom Typ HIV-1, HIV-2 oder SIV gehört, der möglicherweise in der oben erwähnten biologischen Probe vorhanden ist, und gegebenenfalls einen Schritt der Behandlung dieser Nukleinsäure mit Hilfe einer reversen Transkriptase, wenn diese Nukleinsäure in Form von RNA vorliegt, b) einen Zyklus, der folgende Schritte umfasst: – Denaturierung der zu detektierenden Doppelstrang-Nukleinsäure, was zur Bildung einer Einzelstrang-Nukleinsäure führt, – Hybridisierung von jedem der Nukleinsäurestränge, die bei dem vorhergehenden Denaturierungsschritt erhalten wurden, mit mindestens einem Starter oder einem Starterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 durch Inkontaktbringen der oben erwähnten Stränge mit mindestens einem Paar der oben erwähnten Starter, – Bildung, ausgehend von DNA-Startern, die zu den Strängen komplementär sind, auf die sie hybridisiert sind in Gegenwart einer DNA-Polymerase und vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphaten (dNTP), was zur Bildung einer größeren Anzahl von zu detektierenden Doppelstrang-Nukleinsäuren führt als beim vorhergehenden Schritt der Denaturierung, wobei dieser Zyklus eine bestimmte Anzahl von Malen wiederholt wird, um die möglicherweise in der biologischen Probe vorliegende, zu detektierende Nukleinsäuresequenz in einem Ausmaß zu erhalten, das ausreicht, deren Detektion zu ermöglichen, c) einen Schritt des Nachweises eines möglichen Vorhandenseins von Nukleinsäure, die zum Genom von Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV gehört, in der biologischen Probe.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Denaturierungsschritt in Gegenwart des (oder der) Starterpaare(s) gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12 durchgeführt wird.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es unter folgenden Bedingungen durchgeführt wird: a) Hybridisierung: Die Starter (1 μl einer Lösung von 40 μmolar an jedem der Starter) werden für den ersten Schritt der Denaturierung-Reassoziation mit DNA-Matrix (100 bis 300 ng) zusammengebracht; es wird 10 Minuten lang bei 100°C erhitzt, und daraufhin werden die Gefäße, die diese Mischung aus DNA-Matrix und Primern enthalten, in Eis-haltiges Wasser getaucht. Die Primer sollen im Amplifikationsschritt in einer Endkonzentration verwendet werden, die jeweils 0,8μM beträgt. b) Amplifikation: Man fügt dem vorher beschriebenen Medium die 4 dNTPs, wobei jedes zu 0,5μmolar in der Endlösung (50μl) verwendet wird, und eine Einheit von Taq-Polymerase für ein Reaktionsmedium von 50μl hinzu.
  16. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 zur in vitro-Diagnose der Infektion eines Individuums mit einem Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2, oder eines Tieres mit mindestens einem der drei Viren (HIV-1, HIV-2, SIV).
  17. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, das i) mindestens einen Starter oder ein Oligonukleotidstarterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, ii) geeignete Reagentien zur Durchführung des Zyklus der Arbeitsgänge der Amplifikation, insbesondere DNA-Polymerase, vier unterschiedliche Nukleotidtriphosphate und den Puffer „10 × buffer", der in Anspruch 12 beschrieben ist, iii) eine (oder mehrere) Sonde(n), die markiert sein kann (können), die in der Lage ist (sind), an die zu detektierende(n), amplifizierte(n) Nukleinsäuresequenz(en) zu hybridisieren.
  18. Verwendung von mindestens einem Starter oder einem Starterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Genamplifikation von Nukleinsäuresequenzen des Gens gag oder des Gens pol von Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV.
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