ES2275451T3 - Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1,vih-2 y siv, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de los genomas de estos retrovirus y para el diagnostico in vitro de las infecciones debidas a estos virus. - Google Patents

Secuencias nucleotidicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo vih-1,vih-2 y siv, y sus aplicaciones especialmente para la amplificacion de los genomas de estos retrovirus y para el diagnostico in vitro de las infecciones debidas a estos virus. Download PDF

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ES2275451T3 ES05014676T ES05014676T ES2275451T3 ES 2275451 T3 ES2275451 T3 ES 2275451T3 ES 05014676 T ES05014676 T ES 05014676T ES 05014676 T ES05014676 T ES 05014676T ES 2275451 T3 ES2275451 T3 ES 2275451T3
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Abstract

Oligonucleótido caracterizado porque su secuencia consiste en: i) una secuencia específica del gen gag o del gen pol, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºCñ1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, o ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i.

Description

Secuencias nucleotídicas procedentes del genoma de los retrovirus del tipo VIH-1, VIH-2 y SIV, y sus aplicaciones especialmente para la amplificación de los genomas de estos retrovirus y para el diagnóstico in vitro de las infecciones debidas a estos virus.
La presente invención se refiere a secuencias oligonucleotídicas utilizables para la aplicación de técnicas de amplificación de secuencias nucleicas específicas de retrovirus de inmunodeficiencia humana del tipo VIH o de retrovirus de inmunodeficiencia del mono del tipo SIV.
La invención se refiere en particular a la aplicación de estas secuencias a procedimientos de diagnóstico in vitro en el ser humano de la infección de un individuo por un retrovirus del tipo VIH (actualmente VIH-1 y/o VIH-2).
El aislamiento y la caracterización de retrovirus agrupados bajo la designación VIH-1 y VIH-2 se han descrito en las solicitudes de patente europea nº 85/905.513.9 (VIH-1) y nº 87/400.151.4 y EP 0 269 520 (VIH-2). Estos retrovirus se han aislado en diversos enfermos con síntomas de una linfadenopatía o de un síndrome de un síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).
Los retrovirus del tipo VIG-2 como los retrovirus del tipo VIH-1, se caracterizan por un tropismo para los linfocitos T4 humanos y por un efecto citopatógeno respecto de estos linfocitos cuando se multiplican, para entonces causar entre otros poliadenopatías generalizadas y persistentes o un SIDA.
Otro retrovirus, denominado SIV-1, sustituyendo esta denominación la denominación anteriormente conocida de STLV-III, se ha aislado en el mono macaco rhesus (M.D. DANIEL et al., Science, 228, 1201 (1985); N.L. LETWIN et al., Science, 230, 71 (1985) bajo la denominación "STLV-IIImac").
Otro virus, designado "STLV-III_{AGM}", o (SIV_{AGM}) se ha aislado en monos verdes salvajes. Pero contrariamente a los virus presentes en el mono macaco rhesus, la presencia de STLV-III_{AGM} no parece inducir una enfermedad del tipo SIDA en el mono verde africano.
Por motivos de comodidad verbal, estos virus no se designaran a continuación más que con la expresión SIV (la expresión SIV es la abreviación inglesa de "Simian Immunodeficiency Virus" (Virus de inmunodeficiencia del mono) eventualmente seguida de una abreviación que designa la especie de mono del cual proceden por ejemplo "MAC" para el macaco o "AGM" para el mono verde africano (Abreviación de "African Green Monkey").
Una cepa del retrovirus SIV-1mac se ha depositado en la C.N.C.M el 7 de febrero de 1986 con el número
I-521.
El seguimiento de del estudio de los retrovirus VIH-1 y VIH-2 condujo también a la obtención de secuencias de ADN complementarias (ADNc) de los ARN de su genoma. La secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-2 (VIH-2 ROD) se depositó el 21-02-1986 en la C.N.CM con el número I-522, con el nombre de referencia LAV-2-ROD.
Igualmente, la secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-1 se describe en WAIN HONSON; SONIGO, COLE, DANOS y ALIZON en CEII (enero 1985).
Igualmente por razones de comodidad verbal, los virus del tipo VIH-1 y VIH 2 se designará a veces en este documento por la expresión VIH.
Los procedimientos de diagnóstico in vitro de las infecciones por virus del tipo VIH-1 y VIH-2 que existen actualmente, recurren a la detección de anticuerpos NATI-VIH-1 O ANTI-VIH-2 eventualmente presentes en una muestra biológica (biopsia) o en un fluido biológico, por ejemplo en un suero obtenido, a partir del paciente en estudio, por puesta en contacto de este fluido biológico con extractos o antígenos de VIH-1 o VIH-2, en condiciones que permiten la producción de una eventual reacción inmunológica de estos extractos o antígeno con estos anticuerpos.
Tales procedimientos de diagnóstico corren el riesgo de ser falsamente negativos, en particular en el caso de una infección reciente de un individuo por virus del tipo VIH.
Las técnicas de amplificación génica son una contribución considerable para la puesta a punto de procedimientos de diagnóstico in vitro particularmente sensibles de enfermedades virales. Entre estas técnicas de amplificación génica, se pueden mencionar la técnica PCT (Polymerase Chain Reaction) tal como se describe en las solicitudes de patente europea nº 86/302.298.4 del 27-03-1986 y el número 87/300.203.4 del 09-01-1987, o también la técnica denominada "Q\betareplicasa" descrita en Biotyechnology, vol 6 página 1197 (octubre 1988) y la que procede con la ayuda de una ARM polimerasa (T7RNA polimerasa) descrita en la solicitud de patente internacional número WO89/01050. Estas técnicas permiten mejorar la sensibilidad de detección de los ácidos nucleicos de los virus y necesitan la utilización de cebadores específicos de síntesis.
\newpage
Rayfield et al., (The Journal of Infectious Medicine, 1988, 158(9): 1170-1176) describe un par de cebadores oligonucleotídicos SK100 y SH104 para la aplicación de una amplificación génica del gen gag de virus de cualquier VIH-1 y VIH-2, consistiendo los cebadores, cada uno en una secuencia específica del gen gag susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºC+/-1ºC con los genomas de los virus VIH-1 y VIH-2.
Para la búsqueda de los virus del tipo VIH, la elección de los cebadores es problemática. En efecto, debido a la gran variabilidad de las secuencias de nucleótidos del genoma viral, un cebador conforme a la secuencia conocida de un aislado dado de un virus del tipo VIH puede fallar en la amplificación de algunas variantes virales del tipo VIH. Por otra parte, incluso si se elige un cebador en una región conservada del genoma de un virus VIH a otro, no se garantiza por este hecho su "buen funcionamiento" y puede dar lugar a malos rendimientos de amplificación.
La presente invención proporciona precisamente cebadores oligonucleotídicos que permiten, entre otros, la amplificación, en particular con fines de diagnóstico, del genoma de cualquier virus del tipo VIH y SIV, con rendimientos considerados como máximos en el estado actual de la técnica y evitando sobre todo la presencia de numerosas bandas anespecíficas.
Los cebadores de la presente invención son a la vez específicos de los virus del grupo VIH-1 y/o de los virus de los grupos VIH-2 y SIV, y son sensibles a las variaciones del genoma de estos virus.
La presente invención tiene por objeto cebadores oligonucleotídicos, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, utilizables para la amplificación genómica de los virus del tipo VIH-1 y/o del tipo VIH-2 y SIV.
La invención se refiere a cualquier secuencia nucleotídica caracterizada porque su secuencia:
-
bien se elige entre las que están contenidas en una de las secuencias nucleotídicas comprendidas en el gen gag de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli VIH-2 ROD y SIV MAC, y más particularmente entre las que están contenidas en los encadenamientos nucleotídicos definidos a continuación,
-
bien (especialmente para las secuencias más largas) contiene una de las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas procedentes de VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli VIH-2 ROD y SIV MAC, o contiene una secuencia nucleotídica complementaria de una de estas últimas secuencias, entendiéndose que los eventuales nucleótidos suplementarios que "sobresalen" de la secuencia nucleotídica del tipo en cuestión, del lado de los extremos 3' o 5', coinciden preferiblemente con los que se encuentran colocados más del lado de los extremos 5' o 3' correspondientes en el seno mismo de la secuencia completa de los virus del tipo VIH-1, VIH-2 o SIV MAC anteriormente mencionados,
-
bien, si esta secuencia nucleotídica no es idéntica a una de las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas, o no es complementaria de una de estas secuencias, es, sin embargo, susceptible de hibridarse con una secuencia nucleotídica procedente de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, y con una secuencia nucleotídica procedente del virus VIH-2 ROD y SIV MAC, anteriormente mencionada. La hibridación se puede efectuar a una temperatura de 60ºC+/-1ºC (preferiblemente 60ºC+/-0,5ºC), preconizada para un rendimiento óptimo.
La numeración de los nucleótidos anteriormente mencionados corresponde a la utilizada en el manual de referencia "Human Retrovirus and AIDS-1989" editado por el "Los Alamos National Laboratory - Nuevo México - EE.UU.".
(Las secuencias de los virus VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, se han descrito por MONTAGNIER, SONIGO, WAIN-HOBSON y ALIZON en la solicitud de patente europea EP 0 253 701 del 23-06-1986.).
Las secuencias de la invención se sintetizaron en un sintetizador comercializado por Applied Biosystems (procedimiento fósforo-amiditas, o en cualquier otro aparato que utilice un procedimiento similar.
La invención se refiere más particularmente a las secuencias oligonucleotídicas caracterizadas por los siguientes encadenamientos nucleotídicos (representados en el sentido 5'\rightarrow3'; las iniciales "S" y "AS" indican si el oligonucleótido es con sentido o antisentido, es decir, si el oligonucleótido está orientado respectivamente en el sentido 5'o\rightarrow3' o en el sentido 3'o\rightarrow5'):
1.-) secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-1, VIH-2 y SIV (las series de cifras espaciadas por un guión indican la posición de los nucleótidos en los genomas que corresponden respectivamente a los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli VIH-2 ROD y SIV):
\bullet
secuencias específicas del gen gag del genoma de los virus anteriormente mencionados (gen que codifica un grupo de antígeno específicos del nucleótido de estos virus).
Se pueden aportar algunas variantes en algunas posiciones de las secuencias nucleotídicas indicadas anteriormente, sin que las propiedades de hibridación de estas secuencias nucleotídicas con los genes de los virus del tipo VIH y/o SIV se vean afectadas. Las secuencias nucleotídicas que comprenden estas variantes se representan debajo de las secuencias nucleotídicas iniciales de las que se derivan por sustitución de una o más bases. Las bases modificadas respecto de las de las secuencias nucleotídicas iniciales se indican con todas sus letras mientras que las bases de las secuencias iniciales que no se han sustituido en las secuencias que comprenden estas variantes se indican con la ayuda de líneas de puntos.
\bullet
La síntesis de los cebadores se hace utilizando todas las variantes simultáneamente. Es la mezcla de todas las variantes para una secuencia dada que se utiliza en los ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
1
S, 636-653, 635-652, 636-653, 859-876, 834-851
2
S, 854-872,864-888,848-872,1160-1184, 1124-1148
3
AS,900-881, 916-897, 900-881, 1212-1193,1176-1157
\hskip2,8cm
4
AS,1385-1369,1419-1403,1385-1369,1703-1687,1667-1651
\hskip2,8cm
5
AS, 1388-1369, 1421-1403, 1388-1369, 1706-1687, 1670-1651,
6
S, 1369-1388, 1403-1421, 1369-1388, 1687-1706, 1651-1670,
\hskip2,8cm
7
S, 2021-2039, 2055-2073, 2024-2042, 2329-2349, 2299-2318,
\hskip2,8cm
8
AS, 2039-2021, 2073-2055, 2042-2024, 2349-2329, 2318-2299
La solicitud describe igualmente otras secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-1, VIH-2 y SIV.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas del gen vpr
MMy18: GAT AGA TGG AAC AAG CCC CAG S, 5590-5610, 5585-5605, 5554-5574, 6233-6296, 6147-6170,
MMy19: TCC ATT TCT TGC TCT CCT CTG T AS, 5870-5849, 5865-5844, 5834-5813. 6551-6531, 6454-6431,
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencia específica del gen pol; 
\hskip2,8cm
9
S, 2620-2643, 2615-2638, 2584-2607, 2971-2994, 2887-3010
\hskip2,8cm
10
AS, 2643-2620, 2638-2615, 2607-2584, 2994-2971, 3010-2887,
\hskip2,8cm
11
S, 3339-3361, 3334-3356, 3303-3325, 3690-3712, 3606-3628,
\hskip2,8cm
12
AS, 3361-3339, 3356-3334, 3325-3303, 3712-3690, 3628-3606,
MMy31:CAT GGG TAC CAG CAC ACA AAG G
S, 4186-4207, 4181-4202, 4150-4171, 4534-4555, 4450-4471,
MMy31bis: CCT TTG TGT GCT GGT ACC CAT G
AS, 4207-4186, 4202-4181, 4171-4150, 4555-4534, 4471-4450,
\hskip2,8cm
13
S, 4992-5011, 4987-5006, 4956-4975, 5340-5359, 5256-5275,
\hskip2,8cm
14
AS, 5011-4992, 5006-4987, 4975-4956, 5359-5340, 5275-5256=
2.-) La solicitud describe igualmente secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-2 y SIV (las series de cifras espaciadas por un guión indican la posición de los nucleótidos en los genomas que corresponden respectivamente a los virus VIH-2 ROD y SIV-MAC).
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas de gen nef (que codifica un factor negativo de 27 kD)
MMy12:
AGA GAC TCT TGC GGG CGC GTG
\quad
S, 9165-9185, 9139-9159,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy13:
ATA TAC TTA GAA AAG GAA GAA GG
\quad
S, 9542-9564, 9516-9538,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy13bis:
CCT TCT TCC TTT TCT AAG TAT AT
\quad
AS, 9564-9542, 9538-9516,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy14:
AGC TGA GAC AGC AGG GAC TTT CCA
\quad
AS, 9956-9933, 9893-9870,
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas de gen vif2 (que codifica un factor de infecciosidad de 23 kD)
MMy20:
TAT GGA GGA GGA AAA GAG ATG GAT AGT
\quad
S, 5424-5450, 5340-5366,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy21:
TAG CAC TTA TTT CCC TTG CTT T
\quad
S, 5754-5775, 5670-5691,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy21bis:
AAA GCA AGG GAA ATA AGT GCT A
\quad
AS, 5775-5754, 5691-5670,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy22:
CCC TTG TTC ATC ATG CCA GTA T
\quad
AS, 6082-6061, 5995-5974,
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas del gen vpx (que codifica una proteína de 12 kD)
MMy23:
ATG TCA GAT CCC AGG GAG A
\quad
S, 5900-5918, 5813-5831,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy24:
CCT GGA GGG GGA GGA GGA GGA
\quad
AS, 6228-6208, 6141-6121,
3.-) Finalmente, la solicitud describe también secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, y VIH-1 Eli (las series de cifras espaciadas por un guión indican la posición de los nucleótidos en los genomas que corresponden respectivamente a los virus VIH-1 Bru, VIH-1 MAl y VIH-1 Eli).
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas del gen env (que codifica las proteínas de envoltura)
MMy5:
CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT GCC CC
\quad
S,6905-6930,6903-6928,6860-6885
\vskip1.000000\baselineskip
MMy5bis:
GGG GCA CAA TAA TGT ATG GGA ATT GG
\quad
AS, 6930-6905, 6928-6903, 6885-6860,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy6:
AAT GGC AGT CTA GCA GAA GAA GA
\quad
S,7055-7077,7053-7075,7010-7032
\vskip1.000000\baselineskip
MMy7:
ATC CTC AGG AGG GGA CCC AGA AAT T
\quad
S, 7360-7384, 7349-7373,7306-7330
\vskip1.000000\baselineskip
MMy7bis:
AAT TTC TGG GTC CCC TCC TGA GGA T
\quad
AS, 7384-7360,7373-7349,7330-7306
\vskip1.000000\baselineskip
MMy8:
GTG CTT CCT GCT GCT CCC AAG AAC CC AS, 7857-7832,7846-7821,7800-7775
\vskip1.000000\baselineskip
MMy8bis:
GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA AGC AC
\quad
S, 7832-7857, 7821-7846, 7775-7800,
MMy9:
\hskip1,7cm
15
\quad
S,8844-8869, 8836-8861, 8787-8812,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy9bis:
CTA CTT TTT GAC CAC TTG CCA CCC AT
\quad
AS, 8869-8844, 8861-8836, 8812-8787,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy78:
TAT TAA CAA GAG ATG GTG G
\quad
S, 7629-7647, 7612-7630, 7572-7590,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy89:
CCA GCA AGA AAA GAA TGA A
\quad
S, 8224-8242, 8213-8231, 8167-8185,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy89bis:
TTC ATT CTT TTC TTG CTG G
\quad
AS, 8242-8224, 8231-8213, 8185-8167,
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas del gen nef1
MMy10:
AAA AGA AAA GGG GGG ACT GGA
\quad
S, 9116-9136, 9117-9137, 9062-9082,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy10bis:
TCC AGT CCC CCC TTT TCT TTT
\quad
AS,9136-9116, 9137-9117, 9082-9062,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy11:
AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC C
\quad
AS,9503-9483, 9505-9484, 9449-9428,
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas del gen vif 1
MMy15:
GAT TAT GGA AAA CAG ATG GCA GGT GAT
\quad
S, 5073-5099, 5068-5094, 5037-5063,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy16:
GCA GAC CAA CTA ATT CAT CTG TA
\quad
S, 5383-5405, 5378-5400, 5347-5369,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy16bis:
TAC AGA TGA ATT AGT TGG TCT GC
\quad
AS, 5405-5383, 5400-5378, 5369-5347,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy17:
CTT AAG CTC CTC TAA AAG CTC TA
\quad
AS, 5675-5653, 5670-5648, 5639-5617,
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Secuencias específicas del gen vpu
MMy25:
GTA AGT AGT ACA TGT AAT GCA ACC T
\quad
S, 6081-6105, 6076-6100, 6045-6069,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy26:
AGC AGA AGA CAG TGG CCA TGA GAG
\quad
S, 6240-6263, 6238-6261, 6207-6230,
\vskip1.000000\baselineskip
MMy27:
ACT ACA GAT CAT CAA TAT CCC AA
\quad
AS, 6343-6321, 6338-6316, 6307-6285,
La invención tiene también por objeto las secuencias (o cebadores) que poseen una estructura nucleotídica complementaria de las de los cebadores definidos anteriormente.
Se refiere igualmente a las secuencias nucleotídicas que presentan algunas mutaciones respecto de la definidas anteriormente sin que se modifiquen las propiedades de hibridación, tal como se han definido anteriormente, de estas secuencias. El porcentaje de nucleótidos diferentes de los que constituyen las secuencias descritas anteriormente, sin afectar por ello las propiedades de hibridación de las secuencias de la invención, puede alcanzar el 40%.
De una manera general, en el caso de un cebador (primer) con sentido (S), se tolera un mayor número de mutaciones del lado 5' que del lado 3' del cebador, debiéndose el lado 3' hibridar perfectamente con una cadena determinada de una secuencia nucleica para permitir la amplificación de esta secuencia. en el caso de un cebador antisentido (AS), la tolerancia se permite del lado 3'.
\newpage
\global\parskip0.980000\baselineskip
La invención tiene también por objeto los cebadores tales como los definidos anteriormente y que comprenden una conservación de al menos 5 bases de cada lado, comprendiendo la parte mediana modificaciones, sin que las propiedades de hibridación anteriores se vean afectadas.
Una de las características de los cebadores oligonucleotídicos de la invención es proporcionar a una banda de amplificación neta, desprovista generalmente de bandas anespecíficas cuando se aplican las indicaciones técnicas de utilización descritas en la presente invención. Este hecho se debe a la longitud de los cebadores que pueden alcanzar 27 bases, lo que aumenta la especificidad de hibridación, así como a las drásticas condiciones de utilización que permiten eliminar las asociaciones parásitas. La especificidad para cada tipo de virus lo es en función, además del porcentaje de homología con la matriz de referencia, de la longitud de los cebadores, que pueden alcanzar, para un rendimiento aceptable, hasta 40 bases.
La invención se extiende también a los cebadores tales como los descritos anteriormente ligados al nivel de su extremo 5' a un promotor para la aplicación de un procedimiento de amplificación genómica por síntesis de múltiples copias de ADN o de ARN tal como se describe en la solicitud de patente europea nº 88/307.102.9 del 01-08-1988.
La invención tiene especialmente por objeto la utilización de los cebadores descritos anteriormente para la aplicación de un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas de virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2, y/o SIV, pudiéndose aplicar este procedimiento al diagnóstico in vitro de la potencial infección de un individuo por un virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH_1, VIH-2, CIV).
Este procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención se realiza a partir de una muestra biológica (por ejemplo un fluido biológico tal como suero, linfocitos de la sangre en circulación) obtenida a partir de un paciente en estudio, y comprende principalmente las siguientes etapas:
-
una etapa de extracción del ácido nucleico que se va a detectar perteneciente al genoma de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 o VIS, eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente citada y, llegado el caso, una etapa de tratamiento con ayuda de una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN, para obtener un ácido nucleico bicatenario (estando también esta última etapa designada más adelante como etapa de retrotranscriptasa del ARN viral)
-
un ciclo que comprende las siguientes etapas:
\bullet
\vtcortauna desnaturalización del ácido nucleico bicatenario que se va a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico monocatenario,
\bullet
\vtcortauna hibridación de cada una de las cadenas de ácido nucleico obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente con al menos un cebador según la invención, mediante la puesta en contacto de las cadenas anteriormente citadas con al menos un par de los cebadores según la invención en las condiciones de hibridación anteriormente definidas,
\bullet
\vtcortauna formación a partir de los cebadores de ADN complementarios con las cadenas con las que hibridan en presencia de un agente de polimerización (ADN polimerasa) y de cuatro trifosfatos de nucleósidos (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos bicatenarios que se van a detectar que en la etapa de desnaturalización precedente, repitiéndose este ciclo un número determinado de veces para obtener dicha secuencia nucleica que se va a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección,
-
una etapa de detección de la presencia eventual del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS en la muestra biológica.
La etapa de hibridación anteriormente descrita se realiza ventajosamente a 60ºC durante 1 minuto y 30 segundos en el tampón "10 X buffer" cuya composición (en concentración final de utilización) se indica mas adelante.
El procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención se puede realizar bien a partir del ARN viral, bien a partir del ADN complementario, episomial o integrado.
En efecto, los genomas de los virus VIH y SIV se presentan en forma de ARN o de ADN en función de la localización del virus en el organismo.
Cuando el virus se sitúa en el interior de las células del organismo, especialmente en el interior de las células sanguíneas, su ARN se vuelve a copia en ADN por una transcriptasa inversa. Por el contrario, el genoma de los virus del tipo VIH en medio extracelular, especialmente en la sangre, permanece en forma de ARN.
La etapa de extracción según la invención del ADN viral contenido en las células de la muestra biológica preconizada por los inventores - además del procedimiento clásico con fenol cloroformo- presenta las siguientes etapas:
\bullet
\vtcortauna suspensión del residuo celular en 0,5 ml de agua pirolizada en un Potter fe pistón grande,
\global\parskip1.000000\baselineskip
\bullet
\vtcortauna trituración de las células denominado de "ida y vuelta",
\bullet
\vtcortauna adición Triton X100 para 1 concentración final del 0,1%
\bullet
\vtcortauna desnaturalización con calor durante 15 a 25 minutos a 100ºC,
\bullet
\vtcortauna centrifugación corta para no eliminar más que los restos celulares,
\bullet
\vtcortauna precipitación del ADN durante la noche a -20ºC por adición de 2,5 volúmenes de etanol absoluto y del 10% del volumen final de acetato de sodio 3 molares. El ADN a continuación se recupera y se vuelve a suspender en el agua pirolizada después de haberse lavado 2 veces con etanol a 70ºC. Hay que subrayar que este procedimiento permite la precipitación conjunta de los ADN y de los ARN, lo cual permite la detección del mensaje genómico de los virus de tipo VIH o SIV mediante la utilización del procedimiento denominado "PCR directo ADN" o por el denominado "PCR-ARN".
La etapa de extracción del AAARN viral se efectúa generalmente de la manera clásica conocida por el experto en la técnica.
Después de la extracción del ARN, es necesaria efectuar una etapa suplementaria de transformación del ARN, monocatenario en ADN bicatenario cuando el diagnóstico in vitro de la invención se realiza a partir de muestras biológicas que contienen los virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV cuyos genomas están en forma de ARN.
Esta transformación del ARN en ADN se realiza por tratamiento del ARN obtenido después de la extracción de la muestra biológica, especialmente suero, en un medio apropiado con la ayuda de una transcriptasa inversa.
\bullet
\vtcortauna La invención tiene más particularmente entre otro por objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro tal como se define anteriormente, en el cual la etapa de retro-trascripción del ARN viral se realiza de la siguiente manera:
-
10 \mug de ARN extraído resuspendido en agua se pone en presencia del par de cebadores a la concentración de 40 \muM cada uno, en un volumen final de 40 \mul. El conjunto se desnaturaliza a 100ºC durante 10 minutos y a continuación se sumerge en agua helada,
-
se añaden 10 \mul de la siguiente mezcla: 5 \mul del tampón "10 buffer" descrito más adelante + 1 unidad de transcriptasa inversa de (AMV (Avian Myeloblastosis Virus) o de MuMLV (Moloney Leukemia Virus)) + 1 unidad de Taq polimerasa + 1 \mul de la mezcla de los 4 dNTP a 25 mM cada uno + agua C.S.P. 10 \mul. El volumen final es por lo tanto de 50 \mul.
Esta reacción se efectúa en dos etapas:
-
a)
\;
primera etapa: fabricación del ADNc por acción de la transcriptasa inversa a 42ºC durante 13 minutos,
-
b)
\;
segunda etapa: amplificación génica clásica: se calienta a 95ºC durante 3 minutos para destruir la transcriptasa inversa y permitir la etapa de deshidratación/hibridación, y a continuación se inicia el ciclo descrito anteriormente para la amplificación génica.
La invención tiene más particularmente por objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro tal como el que se describe anteriormente, en el cual la etapa de desnaturalización se realiza en presencia del (o de los pares de) cebador(es)
o (primers) de la invención. en efecto, como se ha precisado anteriormente, una de las características de los oligonucleótidos (o primers), de la invención es proporcionar una banda de amplificación neta, generalmente desprovista de bandas anespecíficas, cuando se utilizan en las siguientes condiciones:
-
hibridación: se ponen los cebadores (1 \mul de una solución 40 \muMolar (40 \muM) de cada cebador) en presencia de matriz de ADN (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, después se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de matriz de ADN y de cebadores en agua que contiene hielo, para de este modo aumentar la tasa de reasociación de matriz de ADN/cebadores. Los cebadores se deben utilizar a una concentración final en la siguiente etapa de amplificación de 0,8 \muM cada uno;
-
amplificación: se añaden al medio precedente los 4 A dNTP, utilizándose cada uno a 0,5 \muMolar en solución final (50 \mul), y una unidad de Taq polimerasa para un medio de reacción de 50 \mul. Ésta etapa se realiza en un tampón de amplificación de la presente invención, generalmente designado con el nombre "10 X buffer" cuya composición (cuando se diluye a 1/10) es la siguiente: Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM; (NH_{4})_{2}SO_{4}: 15 mM; MgCl_{2} : 5 mM; \beta-mercapto-etanol: 10 mM; gelatina: 0,25 mg/ml. Se añaden 5 \mul de este tampón y agua c.s.p. 50 \mul al medio anterior.
\newpage
Los ciclos de amplificación se realizan de la siguiente manera: 30 a 40 ciclos compuestos de:
\bullet
94ºC durante 10 segundos (desnaturalización),
\bullet
60ºC durante 1 minuto (hibridación),
\bullet
78ºC durante 1 minuto 30 segundo (elongación)
El todo será seguido por un ciclo único a 78ºC durante 15 minutos.
La precisión de las temperaturas indicadas a +/- 0,3ºC aproximadamente, así como su estabilidad durante los diferentes ciclos, representan condiciones esenciales para la obtención de los rendimientos máximos así como la ausencia de bandas anaespecíficas.
La concentración óptima de ADN es de 100 a 300 ng para ADN genómico extraído de células (de pacientes o en cultivo, de mamíferos u otros).
Es evidente que las condiciones anteriores representan condiciones óptimas para un medio de reacción final de 50 \mul, y que estas condiciones se pueden modificar en función del volumen final del medio de reacción.
A título de ejemplo de pares de cebadores preferidos utilizables en el marco de la presente invención, se pueden mencionar los siguientes pares de cebadores:
- MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy18-MMy19, MMy4bis-MMy28bis, MMy28-MMy29bis, MMy29-MMy30bis, MMy31-MMy32bis, especialmente para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo VIH-1 y/o VIH-2.
El agente de polimerización utilizado en la etapa de elongación del ciclo es una ADN polimerasa termoestable, especialmente Taq polimerasa, amplifiosa de la firma Appligène o cualquier ADN polimerasa termoestable que se pueda comercializar.
De manera general, el ciclo del procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención se repite entre 30 y 40 veces.
El procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención permite igualmente, en función de los pares de cebadores nucleotídicos utilizados, detectar selectivamente los genes de los virus del tipo VIH y/o SIV presentes en la muestra biológica.
Los pares de cebadores utilizables, a título de ejemplos, para el procedimiento de amplificación génica anteriormente mencionado, son los siguientes:
- MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy4bis-MMy28bis para le gen gag.
La solicitud describe igualmente los siguientes pares de cebadores:
-
MMy18-MMy19 para el gen vpr,
-
MMy5-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy5-MMy7bis, MMy6-MMy7bis, MMy26-MMy5bis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis para el gen env,
-
MMy9-MMy11, MMy9-MMy10bis, MMy10-MMy11 para el gen nef1,
-
MMy15-MMy17, MMy15-MMy16bis, MMy16-MMy17, para el gen vif1,
-
MMy20-MMy22, MMy20-MMy21bis, MMy21-MMy22 para el gen vif 2,
-
MMy23-MMy24 para vpx,
-
MMy12-MMy14, MMy12-MMy13bis, MMy13-MMy14 para el gen nef2,
-
MMy25-MMy27, MMY26-MMy27 para el gen vpu,
-
MMy28-MMy29bis, MMy29-MMy30bis, MMy30-MMy31bis, MMy31-MMy32bis para el gen pol.
Sin embargo, las combinaciones entre cebadores "S" y "AS" descritas anteriormente no son limitativas y se pueden variar según lo desee el usuario.
\newpage
Las dimensiones de los fragmentos nucleotídicos sintetizados con la ayuda de los pares de cebadores anteriormente mencionados a título de ejemplos, se indican en las siguientes tablas I a XI:
(las cifras indicadas en las siguientes tablas representan el número de nucleótidos de los fragmentos sintetizados, y los "guiones" indican que los pares de cebadores ensayados no permiten caracterizar las cepas virales correspondientes).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA I
16 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA II
17 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA III
18
TABLA IV 
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA V 
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA VI 
\vskip1.000000\baselineskip
21
TABLA VII 
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA VII 
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA IX 
\vskip1.000000\baselineskip
24
TABLA X
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA XI
26
Hay que subrayar que gracias a su disposición en el genoma, los cebadores que sirven para la amplificación se pueden combinar de tal manera que se pueden utilizar como sonda, bien después del marcado con el ^{32p} por quinación, bien para la utilización en la técnica de las sondas frías para verificar la especificidad de la banda de amplificación observada durante un análisis por Southern transfert''. Además, durante un análisis por secuenciación del ADN amplificado, estos oligonucleótidos se pueden utilizar como cebador específico para la DNA polimerasa que permite una doble secuenciación en cada sentido, por lo tanto una doble lectura de las secuencias haciendo desaparece de este modo las eventuales ambigüedades de interpretación.
Igualmente se describen los cebadores tal como se describen anteriormente, se marcan especialmente de manera radiactiva o enzimática, así como su utilización como sondas nucleotídicas, especialmente en el marco del procedimiento de diagnóstico in vitro tal como se describe anteriormente.
Se describen igualmente oligonucleótidos tal como se describen anteriormente y que comprenden azúcares en conformación a. Tales oligonucleótidos presentan la característica de invertir el sentido de la doble hélice formada con la matriz (cadena del genoma del virus), pasando de este modo esta doble hélice del estado "S" al estado "AS".
Se describen igualmente los oligonucleótidos descritos anteriormente, de los cuales algunos se metilan y/o comprenden uno o varios átomos de azufre especialmente las adeninas. Tales oligonucleótidos presentan la característica de aumentar la estabilidad de la doble hélice, y, por consiguiente, de hibridarse mejor con la cadena de ADN que se va amplificar.
Se describen igualmente los oligonucleótidos tal como se describen anteriormente y se presentan bajo la forma denominada "de bases modificadas" que comprende nucleótidos sobre los cuales se injertan de manera covalente agentes cromóforos moléculas aromáticas planas tales como la acridina naranja), especialmente según el procedimiento descrito en el artículo de C. Hélène aparecido en "la Vie des Sciences", informes, serie general, tomo 4, nº 1, p. 17-37. Tales oligonucleótidos presentan la característica de ser fácilmente detectables, especialmente por fluorescencia.
Se describe igualmente la utilización de los oligonucleótidos descritos en la presente solicitud para la aplicación de un procedimiento de diagnóstico in vitro de la infección de monos (macacos, mono de mangabeys o mono verde) por el virus del tipo SIV, retomando este procedimiento las principales características del descrito anteriormente.
La invención tiene igualmente por objeto un kit par la aplicación de los procedimientos de amplificación génica anteriormente mencionados. a título de ejemplo, un kit de la presente invención comprende:
-
al menos un cebador o un par de cebadores oligonucleotídicos según la invención, comprendiendo cada par un cebado que hibrida a una de las cadenas de la secuencia de ácido nucleico que se va a detectar, y un cebador que hibrida con la cadena complementaria de este último en las condiciones anteriormente definidas,
-
reactivos apropiados para la puesta en práctica del ciclo de operaciones de amplificación, especialmente ADN polimerasa, cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y el medio de reacción denominado "10 x buffer" descrito anteriormente,
-
una (o más) sondas, que se puede marcar, especialmente por radiactividad o por la técnica de las sondas frías, capaz de hibridar específicamente con la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos amplificada(s) que se van a detectar.
Se describe también la utilización de los cebadores de la invención indicados anteriormente para la puesta en práctica de un procedimiento de síntesis de proteínas codificadas por las secuencias nucleotídicas amplificadas con la ayuda de estos cebadores.
A título ilustrativo, este procedimiento de síntesis de proteínas comprende la amplificación de secuencias nucleotídicas de los genomas de los virus del tipo VIH o SIV (que codifican una proteína determinada y que han experimentado, en su caso, algunas modificaciones de sus nucleótidos) por puesta en contacto de dichas secuencias con al menos un par de cebadores según la invención en las condiciones anteriormente descritas, seguida de la traducción de estas secuencias así amplificadas en proteínas: esta última etapa se realiza especialmente por transformación de células huéspedes apropiadas con la ayuda de vectores que contienen dichas secuencias amplificadas, y recuperación de las proteínas producidas en estas células huéspedes.
Se describen igualmente los polipéptidos procedentes de la traducción de las secuencias (o cebadores) nucleotídicas de la invención.
La solicitud describe también la utilización de los cebadores oligonucleotídicos antisentido como agentes antivirales en general, especialmente en la lucha contra el SIDA, así como composiciones farmacéuticas que contienen estos cebadores antisentido en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se describen igualmente las composiciones inmunógenas que comprende uno o más productos de traducción de las secuencias nucleotídicas según la invención, y/o uno o más productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas según los procedimientos descritos anteriormente a partir de los cebadores definidos según la invención, asociándose estos productos de traducción a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se describen los anticuerpos dirigidos contra uno o varios de los productos de traducción descritos anteriormente (o dicho de otro modo, susceptibles de formar una reacción inmunológica con uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas según la invención, o también uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas a partir de los cebadores definidos según la invención) y su utilización para la puesta en práctica de procedimientos de diagnóstico in vitro de la infección de un individuo por un virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2, o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, SIV) según los procedimientos conocidos por el experto en la técnica.
A título ilustrativo, tal procedimiento de diagnóstico in vitro comprende la puesta en contacto de una muestra biológica (especialmente suero) procedente de un paciente en estudio, con anticuerpos descritos, y la detección con la ayuda de cualquier procedimiento apropiado (especialmente con la ayuda de antiinmunoglobulinas marcadas) de los complejos inmunológicos formados entre los antígenos de los virus del tipo VIH o SIV eventualmente presentes en la muestra biológica y dichos anticuerpos.
Se describen kits de diagnóstico in vitro que comprenden anticuerpos descritos, y en su caso, reactivos apropiados para la identificación de la reacción inmunológica formada entre dichos anticuerpos y los antígenos de los virus VIH o SIV.
Se describe igualmente un procedimiento de preparación de los polipéptidos anteriormente mencionados, especialmente los que corresponden según el código genético universal a las secuencias (o cebadores) nucleotídicas descritas anteriormente, caracterizándose este procedimiento porque, partiendo preferiblemente del aminoácido C-terminal, se condensan sucesivamente de dos en dos los aminoácilos sucesivos en el orden requerido, o aminoácilos y fragmentos previamente formados y que ya contienen diversos residuos aminoácilos en el orden apropiado, o también diversos fragmentos previamente preparados de este modo, entendiéndose que se habrá tenido cuidado de proteger previamente todas las funciones reactivas llevadas por estos aminoácilos o fragmento con la excepción de las funciones amina de uno y carboxilo del otro o viceversa, que deben intervenir normalmente en la formación de los enlaces peptídicos, especialmente después de la activación de la función carboxilo, según los procedimientos conocidos en la síntesis de los péptidos y así sucesivamente, progresivamente, hasta el aminoácido N terminal.
Por ejemplo, se recurrirá a la técnica de síntesis peptídica en solución homogénea descrita por Houbenweyl en "Methode der Organischen Chemie" (Método de la química orgánica) editado por E. Wunsch, vol. 15-I y II THIEME, STUTTGART, 1974, o a la de síntesis peptídica en fase sólida descrita por R.D. Merrifield en "Solid Phase Peptide Synthesis" (J.AM. CHEM. SOC., 45,2149-2154).
Se describe igualmente un procedimiento de preparación de las secuencias (o cebadores) nucleotídicas descritas anteriormente, comprendiendo este procedimiento las siguientes etapas:
-
incubación del ADN genómico, aislado a partir de uno de los virus del tipo VIH o SIV anteriormente mencionados, con ADNasa I, y a continuación adición de EDTA y purificación por extracción a la mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25-24-1) y a continuación por éter.
-
tratamiento del ADN así extraído por Eco R1 metilasa en presencia de DTT, y purificación por extracción tal como se describe anteriormente,
-
incubación del ADN así purificado con los 4 trifosfatos de desoxinucleótidos dATP, dCTP, dGTP y dTTp en presencia de T4 ADN polimerasa y de ADNligasa de E. coli, y a continuación purificación según el procedimiento descrito anteriormente,
-
clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico buscado con la ayuda de una sonda apropiada.
Un procedimiento de preparación particularmente ventajoso de las secuencias nucleotídicas de la invención comprende las siguientes etapas:
-
la síntesis de ADN utilizando el procedimiento automatizado de las \beta-cianetil fosforamiditas descrita en Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986),
-
la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico por hibridación con una sonda apropiada.
Otro procedimiento de preparación de las secuencias nucleotídicas de la invención comprende las siguientes etapas:
-
el ensamblado de los oligonucleótidos químicamente sintetizados, provistos en sus extremos de sitios de restricción diferentes, cuyas secuencias son compatibles con el encadenamiento de aminoácidos del polipéptido natural según el principio descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80; 7461-7465, (1983),
-
la clonación de los ácidos nucleicos obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico buscado por hibridación con una sonda apropiada.

Claims (13)

1. Oligonucleótido específico del gen gag elegido entre:
-
5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3'
-
5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3'
-
5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3'
-
5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3'
-
5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3'
-
5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3'
-
5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3'
-
5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3'
-
5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3'
-
3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5''
-
3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5'
-
3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5'
-
3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5'
-
3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5'
-
3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5'
-
3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5'
-
3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5'
-
3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
2. Oligonucleótido complementario de un oligonucleótido tal como se define en la reivindicación 1.
3. Par de cebadores oligonucleotídicos para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus del tipo VIH-1, VIH-2 y VIS, consistiendo cada uno de los cebadores en:
i) una secuencia específica del gen gag, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºC\pm1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, o
ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i).
4. Par de cebadores según la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia de al menos un cebador oligonucleotídico está modificada con respecto a la secuencia del gen gag de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y VIS Mac.
5. Par de cebadores según la reivindicación 3 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus de tipo VIH-1, VIH-2 y SIV, consistiendo los cebadores en:
i. al menos una mezcla elegida del siguiente grupo de mezclas de secuencias con sentido:
Mmy1: mezcla constituida por las secuencias
5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3',
5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
MMy2: mezcla constituida por las secuencias
5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3'
5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3',
5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3',
\vskip1.000000\baselineskip
MMy4bis: mezcla constituida por las secuencias
5'-CAT CAA GCA GCC AGT CAA AG-3',
5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3',
\vskip1.000000\baselineskip
MMy28: mezcla constituida por las secuencias
5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3',
5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3',
\vskip1.000000\baselineskip
y al menos una mezcla elegida del siguiente grupo de mezclas de secuencias antisentido:
MMy3: mezcla constituida por las secuencias
3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5',
3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5',
\vskip1.000000\baselineskip
MMy4: mezcla constituida por las secuencias
3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5',
3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5',
\vskip1.000000\baselineskip
MMy4B: mezcla constituida por las secuencias:
3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5',
3'-CTC TGC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5',
\vskip1.000000\baselineskip
MMy28bis: mezcla constituida por las secuencias
3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5',
3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5',
3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'.
6. Par de cebadores según la reivindicación 5 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, consistente en:
i) MMy1-MMy3:_
5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3'
5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3'
3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5''
3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5'
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
ii) MMy1-Mmy4:_
5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3'
5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3'
3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5'
3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5'
\vskip1.000000\baselineskip
iii) MMy2-MMy4:_
5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3'
5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3'
5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3'
3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5'
3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5'
\vskip1.000000\baselineskip
iv) MMy4Bbis-Mmy28bis:_
5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3'
5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3'
3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5'
3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5'
3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
7. Oligonucleótido o par de cebadores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, susceptible de hibridar con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y VIS Mac en un tampón de composición Tris-HCl 50 mM, pH 8,9, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, MgCl_{2} 5 mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM, gelatina 0,25 mg/ml.
8. Procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS, realizado a partir de una muestra biológica, comprendiendo este procedimiento principalmente las siguientes etapas:
a)
una etapa de extracción del ácido nucleico que se va a detectar perteneciente al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente citada y, en su caso, una etapa de tratamiento con ayuda de una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN,
b)
un ciclo que comprende las siguientes etapas:
-
desnaturalización del ácido nucleico bicatenario que se va a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico monocatenario,
-
hibridación de cada una de las cadenas de ácido nucleico obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente con al menos un cebador o un par de cebadores según una de las reivindicaciones 1 a 7, mediante la puesta en contacto de las cadenas anteriormente citadas con al menos un par de los cebadores anteriormente citados,
-
formación a partir de los cebadores de ADN complementarios con las cadenas con las que hibridan en presencia de una ADN polimerasa y de cuatro trifosfatos de nucleósidos (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos bicatenarios que no se van a detectar más que en la etapa de desnaturalización precedente,
repitiéndose este ciclo un número determinado de veces para obtener dicha secuencia nucleica que se va a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección,
c)
una etapa de detección de la eventual presencia del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 y/o VIS en la muestra biológica.
\global\parskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa de desnaturalización se realiza en presencia del (o de los) par(es) de cebadores según una de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque se realiza en las siguientes condiciones:
a)
hibridación: se ponen los cebadores (1 \mul de una solución 40 \mumolar de cada cebador) en presencia de matriz de ADN (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, después se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de matriz de ADN y de cebadores en agua que contiene hielo. Los cebadores se deben utilizar a una concentración final en la siguiente etapa de amplificación de 0,8 \muM cada uno;
b)
amplificación: se añaden al medio precedente los 4 dNTP, utilizándose cada uno a 0,5 \mumolar en la solución final (50 \mul), y una unidad de Taq polimerasa para un medio de reacción de 50 \mul.
11. Aplicación del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en el diagnóstico in vitro de infección de un individuo por un virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, VIS).
12. Kit para la puesta en práctica de un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2, y/o SIV realizado a partir de una muestra biológica que comprende:
i)
al menos un cebador o un par de cebadores oligonucleotídicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
ii)
reactivos apropiados para la puesta en práctica del ciclo de operaciones de amplificación, especialmente ADN polimerasa, cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y el tampón 10 x buffer tal como se describe en la reivindicación 10,
iii)
una (o más) sondas, que puede estar marcada, capaz de hibridar con la(s) secuencia(s) de ácido nucleico amplificada(s) que se van a detectar.
13. Utilización de al menos un cebador o de un par de cebadores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS.
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