DK174910B1 - Antigen, fremgangsmåde til fremstilling af antigenet, fremgangsmåde til diagnosticering samt immunogene præparater - Google Patents

Description

DK 174910 B1

Den foreliggende opfindelse angår et produkt der indeholder polypeptidske-lettet af et glycoprotein af LAV kappen samt en fremgangsmåde til fremstilling heraf. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til diagnosticering af antistoffer over for LAV virus, samt et immunogent præparat.

5

Det kausative agens, hvad enten det drejer sig om LAS eller AIDS, et retrovirus er blevet identificeret af F. BARRE-SINOUSSI et al., Science, 220, 868 (1983). Det har følgende egenskaber. Det er T-lymphotropt; dets foretrukne mål udgøres af Leu 3 celler (eller T4 lymphocytter); det har omvendt 10 transcriptase-aktivitet, hvilket nødvendiggør tilstedeværelsen af Mg+ og udviser stærk affinitet over for poly(adenylat-oligodeoxy-thymidylat) (poly(A)-oli-go(dT) 12-18). Det har en densitet på 1,16-1,17 i en saccharosegradient, en gennemsnitsdiameter på 139 nanometer; og en kerne, der har en gennemsnitsdiameter på 41 nanometer. Antigener af dette virus, specielt et protein 15 p25, genkendes immunologisk af antistoffer, der findes i sera udvundet fra patienter, der er inficeret med LAS eller AIDS. p25-proteinet, der er et kerne-protein, genkendes ikke immunologisk af p24-protein af HTLVI og II vira. Viruset er også uden et p19-protein, der er immunologisk kryds-reaktivt med p19-proteinerfra HTLVI og HTLVII.

20

Retrovira af denne type (somme tider betegnet med den generiske forkortelse LAV) er deponeret i National Collection of Micro-organism Cultures of the INSTITUT PASTEUR of Paris, under numrene I-232, I-240 og 1-241. Virusstammer lig med LAV i alle henseender set ud fra morfologisk og immunolo-25 gisk synspunkt er isoleret i andre laboratorier. Der henvises herved til f.eks. retrovirusstammer betegnet HTLV-III isoleret henholdsvis af R.C. GALLO et al., Science, 224, 500 (1984) og af M.G. SARNGADHARAN et al., Science 224, 506 (1984) og retrovirus isoleret af M. JAY LEVY et al., Science, 25, 840-842 (1984), hvilket virus er blevet betegnet ARV. For at lette sprogbru-30 gen vil de sidstnævnte vira, såvel som andre, der har ækvivalente morfologiske og immunologiske egenskaber, i det efterfølgende blive betegnet under DK 174910 B1 2 den generiske betegnelse "LAV”. Der henvises også til europæisk patentansøgning indleveret 14. september 1984 med prioritet fra engelsk patentansøgning nr. 83 24800 indleveret 15. september 1983 med hensyn til en mere detaljeret beskrivelse af LAV retrovira eller lignende og i anvendelser, som 5 ekstrakterne af disse vira giver anledning til.

Til at begynde med var kerne-antigenerne hovedantigeneme af de viruslysa-ter eller ekstrakter, der blev genkendt af serum fra patienter inficeret med AIDS eller LAS i de forsøgssystemer, der på det tidspunkt blev anvendt. Et 10 p42-protein, som viste sig at bestå af et kappeprotein, var også blevet påvist.

På samme måde har GALLO et al påvist et p41-protein, der også anses for at være en mulig komponent af viruskappen.

Fremgangsmåder til at opnå et LAV-virus er også blevet beskrevet. Der hen-15 vises specielt til den allerede nævnte artikel af F. BARRE-SINOUSSI et al., med hensyn til præparationen af viruset i T-lymphocytkulturer stammende enten fra blod eller fra navlestrengen eller også fra knoglemarvsceller fra voksne raske donorer. Denne metode omfatter specielt følgende essentielle trin: 20 frembringelse af en viral infektion af disse T-lymphocytter efter aktivering af et lectin mitogen med en viral suspension stammende fra en urenset supernatant væske af lymphocytter, der frembringer viruset (til at begynde med opnået fra en patient inficeret med LAS eller AIDS), dyrkning af celler infice-25 ret med TCGF i nærvær af anti-a-interferonfåreserum, rensning af det frembragte virus (produktionen starter sædvanligvis mellem den 9. og 15. dag efter infektion og varer fra 10 til 15 dage), idet rensningen omfatter udfældningen af virus i polyethylenglycol for at frembringe en første 30 koncentration af viruset, herefter centrifugering af det opnåede præparat i en 20 -60% saccharosegradient eller i en isotonisk gradient af metrizanid (for- DK 174910 B1 3 handlet under handelsnavnet NYCODENS af NYEGåRD, Oslo) og udvinding af viruset med det bånd, der har en densitet på 1,16-1,17 i saccharosegra-dienten eller på1,10-1,11 i Nycodensgradienten.

5 LAV-viruset kan også frembringes ud fra permanente cellelinier af type T som f. eks. CEM-linien eller ud fra B-lymphoblastoide cellelinier f. eks. opnået ved transformation af lymphocytterne stammende fra en rask donor med Ep-stein-Barr-viruset, f.eks. som beskrevet i fransk patentansøgning nr. 84 07151 indleveret 9. maj 1984. De frembragte permanente cellelinier frem-10 bringer kontinuert et virus (betegnet LAV-B, når det drejer sig om B-lympho-blastoid-cellelinierne), der er i besiddelse af de essentielle antigene og morfologiske træk fra LAV-vira (bortset fra, at det er indsamlet i et densitetsbånd, der er lidt højere end i det forudgående tilfælde (specielt 1,18) i saccharose).

Den endelige oprensning af viruset kan også udføres i en Nycodenzgradient.

15

En metode til at klone DNA-sekvenser, der kan hybridisere med det genome RNA fra LAS, er allerede blevet omtalt i engelsk patentansøgning nr. 84 23659 indleveret 19. september 1984. Der henvises herved til denne ansøgning, hvad angår materiale, der er fælles for nævnte ansøgning og nærvæ-20 rende ansøgnings yderligere forbedringer.

Opfindelsen har til hensigt at tilvejebringe rensede uændrede virusformer (eller vira, der er mindre forandret ved de anvendte oprensningsmetoder) og metoder til opnåelse af disse uændrede rensede vira.

25

Herudover har opfindelsen til hensigt at tilvejebringe yderligere hidtil ukendte metoder, som ikke alene er værdifulde til afsløring af LAV eller beslægtede vira (i det efterfølgende mere generelt omtalt som "LAV-vira"), men som også har større anvendelighed, specielt til afsløring af specifikke dele af det geno-30 me DNA af disse vira, hvis udtrykelsesprodukter ikke altid direkte kan afsløres ved immunologiske metoder. Herudover har opfindelsen til hensigt at til- DK 174910 B1 4 vejebringe polypeptider indeholdende sekvenser fælles med polypeptider omfattende antigene determinanter indbefattet i proteinerne kodet og udtrykt af LAV-genomet, der forekommer i naturen. Desuden tilvejebringer opfindelsen metoder til afsløring af proteiner beslægtede med LAV-virus, specielt til 5 diagnose af AIDS eller præ-AIDS eller i modsætning hertil metoder til at afsløre antistoffer over for LAV-viruset eller proteiner beslægtet hermed, specielt hos patienter, der er ramt af AIDS eller præ-AIDS eller mere generelt hos asymptomatiske bærere og i blod-produkter. Endelig har opfindelsen også til hensigt at tilvejebringe immunogene polypeptider og mere specielt 10 beskyttende polypeptider, der anvendes ved fremstillingen af vaccinepræparater mod AIDS eller beslægtede syndromer.

I overensstemmelse hermed angår opfindelsen et produkt, der er karakteriseret ved det i krav 1 ’s kendetegnede del angiven.

15

En uændret renset LAV-retrovirus adskiller sig fra de kendte vira, der er defineret ovenfor, ved at de omfatter en vis mængde af én eller flere kappeantigener der er tilstrækkelig til at kunne visualiseres, dersom viruset mærkes med 35 S-cystein, uden umærket cystein i et forhold på 200 mikrocurie pr. ml 20 substrat. Disse antigener, blandt hvilke specielt glycoproteiner, genkendes selektivt in vitro af sera fra patienter, der er inficeret af AIDS eller LAS eller af sera fra asymptomatiske bærere af viruset.

Opfindelsen angår selve antigenerne, specielt med en molekylvægt på ca.

25 110.000-120.000, der også er i besiddelse af evnen til at blive genkendt af sera fra patienter inficeret med AIDS eller LAS eller af sera fra personer, der er blevet udsat for LAV-vira eller disses analoge.

Foretrukne omhandlede antigener udgøres af glycoproteiner.

30 DK 174910 B1 5

Et foretrukket antigen ifølge den foregående definition, der kan opnås fra et lysat af dette virus (eller ved forsigtig rensning af virusets kappe) er et glycoprotein med en molekylvægt i størrelsesorden 110.000 dalton, bestemt ved dets vandringslængde i forhold til vandringslængdene i det samme van-5 dringssystem af standardproteiner med kendte molekylvægte. Specielt blev sammenlignende målinger foretaget på en 12,5% polyacrylamidgel under en spænding på 18 V i 18 timer, idet der anvendtes følgende standardproteiner (markedsført af AMERSHAM): 10 - (14C)-methyl lysozym (molekylvægt: 14300), - (14C)-methyl carbondioxid (molekylvægt: 30000), - (14C)-methyl ovalbumin (molekylvægt: 46000), - (14C)-methyl bovint albuminserum (molekylvægt: 69000), - b-(14C)-methyl phosphorylase (molekylvægt 92500), 15 - (14C)-methyl myosin (molekylvægt: 200000).

Disse glycoproteiner har også evnen til at danne komplekser med concana-valin A, idet komplekset er dissocierbart i nærvær af 0-methyl-_-D-mannopyranosid. De kan også binde til andre lectiner f. eks sådanne, der er 20 kendt under navnet "Lentyl-Lectin". Det foretrukne omhandlede antigen med en molekylvægt på 110.000 er også følsomt over for indvirkningen af en-doglycosidaser. Denne virkning kan fastslås ved fremkomsten af et protein med en molekylvægt at størrelsesordenen 90.000 ud fra antigenet med en molekylvægt på 110.000, idet førstnævnte kan skilles f. eks. ved immuno-25 præcipitation eller ved en adskillelse, hvor man anvender forskellene i molekylvægt (vandringer forskellige på gelen).

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede produkter, hvilken fremgangsmåde er særegen ved det i krav 14’s kendeteg-30 nede del angivne. Denne fremgangsmåde adskiller sig væsentlig fra de ovenfor nævnte kendte metoder med hensyn til den endelige oprensning.

DK 174910 B1 6

Specielt er oprensningen ved den omhandlede fremgangsmåde ikke længere udført i gradienter, men omfatter udførselen af differentielle centrifugeringer udført direkte på den supernatante del af dyrkningssubstratet fra de producerende celler. Disse centrifugeringer omfatter specielt en første centrifugering 5 med en vinkelcentrifugeringshastighed specielt ved 10000 omdr. pr. min., der muliggør fjernelse af ikke-virale bestanddele, mere specielt af cellebestand-dele, herefter en anden centrifugering ved højere vinkelhastighed, specielt ved 45000 omdr. pr. min., hvorved der opnås udfældningen af selve viruset. I en foretrukken udførelsesform udføres den første centrifugering ved 10000 10 omdr. pr. min. i 10 minutter og den anden ved 45000 omdr. pr. min. i 20 minutter. Disse er naturligvis kun vejledende værdier, idet det er velkendt af fagmanden at modificere centrifugeringsbetingelserne til opnåelse af adskillelse af de cellulære bestanddele fra de virale bestanddele.

15

Denne modifikation af oprensningen bevirker frembringelsen af virale præparater, ud fra hvilke det nævnte antigen lettere kan isoleres end fra viruspræparater, der er frembragt ved de tidligere nævnte metoder. Under alle omstændigheder kan de vira, der opnås til slut ved den omhandlede frem-20 gangsmåde, lettere genkendes af sera fra patienter eller fra personer, der har været udsat for LAV-viruset eller for morfologisk og antigent lignende stammer.

De omhandlede antigener kan selv fås fra ovennævnte omhandlede vira ved 25 lyse (eller anden passende bearbejdning) af sidstnævnte i nærværelse af et hvilket som helst passende detergent eller ved udvindelse og fraskillelse af de frigjorte antigener. Med fordel udføres lysen af virus i nærværelse af apro-tinin eller et hvilket som helst andet middel, der er i stand til at hæmme indvirkningen af proteaser. Fraskillelsen af de omhandlede antigener kan udfø-30 res ved i og for sig kendte metoder; f. eks. er det muligt at gå videre med adskillelsen af proteinerne ved at anvende deres respektive forskellige vandrin- DK 174910 B1 7 ger i en forudbestemt gel, idet det ønskede protein herefter isoleres fra den zone af gelen, hvor det normalt ville findes ved en elektroforesebehandling under veldefinerede betingelser, idet man tager hensyn til dets molekylvægt.

De omhandlede antigener kan imidlertid skilles fra lysatet fra de ovennævnte 5 vira p.g.a. deres affinitet over for lectiner, specielt over for concanavalin A eller lentyl-lectin. Det anvendte lectin er fortrinsvis immobiliseret på en fast understøttelse som f. eks. den tværbundne polymer, der stammer fra agarose og som markedsføres under navnet SEPHAROSE, Efter vask af de bundne antigener med en passende puffer kan antigenerne elueres på en 10 hvilken som helst passende måde, idet man specielt anvender en O-methyl-α-D-mannopyranosid i opløsning.

En mere grundig rensning af disse antigener kan udføres ved immuno-præcipitation med patient-sera, der vides at indeholde antistoffer, der er ef-15 fektive over for proteinet, ved hjælp af koncentrerede antistof-præparater (po- lyklonale antistoffer) eller med monoklonale antistoffer mere specielt rettet mod det omhandlede antigen, specielt det, der har en molekylvægt på 110.000, nedenfor beskrevet med forkortelsen gp110.

20 Yderligere detaljer ved opfindelsen vil blive klarlagt i den efterfølgende angiver, der beskriver isolering af et omhandlet virus og af antigener, specielt et kappeantigen af viruset, idet der henvises til tegningen, hvor fig. 1 er en fotografisk gengivelse af gelstrimler, der er anvendt til at udføre 25 elektroforese af lysatekstrakter af T-lymphocytter, henholdsvis inficeret og uinficeret (kontroller) med en LAV-suspension, fig. 2 er et restriktionskort af et komplet LAV-genom (clon λϋ19), 30 fig. 3a til 3e er den fuldstændige sekvens af et LAV-viralt genom, i DK 174910 B1 8 - fig. 4 og 5 viser skematisk dele af de tre mulige aflæsningsfaser af LAV-genomt RNA, herunder de åbne læserammer (ORF), der forekommer i hver af aflæsningsfaserne, og 5 fig. 6 er en skematisk afbildning af den LAV lange endestillede gentagelse (LTR).

T-lymphocytter stammende fra en rask donor og inficeret med LAV 1 under de betingelser der er beskrevet af F. Barre-Sinoussi et Coll., på CEM-celler 10 stammende fra en patient, der er ramt af leukæmi, og også inficeret in vitro med LAV 1, dyrkedes i et substrat indeholdende 200 mikrocurie 35S-cystein og uden umærket cystein. De inficerede lymphocytter dyrkedes i et ikke-denaturerende substrat for at forhindre nedbrydning af det ønskede antigen.

Den supernatante væske fra dyrkningssubstratet underkastedes herefter en 15 første centrifugering ved 10000 omdr. pr. min. i 10 minutter for at fjerne ikke-virale komponenter, herefter en anden centrifugering med 45000 omdr. pr. min. i 20 minutter for at bundfælde viruset. Viruspelleten lyseres herefter med detergent i nærværelse af aprotinin (5%) specielt under de betingelser, der er beskrevet i artiklen af F. Barre-Sinoussi et Coll.

20

Den samme behandling blev gentaget på lymphocytter, der var opnået fra en rask donor som kontrol.

De forskellige lysater immunopræcipiteredes herefter med serum fra patien-25 ter inficeret med AIDS eller LAS. Sera, der stammede fra raske donorer eller fra donorer inficeret med andre sygdomme, immunopræcipiteredes også.

Herefter underkastedes substratet elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel.

Resultaterne er angivet i fig. 1. Gelstrimlerne nummereret fra 1 til 6 blev op-30 nået fra præparater mærket med 35S-cystein. Strimlerne nummereret 7 til 10 viser resultater opnået på inficerede eller uinficerede lymphocyt-præparater DK 174910 B1 9 mærket med 35S-methionin. Endelig svarer strimlen M til vandringslængden af de ovennævnte identificerede standardproteiner, hvis molekylvægt er angivet i den højere del af figuren.

5 Henvisning til de mærkede virale proteiner angives i figurens venstre side.

Det skal bemærkes, at kolonne 7 til 10 viser det specifikke protein p25 af LAV mærket med 35S-methionin. Det samme protein mangler på strimmel 8 til 10 svarende til resultater opnået med et præparat, der stammer fra raske 10 lymphocytter.

Kolonne 3 og 5 svarer til resultaterne, der er observeret på præparater opnået fra inficerede lymphocytter og mærket med 35S-cystein. Proteinerne p25 og p18, de karakteristiske kerneproteiner af LAV, og glycoprotein gp110, og-15 så specifikt for LAV, fandtes også. Afbildninger svarende til et protein p41 {molekylvægt af størrelsesordenen 41000) forekom i de forskellige præparater, skønt mindre distinkt.

Det omhandlede virus og det omhandlede antigen kan enten udfældes med 20 lectiner, specielt concanavalin A, eller bindes til en Sepharose-concanavalin A søjle. Specielt kan oprensningen af kappeglycoproteinerne udføres påfølgende måde. Bindingen kan specielt udføres ved at bringe et lysat af LAV-virus opløst i en passende puffer i kontakt med concanavalin-A bundet til Sepharose. En passende puffer har følgende sammensætning: 25

Tris 10 mM

NaCI 0,15 M

CaCI2 1 mM

MgCI2 1 mM

30

Detergent markedsført under navnet Triton® 1% DK 174910 B1 10 pH 7,4 Når der er opnået binding vaskes Sepharose®-concanava!in A med en puffer 5 med samme sammensætning, bortset fra at Triton®-koncentrationen sænkes til 0,1%. Eluering udføres herefter med en 0,2 M O-methyl-a-D-mannopyranosidopløsning i vaskepufferen.

Proteinet kan yderligere koncentreres ved immunopræcipitation med antistof-10 fer indeholdt i patientsera, der er inficeret med AIDS, eller med polyklonale antistoffer, der er opnået fra et serum stammende fra et dyr, der forud er immuniseret mod det "uændrede" omhandlede virus eller ovennævnte protein. Proteinet kan herefter udvindes ved dissociering af komplekset med en opløsning, der har passende indhold af ionsalt. Fortrinsvis immobiliseres anti-15 stof-præparatet selv på kendt måde på en uopløselig bærer f. eks. af Sepha-rose® B-typen.

Det er også muligt at gribe til monoklonale antistoffer secerneret af hybrido-mer, der forud er præpareret overfor gp 110. Disse monoklonale antistoffer 20 såvel som hybridomerne, der frembringer dem, udgør også en del af den foreliggende opfindelse.

En metode til at frembringe og udvælge monoklonale antistoffer rettet mod gp110 glycoproteinet er beskrevet nedenfor.

25

Grupper af Balb/c-mus 6 til 8 uger gamle anvendtes. En gruppe fik viruset indeholdende ovennævnte glycoprotein, en anden et renset glycoprotein gp110. Immuniseringsmetoden, der var identisk for alle mus, bestod af indsprøjtning af 10 mg af det antigene præparat i nærværelse af Freunds kom-30 plette adjuvans på dag 0, herefter igen, men i nærværelse af Freunds ukom- DK 174910 B1 11 plette adjuvans pådag 14 og uden adjuvans på dag 28 og 42. De tre første indsprøjtninger blev foretaget intraperitonealt, den fjerde intravenøst.

Den ikke-secemerende myelomavariant 5,53 P3 x 63 Ag8 resistent over for 5 azaguanin, der selv stammer fra MOPC-21 cellelinien, anvendes. Fusion med immuniserede muse splenocytter udføres i nærværelse af polyethy-lenglycol 4000 ved hjælp af metoden beskrevet af Fazekas de st-Groth og Scheidegger på den 45. dag. Selektionen af hybriderne i RPMI i 16-40 ΉΑΤ''-substrat udføres på plader med 24 brønde (kendt under betegnelsen 10 Costar) ved at anvende de samme dyrkningsmetoder.

Hybridomer, der frembringer antistoffer af tilstrækkelig specificitet, klones herefter i plader 96 brønde i nærværelse af et "føde" lag af syngene thymo-cytter. De således selekterede producerende doner opformeres herefter i 24 15 brøndplader stadig i tilstedeværelsen at thymocytter. Når der ses sammenfyldning i én af brøndene, injiceres klonen intraperitonealt i en Balb/c-mus, der er behandlet med en injektion Pristane 8 dage forud og/eller holdt i flydende kultur.

20 Fem forskellige metoder muliggør karakterisering af kloneme, der frembringer antistoffer med passende specificitet. I et første stadie bestemmes de hybrider, der frembringer antistoffer, ved en ELISA-test, der afslører mu-seimmunoglubiner i de supematante væsker. Ud fra denne første selektion søges supematante dele, der har antistoffer rettet mod virale bestanddele 25 ved hjælp af en ELISA-test, der afslører anti-LAV-antistoffer, eller ved immu-nofluorescens på virusproducerende humane celler. Til slut analyseres de supematante væskedele ved radioimmuno-præcipitation af virus mærket med cystein og ved hjælp af Western-blot-metoden på virale præparater, hvilket muliggør bestemmelse af disse anti-LAV-antistoffers specificitet.

30 DK 174910 B1 12

Celler opnået fra de forskellige fusioner anbringes under dyrkning i 648 brønde. Mikroskopisk undersøgelse heraf viser, at hoveddelen af disse brønde indeholder en enkel hybridklon, der er i stand til at vokse i et "HAT’ selektivt substrat. Mere end 50% af disse frembringer antistoffer, der forårsager et 5 positivt respons under ELISA-antivirusundersøgelse. De mest repræsentative fusioner undersøges ved hjælp af Western-blot-metoden og adskillige af dem subklones, idet man tager hensyn til deres respektive specificitetsreaktiviteter i antivirus ELISA og deres opførsel under dyrkningsbetingelserne. De hybrider, der mere specielt selekteres, er de, der frembringer antistoffer, der se-10 lektivt vil genkende det virale glycoprotein gp110, der har en molekylvægt på ca. 110 KD. Alle subkloningerne giver anledning til kloner, der frembringer antistof, der efter udtrykkelse, indsprøjtes i syngene mus. Analyse af tilstedeværende antistoffernes specificitet i de forskellige ascites væsker bekræfter specificiteten af ascites antistofferne med hensyn til gp110.

15

De opnåede monoklonale antistoffer kan i sig selv anvendes til at rense proteiner indeholdende et antigensted også indeholdt i gp110. Opfindelsen angår derfor også disse rensningsmetoder som sådan. Fremgangsmåden kan med fordel anvendes på viruslysater eller T-lymphocytlysater eller andre cel-20 ler, der frembringer LAV eller lignende, når man har passet på at undgå den ukontrollerede fraskillelse af gp110 under rensningsproceduren af viruset, inden lysen heraf. Det er ikke nødvendigt at nævne, at metoden også kan anvendes på en hvilken som helst opløsning indeholdende gp110 eller et protein, polypeptid eller glycoprotein omfattende et antigensted, der normalt er 25 båret af kappeproteinet og genkendt af det monoklonale antistof. For at udføre metoden immobiliseres de monoklonale antistoffer med fordel på en fast understøttelse, fortrinsvis tilpasset affinitetschromatografimetoder. For eksempel fikseres disse monoklonale antistoffer på et agarosegitter med tredimensional tværbinding markedsført under navnet Sepharose® af det svenske 30 Pharmacia Aktieselskab f. eks. ved hjælp af cyanbromidmetoden.

DK 174910 B1 13

En foretrukken udførelsesform er en fremgangsmåde til adskillelse af de nævnte antigener, hvorved man bringer en blanding af antigenerne, herunder de omhandlede (f. eks. et viruslysat eller ekstrakt) i kontakt med en affinitets-5 søjle, der indeholder nævnte monoklonale antistoffer for selektivt at binde polypeptider, proteiner eller glycoproteiner, der selektivt genkendes af de monoklonale antistoffer, at man udvinde sidstnævnte ved dissociering af an-tigen-antistofkomplekset ved hjælp af en passende puffer, specielt en opløsning af passende ionstyrke som f. eks. et salt, fortrinsvis ammoniumacetat 10 (der ikke giver nogen rest ved frysetørring af præparatet) eller en opløsning syrnet til pH 2-4 eller til en glycinpuffer med samme pH, og at man udvinder de eluerede polypeptider, proteiner eller glycoproteiner.

Det er klart, at opfindelsen også omfatter polypeptidfragmenter med lavere 15 molekylvægte, og som indeholder antigene sted, der kan genkendes af de samme monoklonale antistoffer. Det er klart for fagmanden, at rådigheden over monoklonale antistoffer, der genkender gp110 glycoproteinet, også giver muligheder for mindre peptidsekvenser eller fragmenter indeholdende det fælles antigensted eller epitop. Fragmenter af mindre størrelse kan opnås 20 ved at anvende velkendte metoder. For eksempel omfatter en sådan metode spaltning af det oprindelige større polypeptid med enzymer, der er i stand til at spalte det ved specifikke steder. Som eksempel på sådanne proteiner kan nævnes enzymet fra Staphylococcus aureus V8, α-chymotrypsin, "museun-derkæbekirtelprotease" forhandlet af Boehringer Company, Vibrio alginolyti-25 cus chemovar isophag-collagenase, der specifikt genkender peptidet Gly-Pro og Gly-Ala osv.

Det er også muligt at opnå polypeptider eller fragmenter af kappeantigener af viruset ved at klone fragmenter udskåret fra et cDNA opbygget af genome 30 LAV-varianter.

DK 174910 B1 14

Fig. 2 og 3 er restriktionskort over et sådant cDNA omfattende i alt 9,1-9,2 kb. Polypeptiderne kodet af cDNA-fragmenter er anbragt i området, der strækker sig mellem Kpnl stedet (stilling 6100) og Bglll stedet (stilling 9150) af restriktionskort i fig. 2. Tilstedeværelsen af et karakteristisk sted fra et kap-5 peantigen fra LAV-viruset eller lignende i et vilkårligt polypeptid udtrykt (i en passende værtcelle transformeret forud med et tilsvarende fragment eller med en vektor indeholdende dette fragment) kan afsløres med et hvilket som helst passende immunologisk middel.

10 Specielt angår opfindelsen yderligere polypeptider kodet af cDNA-fragmenter defineret nedenfor specielt i fig. 4. Selve nucleinsyrefragmenterne, herunder en cDNA-variant svarende til et helt LAV-retroviralt genom, er karakteriseret ved en række restriktionssteder i efterfølgende orden (fra 5’-enden til 3'-enden).

15

Beliggenheden af de efter hinanden beliggende steder på hele LAV-genomet (se også restriktionskortet over λϋ19 i fig. 1) er angivet i det efterfølgende i forhold til Hindlll-stedet (valgt som beliggenhed 1), der er beliggende i R-regionen. Beliggenhederne er bestemt med en nøjagtighed på + 200 bp: 20

Hind III 0

Sac I 50

Hind III 520

Pst I 800 25 Hind III 1100

Bglll 1500 ΚηρI 3500 Κηρ I 3900

EcoRI 4100 30 Eco RI 5300

Sal I 5500 DK 174910 B1 15

Knpl 6100

Bgl II 6500

Bgl II 7600

Hind III 7850 5 Bam Hl 8150

Xho I 8600 ΚηρI 8700

Bgl II 8750

Bgl II 9150 10 Sacl 9200

Hind III 9250

En anden DNA-variant indholder evt. et yderligere Hindlll omtrent ved koordinat 5550. Der henvises yderligere til fig. 1, der viser et mere detaljeret re-15 striktionskort over hele dette DNA (XJ19).

Yderligere detaljerede polypeptidsekvenser og tilhørende nucleotidsekvens af omhandlede foretrukne polypeptider er angivet i figurerne 4a-4e.

20 Opfindelsen angår yderligere andre foretrukne polypeptidsekvenser (glycosy-lerede eller ikke glycosylerede), der vil blive omtalt i det efterfølgende.

Sekvensbedømmelse og bestemmelse af stederne af særlig interesse udførtes på en rekombinant-fag svarende til λϋ19 omhandlet i nævnte britiske pa-25 tentansøgning nr. 84 23659. En metode til fremstilling heraf er omtalt i denne ansøgning.

Hele rekombinant-fag DNA’et fra klon λϋ19 (omhandlet i den tidligere ansøgning) lydbehandledes som beskrevet i forsøgsrapporten af DEININGER 30 (1983), Analytical Biochem. 129, 216. DNA’et blev repareret ved hjælp af et

Klenow-reaktion i 12 timer ved 16 eC. DNA'en blev elektroforese DK 174910 B1 16 behandlet gennem en 0,8% agarosegel, og DNA i størrelsesordenen 300-600 bp blev afskåret og elektroelueret og udfældet. Genopslæmmet DNA (i 10 mM Tris, pH 8; 0,1 mM EDTA) ligeledes ind i M13mp8 RF DNA (afskåret med restriktionsenzymet Smal og herefter alkalisk phosphateret), idet der 5 anvendtes T4 DNA- og RNA-ligaser (Maniatis T et al. (1982) - Molecular cloning - Cold Spring Harbor Laboratory). En E. coli-stamme betegnet TG1 anvendtes til yderligere undersøgelse. Denne stamme havde følgende genotype: Alac pro, supE, thi.F’traD36, proAB, laclq, ZAM15,r'.

10 Denne E. coli TG1-stamme havde den særhed, at den muliggjorde, at re-kombinanter let kunne genkendes. Den blå farve af cellerne transficeret med plasmider, der ikke rekombinerer med et fragment af LAV DNA, bliver ikke påvirket. I modsætning hertil giver celler transficeret med et rekombinant plasmid indeholdende et LAV DNA-fragment hvide kolonier. Metoden, der 15 anvendtes, er omhandlet i Gene (1983), 26, 101.

Denne stamme blev transformeret med ligationsblandingen under anvendelse af Hanahanmetoden (Hanahan D (1983) J. Mol. Biol. 166, 557). Celler blev udpladet på en tryptose-agaroseplade med IPTG og X-gal i blød agaro-20 se. Hvide plaque blev enten udtaget og undersøgt eller undersøgt direkte in situ under anvendelse af nitrocellulosefiltre. Deres DNA blev hybridiseret med nick-translaterede DNA-indskud af pUC18 Hindlll subkloner af XJ19.

Dette muliggjorde isoleringen af plasmider eller subkloner af λ, der er identificeret i den efterfølgende tabel. Med hensyn til denne tabel skal det bemær-25 kes, at betegnelsen for hver plasmid er efterfulgt af deponeringsnummeret for en cellekultur af E. coli TG1 indeholdende det tilsvarende plasmid i "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes” (C.N.C.M.) i Pasteur Insti-tutet i Paris, Frankrig. En ikke-transformeret TG1 cellelinie blev også deponeret i C.N.C.M. under nr. I-364. Alle disse deponeringer blev foretaget den 15.

30 november 1984. Størrelsen af de tilsvarende indskud stammende fra LAV-genomet er også angivet.

DK 174910 B1 17

TABEL

Hovedtræk ved de rekombinante plasmider 5 -PJ19-1 plasmid (I-365) 0,5 kb

Hind III - Sac I Hind III

10 - pJ19 -17 plasmid (I-367) 0,6 kb

Hind III - Pst 1 - Hind III

-pJ19- 6 plasmid (I-366) 1,5 kb 15

Hind III (5')

Barn Hl Xho I Κρη I

20 Bgl II

Sac I (3‘)

Hind III

- pJ19-13 plasmid (I-368) 6,7 kb 25

Hind III Bgl II Κρη I Κρη I

30 Eco RI

Eco RI

DK 174910 B1 18

Sal I Κρη I

Bgl II

5 Bgl II

Hind III (3')

Positivt hybridiserende M13 fagplader dyrkedes indtil 5 timer, og det enkeltstrengede DNA blev ekstraheret.

10 M13mp8 subkloner af λϋ19 DNA blev sekvenseret efter dideoxymetoden og -teknologien udviklet af Sanger et al (Sanger et al (1977), Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 74, 5463 og M13-kloning og sekventeringshåndbogen, AMERSHAM (1983). Den 17-mer oligonucleotide primer a-^SdATP 15 (400ci/mmol, AMERSHAM) og 0.5X-5X puffer gradientgeler (Biggen M.D. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50 3963) anvendtes. Gelerne blev aflæst og anbragt i computeren under programmerne udviklet af Staden (Staden R. (1982), Nucl. Acids Res. 10, 4731). Alle velegnede referencer og metoder kan findes i AMERSHAM's M13-klonings og sekventeringshåndbog.

20

Den fuldstændige DNA-sekvens af λϋ19 (også betegnet LAV-la) er vist i fig.

4-4e.

Sekvensen blev genopbygget fra sekvensen af fag λϋ19 indskuddet. Num-25 mereringen starter ved cap-bindingsstedet, der blev lokaliseret eksperimentelt (se det efterfølgende). Vigtige genetiske elementer, de vigtigste åbne læserammer og deres forudbestemte slutprodukter er angivet sammen med Hindlll-kloningsstedeme. De potentielle glycosyleringssteder i env-genet er angivet med en streg ovenover. Den NH2-terminale sekvens af p25gag be-30 stemt ved protein-mikrosekvensering er rammet ind.

DK 174910 B1 19

Hvert nucleotid blev sekvenseret gennemsnitlig 5,3 gange: 85% af sekvensen bestemtes på begge strenge og resten sekvenseret mindst to gange fra uafhængige kloner. Basesammensætningen er T 22,2%; C 17,8%; A 35,8%; G 244,2%; G + C 42%. Nucleotidet GC er for en stor del underrepræsenteret 5 (0,9%) som almindeligt blandt eukaryotiske sekvenser (Bird 1980).

Figurerne 5 og 6 giver en skematisk afbildning af længden af de successive åbne læserammer svarende til de successive læsefaser (også betegnet med numrene "1", "2" og M3" der forekommer på den venstre side af fig. 5). De 10 relative beliggenheder af disse åbne læserammer (ORF) i forhold til den nucleotide opbygning af LAV-genomet er refereret ved hjælp af rækken af tal repræsentative for de respektive stillinger af de tilsvarende nucleotider i DNA-sekvensen. De lodrette streger svarer til stillingerne for de tilsvarende stopcodoner.

15 Følgende gener og DNA-fragmenter kan skelnes på de forskellige angivne læserammer. Der refereres herefter også til proteinerne eller glycoproteiner-ne kodet ved hjælp af disse gener og fragmenter.

20 1) "aag-genet" feller ORF-aaa) "gag-genet" koder for kerneproteiner.

gag: nær den 5’ ydre ende af gag orf er en "typisk" initiationscodon (Kozak 25 1984) (stilling 336), der ikke alene er den første i gag orf, men den første fra cap-bindingsstedet. Precursorproteinet er 500 aminosyre lang. Beregnet molekylvægt = 55841 er i overensstemmelse med 55 kd gag precursorpolypep-tidet. Den N-terminale aminosyresekvens af hovenkerneprotein p25 er kodet af nucleotidsekvensen, der starter fra position 732 (fig. 5a). Dette udgør for-30 melt sammenbindingen mellem det klonede LAV-genom og det immunologisk karakteriserede LAVp25-protein. Proteinet kodet 5' for den p25 kodende DK 174910 B1 20 frekvens er temmelig hydrofil. Dets beregnede molekylvægt på 14 866 er i overensstemmelse med molekylvægten af gag-protein p18. 3'-delen af gagregionen koder sandsynligvis for det retrovirale nucleinsyrebindings protein (NBP). Faktisk ligesom i HTLV-1 (Seiki et al., 1983) og RSV (Schwartz et al., 5 1983), findes gentagelsen Cys-X2-0ys-X8-9-Cys fælles for alt NBP (Oroxlan et al., 1984) duplikeret (nucleotider 1509 og 1572 i LAV-sekvens). I overensstemmelse med dens funktion er det formodede NBP ekstremt basisk (17%

Arg + Lys).

10 Specielt fremgår det, at et genomfragment (ORF-gag), der antages at kode for kerneantigenerne herunder p25, p18 og p13-proteineme er anbragt mellem nucleotidstilling 312 (der starter med 5’ CTA GCG GAG 3’) og nucleotid-stilling 1835, (der afsluttes med CTCG TCA CAA 3'). Opbygningen af peptiderne eller proteinerne med dele af ORF’et antages at være den, der svarer 15 til fase 2.

Methioninaminosyren "M" kodet af ATG ved stilling 336-338 er sandsynligvis initiationsmethioninen af gag-proteinprecursoren. Afslutningen af ORF-gag og som følge heraf gag-protein viser sig at være anbragt ved stilling 1835.

20

Begyndelsen af p25-protein, der antages at starte med en Pro-lle-Val-GIn-Asn-lle-GIn-Gly-GIn-Met-Val-His-..., aminosyresekvens, antages at være kodet af nucleotidsekvensen CCTATA..., der begynder ved stilling 732.

25 2) "Poloenet” (eller ORF-ool)

Pol: det omvendte transskriptasegen kan kode et protein på indtil 1003 aminosyrer (beregnet molekylvægt = 113629). Da den første methionincodon er 92 tripletter fra originen af den åbne læseramme, er det muligt, at proteinet er 30 translateret fra et splejset messenger RNA, således at der opnås en gag-pol-polyproteinprecursor.

DK 174910 B1 21

Den pol-kodende region er den eneste, hvori signifikant homologi er blevet fundet med andre retrovirale proteinsekvenser, idet tre områder af homologi er synlige. Det første er en meget kort region på 17 aminosyrer (der udgår fra 5 1856). Homologe regioner er lokaliseret inden i p15 gagRSV-protease (Ditt- mar og Moelling 1978) og et polypeptid kodet af en åben læseramme anbragt mellem gag og pol af HTLV-1 (fig. 5) (Schwartz et al., 1983, Seiki et al., 1983), Dette første område kunne således svare til en bevaret sekvens i vira-le proteaser. Dets ændrede beliggenhed inden i de tre genomer kan ikke væ-10 re signifikant da retrovira, ved splejsning eller andre mekanismer, udtrykker en gag-pol-polyproteinprecursor (Schwartz et al., 1983, Seiki et al., 1983).

Den anden og mest udstrakte homologiregion (der udgår ved 2048) repræsenterer sandsynligvis kernesekvensen af revers transkriptase. Over et område på 250 aminosyrer, med kun minimale indskud eller deletioner, viser 15 LAV 38% aminosyreidentitet med RSV, 25% med HTLV-I, 21% med Mo-MuLV (Schinnick et al., 1981), medens HTLV-I og RSV viser 38% identitet indenfor samme område. Et tredje homologt område er beliggende ved 3'-enden af pol-læserammen og svarer til en del af pp32 peptidet af RSV, der udviser exonuclease-aktivitet (Misra et al., 1982). Der er atter større homolo-20 gi med den tilsvarende RSV-sekvens end med HTLV-1.

Figurerne 4a-4c viser også, at DNA-fragmentet strækker sig fra nucleotidstil-ling 1631 (gående ud fra 5'TTT TTT ....3' til nucleotidstilling 5162, der antages at svare til polgenet. Polypeptidopbygningen af de tilsvarende po-25 lypeptider antages at svare til fase 1. Den standser ved stilling 4639 (afsluttet af 5'G GAT GAG GAT 3').

Disse gener antages at kode for viruspolymerasen eller revers transkriptase.

30 31 Kappeoen (eller ORF-envl DK 174910 B1 22 env: Den env-åbne læseramme har en mulig initiatormethionincodon meget nær starten (8. triplet). Hvis dette er tilfældet, er molekylvægten af det antag-ne env-precursorprotein (861 aminosyrer, beregnet molekylvægt = 97376) i overensstemmelse med størrelsen af LAV-glycoproteinet (110 kd og 90 kd 5 efter glycosidasebehandling). Der er 32 potentielle N-glycosyleringssteder (Asn-X*SerrThr), der er angivet med en streg ovenover i fig. 4d og 4e. Et interessant træk ved env er det meget høje antal Trp-rester i begge ender af proteinet.

10 DNA-sekvensen, der antages at kode for kappeproteineme, antages at strække sig fra nucleotidstilling 5746 (gående ud fra 5' AAA GAG GAG

A....3') indtil nucleotidstilling 8908 (afsluttet ved.....A ACT AAA GAA 3’). Po- lypeptidstrukturerne af sekvenserne af kappeproteinet svarer til de, der af aflæst i overensstemmelse med "fase 3" læsefasen.

15

Begyndelsen af env-transskription antages at være på niveau med ATG-codonen ved stilling 5767-5769.

Der er tre hydrofobe områder, der er karakteristiske for retrovirale kappepro-20 teiner (Seiki et al., 1983) svarende til et signalpeptid (kodet af nucleotider 5815-5850 bp), en anden region (7315-7350 bp) og et transmembransegment (7831-7890 bp). Den anden hydrofobe region (7315-7350 bp) har forud en strækning rig på Arg + Lys. Det er muligt, at dette repræsenterer et sted for proteolytisk spaltning, der ved analogi med over-retrovirale protei-25 ner ville give et ydre kappepolypeptid og et membranassocieret protein (Seiki et al., 1983, Kiyokawa et al., 1984). Et slående træk ved LAV-kappeproteinsekvensen er, at segmenter efter transmembransegmentet er af usædvanlig længde (150 rester). env-Proteinet udviser ingen homologi med nogen sekvens i proteindatabanker. Det lille aminosyremotiv fælles med 30 transmembranproteinerne for alle leukæmogene retrovira (Cianciolo et al., 1984) findes ikke i LAV-env.

DK 174910 B1 23

Opfindelsen angår yderligere de rensede polypeptider, der har aminosyreop-bygningen (eller polypeptidskelletet) af henholdsvis gp110 og gp90, der svarer til den direkte translation af DNA-sekvenserne og fragmenterne, der er 5 defineret nærmere ovenfor (fig. 4d og 4e).

t

Opfindelsen angår yderligere polypeptider indeholdende neutraliserende epi-toper.

10 Beliggenheden af neutraliserende epitoper er yderligere anskueliggjort i fig.

4d. Nærmere omtale sker specielt af de grupper med streg over på tre bogstaver indeholdt i aminosyresekvenserne af kappeproteinerne (læsefase 3), der generelt kan betegnes med formlen Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, hvori X er en hvilken som helst anden mulig aminosyre. Således har det første protein-15 produkt eller polypeptidskellet af env glycoproteinet en molekylvægt over 91 000. Disse grupper antages sædvanligvis at bære glycosylerede grupper.

Disse Asn-X-Ser og Asn-X-Thr-grupper med tilknyttede glycosylerede grupper danner sammen hydrofile områder i proteinet og antages at være anbragt ved yderkanten af og at strække sig udad i forhold til den normale udform-20 ning af proteinerne. Som en følge heraf antages de at være epitoper, der effektiv kan anvendes ved fremstillingen af vaccinepræparater.

Opfindelsen angår således mere specielt peptidsekvenser indeholdt i env-proteinerne og som kan udskæres herfra (eller har den samme aminosyre-25 opbygning), idet de har en størrelse der ikke overskrider 200 aminosyrer.

Foretrukne peptider ifølge opfindelsen (i det efterfølgende omtalt som a, b, c, d, e, f) har vist sig at svare til de, der er kodet af nucleotidsekvenserne, der strækker sig mellem følgende stillinger: a)fra ca. 6171 til ca. 6276 30 DK 174910 B1 24 b) fra ca. 6336 til ca. 6386 c) M " 6466 M " 6516 d) M " 6561 M " 6696 e) " " 6936 ” ” 7006 5 f) " " 7611 " " 7746

Andre hydrofile peptider i den env-åbne læseramme er identificeret i efterfølgende. De er defineret som gående ud fra aminosyre 1 = lysin kodet af AAA ved stilling 5746-5748 i LAV DNA-sekvensen (fig. 4d og 4e) og herefter yder-10 ligere nummereret i overensstemmelse med deres rækkefølge i forhold til slutsekvensen. Det første og andet tal i relation til hver peptid refererer til deres respektive N-terminale og C-terminale aminosyrer.

Disse hydrofile peptider er: 15 aminosyrer 8-23 inklusive, dvs

Met-Arg-Val-Lys-Glu-Lys-Tyr-GIn-His-Leu-T rp-Arg-Trp-Gly-T rp-Lys- 20 aminosyrer 63-78 inklusive, dvs.

Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Glu-Val-

His-Asn-Val-Trp-Ala-Thr- 25 aminosyrer 82-90 inklusive, dvs.

Val-Pro-Thr-Asp-Pro-Asn-Pro-GIn-Glu- aminosyrer 97-123 inklusive, dvs.

30 DK 174910 B1 25

Thr-Glu-Asn-Phe-Asn-Met-Trp-Lys-Asn-Asp-

Met-Val-Glu-GIn-Met-His-Glu-Asp-lle-lle-

Ser-Leu-Trp-Asp-Gln-Ser-Leu* 5 aminosyrer 127-183 inklusive, dvs.

Val-Lys-Leu-Thr-Pro-Leu-Cys-Val-Ser-Leu-Lys-Cys-Thr-Asp-Leu-Gly-Asn-Ala-Thr-Asn-10 Thr-Asn-Ser-Ser-Asn-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-

Gly-Giu-Met-Met-Met-Glu-Lys-Gly-Glu-lle-Lys-Asn-Cys-Ser-Phe-Asn-lle-Ser-Thr-Ser-Ile-Arg-Gly-Lys-Val-GIn-Lys- 15 aminosyrer 197-201 inklusive, dvs.

Leu-Asp-lle-lle-Pro-lle-Asp-Asn-Asp-Thr-

Thr- 20 aminosyrer 239-294 inklusive, dvs.

Lys-Cys-Asn-Asn-Lys-Thr-Phe-Asn-Gly-Thr-Gly-Pro-Cys-Thr-Asn-Val-Ser-Thr-Val-GIn-Cys-Thr-His-Gly-lle-Arg-Pro-Val-Val-Ser-25 Thr-GIn-Leu-Leu-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-

Glu-Glu-Glu-Val-Val-lle-Arg-Ser-Ala-Asn-Phe-Thr-Asp-Asn-Ala-Lys- aminosyrer 300-327 inklusive, dvs.

Leu-Asn-GIn-Ser-Val-Glu-lle-Asn-Cys-Thr- 30 DK 174910 B1 26

Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-lle-

Arg-lle-GIn-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg- aminosyrer 334-381 inklusive, dvs.

5

Lys-lle-Gly-Asn-Met-Arg-GIn-Ala-His-Cys-Asn-lle-Ser-Arg-Ala-Lys-Trp-Asn-Ala-Thr-Leu-Lys-GIn-lle-Ala-Ser-Lys-Leu-Arg-Glu-Gln-Phe-Gly-Asn-Asn-Lys-Thr-lle-lle-Phe-10 Lys-GIn-Ser-Ser-Gly-Gly-Asp-Pro- aminosyrer 397-424 inklusive, dvs.

Cys-Asn-Ser-Thr-GIn-Leu-Phe-Asn-Ser-Thr-15 T rp-Phe-Asn-Ser-Thr-T rp-Ser-Thr-Glu-Gly-

Ser-Asn-Asn-Thr-Glu-Gly-Ser-Asp- aminosyrer 466-500 inklusive, dvs.

20 Leu-Thr-Arg-Asp-Gly-Gly-Asn-Asn-Asn-Asn-

Gly-Ser-Glu-lle-Phe-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp-Asn-Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-T yr-Lys-T yr-Lys-Val- 25 aminosyrer 510-523 inklusive, dvs.

Pro-Thr-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-GIn-

Arg-Glu-Lys-Arg- 30 aminosyrer 551-577 inklusive, dvs.

DK 174910 B1 27

Val-GIn-Ala-Arg-GIn-Leu-Leu-Ser-Gly-lle-

Val-Gln-Gln-Gln-Asn-Asn-Leu-Leu-Arg-Ala-

Ile-Glu-Ala-GIn-GIn-His-Leu- 5 aminosyrer 594-603 inklusive, dvs.

Ala-Val-Glu-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp-GIn-GIn- aminosyrer 621-630 inklusive, dvs.

10

Pro-T rp-Asn-Ala-Ser-T rp-Ser-Asn-Lys-Ser- aminosyrer 657-679 inklusive, dvs.

15

Leu-lle-Glu-Glu-Ser-GIn-Asn-GIn-GIn-Glu-

Lys-Asn-Glu-GIn-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-

Lys-Trp-Ala- 20 aminosyrer 719-758 inklusive, dvs.

Arg-Val-Arg-G I n-G I y-T y r-Ser-Pro-Leu-Ser-Phe-GIn-Thr-His-Leu-Pro-Thr-Pro-Arg-Gly-Pro-Asp-Arg-Pro-Glu-Gly-lle-Glu-Glu-Glu-25 Gly-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-lle- aminosyrer 780-803 inklusive, dvs.

Tyr-His-Arg-Leu-Arg-Asp-Leu-Leu-Leu-lle-30 Val-Thr-Arg-lle-Val-Glu-Leu-Leu-Gly-Arg-

Arg-Gly-Trp-Glu- DK 174910 B1 28

Opfindelsen angår også en hvilken som helst kombination af disse peptider.

4) Andre ORF’er fåbne læserammer) 5 DNA-sekvenser, der tilvejebringer åbne læserammer, omtales som ORF-Q, ORF-R og som Ί", "2", ”3”, "4", "5", idet de relative stillinger er nærmere angivet i fig. 2 og 3.

10 Disse ORF’er har følgende beliggenheder: ORF-Q fase 1 start 4554 stop 5162 ORF-R " 2 ” 8325 " 8972 ORF-1 ”1 " 5105 " 5392 15 ORF-2 ” 2 " 5349 ” 5591 ORF-3 " 1 " 5459 M 5692 ORF-4 " 2 " 5595 " 5849 ORF-5 ” 1 ” 8042 " 8355

20 ORF Q og F

Den virale (+) streng af LAV-genomet vist sig at indeholde lovbestemte retro-virale gener, der koder kernestrukturelle proteiner (gag), revers transskripta-se (pol) og kappeprotein (env) og to ekstra åbne læserammer (orf), som vi 25 benævner Q og F (tabel 1). Den genetiske organisation af LAV 5'LTR-gag-pol-Q-env-F-3'LTR er enestående. Medens kompetente retrovirus pol og env-gener i al replikation lapper over, er de i LAV adskilt af orf Q (192 aminosyrer) efterfulgt af fire små (< 100 tripletter) orf. orf-F (206 aminosyrer) overlapper lidt 3’-enden af env og er bemærkelsesværdig ved, at den er halv ko-30 det af U3-regionen af LTR.

DK 174910 B1 29

En sådan opbygning anbringer LAV klart adskilt fra tidligere sekvensbedømte retrovira (fig. 2). (-)-strengen er tilsyneladende ikke kodende. Det yderligere Hindlll-sted af LAV-klonen λϋ81 (med hensyn til XJ19) ligger op til den tilsyneladende ikke-kodende region mellem Q og env (stilling 5166-5745). Gåen-5 de ud fra stilling 5501 er en sekvens (AAGCCT), der er forskellig i en enkel base (understreget) fra Hindlll-genkendelsessekvensen. Det må antages, at meget af restriktionsstedspolymorfismen mellem forskellige isolater vil ligge i dette område. Klonen λϋ81 er også blevet omtalt i britisk patentansøgning nr.

84 23659 indleveret 15. september 1984.

10

Q oa F

Nucleotidstillingeme af deres respektive ydre dele er angivet i tabel 1 nedenfor.

15

Beliggenheden af orf Q er uden fortilfælde i opbygningen af retrovira. Orf F er enestående ved, at den er halvt kodet af U3-elementet af LTR. Begge orf er har "stærke" initiatorcodoner (Kozak 1984) nær deres 5'-ender og kan kode proteiner på 192 aminosyrer (beregnet molekylvægt = 22487) og 206 amino-20 syrer (beregnet molekylvægt = 23316). Begge formodede proteiner er hydrofile (pQ 49% polær, 15,1 % Arg + Lys; pF 46% polær, 11% Arg + Lys) og vil derfor sandsynligvis ikke være direkte associeret med membranen. Funktionen for de formodede proteiner pQ og pF kan ikke forudsiges, da der ikke er fundet nogen homologi ved at undersøge proteinsekvensdatabanker. Mellem 25 orf F og pX-proteinet af HTLV-1 er der ingen homologi, der kan afsløres. Yderligere er deres hydrofobicitet/hydrofilicitet fuldstændig forskellige. Det er kendt, at retrovirus kan transducere cellulære gener specielt proto-oncogener (Weinberg 1982). Ansøgeren foreslår, at orf Q og F repræsenterer exogent genetisk materiale og ikke noget levn af cellulært DNA, fordi (I) LAV DNA 30 ikke hybridiserer til det humane genom under stringente betingelser (Alizon DK 174910 B1 30 et al., 1984), (II) deres codonbrug kan sammenlignes med brugen af gag, pol og env-geneme (resultater ikke vist).

Organisationen af et rekonstrueret LTR og virale omgivende elementer er vist 5 skematisk i fig. 6. LTR er 638 bp lang og udviser sædvanlige træk (Chen og Barker 1984): (I) den er bunden af en inverteret gentagelse (5' ACTG) indeholdende det bevarede TG-dinucleotid (Temin 1981), (II) nabostillet til 5' LTR er tRNA-primerbindingsstedet (PBS), komplementær med tRNAlys3 (Raba et al., 1979), (III) nabostillet til 3’ LTR er et perfekt 15 bp polypurin-10 område. De tre andre observerede polypurinområder mellem nucleotider 8200-8800 er ikke efterfulgt af en sekvens, der er komplementær med den, der er lige forud for PBS. Grænserne for U5, R og U3-elementer bestemtes påfølgende måde. U5 er anbragt mellem PBS og polyadenyleringsstedet etableret fra sekvensen af 3'-enden af oligo(dT)-primet LAVcDNA (Alizon et 15 al., 1984). Således er U5 84 basepar lang. Længden af R+U5 bestemtes ved at syntetisere tRNA-primet LAVcDNA. Efter alkalisk hydrolyse af primeren fandtes R+U5 at være 181 ± 1 bp. Således er R97 bp lang og cap-bindingsstedet for dens 5’-ende kan lokaliseres. Endelig er U3 456 bp lang.

LAV LTR indeholder også karakteristiske regulerende elementer: en polyade-20 nyleringssignalsekvens AATAAA 19 bp fra R-U5 sammenknytningen og sekvensen ATATAAG, der meget sandsynligt er TATA-kassen, 22 bp 5' for cap-bindingsstedet. Der er ikke længere direkte gentagelser inden i LTR. Interessant viser LAV LTR visse ligheder med muse mammae tumorvirus (MMTV) Donehower et al., 1981). De anvender begge tRNAlys3 som en 25 primer ved (-) strengsyntese, medens alle andre exogene pattedyrs retrovirus kendt hidtil anvender tRNApro (Chen og Barker 1984). De er i besiddelse af meget ens polypurinområder (området af LAV er AAAAGAAAAGGGGGG medens området for MMTV er AAAAAAGAAAAAGGGGG). Det er muligt, at den virale (+) strengsyntese er diskontinuert, da polypurinområdet, der 30 omgiver U3-elementet af 3' LTR er fundet nøjagtig duplikeret i 3'-enden af orf pol ved 4331-4336. Herudover er MMTV og LAV eksceptionel ved, at U3-elementet kan kode en orfen. Når det drejer sig om MMTV indeholder U3 DK 174910 B1 31 orf en. Når det drejer sig om MMTV indeholder U3 hele orf, medens i LAV indeholder U3 110 codoner af 3'-halvdelen af orf F.

Den LAV lange terminale gentagelse (LTR) er skematisk afbildet i fig. 6. Som 5 nævnt opbyggedes LTR fra sekvensen af AJ19 ved sammenstilling af se-kventerne nabostillede til Hindlll-kloningsstederne.

Sekvensering af oligo(dt) primet LAV DNA klon pLAV75 (Alizon et al., 1984) fjerner muligheden af sammenklumpede Hindlll-stederi R-området af LAV.

10 LTR er begrænset af en inverteret gentagelsessekvens (IR). Begge de virale elementer, der omgiver LTR, er repræsenteret = tRNA-primerbindingsstedet (PBS) for 5' LTR og polypurinområdet (PU) for 3' LTR. Angivet er også en formodet TATA-kasse, cap-bindingsstedet, polydenyleringssignalet (AA-TAAA) og polyadenyleringspladsen (CAA). Beliggenheden af den åbne læse-15 ramme F (648 nucleotider) er vist ovenfor LTR-skemaet.

LTR (lange terminale gentagelser) kan også defineres som liggende mellem stilling 8560 og stilling 160 (enden strækker sig over stilling 9097/1). Faktisk er afslutningen af genomet ved 9097, og knytter sig p.g.a. LTR-opbygningen 20 af retrovirus, til begyndelsen af sekvensen:

Hind til

CTCAATAAAGCTTGCCTTG

25 9097 1

Tabel 1 opsummerer beliggenheder og størrelser af virale åbne læserammer, Nucleotidkoordinateme henfører til den første base af den første triplet (1.

30 triplet) af den første methionin initiationscodon (Met) og af stopcodonen (stop). Antallet af aminosyrer og beregnede molvægte er beregnet for umodi- DK 174910 B1 32 ficerede precursorprodukter, der starter ved et første methionin indtil enden bortset fra pol, hvor størrelsen og molekylvægten henfører til hele orf en.

5 Beregnet orf 1. triplet Met stop Antal aminosyrer molekylvægt 10 gag 312 336 1836 500 55841 pol 1631 1934 4640 (1003) (113629)

Orf Q 4554 4587 5163 192 22487 15 env 5746 5767 8350 861 973676 orf F 8324 8354 8972 206 23316 20

Tabel 1: Beliggenhed og størrelse af virale åbne læserammer.

Det er naturligt, at fagmanden vil være i stand til at opnå alle DNA fragmenter der koder for produkter ifølge opfindelsen, f. eks. ved at spalte hele DNA sva-25 rende til det komplette genom af en l_AV art, f.eks. ved spaltning ved hjælp af partiel eller fuldstændig nedbrydning heraf med et passende restriktionsenzym og ved efterfølgende udvindelse af de relevante fragmenter. De forskellige DNA omhandlet ovenfor kan også anvendes som en kilde for passende fragmenter. Metoden omhandlet nedenfor til isolering af fragmenterne, 30 som herefter inkluderes i de ovenfor nævnte plasmider, og som anvendtes herefter til DNA-sekvensbedømmelse, kan anvendes.

DK 174910 B1 33

Naturligvis kan andre metoder anvendes. Visse af disse er angivet i britisk patentansøgning nr. 84 23659 indleveret 19. september 1984. Der skal f. eks. omtales følgende metoder.

5 a) DNA kan indføres i pattedyrceller med passende selektionmarkører ved hjælp af en hel række metoder, calcium phosphatudfældning, polyethylengly-col, protoplaster-fusioner osv.

b) DNA-fragmenter svarende til gener kan klones i ekspressionsvektorer for 10 E. coli, gær- eller pattedyrceller og de fremkomne proteiner renses.

c) Det pro-virale DNA kan blive "shot-gunned" (fragmenteret) i prokaryotiske ekspressionsvektorer til opnåelse af fusionspolypeptider. Rekombinant producerende antigenisk kompetente fusionsproteiner kan identificeres ved sim- 15 pel undersøgelse af rekombinanteme med antistoffer over for LAV-antigener.

De omhandlede produkter i form af LAV-virale antigener kan anvendes til at opnå til diagnostiske formål.

20 Fremgangsmåder ifølge opfindelsen til diagnosticering af antistoffer overfor LAV virus i biologisk væske, specielt serum, er særegent ved det der er angivet i den kendetegnede del af krav 18.

Opfindelsen angår generelt selve polypeptiderne, hvad enten de er syntetise-25 ret kemisk, isoleret fra virale præparater eller udtrykt med forskellige omhandlede DNA, specielt af ORF’er eller fragmenter heraf i passende værter, specielt prokaryotiske eller eukaryotiske værter, efter transformation af disse med en passende vektor, der forud er modificeret med det tilsvarende DNA.

30 Mere generelt angår opfindelsen også en vilkårlig af polypeptidfragmenterne (eller molekyler, specielt glycoproteiner med samme polypeptidskelet som de DK 174910 B1 34 nævnte polypeptider) indeholdende en epitop karakteristisk for et LAV-protein eller glycoprotein, hvilket polypeptid eller molekyle herefter har N-terminale og C-terminale dele henholdsvis enten fri eller uafhængigt af hinanden kovalent bundet til aminosyrer, der er forskellig fra de, der er normal 5 associeret med dem i de større polypeptider eller glycoproteiner af LAV-virus, hvilke sidstnævnte aminosyrer herefter er fri eller hører til en anden polypeptidsekvens. Specielt angår opfindelsen hybride polypeptider indeholdende en vilkårlig af de epitopbærende polypeptider, der nærmere er beskrevet ovenfor, rekombineret med andre polypeptidfragmenter normalt 10 fremmede for LAV-proteinerne, der har en tilstrækkelig størrelse til at tilvejebringe en forøget immunogenicitet af det epitop-bærende polypeptid, idet disse fremmede polypeptidfragmenter enten er immunogent inerte eller ikke griber ind i de immunogene egenskaber af det epitopbærende polypeptid.

15 Sådanne hybridpolypeptider, der kan indeholde indtil 150, endog 250 aminosyrer består sædvanligvis af udtrykkelsesprodukter af en vektor, der fra begyndelsen indeholdt en nucleinsyresekvens, der kunne udtrykkes under kontrol af en passende promotor eller replikon i en passende vært, hvilken nucleinsyresekvens imidlertid forud var modificeret ved indførsel i denne af 20 en DNA-sekvens, der koder det epitopbærende polypeptid.

De epitopbærende polypeptider, specielt sådanne, hvis N-terminale og C-terminale aminosyrer er fri, kan også opnås ved kemisk syntese efter metoder, der er velkendte inden for proteinkemien.

25

Syntese af peptider i homogen opløsning og i fast fase er velkendt.

Med hensyn til dette skal henvises til syntesemetoden i homogen opløsning beskrevet af Houbenweyl i et arbejde med titlen "Methoden der Organischen 30 Chemie" (methods of Organic Chemistry) udgivet af E. Wunsch., vol 15-1 og II, THIEME, Stuttgart 1974.

DK 174910 B1 35

Denne syntesemetode består af efter hinanden følgende kondensering af enten de successive aminosyrer to og to, i passende orden eller de successive peptidfragmenter, der er forud fremstillet eller dannet og allerede inde-5 holder adskillige aminoacylrester i den passende orden. Bortset fra carboxy-og aminogrupper, der vil blive engageret i dannelsen af peptidbindingerne, må man passe på forud at beskytte alle andre reaktive grupper, der bæres af disse aminoacylgrupper eller fragmenter. Imidlertid aktiveres med fordel car-boxygrupperne inden dannelsen af peptidbindingerne ved velkendte metoder 10 inden for peptidsyntesekemien. Alternativt kan man anvende koblingsreaktioner, der omfatter almindelige koblingsreagenser f.eks. af carbodiimidtypen som f.eks. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid. Dersom den anvendte aminosyre og gruppe bærer en yderligere amingruppe (f.eks. lysin) eller en anden syrefunktion (f.eks. glutaminsyre), kan disse grupper beskyt-15 tes med carbobenzoxy eller t-butyloxycarbonylgrupper, når det drejer sig om amingrupper, eller med t-butylestergrupper, når det drejer sig om carbo-xygrupper. Lignende metoder er mulige til beskyttelse af andre reaktive grupper. F.eks. kan SH-gruppen (f.eks. i cystein) beskyttes med en acetami-domethyl- eller paramethoxybenzylgruppe.

20 Når det drejer sig om fremadskridende syntese, aminosyre for aminosyre, starter syntesen fortrinsvis med kondensationen af den C-terminale aminosyre med den aminosyre, der svarer til den nabostillede aminoacylgruppe i den ønskede sekvens osv. trin for trin indtil den N-terminale aminosyre. En anden 25 foretrukken metode, der kan anvendes, er den der er beskrevet af R.D. Mer-rifield i "Solid phase peptide synthesis" (j. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154).

Ved Merrifield-metoden bindes den første C-terminale aminosyre i kæden til en passende porøs polymerharpiks ved hjælp af aminosyrens carboxygrup-30 pe, hvorefter aminogruppen i aminosyren herefter beskyttes f.eks. ved hjælp af en t-butyloxycarbonylgruppe.

DK 174910 B1 36 Når den første C-terminale aminosyre således er fastgjort til harpiksen, fjernes den beskyttende gruppe ved aminogruppen ved vask af harpiksen med en syre f.eks. trifluoreddikesyre, når den beskyttende gruppe for amino-5 gruppen er en t-butyloxycarbonylgruppe.

Herefter kobles carboxygruppen af den anden aminosyre, der skal give den anden aminoacylgruppe i den ønskede peptidsekvens, til den afbeskyttede amingruppe i den C-terminale aminosyre fastgjort til harpiksen. Fortrinsvis er 10 carboxygruppen i denne anden aminosyre aktiveret for f.eks. med dicyclohe-xylcarbodiimid, medens aminosyrens amingruppe er beskyttet f.eks. med en t-butyloxycarbonylgruppe. Den første del af den ønskede peptidkæde, der omfatter de to første aminosyrer, er således opnået. Som forud fjernes beskyttelsen herefter fra amingruppen, og man kan gå yderligere frem med at 15 binde den næste aminoacylgruppe osv., indtil hele det ønskede peptid er opnået.

De beskyttende grupper i de forskellige sidekædegrupper, dersom der er nogen i den dannede peptidkæde, kan herefter flernes. Det ønskede peptid kan 20 herefter frigøres fra harpiksen f.eks. ved hjælp af hydrogenfluoridsyre, og til slut kan den fås i ren form fra den sure opløsning ved almindelige metoder.

Med hensyn til peptidsekvenser af mindre størrelse og indeholdende en epi-top eller immunogen determinant og mere specielt sådanne, der let fås ved 25 kemisk syntes, kan det være nødvendigt for at forøge deres in vivo immunogene karakter at koble eller "konjugere" dem kovalent til et fysiologisk acceptabelt og ikke toxisk bæremolekyle.

Eksempler på bæremolekyler eller makromolekylære understøttelser, der kan 30 anvendes til at fremstille de omhandlede konjugater, er naturlige proteiner som tetanustoxoid, ovalbumin, serumalbuminer, hemocyaniner osv.. Synteti- DK 174910 B1 37 ske makromolekylære bærere som f.eks. polysiner eller poly(D-L-alanin)-poly(L-lysin)’er kan også anvendes.

Andre typer makromolekylære bærere, der kan anvendes, og som sædvan-5 ligvis har en molekylvægt på mere end 20000 er velkendte fra litteraturen.

Konjugaterne kan fremstilles ved velkendte metoder som f.eks. beskrevet af Frantz og Robertson i "Infect, and Immunity", 33, 193-198 (1981), eller af P.E. Kauffman in Applied and Environmental Microbiology, October 1981, 10 Vol. 42, nr. 4, 611-614.

F.eks. kan følgende koblingsmidler anvendes: Glutaraldehyd, ethylchlorfor-miat, vandopløselige carbodiimider (N-ethyl-N'(3-dimethylaminopropyl) car-bodiimid, HCI), diisocyanater, bis-diazobenzidin, di- og trichlor-s-triaziner, 15 cyanbromider, benzaquinon såvel som koblingsmidler nævnt i Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p. 7-23 (Avrameas, Ternynck, Guesdon).

En hvilken som helst kobiingsmetode kan anvendes til at binde én eller flere reaktive grupper af peptidet på den ene side og én eller flere reaktive grupper 20 af bærestoffet på den anden side. Atter opnås kobling med fordel mellem carboxyl og amingruppeme i peptidet og bærestoffet eller omvendt i nærværelse af koblingsmiddel af den type, der anvendes ved proteinsyntese, dvs. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, N-hydroxybenzotriazol osv..

Kobling mellem amingrupper henholdsvis båret af peptidet og bærestoffet 25 kan også foretages med glutaraldehyd f.eks. som beskrevet af BOQUET, P. et al. (1982) Molec. Immunol., 19, 1441-1549, hvor bærestoffet er hemocya-nin.

Immmunogeniciteten af epitopbærende peptider kan også forstærkes ved 30 oligomerisering heraf f.eks. i nærværelse af glutaraldehyd eller et andet passende koblingsmiddel. Specielt angår opfindelsen vandopløselige immuno- DK 174910 B1 38 gene oligomere opnået på denne måde, der specielt omfatter fra 2 til 10 monomere enheder.

De omhandlede glycoproteiner, proteiner og polypeptider i det efterfølgende 5 betegnes som "antigener", hvad enten de er opnået i ren tilstand fra LAV-viruspræparater eller - hvilket specielt angår peptiderne - ved kemisk syntese, er anvendelige ved metoder til afsløring af tilstedeværelsen af anti-LAV-antistoffer i biologiske substrater, specielt biologiske væsker som sera fra mennesker eller dyr, specielt med henblik på mulig diagnostisering af LAS 10 eller AIDS.

Opfindelsen angår specielt en in vitro metode til diagnostisering, der anvender et kappeglycoprotein (eller et polypeptid indeholdende en epitop af dette glycoprotein) til afsløring af anti-LAV-antistoffer i sera fra personer, der inde-15 holder disse. Andre polypeptider, specielt sådanne der bærer en epitop af et kerneprotein - kan også anvendes.

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen omfatter: 20 - Anbringelse af en forudbestemt mængde af én eller flere af antigenerne i brøndene på en mikrotiterplade; - indførsel af stigende fortyndinger af biologiske væsker f.eks. serum, der skal diagnostiseres, i disse brønde; - inkubering af mikropladen; 25 - forsigtig vask af mikropladen med en passende puffer; - tilsætning til brøndene af specielt mærkede antistoffer rettet mod blodim-munoglobuliner og - afsløring af det dannede antigen-antistofkompleks, der herefter er en indikation på tilstedeværelsen af LAV-antistoffer i den biologiske væske.

30 DK 174910 B1 39

Med fordel foretages mærkningen af anti-immunoglobulinantistofferne ved hjælp af et enzym valgt blandt de, der er i stand til at hydrolysere et substrat, idet substratet undergår en forandring med hensyn til bestrålingsabsorption i det mindste inden for et forud bestemt bånd af bølgelængder. Undersøgelse 5 af substratet, foretrukket i forhold til en kontrol, giver herefter et mål for den potentielle risiko eller for den egentlige tilstede værelse af sygdommen.

Foretrukne metoder er således immunoenzymatiske eller også immunofluo-rescensafsløringer specielt i overensstemmelse med ELISA-metoden. Titre 10 kan bestemmes ved immunofluorescens eller direkte eller indirekte immunoenzymatiske bestemmelser. Kvantitative titreringer af antistoffer kan foretages.

Opfindelsen angår også selve det diagnostiske udstyr til in vitro afsløring af 15 antistoffer over for LAV-virus, idet udstyret omfatter en vilkårlig af de heri beskrevne polypeptider og alle biologiske og kemiske reagenser samt udstyr, der er nødvendigt for at udføre den diagnostiske undersøgelse. Foretrukket udstyr omfatter alle nødvendige reagenser til udførelse af ELISA-forsøgene. Foretrukne udstyr vil således udover en vilkårlig af de nævnte polypeptider 20 yderligere indeholde passende pufre og anti-humane immunoglobuliner, idet anti-humane immunoglobuliner er mærket enten med et immunofluores-censmolekyle eller med et enzym. I det sidste tilfælde omfatter foretrukket udstyr også et substrat, der kan hydrolyseres med enzymet og som giver et signal, specielt en modificeret absorption af en stråling, i det mindste ved en 25 forudbestemt bølgelængde, idet signalet herefter er en indikation på tilstedeværelsen af antistof i den biologiske væske, der skal undersøges med udstyret.

Opfindelsen angår også vaccinepræparater, hvis aktive princip udgøres af en 30 vilkårlig af antigenerne dvs. de heri beskrevne polypeptider, hele antigener, specielt de rensede qp110 eller immunogene fragmenter heraf, fusions- DK 174910 B1 40 polypeptider eller oligopeptider sammen med et passende farmaceutisk eller fysiologisk acceptabelt bærestof.

Et første type foretrukket aktivt princip er qp110 immunogenet.

5

Andre foretrukne aktive principper, der falder inden for området, består af peptiderne indeholdende mindre end 250 am i nosy reenheder, fortrinsvis mindre end 150, der kan deduceres for de komplette genomer af LAV og mere foretrukkent de peptider, der indeholder én eller flere grupper valgt blandt 10 Asn-X-Ser og Asn-X-Ser beskrevet ovenfor. Foretrukne peptider til anvendelse til fremstilling af vaccineprincipper er peptider (a) til (f) defineret ovenfor.

Som eksempel, uden dog at virke begrænsende, kan nævnes, at passende doser af vaccinepræparaterne er sådanne, der er i stand til at frembringe antistoffer in vivo hos værten, specielt i en menneskelig vært. Passende doser 15 ligger fra 10 til 500 pg poiypeptid, protein eller glycoprotein pr. kg f.eks. 50 til 100 pg pr. kg.

De omhandlede forskellige peptider kan også anvendes som sådan til fremstilling af antistoffer, fortrinsvis monoklonale antistoffer specifikke over for de 20 respektive forskellige peptider. Til fremstillingen af hybridomer, der udskiller disse monoklonale antistoffer, anvendes almindelige fremstillings- og undersøgelsesmetoder. De monoklonale stoffer, der i sig selv er en del af den foreliggende opfindelse, udgør herefter værdifuldt værktøj til identifikation og endog bestemmelse af de relative forhold mellem de forskellige polypeptider 25 eller proteiner i biologiske prøver, specielt prøver fra mennesker indeholdende LAV eller relaterede vira.

I forbindelse med opfindelsen anvendes der værter (prokaryotiske eller euka-ryotiske celler), der er transformet ved hjælp af ovennævnte rekombinanter, 30 og som er i stand til at udtrykke DNA-fragmenterne.

DK 174910 B1 41 I forbindelse med opfindelsen anvendes der også vektorer til transformation af eukaryotiske celler af human oprindelse, specielt lymfocytter, hvis polymeraser er i stand til at genkende LTR af LAV. Specielt er disse vektorer karakteriseret ved tilstedeværelsen af et LAV LTR heri, idet LTR herefter er aktiv 5 som en promotor, der i stand til effektiv transskription og translation i en passende vært af et DNA-indskud, der koder for et bestemt protein anbragt under dettes kontrol.

Det er ikke nødvendigt at nævne at opfindelsen også kan anvendes alle vari-10 anter af genomer og tilsvarende DNA-fragmenter (ORF'er), der har i det væsentlige ækvivalente egenskaber, idet alle genomerne hører til retrovirus, der kan betragtes som ækvivalenter af LAV.

Det er klart, at de efterfølgende krav også dækker alle ækvivalenter af pro-15 dukteme (glycoproteiner, polypeptider, DNA osv.), hvor et ækvivalent er et produkt dvs. polypeptid, der kan skelnes fra et bestemt ét defineret i et af kravene, f.eks. ved hjælp af én eller flere aminosyrer, medens det stadig har i det væsentlige samme immunologiske eller immunogene egenskaber. En lignende regel for ækvivalens skal anvendes med hensyn til DNA’er, idet det 20 skal forstås, at ækvivalensreglen herefter vil være bundet til reglen om ækvivalens, der hører til de polypeptider, som de koder for.

Det skal forstås af den efterfølgende litteratur og alle patentansøgninger eller patenter, der ikke specielt er identificeret, men som udgør en del af beskri-25 velsen, herved skal anses som litteraturhenvisninger.

30

Claims (19)

1. Produkt, kendetegnet ved, at det indeholder polypeptidskelettet af 5 et glycoprotein af LAV kappen med en molekylvægt på ca. 110.000 eller af et antigen med lavere molekylvægt stammende fra det nævnte, hvilket rensede produkt er i stand til at genkendes af sera af human oprindelse, som indeholder antistoffer over for LAV-virus.

2. Produkt ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er et renset glycopro tein opnået fra et lysat af et LAV virus.

3. Glycoproteinet ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det danner komplekser med concanavalin A, hvorhos komplekset er dissocierbart i nærvæ- 15 relse af O-methyl-a-D-mannopyranosid.

4. Glycoproteinet ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at det binder lectiner.

5. Glycoproteinet ifølge et vilkårligt af de foregående krav 2 til 4, k e n d e t e g n e t ved, at det også er følsomt over for indvirkningen af endoglycosida-ser.

6. Produkt ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er et genetisk mani-25 puleret polypeptid bestående af ovennævnte polypeptidskelet eller et fragment deraf.

7. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polypeptidskelettet deraf er indeholdt i polypeptidet kodet af det nucleinsyrefragment, der strækker sig 30 mellem nucleotid nummer 5746 og nucleotidnummer 8208 på fig, 4. DK 174910 B1 43

8. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polypeptidskelettet deraf er indeholdt i polypeptidet kodet af det nucleinsyrefragment, der strækker sig mellem nucleotid nummer 5746 og nucleotid nummer 8350 på fig. 4.

9. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polypeptidskelettet deraf er indeholdt i polypeptidet kodet af det nucleinsyrefragment, der strækker sig mellem nucleotid nummer 5767 og nucleotid nummer 8208 på fig. 4.

10 Met-Arg-Val-Lys-Glu-Lys-T yr-GIn-His-Leu- T rp-Arg-T rp-Gly-T rp-Lys- aminosyrer 63-78 inklusive, dvs.

10. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polypeptidskelettet der-10 af er indeholdt i polypeptidet kodet af det nucleinsyrefragment, der strækker sig mellem nucleotid nummer 5767 og nucleotid nummer 8350 i fig. 4.

11. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er udtrykkelsespro-duktet af et cDNA (orf-env) svarende til det nucleinsyrefragment der strækker 15 sig mellem nucleotiderne nummer 5746 og 8208 på fig. 4 eller mellem nucleotiderne nummer 5746 og 8350 på fig. 4 eller mellem nucleotiderne nummer 5767 og 8208 på fig. 4 eller mellem nucleotiderne nummer 5767 og 8350 på fig. 4 i en passende værtscelle.

12. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er et polypeptid sva rende til et vilkårligt af de, der er kodet af nucleotidsekvenserne, der strækker sig henholdsvis mellem følgende positioner: a) fra ca. 6171 til ca. 6276 25 b) fra ca. 6336 til ca. 6386 c) fra ca. 6466 til ca. 6516 d) fra ca. 6561 til ca. 6696 e) fra ca. 6936 til ca. 7006 f) fra ca. 7611 til ca. 7646 30 hvilke nucleotidsekvenser kan afledes af LAV DNA'et på fig. 4a-4e. 44 DK 174910 B1

13. Produkt ifølge krav 1,kendetegnet ved, at det er et peptid valgt blandt nedenstående definerede polypeptider, idet tallene i forbindelse med hvert peptid svarer til positionerne af dets N-terminale og C-terminale amino-5 syrer gående ud fra lysin (amino 1) kodet af AAA'et ved stillingerne 5734-5748 af LAV DNA'et vist i fig. 4a-4e: aminosyrer 8-23 inklusive, dvs

14. Fremgangsmåde til fremstilling af produktet ifølge et vilkårligt af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man går ud fra et LAV-virus opnået fra den supernatante del af en dyrkning af celler inficeret hermed og renset under sådanne betingelser, at det stadigt indeholder en væsentlig del af kappeanti-30 generne, at man lyserer viruset, at man udvinder antigenerne frigjort i den DK 174910 B1 48 supematante del, og at man skiller det rensede præparat fra andre komponenter i lysatet.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at udgangsvirus 5 er blevet renset ved en centrifugering, der især omfatter en første centrifugering med en vinkelcentrifugeringshastighed, specielt på 10.000 omdrejninger pr. minut, hvilket muliggør fjernelse af ikke-virale bestanddele, mere specielt af cellebestanddele, herefter en anden centrifugering ved en højere vinkelhastighed, specielt ved 45.000 omdrejninger pr. minut til opnåelse af et bund- 10 fald af selve viruset.

15 Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-T yr-Asp-Thr-Glu-Val- H i s-Asn-Val-T rp-Ala-Thr- aminosyrer 82-90 inklusive, dvs.

20 Val-Pro-Thr-Asp-Pro-Asn-Pro-GIn-Glu- aminosyrer 97-123 inklusive, dvs. Thr-Glu-Asn-Phe-Asn-Met-T rp-Lys-Asn-Asp-25 Met-Val-Glu-GIn-Met-His-Glu-Asp-lle-lle- Ser-Leu-Trp-Asp-GIn-Ser-Leu- aminosyrer 127-183 inklusive, dvs. Val-Lys-Leu-Thr-Pro-Leu-Cys-Val-Ser-Leu- 30 DK 174910 B1 45 Lys-Cys-Thr-Asp-Leu-Gly-Asn-Ala-Thr-Asn-Thr-Asn-Ser-Ser-Asn-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Gly-Glu-Met-Met-Met-Glu-Lys-Gly-Glu-lle-Lys-Asn-Cys-Ser-Phe-Asn-lle-Ser-Thr-Ser-5 Ile-Arg-Gly-Lys-Val-GIn-Lys- aminosyrer 197-201 inklusive, dvs. Leu-Asp-lle-lle-Pro-lle-Asp-Asn-Asp-Thr-10 Thr- aminosyrer 239-294 inklusive, dvs. Lys-Cys-Asn-Asn-Lys-Thr-Phe-Asn-Gly-Thr-15 Gly-Pro-Cys-Thr-Asn-Val-Ser-Thr-Val-GIn- Cys-Thr-His-Gly-lle-Arg-Pro-Val-Val-Ser-Thr-GIn-Leu-Leu-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val-Val-lle-Arg-Ser-Ala-Asn-Phe-Thr-Asp-Asn-Ala-Lys- 20 aminosyrer 300-327 inklusive, dvs. Leu-Asn-GIn-Ser-Val-Glu-lie-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-lle-25 Arg-lle-GIn-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg- aminosyrer 334-381 inklusive, dvs. Lys-lle-Gly-Asn-Met-Arg-GIn-Ala-His-Cys-30 Asn-lle-Ser-Arg-Ala-Lys-T rp-Asn-Ala-Thr- Leu-Lys-GIn-lle-Ala-Ser-Lys-Leu-Arg-Glu- DK 174910 B1 46 Gln-Phe-Gly-Asn-Asn-Lys-Thr-lle-lle-Phe- Lys-GIn-Ser-Ser-Gly-Gly-Asp-Pro- aminosyrer 397-424 inklusive, dvs. 5 Cys-Asn-Ser-Thr-GIn-Leu-Phe-Asn-Ser-Thr-T rp-Phe-Asn-Ser-Thr-T rp-Ser-Thr-Glu-Gly-Ser-Asn-Asn-Thr-Glu-Gly-Ser-Asp- 10 aminosyrer 466-500 inklusive, dvs. Leu-Thr-Arg-Asp-Gly-Gly-Asn-Asn-Asn-Asn-Gly-Ser-Glu-lle-Phe-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Asp-Met-Arg-Asp-Asn-Trp-Arg-Ser-Glu-Leu-15 T yr-Lys-T yr-Lys-Val- aminosyrer 510-523 inklusive, dvs. Pro-Thr-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-GIn-20 Arg-Glu-Lys-Arg- aminosyrer 551-577 inklusive, dvs. Val-GIn-Ala-Arg-GIn-Leu-Leu-Ser-Gly-lle-25 Val-GIn-GIn-GIn-Asn-Asn-Leu-Leu-Arg-Ala- Ile-Glu-Ala-GIn-GIn-His-Leu- aminosyrer 594-603 inklusive, dvs.

30 Ala-Val-Glu-Arg-T yr-Leu-Lys-Asp-GIn-GIn- DK 174910 B1 47 aminosyrer 621-630 inklusive, dvs. Pro-T rp-Asn-Ala-Ser-T rp-Ser-Asn-Lys-Ser- 5 aminosyrer 657-679 inklusive, dvs. Leu-lle-Glu-Glu-Ser-GIn-Asn-GIn-GIn-Glu- Lys-Asn-Glu-GIn-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp- Lys-Trp-Ala- 10 aminosyrer 719-758 inklusive, dvs. Arg-Val-Arg-GIn-Gly-T yr-Ser-Pro-Leu-Ser-Phe-GIn-Thr-His-Leu-Pro-Thr-Pro-Arg-Gly-15 Pro-Asp-Arg-Pro-Glu-Gly-lle-Glu-Glu-Glu- Gly-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-lle- aminosyrer 780-803 inklusive, dvs.

20 Tyr-His-Arg-Leu-Arg-Asp-Leu-Leu-Leu-lle- Val-Thr-Arg-lle-Val-Glu-Leu-Leu-Gly-Arg-Arg-Gly-Trp-Glu- eller en vilkårlig kombination af disse peptider. 25

16. Fremgangsmåde til fremstilling af produktet ifølge et vilkårligt af kravene 6-13, k e n d e t e g n e t ved, at man transformerer en cellekultur med en vektor modificeret med en LAV DNA sekvens, der koder det tilsvarende po- 15 lypeptid, idet cellekulturen er i stand til at udtrykke LAV DNA sekvensen, at man udvinder udtrykkelsesprodukterne indeholdende produktet ifølge et vilkårligt af kravene 6-13 fra cellekulturen, og at man skiller produktet ifølge et vilkårligt af kravene 6-13 fra de andre udtrykkelsesprodukter.

17. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 14, 15 eller 16, k e n d e t egnet ved, at adskillelsen af produktet foretages ved, at dette bringes i kontakt med monoklonale antistoffer, der speficikt genkender et produkt ifølge et vilkårligt af kravene 1-13.

18. Fremgangsmåde til diagnosticering af antistoffer over for LAV-virus i en biologisk væske, specielt humant serum, kendetegnet ved, at man bringer den biologiske væske i kontakt med produktet ifølge et vilkårligt af kravene 1-13 under betingelser, der er velegnede til kompleksdannelse mellem antistofferne og produktet, der skal dannes, og at man detektorer kom- 30 plekset som indikation på tilstedeværelsen af antistofferne i den biologiske væske. DK 174910 B1 49

19. Immunogent præparat kendetegnet ved, at det indeholder det rensede produkt ifølge et vilkårligt af kravene 1-13 sammen med et farmaceutisk vehicle velegnet til fremstilling af vacciner, hvorhos det rensede produkt er i 5 en mængde, der er i stand til at fremkalde produktion af antistoffer rettet mod produktet. 10