DE3722272A1 - Differenzierung des krankheitszustandes bei aids-antikoerpertests - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den Nachweis bzw. die Bestimmung von Antikörpern für verschiedene Viren, von denen bekannt ist, daß sie das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) hervorrufen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Analyse von Körperflüssigkeiten auf solche Antikörper als Hinweis auf eine AIDS-Infektion.

Beispiele für bekannte AIDS-Viren sind das Human T-Zellen- Leukemia-Virus-III (HTLV-III), das Lymphadenopathy- Associated-Virus (LAV) und das Acquired Immune Deficiency Syndrome Related Virus (ARV). Als Ergebnis von seroepidemiologischen Untersuchungen wurden Tests zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern gegen diese Viren entwickelt, die anzeigen, daß dort, wo nachweisbare Gehalte an solchen Antikörpern vorliegen, das infektöse Virus ebenfalls vorhanden sein kann. In jedem Falle wird die Anwesenheit der Antikörper als Anzeichen für eine frühere Exposition oder Infektion mit dem Virus angesehen und läßt vermuten, daß das Virus oder das Virusgenom weiterhin vorhanden ist.

Es wurde nun gefunden, daß die Anwesenheit und die Mengen von Antikörpern gegen bestimmte AIDS-Virusproteine nicht nur die Exposition eines Individuums an AIDS anzeigen können, sondern auch differenzieren können zwischen solchen, die tatsächlich durch AIDS infiziert worden sind, und solchen, die AIDS zwar ausgesetzt waren, jedoch gesund geblieben sind. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung können die Bandenmuster und Dichten auf Serum-inkubierten Western-Blots und ähnlichen Festphasen-Bindungsmedien abgelesen werden zur Unterscheidung zwischen den zwei Zuständen unter denjenigen, die in AIDS-Antikörper-Reihenuntersuchungstests positiv sind. In den Testergebnissen, über die hier beispielsweise berichtet wird, liegen Antikörper gegen mindestens sechs AIDS-Virusproteine alle in erhöhten Gehalten vor bei denjenigen, die AIDS ausgesetzt waren, verglichen mit denjenigen, die AIDS nicht ausgesetzt waren, und die Gehalte an Antikörpern gegen drei dieser Proteine zeigen statistisch signifikante Unterschiede zwischen gesunden und immungeschwächten Personen. Durch Messung des Gehaltes an irgendeinem oder allen dieser drei Antikörper im Vergleich zu Standardgehalten oder Standardbereichen auf der Basis von statistischen Beurteilungen bekannter Populationen können prognostische und/oder diagnostische Informationen in bezug auf AIDS erhalten werden.

Die beiliegende Zeichnung zeigt eine Balkengraphik, welche die Gehalte an Antikörpern für bestimmte angegebene AIDS- Virusproteine darstellen, die aus Personen entnommen wurden, die zu den drei Gruppen gehören: bestätigte AIDS-Patienten, Homosexuelle (eine anerkannt hohe Risikogruppe) und solche, die nicht zu einer Risikogruppe gehören.

Die Testergebnisse, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, wurden abgeleitet von Western-Blot-Analysen, die mit mehreren Populationen von Personen durchgeführt wurden unter Verwendung eines Immunoblot-Assay-Kits (von der FirmaBio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Kalifornien/ USA) nach den Angaben des Herstellers. Die entwickelten Immunoblot-Streifen wurden durch Reflexionsdensitometrie auf einem Bio-Rad-Video-Densitometer, Modell 620, der in Serie mit einem Digital-Microvax II-Computer verbunden ist, ausgewertet. Das Datenbasis-Management und die statistischen Auswertungen wurden mit der RS/1-Software durchgeführt. Die Testpersonen umfaßten 100 Individuen, die als AIDS- infiziert diagnostiziert wurden, 124 männliche Homosexuelle Individuen (eine anerkannte hohe Risikogruppe) und 59 Individuen, die nicht zu einer bekannten Risikogruppe gehören. Jede Densitometerlinie wurde ausgewertet in bezug auf die Reaktivität bei ausgewählten R_f (relative Mobilitäts)- Positionen entsprechend den folgenden Virus-Molekulargewichten: 15K, 18K, 24K, 32K, 41K-43K, 55K, 65K und 120K. Jede Linie wurde dann einer der folgenden Bandenmusterklassifikationen zugeordnet:

Tabelle I

Wenn einmal die Linien so zugeordnet waren, wurden die Bandenmusterverteilungen verglichen mit Testergebnissen auf den gleichen Proben, die erhalten wurden bei Anwendung eines Immunofluoreszenz-Antiköpertests (IFA), der von den Orange County Public Health und Medical Services Laboratories (Santa Ana, Kalifornien/USA) durchgeführt wurde, und unter Verwendung von drei FDA-lizenzierten Kits. Letztere waren wie folgt: (1) Virgo HTLV-III ELISA, Elektro-Nucleonics, Inc. (ENI), Fairfield, New Jersey/USA; (2) Abbott HTLV-III EIA, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois/USA; und (3) HTLV-III Bio-Enzabead Test, Litton Bionetics, Charleston, South Carolina/USA, wobei alle Tests nach den Angaben des Herstellers durchgeführt wurden. Die Vergleiche sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Vergleich der Immunoblot-Bandenmuster mit IFA und verschiedenen ELISAS

Die Daten in dieser Tabelle zeigen eine gute Korrelation zwischen dem Bio-Rad Immunoblot-Assay und den ELISA und IFA- Tests sowohl in bezug auf die Empfindlichkeit als auch in bezug auf die Spezifität für den Nachweis von Antikörpern gegen AIDS-assoziierte Virusproteine. Es wurden mehrere verschiedene Bandenmuster innerhalb und zwischen den Gruppen und Risikopersonen festgestellt. Personen mit einer festgestellten AIDS-Infektion wiesen einen höheren Anteil an dem Bandenmuster C auf, während andere Risikogruppen überwiegend Bandenmuster A und B aufwiesen. Von den 59 Proben von Personen, die nicht zu einer Risikogruppe gehörten, zeigte nur 1% eine Reaktivität gegenüber p24 oder dem gp41-43-Bereich, während 5% eine Reaktivität gegenüber anderen Molekulargewichten aufwiesen. Ausgewählte Proben mit einer potentiellen bis nicht-spezifischen Reaktion wurden ebenfalls untersucht und es wurde gefunden, daß sie im allgemeinen negativ sind sowohl gegenüber dem ELISA-Test als auch gegenüber dem Immunoblot-Assay mit Ausnahme der drei CMV-positiven Individuen.

In den beiliegenden Zeichnungen sind die durchschnittlichen optischen Dichten bei ausgewählten R_f-Werten für drei der Populationen angegeben: die 100 AIDS-infizierten Personen, die 124 männlichen Homosexuellen und die 59 Personen, die nicht zu einer bekannten Risikogruppe gehören. Ein Fehlerbereich für jede Figur ist an der Oberseite jedes Balkens durch eine vertikale Klammer angezeigt.

Die Ergebnisse der beiliegenden Zeichnungen zeigen, daß bei R_f-Werten, die einem Molekulargewicht von 41K-43K entsprechen, die mittlere optische Dichte der AIDS-Population (1,37) um eine statistisch signifikante Menge (P ≦ωτ 0,005) höher war als diejenige der homosexuellen Population (0,71). Umgekehrt waren bei R_f-Werten, die Molekulargewichten von 120K und 24K entsprechen, die mittleren optischen Dichten der Homosexuellen- Population um eine statistisch signifikante Menge höher als diejenigen der AIDS-Population. In bezug auf das Molekulargewicht 120K betrug die mittlere optische Dichte der Homosexuellen- Population 0,05 im Vergleich zu 0,02 für die AIDS- Population (P ≦ωτ 0,01), während für das Molekulargewicht 24K die mittlere optische Dichte für die Homosexuellen-Population 0,62 im Vergleich zu 0,36 für die AIDS-Population (P ≦ωτ 0,001) betrug. Im Bereich der mittleren optischen Dichten wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Homosexuellen-Population und der AIDS-Population bei R_f-Werten entsprechend den Molekulargewichten 65K, 55K und 18K beobachtet.

Die Antikörper-Gehalte, die den AIDS-Virus-Proteinen mit Molekulargewichten von 41K-43K, 120K und 24K entsprechen, zeigen somit statistisch signifikante Unterschiede zwischen Proben aus mit AIDS infizierten Personen und Proben aus Personen einer hohen Risikogruppe (die vermutlich AIDS ausgesetzt waren), die jedoch gesund geblieben sind, wobei der 41K-43K-Gehalt bei der AIDS-Population um ungefähr einen Faktor von 2 höher ist und die 120K- und 24K-Gehalte wiederum um ungefähr einen Faktor von 2 niedriger sind. Mit diesen statistisch signifikanten Unterschieden kann man somit differenzieren zwischen Personen, die mit AIDS infiziert sind (einschließlich derjenigen, in denen AIDS immanent ist) und solchen Personen, die AIDS ausgesetzt waren, jedoch noch gesund sind. Die Analyse kann auf irgendeinem dieser drei einzelnen Molekulargewichte basieren. Der 41K-43K-Bereich zeigt beispielsweise in der Zeichnung einen besonders breiten Bandenintensitätsunterschied. Alternativ kann die Analyse auf allen drei Molekulargewichten oder auf irgendeiner anderen Kombination basieren, was die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen gesunden und an AIDS erkrankten Populationen zeigt.

Der Unterschied zwischen den beiden Zuständen (erkrankt gegenüber nur exponiert) kann auch erzielt werden, indem man die Ansprechempfindlichkeitswerte bei dem (den) ausgewählten Molekulargewicht(en) vergleicht mit einem Standardwert, der von einem Assay-Versuch nach dem gleichen Verfahren mit einer bekannten Probe stammt, oder mit Bereichen auf der Basis der statistischen Auswertung der Populationen.

Der Nachweis kann unter Anwendung irgendeines Testverfahrens durchgeführt werden, mit dessen Hilfe Antikörpergehalte gegenüber spezifischen Proteinen (oder Proteinen innerhalb eng definierter Banden) nachgewiesen werden können. Es ist eine große Vielzahl solcher Verfahren bekannt. Zu Beispielen gehören Radioimmuno-Assays, Immunofluoreszenz-Assays (IFA), Enzym-gebundene Immunosorbens-Assays (ELISA) und Enzym-Immuno- Assays (EIA). Diese Assays können Festphasen-Komponenten verschiedener Konfigurationen einschließlich Mikroperlen, beschichteter Behälter oder Protein-gebundener Streifen oder Membranen umfassen. Streifen sind besonders bevorzugt und diese können nach einer Vielzahl von Methoden hergestellt werden, beispielsweise nach den Western-Blot- und Southern- Blot -Methoden sowie unter Anwendung von Methoden, bei denen Proteine einzeln isoliert und auf den Streifen in diskreten Bereichen immobilisiert werden.

Ein Beispiel umfaßt die Verwendung eines Western-Blot eines Elektropherogramms eines AIDS-Virus. AIDS-Viren sind aus einer Vielzahl von Quellen allgemein erhältlich. Man kann beispielsweise HTLV-III erhalten von der Organon Teknika Corporation, Bionetics Laboratory Products Div., Charleston, South Carolina/USA; Prototech Incorporated, St. Paul, Minnesota/USA, oder Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey/USA. Alternativ kann man auch LAV erhalten von Genetic Systems, Seattle, Washington/USA. Der Virus kann nach konventionellen Methoden, beispielsweise durch Verwendung von SDS in einer Pufferlösung, lysiert werden.

Bei dem Festphasen-Träger kann es sich um irgendein inertes Festphasen-Material handeln, das die Virus-Proteine immobilisieren kann. Bevorzugte Träger sind saugfähige Membranen, wie z. B. solche aus Nitrocellulose, Aminobenzyloxymethyl(ABM)-Papier, 2-Aminphenylthioäther(APT)-Papier, Nylon, durch elektrische Aufladung modifiziertem Nylon, Diazobenzyloxymethyl(DBM)- Papier, 2-Diazophenylthioäther(DPT)-Papier und Diethylaminoethyl (DEAE)-Cellulose. Nitrocellulose ist besonders bevorzugt. Die Virus-Proteine werden aufgetrennt in diskrete Bereiche oder Banden, die in einem vorher festgelegten Muster räumlich angeordnet sind zur Immobilisierung auf dem Träger. Die Trennung wird zweckmäßig erzielt durch elektrophoretische Fraktionierung der Proteine in einem Plattengel, wie z. B. Agarose oder Polyacrylamid, wobei Polyacrylamid bevorzugt ist. Die räumliche Anordnung entspricht somit derjenigen des resultierenden Elektropherogramms. Die Immobilisierung der Banden auf dem Träger kann erzielt werden durch direkte Übertragung von dem Gel. Diese kann erzielt werden durch Diffusionsübertragung (Southern-Blotting) oder durch elektrophoretische Übertragung (Western-Blotting). Letztere ist bevorzugt. Die Immobilisierung wird erzielt durch Oberflächenadsorption beim Kontakt, vorzugsweise ohne Vermittlung eines bindenden Agens.

Um die Einheitlichkeit von einem Test zum nächsten zu verbessern und das Auftreten von falsch-positiven Testergebnissen minimal zu halten, ist es bevorzugt, daß etwa gleiche Konzentrationen jedes Virus-Proteins in jedem einzelnen Blot vorliegen. Es ist selten, daß die Viren selbst solche Konzentrationengehalte ergeben und es ist daher zweckmäßig, daß bestimmte Banden während des Bandentrennverfahrens vermindert oder vergrößert werden. Dies kann erzielt werden durch Anwendung von HPLC oder Affinitäts-Chromatographie zum Konzentrieren oder zum Auslöschen geeigneter Banden. Wenn beispielsweise eine Virusprobe eine überschüssige Menge an p24-Protein enthält, kann die Probe durch eine Lectin-Kolonne geschickt werden, in der alle Proteine mit Ausnahme der p24 zurückerhalten werden. Die gebundenen Proteine werden dann selektiv eluiert und das p24-Protein wird in einem geeigneten Mengenanteil in die Mischung zurückgeführt. Als ein weiteres Beispiel können Virus-Proben mit einem Mangel an p41-Protein durch reines p41-Protein ergänzt werden, das erhalten wurde durch HPLC aus einem anderen Virus oder einer Proteinquelle in einer ausgewählten Konzentration.

Ein Blockierungsmittel ist im allgemeinen darin enthalten, um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern, wenn einmal die Immobilisierung der Virus-Proteine erfolgt ist. Milch- Proteine und Detergentien sind besonders wirksame Blockierungsmittel, die im allgemeinen in wäßriger Lösung zusammen mit einem Antischäumungsmittel verwendet werden. Eine typische Milchprotein-Konzentration liegt innerhalb des Bereiches von etwa 1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%.

In einem Assay-Kit können die verschiedenen Komponenten kombiniert sein, die erforderlich sind zur gleichzeitigen Durchführung mehrerer Assays gemäß der vorstehenden Beschreibung. Zu den Kit-Komponenten gehört eine Reihe von im wesentlichen identischen Streifen aus dem Festphasen-Material, von denen jeder die auf einer Seite desselben und in Abständen entlang seiner Länge immobilisierten Virus-Proteine aufweist. Die Streifen können üblicherweise aus einer Western-Blot-Membran ausgeschnitten werden, die aus einem einzelnen Plattengel übertragen wurde. Die Streifen sind daher identisch in bezug auf die Typen, Mengen und Positionen der Virus-Proteine. Die Streifen werden vorzugsweise markiert, um die Seite anzugeben, an welche die Proteine gebunden sind, und um die geeignete Orientierung anzuzeigen, wodurch sichergestellt wird, daß alle Banden in der gleichen Reihenfolge vorliegen.

Eine zweite Komponente des Kits ist eine Lösung eines Konjugats aus einem Antikörper, der spezifisch ist für die Proben- Antikörper, die an die Virus-Proteine gebunden werden, wobei es sich bei der anderen Komponente des Konjugats um ein geeignetes Enzym, vorzugsweise alkalische Phosphatase, handelt. Der Konjugat-Antikörper ist ein Anti-Human-Immunoglobulin, wie z. B. Anti-Human-IgG, -IgM, -IgA oder ein anderer Antikörper, der ein Klassen- oder Subklassen-spezifischer Antikörper ist. Anti-Human-IgG ist bevorzugt.

Die verwendete Konjugatmenge ist eine Menge, die im Überschuß gegenüber dem erwarteten Bereich der Menge der Probenantikörper in jedem Assay vorliegt, so daß alle Probenantikörper auf dem Träger gebunden werden unter Bildung von Komplexen. Die Konzentration des Konjugats in der Lösung wird ausgewählt auf der Basis der Empfindlichkeit. Im allgemeinen wird die niedrigste Konzentration angewendet, die sichtbare Ergebnisse auf einer Standardprobe ergibt. Bei den meisten Anwendungszwecken fällt diese in den Bereich der Verdünnungen von 1 : 500 bis 1 : 2000.

Eine dritte Komponente ist eine Lösung des Substrats, auf die das Enzym einwirkt, vorzugsweise eine Kombination aus Nitroblue- Tetrazoliumchlorid und 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (NBT/BCIP) in etwa äquimolaren Mengen. Die verwendete Substratmenge ist eine Menge, die ausreicht, um als Folge der Einwirkung des Enzyms eine nachweisbare Änderung hervorzurufen. Für NBT/BCIP liegt diese im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 1 × 10^-4 bis etwa 10 × 10^-4 Mol/l für jede Komponente.

Es kann auch eine Waschlösung, die das Blockierungsmittel enthält, darin enthalten sein. Außerdem sind vollständig entwickelte Vergleichsstreifen, welche die Standardwerte darstellen, als Anleitung für den Operator darin enthalten. Diese Streifen können als Photographien in einem Instruktions- Manual vorliegen oder sie können tatsächlich Streifen sein. Außerdem sind Behälter darin enthalten für die Aufnahme der einzelnen Teststreifen und zum Eintauchen derselben in die Proben, Reagenzien und Waschlösungen zum Zwecke der Inkubation und des Bewegens bzw. Rührens, während man sie die Flüssigkeiten in den verschiedenen Stufen des Assay-Verfahrens ansaugen läßt.

Ein anderes Beispiel ist ein solches, bei dem Festphasen- Bindungsreagenzien verwendet werden, die aus einem AIDS-Viruslysat hergestellt werden durch Isolieren der Proteine der Wahl aus dem Lysat, Verdünnen jedes Proteins in einer Trägerflüssigkeit unter Bildung von Stammischungen, die jeweils ein Protein in einer vorher festgelegten Konzentration enthalten, und Aufbringen der Mischungen auf diskrete, genau definierte Bereiche auf einem Festphasen-Träger und Immobilisieren der Proteine darauf in einem vorher festgelegten Muster.

Zur Vorbereitung für die Trennungen wird der Virus mit einem Detergens solubilisiert unter Verwendung von SDS oder CHAPS und mit Mercaptoethanol oder Dithiothreit reduziert. Bei einer vorläufigen Chromatographie in einer Lectin-Kolonne werden dann alle Glycoproteine (160, 120, 65 und 41-43 kd) in der Mischung zurückgehalten. Die nicht-zurückgehaltenen Proteine werden dann in einer Umkehrphase-HPLC-Kolonne konzentriert, danach mit einem steigenden Gradienten einer organischen Komponente eluiert zur Abtrennung der übrigen Proteine. Die in dieser Stufe verwendete Kolonne kann eine Kolonne mit einer eingebundenen Phase, wie z. B. eine C-4-, C-1-, Phenyl- oder Cyclopropyl-Kolonne sein. Die in der Lectin-Kolonne zurückgehaltenen Glycoproteine werden eluiert und konzentriert in einer Umkehrphasen-HPLC-Kolonne, aus der sie durch Gradientenelution abgetrennt werden. Die Umkehrphasen-Kolonne führt in jedem Falle zu einer Konzentration, zu einer weiteren Trennung und Entsalzung der Proteine. Nach der Umkehrphasen- Chromatographie können die Fraktionen in einem Verdampfer, beispielsweise einem Savant Speed-Vac-Verdampfer zur Trockne eingeengt werden. Die Trennung kann überwacht werden durch Entnahme kleiner Proben aus jeder Fraktion und Untersuchen derselben unter Anwendung der Western-Blot-Analyse.

Bei einer alternativen Methode kann zuerst eine Trennung durchgeführt werden durch Gelpermeations-Chromatographie, bei der die Proteine mit hohem Molekulargewicht (160, 120 und 65 kd) voneinander und von den Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht getrennt werden. Die Komponenten mit dem niedrigeren Molekulargewicht können dann direkt auf eine Umkehrphasen- Kolonne aufgegeben werden zur Durchführung einer gleichzeitigen Entsalzung und Trennung. Unvollständige Trennungen können dann in anderen Umkehrphasen-Kolonnen wiederholt werden.

Eine dritte Alternative besteht darin, die Ionenaustausch- oder Hydroxyapatit-Chromatographie in Gegenwart von Detergentien als erste Verfahrensmaßnahme anzuwenden, woran sich die Umkehrphasen-Schlußtrennung anschließt. Die hydrophobe Wechselwirkungs- Chromatographie in Gegenwart von organischen Modifizierungsmittels ist eine vierte Alternative, während die Affinitäts-Chromatographie, in der eine Farbstoffsäule, wie z. B. Affi-Gel Blue, verwendet wird, eine fünfte Alternative darstellt, wobei sich an beide die Umkehrphasen-HPLC anschließen kann.

Nachstehend wird ein spezifisches Beispiel für eine AIDS-Virusprotein- Trennung unter Anwendung der Gelpermeations- Methode näher beschrieben.

1. Herstellung der Virus-Probe

Ein gereinigter Virus wurde in einer Lösung von 2% Natriumdodecylsulfat und 700 mM 2-Mercaptoethanol in 60 mM TRIS- Chlorid bei pH 8,0 suspendiert und 2 Minuten lang auf 100°C erhitzt. Der resultierende lysierte und solubilisierte Virus wurde dann direkt einer HPLC-Kolonne zugesetzt.

2. Größenausschluß-Chromatographie

Bei der Kolonne handelte es sich um eine Bio-Rad TSK 250- Größenausschluß-Chromatographiekolonne einer Größe von 600 mm × 7,5 mm (ein Produkt der Firma Bio-Rad Laboratories Inc., Richmond, Californien/USA) und die Chromatographie wurde durchgeführt unter Anwendung einer isokratischen Elution mit einem Gemisch aus 20% Isopropanol in PBS, das 0,05% Triton X-100 enthielt. Die Strömungsrate betrug 0,75 mm/min und der Abstrom wurde bei 214 nm überwacht. Die Fraktionen mit einem Volumen von 0,5 ml wurden unter Verwendung eines automatischen Fraktionssammlers gesammelt und die organische Komponente wurde in einem Speed-Vac-Verdampfer entfernt. Das Eluat wurde mittels des Western-Blot überwacht, um die Abtrennung der Virus-Proteine sicherzustellen.

Die Virus-Proteine mit dem höchsten Molekulargewicht (160, 120 und 65 kd) wurden einzeln mittels dieser Trennung isoliert, während die übrigen Proteine in Form von Mischungen eluiert wurden (65 und 55 kd; 55 und 41-43 kd; 41-43, 30 und 24 kd; und 24 und 18 kd). Die Einzelkomponenten-Fraktionen 160, 120 und 65 kd) wurden in einer Umkehrphasen-Kolonne (C-8-Kolonne einer Größe von 4,6 mm × 40 mm) entsalzen und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei das reine Protein zurückblieb. Die Proteine wurden aus den Multikomponenten- Fraktionen wie in den nachstehenden Abschnitten beschrieben isoliert.

3. Umkehrphasen-hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie

Die Fraktionen, die ein 24 kd-Protein enthielten, wurden auf einer Bio-Rad TSK Phenyl-5PW-Kolonne (5,7 mm × 125 mm) fraktioniert, um dieses Protein selektiv zu entfernen. Es wurde ein linearer Gradient von 100% Lösungsmittel A (0,1%ige wäßrige Trifluoressigsäure) bis 100% Lösungsmittel B (0,1% ige Trifluoressigsäure in Acetonitril, enthaltend 10% Isopropanol) innerhalb von 30 Minuten durchlaufen gelassen. Das p24-Protein passierte die Kolonne zuerst, während die anderen Proteine anschließend in Form einer Mischung eluiert wurden. Die Mischung wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie unter Verwendung einer C-4-Kolonne weiter fraktioniert.

Die Phenyl-5PW-Kolonne konnte auch als hydrophobe Wechselwirkungs- Kolonne unter Anwendung eines Umkehrsalzgradienten in Gegenwart von 20% Isopropanol verwendet werden, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.

4. Weitere Umkehrphasen-Chromatographie

Die Proteinmischungen aus der im obigen Abschnitt 2 beschriebenen Gelfiltrations-Kolonne wurden weiter fraktioniert auf einer Bio-Rad Hi-Pore RP304-Kolonne. Vor der Fraktionierung wurden die Proben in einem Speed-Vac-Verdampfer eingedampft, um die organische Komponente zu entfernen, dann wurden sie direkt in die Kolonne eingespritzt. Es wurde ein linearer Gradient von dem Puffer A (0,1%ige wäßrige Heptafluorbuttersäure) bis zum Puffer B (0,1%ige Heptafluorbuttersäure in Acetonitril) über einen Zeitraum von 60 Minuten, nachdem anfänglich 15 Minuten lang 100% Puffer A durchlaufengelassen worden war, in einer Strömungsrate von 1 ml/min durchlaufengelassen, während das Eluat bei 214 nm überwacht wurde. Es wurden Fraktionen in 0,5 ml-Intervallen gesammelt und durch Western-Blot-Analyse überwacht. Alle restlichen Proteinmischungen wurden nach dieser Methode in Einzelkomponenten aufgetrennt.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend anhand bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß zahlreiche zusätzliche Modifikationen, Abänderungen und Substitutionen durchgeführt werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Claims (8)

1. Verfahren zum Nachweis von AIDS in einem Individuum, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Antikörper in dem Serum des Individuums gemessen wird, die sich an AIDS-Virusproteine mit Molekulargewichten, ausgewählt aus der Gruppe etwa 24 000, etwa 41 000 bis etwa 43 000 und etwa 120 000, binden und daß das Meßergebnis mit einem Standard verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den AIDS-Virusproteinen um solche mit Molekulargewichten in dem Bereich von etwa 41 000 bis etwa 43 000 handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Antikörper für jedes der AIDS-Virusproteine in der Gruppe gemessen wird.

4. Verfahren zur Ablesung eines AIDS-Virus-Antigen- Blots, das an markierte Antikörper aus einem Individuum gebunden ist, daß AIDS ausgesetzt war, um eine AIDS-Infektion des Individuums zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt die Bestimmung des Gehaltes an Antikörper- Bindung an AIDS-Virusproteine mit Molekulargewichten, ausgewählt aus der Gruppe etwa 24 000, etwa 41 000 bis etwa 43 000 und etwa 120 000, und den Vergleich des bestimmten Gehaltes mit einem Standard.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den AIDS-Virusproteinen um solche mit Molekulargewichten in dem Bereich von etwa 41 000 bis etwa 43 000 handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Antikörper für jedes der AIDS- Virusproteine in der Gruppe bestimmt wird.

7. Verfahren zur Bestimmung der Stufe der AIDS-Entwicklung in Individuen, die AIDS ausgesetzt waren, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt die Bestimmung des Gehaltes an Antikörpern in den Induviduen, die sich an AIDS-Virusproteine mit Molekulargewichten aus der Gruppe etwa 24 000, etwa 41 000 bis etwa 43 000 und etwa 120 000 binden, und den Vergleich des bestimmten Gehaltes mit einem Bereich des Gehaltes an diesen Antikörpern in Personen mit einer bekannten AIDS-Entwicklungsstufe, der abgeleitet ist von einer statistischen Beurteilung einer Population dieser Personen.

8. Verfahren zur Bestimmung der AIDS-Infektion eines Individuums, das AIDS ausgesetzt war, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt die Inkubation eines AIDS-Virus-Antigen- Blots aus Banden mit einem definierten Antigen-Molekulargewicht mit dem Serum des Individuums unter Bildung eines Bindungsmusters aus der gebundenen Antikörper-Banden darauf und den Vergleich des Bindungsmusters mit Standard-Bindungsmustern von Personen, von denen bekannt ist, daß sie mit AIDS infiziert sind, und von Personen, von denen bekannt ist, daß sie AIDS ausgesetzt waren, jedoch nicht mit AIDS infiziert worden sind.