JPS63503513A - Lavウィルス変異株、これらのdnaおよびタンパク成分ならびに、特に診断目的および免疫原性組成物製造用のそれらの用途 - Google Patents
Lavウィルス変異株、これらのdnaおよびタンパク成分ならびに、特に診断目的および免疫原性組成物製造用のそれらの用途Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
明細書
LAVウィルス変異株、これらのDNAおよびタンパク成分ならびに、特に診断
目的および免疫原性組成物製造用のそれらの用途
本発明は、リンパ節症(以下、LASと略記)、後天性免疫不全症候群(以下、
AIDSと略記)を誘発し得るウィルス、このようなウィルスの抗原、特に精製
抗原、およびこのような抗原、特にウィルスのエンベロープ抗原の製造法に関す
る。また、本発明は、糖鎖の有無に拘わらず、こさらに、本発明は、以降に開示
する新たなリンパ節症関連ウィルス(LAV)のゲノムRNAないしDNAとハ
イブリダイゼーション可能なりローン化DNA配列、およびこれらの製造法なら
びに使用に関する。尚さらに、本発明は、新たなLAVもしくは関連ウィルスま
たはDNAプロウィルスを、如何なる培地(とりわけ、それらを含む生物学的試
料)中での検出に用いられるDNA配列を含む安定なプローブに関する。
重要な遺伝子レベルでの多形現象は、後天性免疫不全症候群(AIDS)、およ
びリンパ節症(LAS)、AIDS閏連疾患(A RC>、ある種の脳障害等の
その他の疾患の発生源となるヒトのレトロウィルス(総説については、He1s
s。
1984参照)に関して認められている。実際、現在までに分析された分離株の
すべてにおいて、それらが同一の場所および時期に得られたものであっても、異
なった制限地図が提示された( BENNら、 1985) 、同一の制限地図
は、リンパ節症ウィルス(LAv) (ALIZONら、 1984) オよび
ヒト3型T細胞白血病ウイルス(HTLV−3,HAFINら、 1984)と
命名された最初の2つの分離株にのみ認められ、これは例外と見られている。A
IDSウィルスの遺伝子レベルでの多形現象は、以下のウィルスの完全なヌクレ
オチド配列の決定後に、その評価がよりよく行われた。LAV (W^IN−)
IOBSONら、 1985) 、HTLV−3(RATHERら、1985゜
MUESINGら、 1985) 、およびAIDS関連レトロウィルスと命名
された第3の分離株< A RV > (5ANC)IEZ−PESCADOR
ら、 1985) 、特に、制限酵素切断地図での多形現象の原因となる核酸変
異の外に、分離株は、アミノ酸置換と相互の挿入−欠失の双方によって(RAB
SONおよびMARTIN、 1985)、タンパクレベル、特にエンベロープ
のタンパクレベルで顕著な違いが見られるようであった(ARVとLAV間にお
ける差異、13%以下)。
しかし、上記の差異によっても、類似タンパク、すなわち、p25タンパクのよ
うな類似の性質を有するコアタンパク、または110−120kD糖タンパクの
ような類似のエンベロープ糖タンパクが有する免疫的交差反応性によって示され
るような免疫学的関連性のレベルが甚だしく崩壊されるまでには至らない、従っ
て、前記の如何なるLAVウィルスのタンパクも、in vivoで誘発され、
他のLAV変異体に感染した個体から得られた生物流体中に存在する抗体のin
vitroでの検出に対して用いることができる。従って、こういったウィル
スは、LAVウィルスの一クラスに分類され、以後一般にLAV−1ウイルスの
クラスに属すると言うことにする。
本発明は、新しいウィルスの発見に端を発するが、それは、臨床上AIDSに関
連する疾患の原因となり、尚もrLAV−1ウイルス」のクラスに属するが、遺
伝学的に上記のLAV変異株とは顕著に異なったウィルスである。
この新しいウィルスは、基本的に第7A図ないし第7J図(L A V t+−
+)、および第8A図ないし第8工図(LAVMAL)でそれぞれ示されるDN
A塩基配列に特徴がある。
さらに、本発明は、RNAまたはこのRNAに由来するしいウィルスの変異体に
関する。
また、本発明は、前記ウィルスに由来し、L A V t L IまたはLAv
PIALのゲノムRNAとハイブリダイゼーションし得るDNA断片を含む、前
記ウィルスのDNA自体に関する。特に、前記DNAは、前記cDNAまたはc
DNA断片から成るか、その両者いずれかを含む組換型DNAから成る。
さらに、本発明は、L A V t L IもしくはLAV、IAL、または関
連ウィルスのDNAまたはcDNA断片を含む組換型DNAに関する。勿論、断
片がなんらかの欠失または突然変異を含んでいても、L A V E L□もし
くはL A V * ALのレトロウィルスゲノムとのハイブリダイゼーション
能力に実質的な変化が6なければ、そういった断片は、上記で詳述したDNAま
たはDNA断片の明白な等傷物を形成すると看倣すべきである。
また、特に本発明は、本発明の如何なるDNA断片がらも作ることができるクロ
ーン化プローブ、従って、そのような断片を含む組換型DNA、特に、原核もし
くは真核細胞中で増幅でき、上記の断片を含む如何なるプラスミドにも関する。
分子のハイブリダイゼーションプローブとして、LAVo、またはLAVPIA
LのDNA断片を含むクローン化DNA(放射性ヌクレオチドまたは蛍光試薬で
の標識によって)を用いれば、LAVヴイリオンのRNAを、例えば、血液、体
液、または血液製剤(例えば、第■因子濃縮製剤のような抗血友病因子)中で直
接検出し得る。こういった検出を可能にする適切な方法では、例えば、ニトロセ
ルロースフィルター等の支持体上へウィルスを固定化し、ヴイリオンを゛破壊し
、標識(放射線ラベル、または非放射性(「コールド」)の蛍光もしくは酵素ラ
ベル)プローブとハイブリダイゼーションさせる。そのような方法は、末梢血中
のB型肝炎ウィルスに対して既に開発されている(SCOTTOJら、Hepa
tology(1983)没、379−384による)。
本発明のプローブは、LAV関連症候群の患者の組織に由来するゲノムDNAの
迅速なスクリーニング用にも使用できる。これは、宿主組織またはその他の組織
中に存在するプロウィルスDNAまたはRNAがLAv!L、またはLAV、I
ALに関連しているかを調べるためである。
そのようなスクリーニングに用いられる方法には、以下の工程が含まれる0組紐
からのDNAの抽出、このDNAの制限酵素分解、生じた断片の電気泳動、およ
び組織から得られたゲノムDNAのサザンブロツティング、それに続く標識クロ
ーン化LAVのプロウィルスDNAとのハイブリダイゼーション、さらに、in
5ituでのハイブリダイゼーションも使用できる。
また、ヒト、霊長類ならびに他の哺乳類のリンパ液および組織ならびに他の非リ
ンパ組織もスクリーニングにかけ、他の進化的に関係のあるレトロウィルスの存
在を調べることができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄が非緊縮条件下で
行われても、上記の方法を用いることができる。
なお、本発明のDNAは、診断法としてLAVウィルス抗原の発現、およびLA
Vに対するワクチンの製造にも用いられる。この点で特に有利な断片は、以降で
考察する。
使用可能な方法を幾つか列挙する。
a)リン酸カルシウム沈澱法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト融合
法等の様々な方法により、適当な選択マーカーをもった哺乳類細胞中にDNAを
トランスフェクションする。
b)遺伝子に対応したDNA断片は、大腸菌、酵母または哺乳類m服用の発現ベ
クターにクローニングし、その結果得られるタンパクを精製することができる。
C)プロウィルスは、「ショットガン」(断片化)法によって原核細胞の発現ベ
クター中に入れ、融合ポリペプチドを作成すること、ができる、抗原性を有する
融合タンパクを産生する組換体は、LAV!L、またはLAV、A、、抗原に対
する抗体を用いた、組換体の簡単なスクリーニングによって同定することができ
る。
この点に関しては、図中でオープンリーディングフレーム中にあり、図示のポリ
ペプチド骨格を有する産物をコードする、LAVEL+およびLAvMALゲノ
ムの一部が挙げられる。
さらに、本発明は、第7A図ないし第8I図に見られる様々なポリペプチドに関
する。ヨーロッパ出願第0178978号、および1985年10月18日に提
出されたPCT出願のPCT/EP85100548に開示された方法は、対応
するウィルスがら上記のような=ペプチドを製造するのに応用可能である。
本発明の目的は、L A V E L、 IまたはLAvIIALゲノムがコー
ドし、それらが発現するタンパクに含まれる抗原決定基から成るポリペプチドと
共通の配列を含むポリペプチドを提供することにある6本発明の別の目的は、特
に、AIDSもしくは潜伏性プレAIDSに感染した患者に対し、またはより一
般的に無症候性キャリヤーおよび血液製剤中で、LAVウィルスに関連したタン
パクの検出、特にAIDSもしくは潜伏性AIDSの診断に用いる手段、あるい
はこれとは対照的に、LAVウィルスもしくはその関連タンパクに対する抗体の
検出に用いる手段を提供することである。
本発明の最後の目的は、免疫原性ポリペプチド、より特定的にはAIDSもしく
は関連症候群に対するワクチン組成物製造用の保護ポリペプチドを提供すること
にある。
さらに、本発明は、低分子量であって、第7A図ないし第81図に示すものと共
通のペプチド配列または断片を有するポリペプチド断片に関する。サイズの小さ
な断片は、既知の手法を用いて得ることができる。そのような方法の例として、
特異的サイトでポリペプチドを切断し得る酵素による、元の大きなポリペプチド
の切断が挙げられる。このようなタンパクの例として、黄色ブドウ球菌(江吐「
匡−りじ且L」−aureus)V 8の酵素、α−キモトリプシン、BOEt
lRINGER社の「マウス顎下腺プロテアーゼJ 、Vibri。
a! 1nol Lieus ehe+*ovar 7−のコラ−ゲナーゼ等が
挙げられ、これらは前記ペプチドのGly−ProおよびGly−Ala等を特
異的に認識する。
本発明のその他の特徴は、L A V ELIおよびL A V MALから得
られたデータに関する以降の開示に見られよう、これについて、次の一連の図が
参照となる。
◆第1Aおよび18図には、L A V 、、、J (1983年7月15日に
第1−232号としてCNCMに寄託された既知のLAV分離株)と比較しての
、L A V t L IおよびL A V n A Lゲノムの制限酵素切断
地図を示す。
◆第2図には、上記ゲノムのオープンリーディングフレームの相対位置を記した
比較地図を示す。
◆第3Aないし3F図(以降、しばしば総括的に第3図として引用)には、オー
プンリーディングフレームでコードされたタンパク(または糖タンパク)間の相
対的な対応を示す、ここで、L A V ELIおよびL A V N ALの
タンパクのアミノ酸残基は、L A V souにおける対応または相同タンパ
クまたは糖タンパクのアミノ酸残基(番号の付いた)と対応して縦に並んでいる
。
◆第4Aないし4B図(以降、しばしば総括的に第4図として引用)には、L
A V m−U、 L A V HLxならびにL A X’ MALの相同タ
ンパク間における配列分岐の定量結果を示す。
◆第5図には、ウィルスの様々なエンベロープタンパクの分岐度を模式的に示す
。
◆第6Aおよび6B図(あるいは、一括して第6図)には、様々なAIDSウィ
ルス分離株のタンパクに見られる同方向反復配列を明らかにして示す。
◆第7Aないし7J図、および第8Aないし8工図には、L A V−Llなら
びにL A V MALそれぞれの完全なヌクレオチド配列を示す。
1」
2人のアフリカ人の分離株における特性決定ならびに分子レベルでのクローニン
グ。
異なったAIDSウィルス分離株は、患者の名前を表す3文字の下つきで示す、
L A V BRυは、フランスの同性愛者でリンパ節症患者から1983年
に分離したAIDSウィルスの原型を示すが、前年アメリカで感染したと考えら
れている°(Barr&−5inoussiら、 1983) 、ザイールに起
源を発する、2人のアフリカ人の両分雌株は、L A V t L rが24才
の女性AIDS患者から1983年に発見されたものであり、LAVPIALが
7オの小児ARC患者から1985年に発見されたものである。後者は、彼の両
親がLAV陰性血清であったので、恐らくザイールで輸血後の1981年に感染
したと見られる。
2種類の各ウィルスの回収および精製は、1984年9月9日提出のヨーロッパ
特許出願第84401834/138667号に開示された方法に従って実施し
た。
LAVtL□およびL A V NALは、それらの構造的および機能的特性に
よって、性質の分かっている従来の分離株と1nvitroで識別し得る。患者
、ELIならびにMALの血清、および対照血清において、ウィルスの代謝的ラ
ベルおよび免疫沈降を調べたところ、L A V EL工とL A V NA
Lのタンパクは、同一の分子量(MW)を有し、rLAV−IJクラスの原型A
IDSウィルスのタンパクと免疫交差反応(データは示さない)を起こすことが
明らかにされた。
本発明で用いた精製法、制限酵素切断地図作成法(マツピング)、および塩基配
列決定法に関しては、更にヨーロッパ出願第178978号、および国際出願第
PcT/E P 85100548号が参考となる。また、以降の「実験法」な
らびに「図面の説明」も参照されたい。
L A V ELIおよびL A V 、、Lゲノムに関する最初の制限酵素分
析は、プローブとしてクローン化LAV、Rυの全ゲノムを用いて、急性6染リ
ンパ球由来の全DNAをサザン法で解析することによって行われた。ハイブリダ
イゼーションのすべては緊縮条件下で観察されたが、2人のザイール人の分離株
における制限酵素切断地図の特徴は明らかに異なっていた。完全なウィルスの遺
伝情報を運ぶλファージのクローンが得られ、さらに、その特徴が制限酵素によ
るマツピングおよびヌクレオチド配列解析から明らかになった。すなわち、クロ
ーンE−H12はL A V EL、の怒染紺胞から由来し、5“のフランキン
グ領域に細胞性配列を有し、3°末端には頭を欠いた長鎖同方向反復配列(LT
R)を有するプロウィルスが組み込まれている。クローンM−H1lは、その制
限酵素切断地図がLAV、IAL感染細胞がらのDNAを完全にHindI[で
切断(LTR中に存在する唯一のHindlサイトを利用)して得られた。従っ
て、恐ら(M−Hllは、組み込まれていないウィルスDNAに由来するのであ
ろう、何故ならば、後者の種は組み込まれたプロウィルスより少なくとも10倍
多いためである。
第1B図には、L A V −L、 I、LAVNAL、および原型LAVIR
L+に関する制限酵素切断地図の比較を示す、これらの地図はすべて、ヌクレオ
チド配列から得られたものである。
またこの図には、以前7つの制限酵素を用いてマツピングした3人のザイール人
の分離株(Bennら、 1985)の地図と比較して示した。解析の対象とな
った数は限られているが、それらプロフィールのすべてが明らかに異なっている
(LA V 、、Uの制限酵素切断地図にある23個のサイトのうち、7個だけ
が図示した6つすべての制限酵素切断地図に存在する)ので、AIDSウィルス
の遺伝子レベルでの多形が確かめられた。5つのザイール人の制限酵素切断地図
間で明白な関係はないが、それらの共通サイトのすべてはLAV I RUにも
認められるものである。
遺伝子配列機構の保存性
クローン化ゲノムのヌクレオチド配列がち推論するところでは、L A V E
LIおよびLAV□、の遺伝子配列機構は、その他の分離株に見いだされたもの
と同じである(すなわち、5′末端−gag−pol=中心領域−env−3゜
末端)、i!Lも原著な特徴は、pol−env間に位置する中心領域の保存性
(第2図)である、なお、これらは、ヒッジのレンチウィルス・ビスナに見いだ
された( Sonigoら。
1985 )のもと同じ機構で、我々が以前Q、R,S、TならびにUと命名し
た一連の重複オーブンリーディングフレーム(orf)により構成されている。
orf−S (rtatJとも呼ばれる)は、ウィルスの発現の相互活性化に関
与する( 5odroskiら、1985.Aryaら、 1985) 、 o
rf−Q(rsOrJまたはorf−A、とも呼ばれる)の生物学的機序は未だ
に不明である( Leeら、 1986; Kangら、 1986) 。
その他の3つのorf (R,TならびにU)のなかでは、o r f−Rだけ
が7番目のウィルス遺伝子のようである。
これは以下の理由による。QならびにSに関する相対位置の厳格な保存性(第2
図)、スプライス・アクセプタならびにAUGのイニシエーター・コドンが常に
存在する可能性、ウィルス遺伝子に関する同一コドンの使用、および異なった分
離株内でタンパクのアミノ酸配列がgag、p。
lならびにQのそれと比較し得る事実(第4図参照)。
さらに、以下のものも保存される。LTRのU3、RならびにU5エレメントの
サイズ(データは示さない)、TATAボックスならびにAATAAAポリアデ
ニル化シグナルのようなそれらの調節エレメントの位置ならびに配列、およびそ
れらの隣接領域(すなわち、tRNA”’3の3′末端に相補的なプライマー結
合サイト(PBS)およびポリプリン領域(PPT)l 、LTR内における殆
どの遺伝子レベルでの変異は、U3の5′末端側半分(、orfFの一部をコー
ドする)に位置している。一方、U3およびRの3°末端はシス型調節エレメン
トの殆どを有し、プロモーター、エンハンサ−およびトランス型因子レセプタが
よく保存されている。
全体として、ザイール人がらの分離株は、以前に配列決定されたアメリカおよび
ヨーロッパ起源の分離株と同じタイプに属する可能性が高い。
ウィルスタンパクの変異性
上記の分離株のすべては、同一の遺伝子構造を有するが、それらのタンパクの一
次構造には大きな差異が認められている。第3Aないし3F図には、LAV□8
およびARV2のアミノ酸配列と共に、L A V !LlおよびL A V
、、、のアミノ酸配列を示す(第7A〜75図、および第8A〜8工図を組み合
わせて調べた)、これらの分岐度は、双対の共線解析(第4図)によるアミノ酸
置換のパーセントとして定量的に示す、また、各配列中に生じたにちがいない挿
入および欠失を計測した。
上記の事実から、3つの大きな観察結果が引き出される。
第一には、アフリカ人由来の分離株のタンパクにおけるアミノ酸配列は、HTL
V−3およびARV2のそれより順著にL A V **uから分岐しており(
第4A図)、ARV2を対称としても、同様の結果が得られる(データは示さな
い)、AIDSウィルス分離株間の遺伝子レベルでの多形の範囲は、従来の観察
結果より極めて広い、二番目として、我々が調べた2つの配列から、エンベロー
プは、gagおよびpo1遺伝子より変異しやすいことが認められた。なお、L
Av、、lUとHTLV−3のエンベロー1間で観察された、比較的小さな差異
は例外と見られる。三番目として、2人のアフリカ人からの分離株における相互
の分岐度(第4B図)は、L A V 、、uとそのどちらかの間の分岐度と比
較が可能である。配列が決定した3種類の分離株(アメリカならびにヨーロッパ
からの分離株、およびアフリカからの2種類の分離株)によって推定し得る限り
では、アフリカのAIDSウィルスは盟著な進化を経てきたことが考えられる。
a および o1タンパク:エンベロープに比較して、これらのアミノ酸配列の
保存性が高いので、これに対応する遺伝子領域には重要な構造または酵素活性の
情報がコードされている。3種票の成熟gagタンパクの中で、LAvの抗原タ
ンパク(Barr6−Sinoussiら、 1983)によって最初に認諾さ
れるp25も、アミノ酸の保存性がよい(第3図)、gagおよびpotにおい
て、分難株間の差異は、基本的には点突然変異により、極めて少数の挿入および
欠失も認められる。これらの中で、12個のアミノ酸(AA)が挿入したしAV
ouのgagおよびpolの重複領域の存在に注意を払う必要がある。この挿入
は、上記の分離株および)(TLV−3中にのみ存在する36bpの同方向反復
配列の第2のコピーによってコードされたものである。
このような重複は、公開されたL A V B Ruの配列(1712位、l1
ain−Flobsonら、 1985)における計算ミスノタメ除外したが、
実際には、HTLV−3の配列に存在していた( Ratnerら、 1985
; Muesingら、 1985)。
env:エンベロープの糖タンパク前駆体において、3つの断片を区別すること
ができる(AI fanら、 1985; Montan−gnierら、 1
985; DiMarzoVeroneseら、 1985) 、第1の断片は
、エンベロープのシグナルペプチドであり(第3図において、1〜33位)、そ
の配列は変化し得る。第2の断片(34〜530位)は、エンベロープの外膜タ
ンパク(OMPまたはgpllo)を形成し、殆どの遺伝子変異(特に、多数の
相互挿入ならびに欠失の殆どすべて)がここに生じる。第3の断片(531〜8
77位)は、塩基の一定配列(Arg−Glu−Lys−Arg)に続く潜在的
切断サイトによってOMPから離れた位置にあり、細胞膜中のエンベロープ糖タ
ンパクをつなぎ止める機能の膜間タンパクを形成する( T M Pまたはgp
41)、TMPの保存性はOMPより優れており、そして、これは様々なマウス
白血病ウィルス(ML V 、 Kochら、 1987)間で認められ、タン
パク分子の構造的制約によると考えられている。
第3図のアミノ酸配列、および第5図のエンベロープ変異性のグラフ図によれば
、殆どあるいは全く遺伝子レベルでの変異のない保存領域、および様々な配列が
非常に異なっている超可変領域(多数の突然変異、および相互挿入ならびに欠失
の発生による)の存在が明確に認められる。なお、HTLV−3エンベロープの
配列は上記の例に含めなかった。というのは、それが、超可変領域でさえL A
V wuの配列と酷似していた(第4図参照)ので、解析結果になにも影響を
与えなかったからである。このグラフ図は、さらに多くのデータによって充実す
るが、超可変領域(Hyl、2ならびに3)に関する概略的パターンはすでに明
らかとなっている。そして、そのすべてがOMP中に位置し、恐らく重要な生物
機能と関連した3つの保存性のよい領域(第3図の配列における37〜130.
211〜289、および488〜530残基)を介して離れて存在する。
遺伝子レベルでの変異性が著しいにも拘わらず、エンベロープ糖タンパクの三次
構造は恐らく一定であろう、その証拠に、殆どすべてのシスティン残基の位置が
異なった分離株間で保存されており(第3および5図)、3つのシスティン残基
だけがTMPのシグナルペプチドまたはC末端領域に存在する。OMPの超可変
領域が保存性シグナルにつながっているが、この事実から、それらが共通の三次
構造に付着するループであると考えられる。また、様々なエンベロープタンパク
の疎水性領域を計算(KyteおよびDoo−little、 1982) L
なところ、それらの保存性は極めて高かった(データは示さず)。
ザイール人からの分離株のエンベロープに見いだされるNグリコジル化サイト、
Asn−X−3er/Thrの約半数がL A V axuの同位置にマツプさ
れる( L A V−L+では17/26、LAVNALでは17/28>、そ
の他のNグリコジル化サイトは、envの可変領域内にあるが、このことから、
異なった分離株間でエンベロープのグリコジル化の程度に差があると考えられる
。
の のウィルス ンパ :同定の完了した他の3つのタンパクのうち、envの
3°末端側のorfF(^l1enら。
1985b)によってコードされたP27のアミノ酸配列の差異が最も大きい(
第4図)、中心領域のorfQおよびorfSによってコードされた残り2つの
タンパクには、挿入または欠失が全く存在しない。env中に見いだされるアミ
ノ酸置換の頻度に比較して、orfSの遺伝子産物(トランス活性化因子)のア
ミノ酸置換頻度の方が高いのは驚異である。一方、orfQによってコードされ
たタンパクは、gagと同様にアミノ酸置換が少ない、さらに、L A V E
L+およびLAvPIALの中心領域によってコードされたタンパクの変異度が
低いのも注目に値する。
(も
5つの別個の分離株からヌクレオチド配列が完全に決定できるので、現在ではA
IDSウィルスの遺伝子レベルでの変異性に関する一般的特徴が幾つか明らかに
なっている。
これに関して、まず第一の根本原因は点突然変異であり、それによってアミノ酸
置換が頻繁に生じ、そしてこの置換はゲノム(orfS、envおよびorfF
)の3°末娼部で頻繁に起きる。あらゆるRNAウィルスと同様に、レトロウィ
ルスもRNAポリメラーゼの複製異常によって、突然変異を極めて起こし易いと
考えられている。それは、複製段階での修正機能がないためである(Holla
ndら、1982゜5LeinhauerおよびHo1land、 1986)
。
遺伝子レベルでの変異に関する別の原因は、挿入または欠失である。第3図のア
ミノ酸配列から、殆どの場合で挿入が生じているようであり、そうでなければ、
それぞれの分離株の全く同じ位置に欠失が起きているはずである。さらに、この
ような挿入の解析が完了するや、我々は、それらが同方向反復配列の2つのコピ
ーのうちの1つであることが多いのに気付いた(第6図)、なお、L A V
m *。のgag−po1重複中の36bP反復配列のように保存性が完全なも
のもあり(第6図−a)、アミノ酸置換を生じる点突然変異を有するものもある
。また、結果的に、envの超可変領域(第6図−gおよびh)での挿入は、そ
れが明らかに起きていても、見いだすことは難しい0点突然変異に着目すると、
env遺伝子およびorfFも、残りのゲノムより挿入による遺伝子レベルでの
変異を生じ易いようである。解析した配列において、このような反復配列の保存
度は、挿入が発生した時期に関連しているにちがいない、縮退の程度が大きいほ
ど、生成時期が古い、L A V 、、UとHTLV3との分岐の生成し、た時
期が新しいことは、それらの相同タンパク間のアミノ酸のミスマツチ数が極めて
少ないことから推測し得る。しかし、L A v**uの反復配列の1つ(en
vのHyl領域中に位置する、第6図f参照)がHTL V B中には存在しな
いので、同方向反復配列のこういった生成が遺伝子レベルの分岐を生じる大きな
原因ということが指摘されている。しかし、我々は、Masor+−Pfize
rサルウィルスのM P M V (Sonigoら、 1986)および免疫
不全症サルウィルスのSRV −1(Powerら、 1986)のような関連
性の深いウィルスを比較しても、そのような現象は少しも認められなかった。同
方向反復配列の1コピーの挿入または欠失は、レトロウィルスの突然変異体で頻
繁に報告されてきた( Shi+eoLohnoおよびTem1n、 1981
;Darlix、 1986)が、我々の観察した範囲では、この現象の発現は
稀である。
こういった重複の分子論的機序は解明されていないが、レトロウィルスゲノムの
二倍性から生じる「選択複写」現象が考えられる( VarmusおよびSwa
nstrom、 1984; C1arkおよびNak、 1983) 、ウィ
ルスDNA鎖の一次構造の合成中に、一つのRNA分子から別のRNA分子への
ジャンプの生じることが知られている。特に、DNAの鋳型上での開裂または安
定な二次構造が存在する場合、この現象が生じる。そして、他方のRNAの鋳型
上に不正確なイニシェーションが再び生じると、短い同方向反復配列の生成(ま
たは排除)に帰着する可能性がある。
遺伝子の変異と、それに続く抗原性の修飾は、微生物にしばしば見られが、宿主
の免疫反応を回避する手段である。
そして、これは、睡眠癩病原虫の中で生じるような感染過程における微生物のエ
ピトープの修飾(BorstおよびCross、1982)、またはインフルエ
ンザウィルス中に見いだされるような多様な抗原の形成(Nebsterら、
1982)によって実現する。ヒトのAIDSウィルスは動物のレンチウィルス
(Son igoら、 1985HChiuら、 1985)と関係があり、そ
の遺伝子レベルでの変異は、ヒツジのレンチウィルス(Scoutら、 197
9; Clementsら、 1980)またはウマの感染性貧血ウィルス(E
I A V 、 Montelaroら、 1984)の感染過程に見られる
ような、抗原性の変異源と考えられよう、しかし、これらの動物実験での大きな
矛盾は、健常なキャリヤー、または軽度もしくは重度のAIDS関連症状を呈す
るAIDS感染者の血清の中和活性が極めて低いか、殆どない点である(Wei
ssら、 1985; C1avelら、 1985) 、さらに、ビスナウィ
ルスでさえも、その病原性に関する抗原レベルでの変異v&楕は正確には解明さ
れていない(ThorIl+arら、 1983゜LuLleyら、 1983
) 、我々としては、次のような感触を得ている。遺伝子レベルでの変異を利用
すれば、例えば、組織または宿主への刺激応答性の修飾といった、様々な環境へ
の適応現象を引き起こすことにより、一般にレンチウィルスの選択的利用が可能
となる。AIDSウィルスの特殊な場合では、遺伝子レベルでの急速な変異が、
特にエンベロープで起こる。こういった変異によって、ウィルスを主な標的細胞
、すなわちT4リンパ球の膜の「微細環境」に適応させることができる。この「
微細環境」は、多形表面タンパクへのウィルスレセプタの接近によって生じ、個
人またはリンパ球間で異なっている。
AIDSウィルスのエンベロープにおける、分離株の殆どのタンパクは免疫的に
交差反応を示すので、AIDSウィルスに対する抗体の検出、および抗原として
精製ヴイリオンの使用に基づくと、遺伝子型の差異が実際の診断用試験法の5受
性に影響を及ぼすことはないようである。しかし、一層強い特異性が期待できる
か、または小さな合成ウィルス抗原もしくは遺伝子工学的に加工されたウィルス
抗原を用いた「第二世代」の試験法の開発にとって、上記の差異が重要であるに
ちがいない、免疫原性の強いエンベロープ糖タンパク、および核の構造タンパク
(gag)の保存領域の同定は、このような試験法にとって非常に重要である。
OMPの終点およびYMPの開始点に見いだされる保存領域(490〜620、
第3図)は、試験法の優れた候補となり得た。というのは、この領域を含む細菌
の融合タンパクが、AIDS患者の血清で頻繁に検出されたからである( Ch
angら、1985) 。
エンベロープ、特にOM Pは、レトロウィルスとその特異的細胞レセプタとの
相互作用を仲介する( DeLarcoおよびTodaro、 1976; R
obinsonら、 1980) 、 AIDSウィルスの場合では、in v
itroの結合アッセイにより、エンベロ−プ糖タンパクのgpHoと、T4細
胞抗原との相互作用が認められた(McDougalら、 1986) 、なお
、この糖タンパクは、ウィルスのレセプタとも、それに関連の深いものとも考え
られている(Klatzmannら、1984; DagIeisbら、198
4)。
相互作用(レセプタと結合領域)を引き起こすAIDSウィルスのエンベロープ
領域の同定は、宿主対ウィルスの相互作用の理解ばかりでなく、予防ワクチンの
調製にとっても重要である。それは、これらのエピトープに対する免疫応答によ
って、恐らく中和抗体が誘導されるがらであろう。
AIDSウィルスのレセプタは、少なくともその一部が一定の構造を形成してい
るので、エンベロープの結合サイトであるT4抗原は、遺伝子レベルでの変異が
ある種のr3i!!応Jを意味する場合でも、分離株間での遺伝子の閏著な変異
が生じる領域によって完全にコードされてはいないようである。タンパクの三次
構造に影響を与えるOMPの保存領域のうち、1箇所または数箇所(第3図のア
ミノ酸配列中の残基37−130,211−289.および488−530)は
、ウィルス対レセプタの相互作用に関与するにちがい°ない、そして、これは、
合成または遺伝子工学的に加工したペプチド(上記の領域由来)を用いた、直接
結合法、またはそれらの領域に対する抗体の中和活性の間接アッセイによって解
明することができる。
アフ1 のAIDSウィルス
ザイール、および中央アフリカの近隣諸国は、風土病であるAIDSウィルス感
染地帯と見られており、このウィルスをアフリカ起源とする見方が激しい議論を
巻き起こした( Norman 、 1985参照)、現在の研究がら、ザイー
ル人のあることが明らかになり、共通の起源が指摘されている。
タンパク間で認められる、極めて重要なアミノ酸配列の差異は、進化上の適応放
散過程と一致する。さらに、2人のアフリカ人の分離株は相互に、既に解析され
たアメリカ人の分離株より分岐度が大きい、その観察結果がら推論する限り、ア
フリカでの進化の過程が長いことが示唆され、先進国よりもアフリカ人の多くが
AIDSウィルスにさらされている事実とも一致する。
最近、西アフリカのギニアビサウ出身のAIDS患者がち分離された新奇なヒト
のレトロウィルスは、形態および生化学的特性(細胞障害性、14928球に対
する細胞向性)の点でLAVに類似しているが、遺伝ならびに抗原性の面では違
いが見られる(C1avelら、1986) 、 FEi田のセネガルでは、人
々は、LAVとも異なるが、明らかに病原性のないレトロウィルスにさらされて
いるようである(Barinら、 1985: Kankiら、 1986)、
上記2種類の新奇なアフリカレトロウィルスは、抗原性の面でサルT細胞白血病
ウィルスの5TLV−IIIに類似しており、正常なアフリカミドリザルならび
に異種のサルに幅広く存在していることが示された(Kankiら、 1985
) 、この事実から、大きなグループのアフリカ霊長類ウィルスは、明らかに非
病原性のサルウィルスからLAVタイプのウィルスまで分布している可能性が生
じた。それらの正確な類縁関係は、遺伝的特徴を完全に決定した後に始めて解明
されるであろうが、それらが共通の先祖から進化してきた可能性が強い。我々は
、重要な遺伝子レベルでの変異を中央アフリカのAIDSウィルス分離株間で観
察してきたが、恐らくこれは全グループの特徴といえ、さらに、各構成ウィルス
間において極めて重要な遺伝的分岐(エンベロープの交差抗原性の喪失)を説明
し得る材料といえよう、こういった意味で、14928球に対する細胞向性の保
存性は、一連のレトロウィルスが獲得した大きな利点といえよう。
犬jLL
ウィルスの分離
LAV、LxならびにLAv、lALは、既知の方法(Barra−Sinou
ssiら、 1983)によって、患者の末梢血がら分離した。
すなわち、患者のリンパ球を分画し、それをインターロイキン2および抗インタ
ーフェロン血清の存在下、植物凝集素で刺激した正常ヒトリンパ球と共に培養し
た。ウィルスの産生は、培養液を対象とした、セルフリー系の逆転写酵素(RT
)活性のアッセイによって測定し、電子順微鏡によって確認した。
分子のクローニング
健常な採血者のリンパ球に、既知の方法(Barra−Sinoussiら、
1983)でウィルスを感染させ、全DNAをRTT性ピークの開始点で抽出し
た。 L A V−Lrについて、L47−1ベクター(LoenenおよびB
rammarら、 1982)を用いたλウィルスのライブラリーを、既決(^
I 1zonら、 1984)に基づ<DNAの部分的Hindll[分解によ
りLAV、ALについては、感染細胞からのDNAをHindl[[で完全に分
解し、9〜10kb分画を0,8%の低融点アガロースゲル上で選別してから、
L47−1のHindllアームにリガーゼを用いて結合させた。LAV、、□
については約5X10’個のプラークが、L A V −At、については約2
×105個のプラークがin vitroでのパックィジング(Δmersha
m )によって得られ、大腸菌LAIOIのプレートに蒔いた。そして、LAV
B Ruゲノムの殆どを有するクローンλJ19の9kbSacI挿入片(A
I 1zonら、 1984)をプローブとして用いて、緊縮条件下の、in
5ituでスクリーニグした。正のシグナルを示すクローンをプラーク精製し、
大腸菌C600recBC上で増殖させた。そして、L A V ILI (E
H12)ならびにLAV、AL(M−Hl 1)の完全な遺伝情報を有する2
つの組換体ファージの特徴を、さらに制限酵素によるマツピングで調べた。
ヌクレオチド配列決定法
E−Hl2ならびにM−Hllに由来するウィルスの断片を、既決(Sonig
oら、 1985)に従って、M13+ap8ベクターへ「ショットガン」法で
クローニング(MessingおよびViera、 1982) した後、グイ
デオキシ法(Sangerら、1977)によってヌクレオチド配列を決定した
。LAvEL、のウィルスゲノムは9176個のヌクレオチドがらなり、LAV
MALのそれは9229個のヌクレオチドがらなっていた。
それぞれのヌクレオチド配列は、平均5個以上のクローンで決定した0本明細書
では完全なヌクレオチド配列は紙幅の都合により提示しないが、それがヌクレオ
チド配列のデータバンクより供与されるようになるまで、著者への請求により自
由に入手し得る。
区画ノとL朋−
第1図:AIDSウィルス分離株の制限酵素切断地図解析。
A/LAVELI (E −H12) オよびLAVllAL(M−Hll)で
感染させた細胞由来のファージスクローン挿入片の制限酵素切断地図、AIDS
ウィルスの遺伝子配列を、模式的に地図の上に示した。LTRは、塗り潰しの線
で示した。 A : Aval、B : BamHI 、 Bg: BglI[
、E:EcoRI 、H: H1ndl[[、Hc:HincU、K:Kpnl
、N: Ndel、P : PstI、S : 5ack、X : Xbal、
アステリスクは、λL47−1ベクターにおけるHindll[クローニングサ
イトを示す。
B/6つの分離株における7種の制限酵素切断サイトの比較、原型AIDSウィ
ルスのLAVllllU、LAV、lALならびにL A V ILI、および
zl、Z2、Z3はザイール人の分離株であり、それらの制限酵素切断地図は論
文発表されている( Bennら、 1985) 、制限酵素切断サイトは、以
下の記号で示す、Bgll[、EcoRI 、 H1ndI[[、HincU、
Kpnl、Ndel、5acl。
第2図:AIDSウィルス分離株の中心領域における遺伝子配列の保存性。
各フェーズの停止コドンは、縦のバーで示す、11!の矢印は、開始コドンの位
置を示す、サブゲノムm RN Aで同定された、スプライスアクセプタ(A)
およびドナー(D)サイトは、L A V s * 、Jの模式図の下に示し、
同様に、LAV ! L +およびLAV、IA5における対応サイトも記した
。PPTは、3°末端LTRに隣接するポリプリン鎖の反復配列を示す、LAV
ouで見いだされた(Wain−Hobsonら、 1985)ように、PPT
は、5°末端がらpol遺伝子の末端にがけて反復した256個のヌクレオチド
より成る。
第3図=4つのAIDSウィルス分社株におけるタンパクのアミノ酸配列。
分離株L A V BRLI (Wa 1n−Hobsonら、 1985)を
対照にとり、A RV 2 (5anehez−Pescadorら、 198
5) 、および2人のザイール人からの分離株、L A V t i、□ならび
にLAVNALに関しては、LAV□8どの差異のみを記した。最低数のギヤツ
ブ(−)が、アミノ酸配列中に導入された。P25”@およびPI3””のN末
端を記入した( 5anchez−Pescador 。
1985) 、シグナルペプチド(sp) 、外膜タンパク(OMP)、および
トランスメンブランタンパク(TMP)を分離する、エンベロープ前駆体におけ
る切断サイトは、樅の矢印で示す、保存性のシスティンには黒塗りの丸印を、変
異性のシスティンには白抜きの四角中を付記した。各アミノ酸に対応するコドン
は、以下のように1字のローマ字で表す、A:Ala、C:Cys、D:Asp
、E:Glu、F:Phe、G:Gly、H:His、I:11e、に:Lys
、L:Leu、M:Met、N:Asn、P:pro、Q:Gln、R:Arg
、5iser、T:Thr、V:Val、W:Trp、Y:Tyr。
第4図:様々な分離株の相同タンパクにおけるアミノ酸配列分岐の定量。
各表のAは、対照としてL A V m−uのタンパクを用いた双対の共線解析
から推測した結果、Bは、L A V tyを対象とした場合の結果をし示す、
材料は、Muesingら、 1985(HTLV−3に関して) 、5anc
hez−Peseadorら、 1985(ARVに関して)、および−ain
−Hobsonら、1985(LAV @ 111+に関して)の指摘による1
表の各項において、タンパクのアミノ酸数<n初のメチオニン残基、またはpo
lのオープンリーディングフレームの開始点がら計算)は左上に示す、その下に
は、配列に含まれる欠失数(左)、および挿入数(右)を記入した。ボールドで
示す大きな数は、アミノ酸置換のパーセント(挿入/排除された欠失)。双対の
共線解析は、コンピューターの補助手段(lllilburgおよびLipma
n、 1983)により、gag ペナルティ−1、K−juple 1 、ウ
ィンド20として実施した。ただし、ギャップの数が最小となり、基本的に第3
図に示すようなアミノ酸配列を有するenvの超可変領域は例外とした。HTL
V−3のorfRでコードされた予想タンパクの配列は、他のすべての分離株に
比較して末堵が不完全なため、比較の対照としなかった。
第5図:AIDSウィルスのエンベロープタンパクの変異度。
env (第3図)中の各アミノ酸の位置Xに関して、変異度(x)を以下の式
によって計算した。
配列中のギャップは、別のアミノ酸が存在しているものと看做す、4つのタンパ
クのあるアミノ酸配列を例にとると、V(x)は、1(4つが同一のアミノ酸)
から16(4つとも異なるアミノ酸)まで分布する。このタイプの式は、従来か
ら免疫グロブリンの可変領域におけるアミノ酸配列の作成に用いられてきた(M
uおよびKabat、 1970) 、 wIの矢印は切断サイトを示し、アス
テリスクは4つの分離株すべてに保存された潜在的なNグリコジル化サイト(N
−X−S/T)を表す、また、黒塗りの三角は保存されたシスティン残基を、黒
塗りの菱形は3つの主な疎水性領域を示す、OMP:外膜タンパク、TMP:)
ランスメンブランタンパク、signal :シグナルペプチド、Hyl、2.
3:超可変領域。
第6図:tl!々なAIDSウィルス分離株のタンパクにおける同方向反復配列
。
これらの例は、第3図に示したgag (a、b)、F(c、d)、およびen
v (e、f、g、h)における決定済みのアミノ酸配列から由来する。同方向
反復配列の2つのエレメントを枠で囲み、縮退位置には下線を引いである。
さらに、本発明は、図に示したポリペプチド構造を含むタンパク、ポリペプチド
または糖タンパクに関する。タンパク、ポリペプチドまたは糖タンパクの最初お
よび最後のアミノ酸残基には、それに関連したオープンリーディングフレームの
最初のアミノ酸から数えた番号が付されている。
しかし、これらの番号は、L A V t□またはLAv、IALの番号に正確
に対応するものではなく、むしろ第3A、3Bおよび3C図に示したタンパクま
たはアミノ酸配列に相当するL A V 、、uの番号に対応する。 L A
V −L Iの「最初のアミノ酸残基」に相当する番号は、L A V *−u
タンパクにおける最初のアミノアシル残基の番号に対応する。なお、このLAV
llRUタンハクは、第3A、3Bおよび3c図ノイづれかにおいて、同方向反
復配列中でそれに対応した、LAVEL+タンパクの最初のアミノ酸を伴ってい
る。従って、関連したアミノ酸配列は第7A〜7図および第8A〜81図から読
み取れるが、その程度の正確さは第3A〜3F図からでは十分でないようである
。
本発明における好ましいタンパクの1次構造は、対応する「最初」と「最後」の
アミノ酸残基の範囲で示される(以下に示す一部の配列を含む、タンパクまたは
糖タンパクの各部も参照のこと)。
OM PまたはgpHoタンパク(前駆体を含む)、1〜530、
OMPまたはgP110タンパク(前駆体は含まず)、TMPまたはgp41タ
ンパクを規定する配列、531〜877、特に、680〜700、OMP内での
保存性の高い領域、
37〜130.211〜289、および488〜。
530、
OMPの最後およびTMPの最初に見いだされる保存性の高い領域、
490〜620゜
「保存性の高い領域」を含むタンパク、またはそれがら成るタンパクは、免疫組
成物の製造、および先に述べたようなりラス1のLAVに対するワクチン組成物
(好ましくは、envタンパク領域に関して)への興味が特に深い。
尚更に、本発明は、図面に詳しく引用し、オープンリーディングフレームに相当
するすべてのDNA断片に関する。
当該分野の技術者であれば、例えば、LAVAL□またはLA V NALの全
ゲノムに対する全DNAの切断(適切な制限酵素を用いた、それらの完全または
部分分解による切断など)、およびそれに続く重要な断片の回収によって、それ
らの総てを利用し得るのが理解されつよう、先に開示した様々なりNAは、適切
な断片源、としても用いられる。適当なプラスミドに組み込める断片の単離に関
するPCT出願で開示された手法は、ここでも応用し得る。
勿論、その他の方法も使用できる。その中の幾つかは、1985年9月17日に
提出されたヨーロッパ特許出願第178.978号に例示されている0例えば、
以下の方法を参考のこと。
a)リン酸カルシウム沈澱法、ポリエチレングリコール分画法、プロトプラスト
融合法等の様々な方法により、適当な選択マーカーを用いてDNAを補乳顕細胞
中にトランスフェクションする。
b)遺伝子に対応したDNA断片は、大腸菌、酵母またはtlIr類細胞のため
の発現ベクターにクローニングし、その結果得られるタンパクを精製することが
できる。
C)プロウィルスは、「ショットガン」法によって原核細胞の発現ベクター中に
断片化し、融合ポリペプチドを作成することができる。抗原性を有する融合タン
パクを産生する組換体は、LAV抗原に対する抗体を用いた、組換体の簡単なス
クリーニングによって同定することができる。
また、本発明は、DNA組換体、特に、前記の如何なるDNA塩基配列をも含む
修飾ベクターに関する。なお、これらのベクターは、対応する微生物または細胞
、特に酵母のような真核細胞(例えば、Saccharomyces cere
visiae)または高等真核細胞(とりわけ、哺乳動物細胞)をトランスフオ
ームするのに適し、そして、対応する微生物または細胞中で前記DNA塩基配列
の発現を可能にするにふされしいものと言える。このような一般的な方法は、1
985年10月18日に提出された上記のPCT特許出願第PCT/EP851
00548号に記載されている。
さらに、本発明は、上記のDNA塩基配列によって修飾され、高等真核細胞(特
に、哺乳動物細胞)をトランスフオームし得る修飾DNA1l換体ベクターに関
する。上記の如何なる配列も、上記ベクターを含むプロモーターの直接制御を受
け、その制御によって上記細胞のポリメラーゼに認諾されるよう組み込まれるこ
とが好ましい、その結果、発現にかかわる最初のコドンが、上記のDNA塩基配
列の最初のトリプレットに対応する。従って、本発明は、LAV、■またはLA
vIIALのゲノムから婦れれる相補的DNA11片、または如何なる適当な方
法によっても得られる相補的cDNAにも関する0例えば、そのような方法には
以下の上記断片に囲まれ、各断片の向かい合う両端の近接した部位が好ましい)
、サイズに応じて、断片の回収および同定。
必要ならば、制限酵素切断地図またはヌクレオチド配列(または、上記DNA断
片にコードされたポリペプチドを含むエピトープに対する特異的モノルローナル
抗体を用いた反応)の点検、そして、さらに必要とあれば、上記DNA断片両端
を所望のヌクレオチド配列にする目的で、断片両端の切り出しく例えば、Ba1
31のようなエキソヌクレアーゼによる)、逆に、クレノー酵素を用いた上記断
片の修復、および上記断片におけるヌクレオチド両側再構成用の合成ヌクレオチ
ド断片の上記両端への結合、続いて、これらの断片を上記ベクターのいずれかに
挿入すると、それでトランスフオームした細胞によって、対応するポリペプチド
を発現させることができる。その後、対応するポリペプチドをトランスフオーム
した細胞から回収(細胞の溶解後であれば、電気泳動によって精製)ことができ
る、言うまでもなく、これらの操作を実施するために、あらゆる従来法を用いる
こともできる。
そのような断片を含む組換体DNA、特に、原核および真核細胞内にて増殖でき
、上記断片を組み込んだ如何なるプラスミドにも間する。
分子レベルでのハイブリダイゼーションプローブとしてクローン化DNA断片(
放射性ヌクレオチドまたは蛍光試薬を用いた標識によって)を利用すれば、体液
または血液製剤(例えば、第■因子濃縮製剤等の抗リウマチ因子)、およびワク
チン(すなわち、B型肝炎用)において、LAVヴイリオンのRN Aを直接検
出することができる。この検出を可能とする適切な方法として、ウィルスの支持
体(例えば、ニトロセルロース等)上への固定化、ヴイリオンの崩壊、および標
識(放射性標識、または「コールド(非放耐性)」の蛍光おjび酵素標識)プロ
ーブを用いたハイブリダイゼーションが挙げられるが、そのような手段は、末梢
血中のB型肝炎ウィルスの検出法として既に開発されている(SCOTTOJ、
Hepatology (1983)、3,379−384) 。
本発明に基づくプローブは、LAV関連症状を呈する患者の組織から由来するゲ
ノムDNAの迅速なスクリーニング用にも使用される。これは、宿主組紐または
その他の組織中に存在するプロウィルスがL A V zL+またはL A V
MAt。
であるかを調べるために行われる。
そのようなスクリーニングに用いられる方法には、以下の工程が含まれる0組織
からDNAの抽出、このDNAの酵素的分解、生じた断片の電気泳動、および組
織から得られたゲノムDNAのサザン法解析、それに続く標識クローン化LAV
のプロウィルスとのハイブリダイゼーション。
in 5ituでのハイブリダイゼーションにも使用できる。
また、ヒト、霊長顕および他の哺乳類のリンパ液、および組織および他の非リン
パPA緑もスクリーニングにかけ、その他の進化的に関係のあるレトロウィルス
の存在を調べること゛ができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を非緊縮条
件下で行ったとしても、上記の方法を用いることができる。
なお、本発明のDNAまたはDNA断片は、診断を目的とした、L A V I
LIまたはまたはL A V n ALのウィルス抗原を発現させるためにも用
いられる。
本発明は、−iにポリペプチド自体に関する。それは、化学的に合成したもの、
ウィルスの調製物から分離したもの、または、本発明の様々なりNA(特に、オ
ープンリーディングフレームまたはその断片)−によって、適切な宿主(特に、
原核または真核細胞)中にて、対応するDNAで前以て修飾した適切なベクター
を用いて宿主をトランスフオーメイションした後に発現したものでもよい。
t オーm C:、本発明ハ、L A V ILIまたはL A V NAL(
7)タンパクまたは糖タンパクに特徴的なエピトープを有する如何なるポリペプ
チド断片(または、分子、特に上記のポリペプチドと同様のポリペプチド骨格を
有する糖タンパク)に関する。このポリペプチドまたは分子のN末端およびC末
端の各末端は、遊離またはそれぞれ別々に、通常はより大きなLAVのポリペプ
チドまたは糖タンパクに会合しているアミノ酸以外のアミノ酸に共有結合する。
そして、これらのアミノ酸が、遊離状態で存在するか、または他のポリペプチド
鎖に結合する。さらに、本発明は、先に詳悉したエピトープ結合ポリペプチドの
如何なるものをも含むハイブリドポリペプチドに関する。そして、このハイブリ
ドボリペプチドは、−iにLAVタンパクとは異種の他のポリペプチド断片と再
結合するため、そのサイズは、エピトープ結合ポリペプチドの免疫原性を増大さ
せるに足るほどとなり、一方の異種ポリペプチド断片は、免疫的に不活性、また
はエピトープ結合ポリペプチドの、免疫原性に干渉を与えないようになる。
そのようなハイブリドボリベブチドは、ジないし150、ときには250分子の
アミノ酸を含むことがあり、通常、適当な宿主に固有のプロモーターまたはレプ
リコンの制御下で発現可能な核酸配列を初めから含むベクターの発現産物によっ
て構成されている。しかし、この核酸配列は、上記のエピトープ結合ポリペプチ
ドをコードするDNA塩基配列の挿入により前以て修飾されたものである。
上記のエピトープ結合ポリペプチド、特に、N末端またはC末端アミノ酸が遊離
のものは、タンパク化学の分野で周知の技術に従って、化学合成によっても得ら
れる。
均質溶液または固相でのペプチドの合成は、よく知られている。
コノ点に関して、「有機化学的手法J(EJUNS!1.1集、15−■および
■巻、 THEME、 Stuttgart 1974)でHoubenwey
lが記載している、均質溶液中での方法を試みることができる。
この合成法は、2,3のアミノ酸が正しい順序で結合した重合体を、または、す
でに数個のアミノアシル残基が正しい順序で結合している市販または自前で合成
した重合ポリペプチド断片を各々連続的に濃縮する方法である。ペプチド結合の
形成に関与するカルボキシル基またはアミノ基を除いて、上記のアミノアシル基
または断片によって生じる他のすべての反応基は、前以て慎重に保護しておくか
な゛ければならない、しかし、ペプチド結合の形成に先立ち、カルボキシル基は
、ペプチド合成の分野では周知の方法に従って適切な活性化が必要である。さら
に、カップリング剤、例えば、1−エチル−,3(3−ジメチル−アミノプロピ
ル)−カルボジイミドのようなカルボジイミド型の試薬を活用してカップリング
反応を試みることができる。使用するアミノ酸群が、もう一つのアミノ基(例え
ば、リジン)、または別の酸性残基(例えば、グルタミン酸)を有たはt−ブチ
ルオキシカルボニル基(アミ7基に対して)、またはt−ブチルエステル基(カ
ルボキシル基に対して)で保護することができる。同様の手段として、その他の
官能基による保護も使用し得る1例えば、アセタミドメチル基またはバラメトキ
シベンジル基を用いれば、SH基(例えば、システィン)を保護することができ
る。
アミノ酸を一つずつ付加す秦段階的方法では、まず、C末端アミノ酸に所期配列
中でその隣接アミノアシル基に対応するアミノ酸を適宜縮合させ、続いて、反応
を段階的にN末端まで進める。信頼できる適当なもう1つの手法として、R,D
、Merrifieldが「固相ペプチド合成法」(J、^+*、Chem。
Soe、、 45.2149−2154)で記載した方法がある。
Merrifield法に従えば、アミノ酸鎖中にある先頭のC末端アミノ酸は
、そのカルボキシル基を介して適切な多孔性合成樹脂に固定化させ、続いて、そ
のアミノ基を、例えば、t−ブチルオキシカルボニル基によって保護する。
先頭のC末端アミノ酸が樹脂に固定化したら、アミノ基の保護基は、酸(例えば
、トリフルオロ誹酸)によって樹脂を洗浄して除去する(アミノ基の保護基がt
−ブチルオキシカルボニル基の場合)。
続いて、所期のペプチド配列における第2のアミノアシル基となる2番目のアミ
ノ酸のカルボキシル基を、樹脂に固定化したC末端アミノ酸の脱保護アミノ基に
結合させる。
ここでは、2番目のアミノ酸のカルボキシル基は、例えばジシクロへキシル−カ
ルボジイミドによって活性化され、一方のアミノ基は、例えばt−ブチルオキシ
カルボニル基によって保護されていることが好ましい、!!L初の2分子のアミ
ノ酸を含む、所期のペプチド鎖における初めの部分は、このようにして得られる
。以降前記の如く、アミノ基を脱保護し、次のアミノアシル基を結合させ、順次
この反応を目的の全ペプチドが得られるまで進める。
様々な側鎖の保護基、上記のように生成ペプチド鎖の保護基でさえも、その後に
除去することができる。そして、目的のペプチドを、例えば、塩酸によって樹脂
から離脱させ、最後に従来法に基づいて酸溶液から純粋な形で回収する。
サイズが最小であって、エピトー1または抗原決定基を有するペプチド配列、な
お特に、化学合成で容易に得られるものに関していうと、それらのin viv
oにおける免疫原性を増大させるために、生理学的に許容し得て、無痺な担体分
子とそれらを共有結合させることができる。
本発明に基づいて共有を成し得る担体分子または高分子支持体としては、破傷!
Ll素、卵白アルブミン、血清アルブミン、ヘモシアニン等の天然のタンパクが
挙げられる。
合成高分子担体では、例えば、ポリシン、すなわちポリ(D−Lアラニン)−ポ
リ(L−リシン)も使用することができる。
使用可能な他のタイプの高分子担体で、通常、20,000を越える分子量のも
のは、文献から知られる。
上記の共有結合体は、’Infect、and Immunity、 33.1
93−198 (1981)JにFranzおよびRobertsonが記載し
た方法、または「^pplied and Enviror+mental旧c
robiology、 1981年10月、 Vol、42. n、4.611
−614JにP、E、 Kauffmanが記載した方法によって合成すること
ができる。
例えば、以下のカップリング試薬が使用される。グルタルアルデヒド、エチルク
ロロフォルメート、水溶性カルボジイミド(N−エチル−No (3−ジメチル
アミノプロピル)−カルボジイミド、HCI) 、ジイソシアネート、とスージ
アゾベンジディン、ジーおよびトリクロロ−5−チアジン、臭化シアン、ベンゾ
キノン、およびrscand、 J。
Immunol、、1987. vol、8. p、7−23 (^vrame
as、Ternynck。
Guesdon) Jに記載されたカップリング試薬。
一方でペプチドの1つまたは数種の反応基、他方で担体の1つまたは数種の反応
基を結合させるために、如何なるカップリング法も使用することができる。さら
に、カップリングは、タンパク合成に用いられるタイプのカップリング試薬、す
なわち、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド、
N−ヒドロキシベゾチアゾール等の存在下、ペプチドおよび担体の有するカルボ
キシル基およびアミノ基(逆も可・)間で適宜生じる。ペプチドおよび担体の有
する各アミノ基間のカップリングは、担゛体がヘモシアニンであれば、例えば、
BONQUET 、 P 、ら((1982)Molec、 Immunol、
、 19.1441−1549)に記載した方法に従い、グルタルアルデヒドを
用いても実施することができる。
エピトープ結合ペプチドの免疫原性は、例えば、グルタルアルデヒドまたはその
他の適当なカップリング試薬の存在下、ペプチドのオリゴマー化によって強化し
得る。さらに、本発明は、このようにして得られ、特に2ないし10個のモノマ
ー単位を含む、水溶性の免疫原性オリゴマーに関する。
糖タンパク、タンパクおよびポリペプチド(通常、以降本発明の「抗原」と称す
る)であって、L A V t L Iおよびt、、AV、At1ll製物の精
製状態で(上記に引用した初期の特許出願に開示されたような方法によって)、
または化学合成(特に、ペプチドの場合)によって得られるものは、生体物質、
特に、ヒトまたは動物からの血清等の体液中(特に、LAVまたはAIDSの診
断を可能にする点で)における抗L A V’抗体の存在を検出の工程に有用で
ある。
さらに、本発明は、抗LAV抗体を有する患者の血清中でそれを検出するために
、LAVもしくはLAV、ALのエンベロープ糖タンパク(または、この糖タン
パクのエピトープを有するポリペプチド)を利用したin vitro診断法に
関する。その他のポリペプチド(特に、コアタンパクのエピトープを有するもの
)も、利用することができる。
本発明に基づく診断法の好ましい態様には、以下の工程が含まれている。
・力価測定用マイクロプレートの穴に、一定量の1または数種の上記抗原を入れ
る。
・これらの穴に体液、すなわち診断すべき血清の逓減希釈液を加える。
・マイクロプレートをインキュベーションする。
・適当な緩衝液でマイクロプレートを慎重に洗浄する。
・穴に血中の免疫グロブリンに対する特異性のあるラベル抗体を添加する。
・生じた抗原−抗体複合体を検出する。これによって、体液中にLAV抗体が存
在することが示される。
抗免疫グロブリン抗体の標識は、酵素によって行うこと射−吸収の変化を生じる
ような基質を加水分解し得るものの中から選ばれる。対照を取って適切な比較が
可能であれば、この基質の検出によって、疾病のリスクまたは影響の可能性を測
定し得る。
これに関する好ましい方法として、特に、ELISA法に基づいた、免疫−酵素
検出法または免疫−蛍光検出法が挙げられる0滴定値は、免疫−蛍光瀾定法、ま
たは直接または間接免疫−酵素測定法による測定値といえる。試験血清における
抗体の定量滴定も実施することができる。
また、本発明は、本明細書に記載した如何なるポリペプチド、および、診断的ア
ッセイを実施するに必要なあらゆる生化学試薬および装置から成る、LAVに対
する抗体をin vitroで検出するための診断用キットに関する。好ましい
キットとして、ELISA法を実施するために必要なあらゆる試薬が挙げられる
。従って、そのようなキットには、上記のポリペプチドに加え、適当な緩衝液、
および免疫蛍光分子または酵素によって標識される抗ヒト抗体が含まれる。酵素
を使用したキットの好ましい例は、酵素によって加水分解され、上記キットを用
いてアッセイすべき体液中で抗体の存在を示すシグナル(特に、少なくとも一定
波長で放射線の吸収を変更した)を発する基質を含むものである。
勿論、L A V ELIとL A V 、A、の双方に関する種々のタンパク
またはポリペプチド以外に、前記のウィルス(例えば、LA V m*u 、H
T L V I[I、ARV等)の相同タンパクまたはポリペプチドと共にL
A V ELIとL A V −ALの双方またはそのどちらか一方の種々のタ
ンパクまたはポリペプチドを利用するのも有益である。
また、本発明は、活性成分が如何なる抗原、すなわち、本明細書に記載した、L
A V t L rとL A V M ALの双方またはそのどちらか一方の
ポリペプチドの完全抗原、特に、精製gpHoまたはその免疫断片、適当な薬理
学的または生理学的に許容し得る担体と結合した融合ポリペプチドまたはオリゴ
ペプチドで構成されているワクチン組成物に関する。
好ましい活性成分の第一のタイプは、前記免疫原のうちのgpHoである。
この分野で考慮すべきその他の活性成分は、L A V ELIおよびLAvM
ALの完全ゲノムについて推定し得るような、アミノ酸残基数250未満、好ま
しくは1505未満、特に好ましくはジないし120を含むペプチド、さらに好
ましくは、上記のAsn−X−5erおよびAsn−X−5erから選ばれた1
つ以上の群を含むペプチドから成る。ワクチン成分の産生に使用するに適したペ
プチドは、前記のペプチド(a)ないしくf)である、一般に、ワクチン組成物
の適正用量は、宿主(特に、ヒト)においてin vivoで抗体を誘発すペプ
チド、タンパク、または糖タンパク10ないし500IIIIの範囲、例えば、
体重1kg当たり50ないし1oouyである。
本発明に基づく様々なペプチドは、それ自体で抗体、特に、異なったペプチドに
それぞれ特異性を有するモノクロ−ナル抗体の産生に用いることもできる。上記
モノクローナル抗体をスクリーニングするハイブリドーマの産生には、従来の産
生性およびスクリーニング法が用いられる。これらのモノクローナル抗体は、そ
れ自体本発明の一部であるので、生体試料、特に、LAVまたは関連ウィルスを
含むヒトの試料中の様々なポリペプチドまたはタンパクの同定、およびそれらの
相対量の測定つための極めて有用な手段となり得る。
さらに、本発明は、前記の組換体によってトランスフオームされ、前記のDNA
断片を発現し得る宿主(原核または真核細胞)に関する。
最後に、本発明は、ヒト起源の真核細胞、特に、そのポリメラーゼがLAVのL
TRを認識し得るリンパ球のトランスフォーメイション用のベクターに関する。
特に、上記ベクターは、内部にLAVのLTRが存在することを特徴とする。従
って、このLTRは、プロモーターとして機能するため、その制御下で一定のタ
ンパクをコードするDNA挿入片を有する適当な宿主中で、有効な転写および藷
訳が可能゛となる。
言うまでもなく、本発明の範囲は、ゲノムのあらゆる変異体、および実質的に等
価の性質を有する対応のDNA断片にわたり、これらゲノムのすべては、LAV
と同等と見なし得るリンパ節症ウィルスに属する。
また、後述の請求の範囲は、産物(11!タンパク、ポリペプチド、DNA等)
のすべて同等物を網羅することを理解しなければならない、その際の同等物とは
、ある種の産物、すなわち、1つまたは数個のアミノ酸によって、請求項のいず
れかで規定される特定のものではなく、実質上同一の免疫的特性および免疫原性
を有するポリペプチドである。
同じような等価の法則はDNAに適用され、さらに、この法則は、そのDNAが
コードするポリペプチドに関する等価の法則につながることが理解されよう。
さらに、前後に引用するあらゆる文献、およびここで特に同一のものとはみなさ
れないあらゆる特許出願または特許は、本明細書中で引例として組み込まれたも
のと看倣さなければならないのが理解されよう。
なお詳悉すると、本発明は、好ましくは同定されたLAVHLlおよびLAV、
A、のアミノ酸配列を有する上記で特定したポリペプチドのいずれかと、以前に
配列が決定されたLAVタンパクに対応するペプチドとを含む免疫原性組成物に
も関する。
この点で本発明は、より特定的に特別なポリペプチドに係り、このポリペプチド
は、先に引用したL A V m*u配列、すなわち、以下に示すL A V
110タンパク自体の最初およびijL後のアミノ酸間の配列により特異的に対
応する配列を有する。すなわち本発明のポリペプチドは、LAV口υのOMPも
しくはL A V m*uのT M Pに含まれる配列、または両者にわたる配
列、特に、L A V ■−ゲノムのenvオーブンリーディングフレームに含
まれる次の位置のアミノ酸間の配列を有するポリペプチドである。
すなわち、その位置は、1〜530.34〜530、より好ましくは、531〜
877、特には、680〜700.37〜130.211〜289,488〜5
30.490〜620である。
これら様々な配列は、上記の目的のいずれか、および本明細書に開示された組成
物のいずれかに使用することができる。
最後に、本発明は、本明細書に開示された様々なペプチドに対して特異的に形成
され得る様々な抗体、特に、それらのペプチドを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体に関ることができる対応のハイブリドーマも、本発明の一部を成す。
L A V tt+に感染した細胞から得られたλファージのクローンE−H1
2は、1986年5月9日に第1−550号の下で、フランスのパリに所在する
パスツール研究所の「微生物培養物の国内収集機関(Cj4 CM )Jに寄託
された。
LAVFIALに感染した細胞から得られたλファージのクローンE−H11は
、1986年5月9日に第1−551号の下で、CN CMに寄託された。
(以下余白)
IJ シ1 C
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4 +−+−J +1’ +I t−1/% 、−I IQ=I u 6 11
1 s as 1m y Bi ヘ − ′p% C! La fl l’j
つ国際調査報告
Claims (19)
- 1.RNAが第7Aないし7J図のcDNAに対応するウィルスであるLAVE LI。
- 2.RNAが第8Aないし8I図のcDNAに対応するウィルスであるLAVM AL。
- 3.第7Aないし7J図のcDNAまたはその一部。
- 4.第8Aないし8I図のcDNAまたはその一部。
- 5.請求項3または4記載のcDNAの少なくとも一部を含む組換体DNA。
- 6.請求項3ないし5のいずれかに記載のクローン化核酸を含むプローブ。
- 7.宿主組織から得られたDNAを請求項6記載のプローブを用いてハイブリダ イゼーションすること、および上記プローブを用いたハイブリダイゼーションに よる検出の可否に応じて上記組織中においてLAVELIまたはLAVMAL、 関連ウィルスまたはプロウィルスの存在を検出することから成る、上記ウィルス またはプロウィルスの存在の宿主組織中における同定法。
- 8.請求項3または4記載のDNA配列中のオープンリーディングフレームまた はそれらの断片によってコードされるペプチド、タンパクもしくはそれらの一部 。
- 9.第3図に示されたアミノアシル残基37からアミノアシル残基130、また はアミノアシル残基211からアミノアシル残基289、またはアミノアシル残 基488からアミノアシル残基530の各領域に亙る鎖のいずれかに対応する、 請求項8記載のペプチド。
- 10.第3図に示されたアミノアシル残基490からアミノアシル残基620に 亙る鎖に対応する、請求項8記載のペプチド。
- 11. ・前駆体を含むOMPすなわちgp110タンパク(1〜530)、 ・前駆体を含まないOMPすなわちgp110タンパク(34〜530)、 ・TMPすなわちp41タンパクを担持する配列(531〜877、特に、68 0〜700)、 ・OMP内での保存性の高い領域(37〜130、211〜289、および48 8〜530)、 ・OMPの最後、およびTMPの最初に見いだされる保存性の高い領域(490 〜620)、 の配列の全部または一部から成るアミノ酸配列で示されるタンパクまたは糖タン パクの一部。
- 12.ヒトの体液を、請求項1もしくは2記載のウィルスから得られた抗原また は請求項8ないし10のいずれかのペプチドから成る抗原と接触させること、お よびLAVELIもしくはLAVMAL、または関連ウィルスに対する抗体と上 記抗原の間の免疫反応を検出することから成る、ヒト体液中における上記抗体の 存在のin vitro検出法。
- 13.以下の工程、 ・力価測定用マイクロプレートの穴に、前記抗原の1または数種の一定量を入れ ること、 ・これらの穴に生物体液、すなわち診断すべき血清の漸増希釈液を加えること、 ・上記のマイクロプレートをインキュベーションすること、適当な緩衝液を用い て上記のマイクロプレートを慎重に洗浄すること、 ・これらの穴に血中の免疫グロブリンに対して特異性のあるラベル抗体を添加す ること、および ・上記生物体液中のLAV抗体の存在を示す、生成抗原−抗体複合体を検出する ことから成る、請求項11記載の方法。
- 14.請求項1もしくは2記載のウィルスまたはそれに関連するウィルスから得 られた抗原、または請求項8ないし11のいずれかに記載のペプチドから成る抗 原ならびに診断アッセイを実施するのに必要な生物および化学試薬および装置を 含む、前記ウィルスに対する抗体をin vitroで検出するための診断用キ ット。
- 15.請求項1もしくは2のいずれか、または両者に記載のウィルス抗原、また は上記ウィルスのRNAもしくはその一部によってコードされた如何なる免疫原 性ペプチド抗原を薬理学的もしくは生理学的に許容し得る適当な担体と共に含む 免疫原性組成物。
- 16.前記ペプチドがgp110エンベロープ糖タンパクまたはその一部である 、請求項15記載の免疫原性組成物。
- 17. ・前駆体を含むOMPすなわちgp110タンパク(1〜530)、 ・前駆体を含まないOMPすなわちgp110タンパク(34〜530)、 ・TMPすなわちgp41タンパクを担持する配列(531〜877、特に、6 80〜700)、OMP内での保存性の高い領域(37〜130、211〜28 9、および488〜530)、 ・OMPの最後、およびTMPの最初に見いだされる保存性の高い領域(490 〜620)、 の配列の全部または一部から成るアミノ酸配列で示されるタンパクまたは糖タン パクを含む、請求項16記載の免疫組成物。
- 18.請求項8ないし11のいずれかのペプチド、タンパクまたは糖タンパクの いずれかに対して産生される抗体、特にモノクローナル抗体。
- 19.請求項5記載のDNA組換体でトランスフォームさせた細胞。
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