DE69525901T2

DE69525901T2 - Immunoassay und Reagenzsatz zum Nachweis von insulinähnlichen Wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE69525901T2
Application number: DE69525901T
Authority: DE
Inventors: Shuji Horikawa; Hiroyuki Kasahara; Kazumine Mori; Shigeto Takasu
Original assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Current assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Priority date: 1994-11-15
Filing date: 1995-11-10
Publication date: 2002-07-25
Anticipated expiration: 2015-11-11
Also published as: JPH08145998A; EP0713096B1; JP2789306B2; US5691150A; EP0713096A1; DE69525901D1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Test für insulinähnliche Wachstumsfaktoren in einer biologischen Probe. Diese Erfindung gehört insbesondere zu einem Immuntest für die Gesamtmenge des insulinähnlichen Wachstumsfaktores I (IGF-I) und des insulinähnlichen Wachstumsfaktores II (IGF-II); und auch zu einem Probesatz hierfür. Die obigen Gesamtmengen können nützliche Informationen für die medizinische Diagnose von Krankheiten hinsichtlich Wachstumsinsuffizienz, wie Wachstumsinsuffizienz, Wachstumshormonabweichung und dergleichen, liefern.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Für die medizinische Diagnose von Krankheiten hinsichtlich Wachstumsinsuffizienz, wie Wachstumsinsuffizienz, Wachstumshormonabweichung und dergleichen, war es herkömmlicherweise die Praxis, die Menge der Wachstumshormone zu messen. Der Blutspiegel schwankte jedoch bedeutend, wodurch es schwierig wurde, denselben für die Diagnose zu verwenden. IGF-I, welches zusammen mit Wachstumshormonen auf das Wachstum von Knochen wirkt und verminderte Schwankungen in dem Blutspiegel zeigt, weist andererseits bekanntlich einen hohen klinischen Nutzen für die Diagnose von Krankheiten hinsichtlich Wachstumsinsuffizienz auf, so dass es nun die Praxis wurde, die Menge von IGF-I anstelle der Menge von Wachstumshormonen zu messen. IGF-II ist bekanntlich viel im Blut und im knöchernen Gewebe, ähnlich wie IGF-I, vorhanden. Die Aufklärung der Bedeutung von seiner in vitro Existenz wird daher gespannt erwartet und für diesen Zweck gibt es einen ausserordentlichen Wunsch nach dem sorgfältigen Test der Faktoren.
Als herkömmliche Messmethoden für insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) sind die folgenden Methoden bekannt. Als erstes wird ein Radiorezeptortest genannt, in welchem die Expression der physiologischen Bindungsaktivität der IGFs mit Targetzellen direkt gemessen wird [R. N. Marshall, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 39, 283-292 (1974); W. H. Daughaday, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 53, 282-288 (1981); R. C. Baxter, Journal of Clinical Endocrinology, 24, 267- 278]. Diese Methode weist jedoch Schwierigkeiten beim Erhalt einheitlicher Rezeptoren für die Verwendung bei Messungen auf, ist komplex und benötigt eine lange Reaktionszeit. Diese Nachteile führen oft zu Ergebnissen, welche eine Bestimmung schwierig machen. Dieser Radiorezeptortest wird daher als wenig nützlich für die alltägliche Verwendung in klinischen Test angesehen.
Ein konkurrierender Immuntest [Furlanetto, Journal of Clinical Investigation, 60, 648-657 (1977)] ist ebenfalls bekannt. Gemäss dieser Methode wird polyklonales Antiserum, welches spezifisch und höchst empfindlich hinsichtlich insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs) ist, hergestellt, und dann, IGFs sollen gemessen werden, werden ¹²&sup5; I- markierte IGFs und polyklonales Antiserum bei geeigneten Konzentrationen reagiert, um die mit ¹²&sup5; I-markierten IGFs und IGFs konkurrierend auf die Bindungsseiten des polyklonalen Antiserums reagieren zu lassen. Diese Methode benötigt jedoch viele Schritte und eine lange Reaktionszeit und umfasst überdies eine lästige B/F Trennung. Solche Nachteile haben es für diese Methode schwierig gemacht, sich in klinische Tests durchzusetzen, in denen eine grosse Anzahl von Proben sofort bearbeitet werden müssen.
In der Zwischenzeit wurde eine Technik entwickelt, um einen monoklonalen Antikörper durch Verschmelzen von in virto immunsensibilisierten, Antikörper bildenden Zellen und Myelomzellen zu erhalten, um ein Hybridoma zu bilden [Nature, 256, 495-497 (1975)]. Die Anwendung dieser Technik hat es möglich gemacht, ein Antikörperprotein in grossen Mengen herzustellen, welches monospezifisch für IGFs ist. Die Entwicklung von Radioimmuntests, welche hohe Spezifität und schnelle Reaktionen kennzeichnen, wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers studiert (Japanisches Patent, Offenlegungsschrift Nr. 3561/1989).
Ein Serum ist übrigens bekannt, welches insulinähnliche Wachstumsfaktoren enthält, die Proteine binden (im folgenden als "IGFBPs" abgekürzt oder manchmal einfach als die "bindenden Proteine" bezeichnet), die eine wichtige Rolle beim Schutz oder bei der Kontrolle von IGF-I und IGF- II spielen. IGFBPs sind auch bekannt dafür, in der Form von Komplexen mit IGFs zu existieren. Diese bindenden Proteine führen bei der Messung der genauen Gesamtmenge von IGFs durch den Radioimmuntest zu einer ernsten Interferenz, so dass die Separation von IGFs von den bindenden Proteinen vor der Messung als eine Vorbehandlung notwendig wird. Als Vorbehandlung wird herkömmlicherweise Gelchromatography unter sauren Bedingungen, Festphasenextraktion (Sep-Pak Extraktion), Säureäthanolextraktion oder dergleichen angewandt.
Unter diesen Vorbehandlungsmethoden ist die Gelchromatography unter sauren Bedingungen [J. Zapf, Joürnal of Clinical Investigation, 68, 1321-1330 (1981), R. L. Hintz, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 45, 988-995 (1977), D. R. Powell, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 63, 1186-1192 (1986)] eine Methode, in welcher die bindenden Proteine und IGFs durch eine Säule getrennt werden, indem der Vorteil des Unterschiedes in ihren molekularen Gewichten genutzt wird, und die so erreichten ausgespülten Fraktionen von IGFs für die Messung neutralisiert werden. Diese Methode ist jedoch nicht für den alltäglichen klinischen Test geeignet, da sie Schwierigkeiten bei dem Bearbeiten einer grossen Anzahl von Proben aufweist und zusätzlich eine zusätzliche Ausrüstung für die Säule benötigt.
Die Festphasenmethode (Sep-Pak) [W. H. Daughaday, Journal of Laboratory Clinical Medicine, 109, 355-363 (1987)] ist eine Methode, um IGFs unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen, kleinen Säule (Sep-Pak) zu trennen und zu quantifizieren, welche mit einem Gel ausgestattet ist, das IGF absorbierend ist. Diese Methode ist jedoch nicht frei von lästigen Arbeiten und ist kostspielig, so dass sie für die Behandlung einer grossen Anzahl von Proben nicht geeignet ist.
Die am häufigsten verwendete Methode unter diesen Vorbehandlungsmethoden ist die Säureäthanolextraktion [W. H. Daughaday, Journal of Clinical Endochrinology and Metabolism, 51, 781-788 (1980)]. Diese Methode umfasst ein Mischserum mit einer mit Salzsäureäthanol gemischten Lösung, welche die IGFs von den bindenden Proteinen mit der Säure trennt, die bindenden Proteine mit Äthanol einer spezifischen Konzentration ausfällt, den Supernatant durch Zentrifugalschleuder trennt und sammelt, die Äthanolkonzentration in dem so erreichten Supernatant verringert, die Säure in dem Supernatant mit einer Neutralisationspufferlösung vollständig neutralisiert und verdünnt, um die starke Säure zu puffern, und die verdünnte Lösung als eine Probe immunologisch misst.
Eine der Eigenschaften der Säureäthanolextraktion liegt darin, dass das Verringern des pH-Wertes der Säure eine grosse Auswirkung auf die Trennung der IGFs von den bindenden Proteinen hat. Bei dieser Methode wird in Betracht gezogen, dass Äthanol sich auflösend und extrahierend auf die säuregetrennten IGFs alleine auswirkt und die in der wässrigen Lösung verbliebenen bindenden Proteine trennt und ausfällt und dabei jede Wiederverbindung der IGFs und der bindenden Proteine zu einem Komplex hemmt.
Die Methode der Säureäthanolextraktion ist am weit verbreitetsten in diesen Tagen. Daten von IGF-I, welche gemäss dieser Methode gemessen wurden, werden als die wichtigste Information für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten hinsichtlich Wachstumsinsuffizienz in öffentlichen Instituten angesehen.
Die Säureäthanolextraktion wird jedoch von Nachteilen begleitet. Sie benötigt lästige Arbeiten wie das Zentrifugalschleudern, und ausserdem ist die Neutralisation des sich ergebenden Supernatanten notwendig, mit anderen Worten, sie benötigt lästige Arbeiten und auch Teströhrchen für die jeweiligen Arbeiten, so dass diese Methode nicht für die Behandlung einer grossen Anzahl von Proben geeignet ist. Ein anderer Nachteil ist, dass nach dem Ansaugen des Supernatanten, das heisst, der Säureäthanollösung durch eine Pipette nach dem Zentrifugalschleudern, ein Fehler in der angesaugten Menge aufgrund des Unterschiedes der Flüssigkeitseigenschaften zwischen Äthanol und der wässrigen Lösung einen wesentlichen Einfluss auf die gemessenen Werte hat, und zusätzlich dazu benötigt der Ansaugschritt viel Zeit. Desweiteren wurde über Einfluss von Äthanol, des organischen Lösungsmittels, welches für die Extraktion verwendet wurde, auf den Immuntest und, abhängig von der Probe, ein nach unten verlaufender Einfluss der bindenden Proteine, welche sich noch immer in dem Säureäthanolextrakt befinden, auf den gemessenen Wert berichtet und Probleme aufgeworfen.
Blum et al., die interessiert an der Bindung von IGF-I und IGF-II an ähnliche Seiten von bindenden Proteinen warn, berichteten, dass ein Immuntest von IGF-I und IGF-II in Serum in einer neutralisierenden Pufferlösung ohne Extraktion durch, im Anschluss an die Behandlung der Probe mit einer Säure (pH-Wert von 3.1 oder geringer), Hinzufügen zu der Neutralisationspufferlösung durchgeführt werden kann, welche IGF-I in dem Fall eines IGF-II Testsystems übersteigt (100 mal oder mehr) oder IGF-II in dem Fall eines IGF-I Testsystems zur Vermeidung einer Wiederverbindung mit den bindenden Proteinen übersteigt [W. F. Blum, Acta Endocrinologica, 118, 374-380 (1988); W. F. Blum, Third International Symposium on Insulin-like Growth Factors, 11-19 (1994)]. Kurzum, diese Methode dient dazu, die Bindung der IGF-I oder IGF-II mit den bindenden Proteinen durch Hinzufügen eines sogenannten analogen IGF zu hemmen.
Für diesen Test sollte jedoch ein Antikörper, welcher keine Querreaktivität mit IGF-I bei der Messung von IGF-I oder mit IGF-I bei der Messung von IGF-II aufweist, das heisst, ein höchst spezifischer Antikörper für die Verwendung ausgewählt werden. Ein höchst spezifische Antikörper, welcher nicht mit einem analogen IGF über Kreuz reagiert, ist also unerlässlich wie der primäre Antikörper (Abfangantikörper) in der Sandwichtechnik. Daraus resultiert also eine Auferlegung einer erheblichen Begrenzung der Auswahl eines Antikörpers. Zusätzlich ist es notwendig, IGF-I und IGF-lT in grossen Mengen für ihren Zusatz zu der Neutralisationspufferlösung vorzusehen. Für die Ausgestaltung dieses Testes für einen kommerziellen Probesatz würde die Notwendigkeit von IGF-I und IGF-II in solch grossen Mengen zu einem erheblichen Anstieg der Kosten führen, so dass es kein preisgünstiger Test sein kann, welcher eine weitverbreitete Annahme verspricht.
Es gibt dementsprechend einen Wunsch nach der Entwicklung eines einfacherer und ökonomischeren Testes für insulinähnliche Wachstumsfaktoren, welcher weder lästige Arbeiten noch viel Ausrüstungen benötigt und eine grosse Anzahl von Proben behandeln kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Das Vorgenannte im Blick behaltend haben die vorliegenden Erfinder eine teure Nachforschung bei der Messung der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren eingeleitet. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die Wiederverbindung der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren mit den insulinähnlichen, bindenden Proteinen durch die Behandlung einer biologischen Probe mit einer Säurelösung, Freigabe der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren von den insulinähnlichen, bindenden Proteinen und dann Verwendung einer Neutralisationspufferlösung, welche eine spezifische Substanz enthält, gehemmt werden kann, und dass die so erhaltene Probe für den Immuntest verwendet werden kann, welcher zu der Vervollständigung der vorliegenden Erfindung führt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher, einen Immuntest für insulinähnliche Wachstumsfaktoren in einer biologischen Probe vorzusehen, welcher vor dem Immuntest die Behandlung der biologischen Probe mit einer Säurelösung umfasst, um die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren von den die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren bindenden Proteinen zu befreien, und dann die biologische Probe mit einer neutralisierenden Pufferlösung zu neutralisieren, in welcher ein Rekombinationshemmer enthalten ist, der aus der Gruppe ausgewählt wurde, welche aus 8-Anilino-1-Naphtalen- Sulfonsäure, Salicylsäure, Natrium-Dodecyl-Sulfat und Heparin oder einem Salz davon besteht.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Probesatz für den Immuntest für insulinähnliche Wachstumsfaktoren in einer biologischen Probe vorzusehen, wobei der Probesatz für den obigen Immuntest geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung machte es möglich, eine grosse Anzahl von biologischen Proben ohne lästige Arbeiten oder viel Equipment zu bearbeiten und insulinähnliche Wachstumsfaktoren einfacher und ökonomischer mit hoher Genauigkeit zu testen.
In der vorliegenden Erfindung wird jede biologische Probe ohne die Verwendung von Äthanol, das heisst, eine organische Lösung hergestellt, so dass ungünstige Auswirkungen wie eine Reduktion der Genauigkeit oder des Bindens in dem Immuntestsystem nicht gegeben sind und dabei ein deutlicher Vorteil gegenüber der herkömmlichen Methode durch Säureäthanolextraktion geschaffen wird. Zusätzlich kann der Immuntest gemäss der vorliegenden Erfindung an einer Probe in der Form einer wässrigen Lösung ausgeführt werden, in welcher IGF und bindende Proteine zusammen enthalten sind. Dies hat die Arbeiten verglichen mit dem herkömmlichen Immuntest durch Säureäthanolextraktion im wesentlichen vereinfacht, bei welchem die Trennung der IGFs von den bindenden Proteinen vor der Messung notwendig war.
Desweiteren zwingt der Immuntest gemäss der vorliegenden Erfindung weder zur Verwendung von gläsernen Teströhrchen, noch benötigt er das Zentrifugalschleudern, so dass eine grosse Anzahl von Proben bearbeitet werden können und eine Reduktion der anfänglichen Kosten für klinische Tests ebenfalls gefördert werden kann.
Ferner weist ANS oder dergleichen, was ein Rekombinationshemmer für die vorliegenden Erfindung wäre, die Vorteile auf, dass es kostengünstig ist, kein teures Reagens als Zusatz benötigt und eine geringere Einschränkung für die Auswahl eines Antikörpers auferlegt.
Bei einige Proben, bei welchen bis jetzt gedacht wurde, dass sie niedrige Extraktionsraten aufweisen, wenn sie gemäss der herkömmlichen Methode durch Säureäthanolextraktion getestet werden, wurde festgestellt, dass sie hohe Werte ergeben, wenn sie durch den Immuntest gemäss der vorliegenden Erfindung getestet werden. Dies wurde dank der hohen Extraktionsraten gemäss der Ausführung des Immuntestes nach der vorliegenden Erfindung erreicht. Dies hat bewiesen, dass der Test gemäss der vorliegenden Erfindung eine Methode ist, welche die volle Extraktion von IGFs und die genaue Messung der gesamten IGFs ermöglicht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt graphisch eine Standardkurve, welche gemäss dem Immuntest nach der vorliegenden Erfindung in Bezug auf IGF-II erhalten wurde; und
Fig. 2 zeigt graphisch eine Standardkurve, welche gemäss dem Immuntest nach der vorliegenden Erfindung in Bezug auf IGF-I erhalten wurde.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Um den Immuntest gemäss der vorliegenden Erfindung anzuwenden, ist es notwendig, eine biologische Probe, welche zu testen ist, mit einer Säurelösung zu behandeln, um die IGFs von den bindenden Proteinen zu befreien, die so behandelte biologische Probe mit einem Neutralisationspuffer zu neutralisieren, welcher einen Rekombinationshemmer enthält, und dann den Immuntest der IGFs in einer Weise auszuführen, welche als per se bekannt ist.
Beispiele der biologischen Probe, welche in der vorliegenden Erfindung als ein System für den Immuntest der gesamten IGF-Menge brauchbar sind, beinhalten IGF enthaltende biologische Flüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin, Aszites, Flüssigkeit aus dem Brusthohlraum, Molke, ein amniotischer Erguss, Rückenmarksflüssigkeit, ein biologisches Extrakt oder biologisches Exsudat.
Beispiele der Säurelösung, welche für die Befreiung der IGFs von den bindenden Proteinen verwendet werden, beinhalten Lösungen wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Trifluoressigsäure und Trichloressigsäure; und ihre Pufferlösungen mit Glyzin, Zitronensäure, Essigsäure, Salicylsäure oder dergleichen.
Diese Säurelösung kann bevorzugt in einer Menge von 5 bis 100 mal so viel wie die biologische Probe verwendet werden, und die resultierende säurebehandelte biologische Probe kann bevorzugt einen pH-Wert von 3.5 oder geringer aufweisen, insbesondere 3.0 oder geringer.
Dem Rekombinationshemmer, welcher der Neutralisationspufferlösung hinzugefügt wird, wird keine besondere Begrenzung auferlegt, soweit es eine Substanz ist, welche eine Affinität zu den die IGF bindenden Proteinen aufweist. Bevorzugte Beispiele beinhalten 8- Anilino-1-Naphtalensulfonsäure (ANS), Salicylsäure, Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) und Heparin oder einem Salz davon. Diese Rekombinationshemmer sind wirksam, sogar wenn sie einzeln verwendet werden, jedoch wirksamer, wenn sie in einer geeigneten Kombination verwendet werden. Eine Kombination von ANS und Salicylsäure kann als eine bevorzugte beispielhafte Kombination ausgewählt werden.
Die Neutralisationspufferlösung, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine Pufferlösung, welche einen pH-Wert in der Grössenordnung von 6.0 bis 10 aufweist. Beispiele beinhalten Phosphatpuffer, Karbonatpuffer, Glyzinpuffer, Barbitalpuffer, Trispuffer, Bistrispuffer oder dergleichen.
Für den Puffer ist es nur notwendig, dass er in Konzentration und Menge so eingestellt wird, dass die biologische Probe, welche mit der oben beschriebenen Säurelösung verdünnt und behandelt wird, vollständig neutralisiert werden kann.
Die Menge des Rekombinationshemmers, welcher dem Neutralisationspuffer hinzugegeben wird, variiert in Abhängigkeit von der Art des Hemmers. Beispielsweise wird der Hemmer bevorzugt in einer Menge von ungefähr 0.01 bis 0.30% hinzugegeben, wenn ANS-Mg oder ein anderes ANS Salz als Hemmer verwendet wird, in einer Menge von ungefähr 0.1 bis 3.0%, wenn Natrium-Salicylat verwendet wird, in einer Menge von ungefähr 0.001% bis 0.02%, wenn SDS verwendet wird, alles basierend auf dem Neutralisationspuffer; und in einer Menge von ungefähr 1 bis 50 U/ml, wenn Heparin verwendet wird. Obwohl der Rekombinationshemmer bei Gebrauch dem Neutralisationspuffer hinzugefügt werden kann, ist es vom Standpunkt der verbesserten Arbeitseffizienz vorteilhaft, ihn im voraus zu dem Neutralisationspuffer hinzuzufügen, so dass der Neutralisationspuffer und der Rekombinationshemmer in der Form einer Mischung geliefert werden können.
In der vorliegenden Erfindung kann die neutralisierte Probe mit dem Rekombinationshemmer, welcher darin enthalten ist, wie sie ist, für den Immuntest verwendet werden. Der Art und Weise der Auswahl des Immuntest sind keine besonderen Grenzen auferlegt. Beispiele umfassen Immuntests, welche verschiedene Kennzeichnungsmethoden wie Radioimmuntest, Enzymimmuntest, Immunfluoreszenztest, Chemilumineszenztest und dergleichen verwenden, von denen jeder mittels der konkurrierenden Technik oder der doppelten Ahtikörper- Sandwichtechnik ausgeführt werden. Diese Immuntests können in einer Weise, welche als per se bekannt ist, ausgeführt werden.
Wenn die Sandwichtechnik für die obigen Immuntests ausgewählt wird, kann entweder die Kombination eines markierten Flüssigphasen-Antikörpers und eines Festphasen- Antikörpers oder die Kombination eines markierten Flüssigphasen-Antikörpers und eines Flüssigphasen- Antikörpers verwendet werden. Die erste Kombination wird jedoch im Hinblick auf die Machbarkeit bevorzugt. Exemplarische Markierungsmethoden, welche für die vorliegende Erfindung brauchbar sind, beinhalten das Markieren mit einem Radioisotop wie ¹²&sup5;I oder dergleichen, während ein oxidierendes Agens wie Chloramin T oder dergleichen verwendet wird, das Markieren mit einem Enzym wie alkalische Phosphatase oder Peroxidase durch die Drehmethode oder dergleichen, und das direkte Markieren mit einer fluoreszierenden Substanz wie Europium oder eine lumineszierende Substanz wie ein Acridiniumester.
Um den oben beschriebenen Immuntest für IGFs gemäss der vorliegenden Erfindung vorteilhaft auszuführen, kann beispielsweise ein IGF Testprobesatz, welcher die unten gezeigten Reagens enthält, verwendet werden.
(a) ein Neutralisationspuffer, welche einen Rekombinationshemmer enthält.
(b) ein markierter Anti-IGF-Antikörper.
(c) ein Festphasen-Anti-IGF-Antikörper.
Unter diesen kann die Komponente (a) in der Form eines lyophilisierten Produktes sein, welches mit Wasser bei Gebrauch hinzugefügt wird. Als Markierung in der Komponente (b) kann ein bekanntes Radioisotop, Enzym, eine fluoreszierende Substanz oder chemilumineszente Substanz verwendet werden. Hinsichtlich der Komponente (c) kann die Umwandlung in eine Festphase eingeleitet werden, welche eine unlösliche Substanz wie Glas, Plastik, Feinpartikel oder feine Pozellanpartikel verwendet. Die Komponente (c) kann die Form einer Wand eines Behälters wie eines Rohres, Korns, proteinartiger Feinpartikel, eiserner Feinpartikel oder dergleichen annehmen.
Der obige Probesatz gemäss der vorliegenden Erfindung kann ferner eine Säurelösung für die Befreiung von IGFs von den bindenden Proteinen umfassen.
In der vorliegenden Erfindung spielt die Säurelösung eine Rolle des Schwächens der Bindung zwischen den insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I, IGF-II) und den die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren bindenden Proteinen (IGFBP-1 bis 6), wobei die IGFs von den bindenden Proteinen getrennt werden.
Falls die Probe mit der Säurelösung mit einem Puffer alleine neutralisiert wird, bilden die IGFs unvermeidlich wieder Komplexe mit den bindenden Proteinen. Wenn die Neutralisation andererseits in Anwesenheit eines Rekombinationshemmers wie ANS, Salicylsäure, SDS, Heparin oder dergleichen oder einem Salz davon wie oben beschrieben durchgeführt wird, binden sich die Rekombinationshemmer an die die IGF bindenden Seiten der IGF bindenden Proteine oder können, durch die Benutzung ihrer sterischen Hinderung, die Rekombination der bindenden Proteine mit IGFs verhindern und es dabei möglich machen, eine genaue Messung an IGFs durchzuführen.
Genau beschrieben, eine biologische Probe wird unter sauren Bedingungen behandelt und dann mit einem Neutralisationspuffer zusammengeführt, welcher, als ein Rekombinationshemmer, ANS, Salicylsäure, SDS oder Heparin oder ein Salz davon enthält, um dieselbe zu neutralisieren, wobei eine Probe, welche für den Immuntest geeignet ist, hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung wird als nächstes durch die folgenden Beispiele genauer beschrieben. Es sollte jedoch klar sein, dass diese Erfindung keinesfalls auf oder durch die Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1

Vorbehandlung der Reagens für den Radioimmuntest der IGF-II und radioimmunologische Mengenbestimmung

(1) Beschaffung des IGF-II Antikörpers

Verschiedene von Maus-Hybridomen gewonnene IGF-II Antikörper werden unter der Verwendung von BSA-IGF-II Konjugationen als eine Immunquelle durch eine Methode hergestellt, welche als per se bekannt ist, und 6B wurde als ein Klon der höchsten Affinität durch die Verwendung der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche als per se bekannt ist, ausgewählt. Hybridoma 1D5 (Japanisches Patent, Offenlegungsschrift Nr. 252987/1993), welches in einer ähnlichen Weise hergestellt wurde, wurde von DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD. erhalten und für den Gebrauch vorgesehen.
Diesen beiden Arten von Klonen war es möglich, in Asziten von Mäusen zu wuchern. Sie wurden mit gesättigtem Natriumsulfat ausgesalzen, gefolgt durch Gelfiltration ["TSKG3000 SWXL", Markenname; 0.05M-NaPO&sub4;/0.1M-Na&sub2;PO&sub4;, pH- Wert 6.4), um Antikörper-Fraktionen zu erhalten. Die so erhaltenen Antikörper-Fraktionen wurden durch Ionenaustausch (monoQ, 20 mM-tris, pH-Wert 8.0) gereinigt, gefolgt durch Konzentration und Dialyse gegen einen Phosphatpuffer (20 mM, pH-Wert 7.4). Diese beiden Klone, 1D5 und 6B, wurden in endgültigen Konzentrationen von 8.7 mg/ml bzw. 2.6 mg/ml hergestellt.
Diese monoklonalen Anti-IGF-Antikörper wiesen jeder eine Reinheit von 95% oder grösser auf, wie durch HPLC gemessen. Gemäss der Scatchard Plotanalyse wurde festgestellt, dass 1D5 und 6B Affinitätskonstanten von 0.9 X 10&sup8; L/Mol und 2 · 10&sup9; L/Mol aufweisen und auch als Subtypen IgGl bzw. IgG2a klassifiziert werden.

(2) Herstellung des ¹²&sup5;I markierten Anti-IGF-Antikörpers

In ein silikonbeschichtetes Glasröhrchen werden 2.6 mCi von NEN gemachtem Na¹²&sup5;I eingegeben, gefolgt durch den Zusatz von 196 ul (500 ug) einer Lösung des obigen 6B monoklonalen Anti-IGF-Antikörpers (MoAb-6B) und dann 30 ug/10 ul (H&sub2;O) Chloramin T. Nachdem die sich daraus ergebende Mischung für 20 Sekunden für die Reaktion gerührt wurde, werden 60 ug/10 ul (H&sub2;O) Natrium-Metabisulfit der Reaktionsmischung zugeführt, um die Reaktion zu beenden.
Die so erhaltene Reaktionsmischung wird dann in eine "Sephacryl S-300 Säule" (Markenname; 1.0 cm im Durchmesser, 45 cm in der Länge) eingegeben, welche ausreichend mit einem 0.1 M tris-HCl Puffer (pH-Wert 7.4), der 0.5% BSA und 0.1% NaN&sub3; enthält, ins Gleichgewicht gebracht wurde. Das Eluat aus der Säule wird 1 ml für 1 ml fraktioniert. Insgesamt dürfen 20 bis 22 ml aus der Säule herausgelassen werden und die Immunaktivität von jeder Fraktion wird bei einer Spitzenposition von hoher Radioaktivität gemessen, um die Position der als Ziel markierten Antikörper zu bestätigen. Die so erhaltenen Fraktionen werden als eine gereinigte Reaktionsmischung zusammengefasst.
Die Markierungsrate der Reaktionsmischung, wie durch die Papierchromatography bestimmt, betrug 90%. Dementsprechend war die spezifische Radioaktivität 5.9 uCi/ug (2620 uCl X 0.90. 500. 0.8 = 5.9 uCi/ug; 0.8: Zähleffizienz eines Zählers).
Die gereinigte Reaktionsmischung wurde mit einem Phosphatpuffer (100 mM, pH-Wert 7.4) verdünnt, welcher 0.1 % Gelatine und 0.1% "Tween #20" (Markenname) enthält, wobei ein ¹²&sup5;I markiertes Anti-IGF-II Antikörperreagens, welches eine endgültige Radioaktivität von ungefähr 14.3 kBg (0.39 uCi/ml) aufweist, hergestellt wurde (die Menge des Reagens, welches für den Test verwendet wurde, war jedoch ungefähr 2.9 kBq/200 ul/Röhrchen).

(3) Herstellung des mit Anti-IGF-II-Antikörper beschichteten Korns

In ein Becherglas werden Polystyrolkörner mit 6 mm Durchmesser und 0.4 ml/Korn von einer 5% Reinigungsmittellösung eingefüllt, nachfolgend mit einem Rührer gerührt, um die Grate und dergleichen von den Oberflächen der Körner zu entfernen. Die Körner werden fünf Mal mit entionisiertem Wasser gewaschen, um die Reinigungsmittellösung zu entfernen. Den Körnern wird ein 1 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 5.9) zugeführt, welcher 5 ug/0.2 ml/Korn des 1D5 monoklonalen Anti-IGF-II-Antikörpers (MoAb- 1D5) enthält, gefolgt durch sanftes Rühren über Nacht bei 25ºC, um die Körner die Antikörper absorbieren zu lassen. Die die Antikörper aufgenommenen Körner werden jedes zweimal mit entionisiertem Wasser ausgewaschen, gefolgt durch den Zusatz von 0.2 ml/Korn von einem 25 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7.4), welcher 0.2 M Magnesiumsulfat (7 Hydroxid), 0.5 M NaCl und 0.5% BSA enthält. Die resultierende Mischung wird dann für drei Stunden stehen gelassen. Der Puffer wird aus der Reaktionsmischung entfernt, gefolgt durch das Trocknen über Nacht, wobei die mit Antikörper beschichteten Körner erhalten werden.

(4) Herstellung von Standard IGF-II, Vorbehandlungslösung und Neutralisationspuffer

Standard IGF-II wird durch Einstellen von "Recombinant IGF- II" (Markenname; Produkt von DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), für welches eine Recombinant-DNA verwendet wurde, auf eine geeignete Konzentration mit einem 100 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7.4) hergestellt, welcher 0.1% NaN&sub3;, 0.1% EDTA2Na und 0.5% BSA enthält.
Als Vorbehandlungslösung wird eine Säurelösung von 25 mM Glyzinhydrochlorid (pH-Wert 1.5) verwendet.
Als Neutralisationspuffer wird ein 200 mM tris-HCl Puffer (pH-Wert 8.0) hergestellt und vorgesehen, welcher 0.08% ANS-Mg (8-Anilino-1-Naphtalensulfon-Hemimagnesium), 0.5 & Gelatine, 0.1% "Tween #20" (Markenname) und 0.1% NaN&sub3; enthält.

(5) Radioimmuntest der IGF-II-Gesamtmenge im Serum und seine Ergebnisse

In gläsernen Teströhrchen oder Teströhrchen aus Polystyrol werden 1.0 ml Anteile der Vorbehandlungslösung zu 25 ul des Serums hinzugefügt, als Proben, welche zu testen sind (Proben Nr. 1 bis 7). Nach kräftigem Rühren werden die Reaktionsmischungen stehen gelassen.
Jede mit Säure verdünnte Probe (50 ul), welche mit der Vorbehandlungslösung oder 50 ul der Standard IGF-II, die an die geeignete Konzentration angepasst wurde, behandelt wurde, wird in ein neuerlich vorgesehenes Polystyrolröhrchen eingegeben, gefolgt durch den Zusatz von 300 ul des Neutralisationspuffers, um die Säure zu neutralisieren und zu puffern. Die resultierende Mischung wird mit einem der mit Antikörper beschichteten Körner zusammengegeben, gefolgt von Schütteln bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
Nach der Vervollständigung der ersten Reaktion wird die Reaktionsmischung durch Ansaugen entfernt. Das Röhrchen wird dann zweimal mit 2 ml/Röhrchen einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dem Röhrchen werden 0.2 ml/Röhrchen ¹²&sup5;I markierte Anti-IGF-II-Antikörperlösung zugeführt, gefolgt von Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunden. Nach der Vervollständigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung durch Ansaugen entfernt. Nachdem das Röhrchen zweimal mit 2 ml/Röhrchen einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen wurde, wird die Radioaktivität jedes Röhrchens gemessen.
Bei dem Test wurde die Konzentration der IGF-II von der Radioaktivität der verdünnten Probe unter Verwendung einer Standardkurve (Tabelle 1 und Fig. 1) abgelesen, welche auf den Radioaktivitäten der Standard IGF-II und den Konzentrationen (umgewandelte Konzentrationen) basierend aufgezeichnet wurde, die durch Multiplizieren seiner eigentlichen Konzentrationen mit 41 erreicht wurden, der Verdünnungsrate der Probe in Zeitperioden.
Zum Vergleich werden die Proben (Nr. 1 bis 7) in einer ähnlichen Weise behandelt, ausgenommen, dass die Säureäthanolextraktion verwendet wird.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 1 Tabelle 2
* In dieser Spalte werden unter "Herkömmliche Methode" die Testergebnisse durch die Säureäthanolextraktion gezeigt.

Beispiel 2

Vorbereitung der Reagenzen für den Radioimmuntest von IGF-I und radioimmunologische Mengenbestimmung

(1) Beschaffung des IGF-I Antikörpers

Verschiedene von Maus-Hybridomen gewonnene IGF-I Antikörper werden unter der Verwendung von BSA-IGF-I Konjugationen als Immunquellen in einer Weise hergestellt, welche als per se bekannt ist. Zwei Arten von Klonen, 2D und 6B werden als Klone von höchster Affinität durch die Verwendung der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche als per se bekannt ist, ausgewählt.
Diese beiden Arten von Klonen durften in Asziten von Mäusen wuchern. Sie wurden mit gesättigtem Natriumsulfat ausgesalzen, gefolgt von Gelfiltration ["TSKG3000 SWXL", Markenname; 0.05M-NaPO&sub4;/0.1M-Na&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 6.4), wobei Antikörper-Fraktionen erhalten wurden. Die Antikörper- Fraktionen wurden durch Ionenaustausch (monoQ, 20 mM-tris, pH-Wert 8.0) gereinigt, gefolgt durch Konzentration und Dialyse gegen einen Phosphatpuffer (20 mM, pH-Wert 7.4). Diese beiden Klone, 2D und 6B, wurden bei endgültigen Konzentrationen von 7.5 mg/ml bzw. 2.6 mg/ml hergestellt.
Diese monoklonalen Anti-IGF-II-Antikörper wiesen jeder eine Antikörperreinheit von 95% oder grösser auf, wie durch HPLC gemessen. Gemäss der Scatchard Plotanalyse wurde festgestellt, dass 2D und 6B Affinitätskonstanten von 7.2 · 10&sup8; L/Mol und 3.2 · 10&sup9; L/Mol aufwiesen und auch als Subtypen IgG1 bzw. IgG2a klassifiziert werden.

(2) Herstellung des ¹²&sup5;I markierten Anti-IGF-I-Antikörpers

In ein silikonbeschichtetes Glasröhrchen werden 2.6 mCi von NEN gemachtem Na¹²&sup5;I eingefüllt, gefolgt durch den Zusatz von 196 ul (500 ug) einer Lösung des obigen 6B monoklonalen Anti-IGF-I-Antikörpers (MoAb-6B) und dann 30 ug/10 ul (H&sub2;O) Chloramin T. Die resultierende Mischung wird für 20 Sekunden zum Reagieren gerührt. Dann werden 60 ug/10 ul (H&sub2;O) Natrium-Metabisulfit der Reaktionsmischung zugeführt, um die Reaktion zu beenden.
Die so erhaltene Reaktionsmischung wird dann in eine "Sephacryl S-300 Säule" (Markenname; 1.0 cm im Durchmesser, 45 cm in der Länge) eingefüllt, welche ausreichend mit eine 0.1 M tris-HCl Puffer (pH-Wert 7.4), der 0.5% BSA und 0.1 %NaN&sub3; enthält, ins Gleichgewicht gebracht wurde. Das Eluat aus der Säule wird 1 ml für 1 ml fraktioniert. Insgesamt dürfen 20 bis 22 ml aus der Säule herausgelassen und die Immunaktivität von jeder Fraktion bei einer Spitzenposition von hoher Radioaktivität gemessen, um die Position der als Ziel markierten Antikörper zu bestätigen. Die so erhaltenen Fraktionen werden als eine gereinigte Reaktionsmischung zusammengefasst.
Die Markierungsrate der Reaktionsmischung, wie durch die Papierchromatography bestimmt, betrug 90%. Dementsprechend war die spezifische Radioaktivität 5.9 uCi/ug (2620 uCi X 0.90 ÷ 500 ÷ 0.8 = 5.9 uCi/ug, 0.8: Zähleffizienz eines Zählers)
Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde mit einem Phosphatpuffer (100 mM, pH-Wert 7.4) verdünnt, welcher 0.1 % Gelatine und 0.1% "Tween #20" (Markenname) enthält, wobei ein ¹²&sup5;I markiertes Anti-IGF-I Antikörperreagens, welches eine endgültige Radioaktivität von ungefähr 14.3 kBg (0.39 uCi/ml) aufweist, hergestellt wurde (die Menge des Reagens, welches für den Test verwendet wurde, war jedoch ungefähr 2.9 kBq/200 ul/Röhrchen).

(3) Herstellung des mit Anti-IGF-I-Antikörper beschichteten Korns

In ein Becherglas werden Polystyrolkörner mit 6 mm Durchmesser und 0.4 ml/Korn von einer 5% Reinigungsmittellösung eingefüllt, nachfolgend mit einem Rührer gerührt, um die Grate und dergleichen von den Oberflächen der Körner zu entfernen. Die Körner werden fünf Mal mit entionisiertem Wasser gewaschen, um die Reinigungsmittellösung zu entfernen. Den Körnern wird ein 1 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 5.9) zugeführt, welcher 5 ug/0.2 ml/Korn des 2D monoklonalen Anti-IGF-I-Antikörpers (MoAb- 2D) enthält, gefolgt durch sanftes Rühren über Nacht bei 25ºC, um die Körner die Antikörper absorbieren zu lassen. Die die Antikörper aufgenommenen Körner werden jedes zweimal mit entionisiertem Wasser ausgewaschen, gefolgt durch den Zusatz von 0.2 ml/Korn von einem 25 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7.4), welcher 0.2 M Magnesiumsulfat (7 Hydroxid), 0.5 M NaCl und 0.5% BSA enthält. Die resultierende Mischung wird dann für drei Stunden stehen gelassen. Der Puffer wird aus der Reaktionsmischung entfernt, gefolgt durch das Trocknen über Nacht, wobei die mit Antikörper beschichteten Körner erhalten werden.

(4) Herstellung von Standard IGF-I, Vorbehandlungslösung und Neutralisationspuffer

Standard IGF-I wird durch Einstellen von "Recombinant IGF- I" (Markenname; Produkt von Toyobo Co, Ltd.), für welches eine Recombinant-DNA verwendet wurde, auf eine geeignete Konzentration mit einem 100 mM tris-HCl Puffer (pH-Wert 6.0) hergestellt, welcher 0.1% NaN&sub3;, 0.5% BSA enthält.
Als Vorbehandlungslösung wird eine Säurelösung von 25 mM Glyzinhydrochlorid (pH-Wert 1.5) verwendet.
Als Neutralisationspuffer wird ein 200 mM tris-HCl Puffer (pH-Wert 9.0) hergestellt und vorgesehen, welcher 0.12% ANS-Mg (8-Anilino-1-Naphtalensulfon-Hemimagnesium), 1.0% Gelatine, 0.1% "Tween #20" (Markenname) und 0.1% NaN&sub3; enthält.

(5) Test der IGF-I-Gesamtmenge im Serum und seine Ergebnisse

In gläsernen Teströhrchen oder Teströhrchen aus Polystyrol werden 1.0 ml Anteile der Vorbehandlungslösung zu 25 ul des Serums hinzugefügt, als Proben, welche zu testen sind (Proben Nr. 1 bis 7). Nach kräftigem Rühren werden die Reaktionsmischungen stehen gelassen.
Jede mit Säure verdünnte Probe (50 ul), welche mit der Vorbehandlungslösung oder 50 ul der Standard IGF-I, die an die geeignete Konzentration angepasst wurde, behandelt wurde, wird in ein neuerlich vorgesehenes Polystyrolröhrchen eingegeben, gefolgt durch den Zusatz von 300 ul des Neutralisationspuffers, um die Säure zu neutralisieren und zu puffern. Die resultierende Mischung wird mit einem der mit Antikörper beschichteten Körner zusammengegeben, gefolgt von Schütteln bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
Nach der Vervollständigung der ersten Reaktion wird die Reaktionsmischung durch Ansaugen entfernt. Das Röhrchen wird dann zweimal mit 2 ml/Röhrchen einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dem Röhrchen werden 0.2 ml/Röhrchen 1251 markierte Anti-IGF-I-Antikörperlösung zugeführt, gefolgt von Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunden. Nach der Vervollständigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung durch Ansaugen entfernt. Nachdem das Röhrchen zweimal mit 2 ml/Röhrchen einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen wurde, wird die Radioaktivität jedes Röhrchens gemessen.
Bei dem Test wurde die Konzentration der IGF-II von der Radioaktivität der verdünnten Probe unter Verwendung einer Standardkurve (Tabelle 3 und Fig. 2) abgelesen, welche auf den Radioaktivitäten der Standard IGF-I und den Konzentrationen (umgewandelte Konzentrationen) basierend aufgezeichnet wurde, die durch Multiplizieren seiner eigentlichen Konzentrationen mit 41 erreicht wurden, der Verdünnungsrate der Probe in Zeitperioden.
Zum Vergleich werden die Proben (Nr. 1 bis 7) in einer ähnlichen Weise behandelt, ausgenommen, dass die Säureäthanolextraktion verwendet wird.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 3 Tabelle 4
* In dieser Spalte werden unter "Herkömmliche Methode" die Testergebnisse durch die Säureäthanolextraktion gezeigt.

Claims

1. Immuntest für insulinähnliche Wachstumsfaktoren in einer biologischen Probe, gekennzeichnet durch ein Behandeln der biologischen Probe vor dem Ausführen des Immuntestes mit einer Säurelösung, um die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren von den die insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Proteinen zu befreien und dann die so behandelte biologische Probe mit einer neutralisierenden Pufferlösung zu neutralisieren, welche einen eine Wiederverbindung hemmenden Hemmstoff beinhaltet, der aus der Gruppe ausgewählt wurde, welche aus 8-Anilino- 1-Naphtalen-Sulfonsäure, Salicylsäure, Natrium-Dodecyl- Sulfat und Heparin oder einem Salt davon besteht.

2. Immuntest nach Anspruch 1, wobei die Säurelösung Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure ist oder eine Pufferlösung davon mit Glyzin, Zitronensäure, Essigsäure oder Salicylsäure.

3. Immuntest nach Anspruch 1 oder 2, wobei die neutralisierende Pufferlösung eine Phosphatpufferlösung, Karbonatpufferlösung, Glyzinpufferlösung, Barbitalpuffer, Trispufferlösung oder Bistrispufferlösung ist.

4. Immuntest nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die biologische Probe ein Serum, Blutplasma, Urin, Aszites, Flüssigkeit im Brusthohlraum, Molke, ein amniotischer Erguss, Rückenmarksflüssigkeit, ein biologisches Extrakt oder ein biologisches Exsudat ist.

5. Immuntest nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches ein Radioimmuntest, Enzymimmuntest, Immunfluoreszenztest oder Chemilumineszenztest ist, welche Gebrauch von einer konkurrierenden Technik oder doppelten Antikörper- Sandwichtechnik macht.

6. Immuntest nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren insulinähnlicher Wachstumsfaktor I oder insulinähnlicher Wachstumsfaktor II sind.

7. Immuntestprobesatz für insulinähnliche Wachstumsfaktoren in einer biologischen Probe, welche zumindest die folgenden Reagentien (a) bis (c) umfasst:

(a) Eine neutralisierende Pufferlösung, welche einen eine Wiederverbindung hemmenden Hemmstoff beinhaltet, der aus der Gruppe ausgewählt wurde, welche aus 8- Anilino-1-Naphtalen-Sulfonsäure, Salicylsäure, Natrium-Dodecyl-Sulfat und Heparin oder einem Salt davon besteht.

(b) einen gekennzeichneten Antikörper gegen die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren; und

(c) einen Festphasen-Antikörper gegen die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren.

8. Immuntestprobesatz nach Anspruch 7, welche ferner eine Säurelösung umfasst.

9. Verfahren für die Vorbereitung einer biologischen Probe, welche das Behandeln der biologischen Probe mit einer Säurelösung umfasst, um die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren von den die insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Proteinen zu befreien und dann die so behandelte biologische Probe mit einer neutralisierenden Pufferlösung in Anwesenheit eines eine Wiederverbindung hemmenden Hemmstoffes zu neutralisieren, der aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus 8-Anilino-1-Naphtalen- Sulfonsäure, Salicylsäure, Natrium-Dodecyl-Sulfat und Heparin oder einem Salt davon besteht.