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Diese Erfindung betrifft immundiagnostische Assays zum Nachweis und zur Bestimmung von
Mastitis und subklinischer Mastitis und monoklonale Antikörper für die Verwendung in
genannten Assays.
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Mastitis kann als eine Entzündung der Brustdrüsen definiert werden und wird durch eine
Vielfalt von mikrobischen Infektionen verursacht. Üblicherweise, aber nicht notwendigerweise,
spiegelt Rindermastitis die Anwesenheit von pathogenen Bakterien im Milchkompartiment des
Euters wieder. Zwei der mit dieser Krankheit am häufigsten assoziierten Bakterien sind
Staphylococcus aureus und Streptococcus agalactiae, welche ansteckend sind und auf oder in
dem Kuheuter leben. Andere Arten von Bakterien, die mit der Krankheit verbunden sind,
werden in der Umgebung der Kühe gefunden.
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Rindermastitis verursacht einen größeren finanziellen Verlust für die Milchindustrie als
irgendeine andere Krankheit. Ungefähr 70 % dieses Verlustes wird einer durch subklinische
Mastitis verursachten verminderten Milchproduktion zugeschrieben, was Milchhersteller selten
erkennen. Zusätzlich zu der Einbuße an Milchproduktion verlieren Hersteller von
Molkereiprodukten Geld durch nachteilige Verarbeitungseigenschaften von mit Mastitis befallener
Milch auf Grund von Änderungen in der Zusammensetzung. Die vorherrschende Auswirkung
der veränderten Milchzusammensetzung, insbesondere der niedrigere Casein- und Feffspiegel,
ist eine geringere Käseausbeute.
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Eine Reihe von Tests zum Nachweis von Mastitisinfektionen werden verwendet, die Zählungen
der somatischen Zellen der Milch und Tests, die auf verschiedene Änderungen in der
Zusammensetzung der Milch basieren, umfassen. Die Verwendung von Zählungen der
somatischen Zellen, um Krankheiten des Euters zu diagnostizieren, war das erste in weiten
Kreisen verwendete Screening-Verfahren und hat sogar bis heute seine Position als den
zuverlässigsten und spezifischsten Test für die Diagnose der Mastitis gehalten. Erhöhte
Mengen von somatischen Zellen können durch eine Reihe von direkten und indirekten
Verfahren nachgewiesen werden. Da somatische Zellzahlen der Milch durch andere Faktoren
als Entzündung, zum Beispiel vom Stadium der Milchabsonderung bzw. -Laktation, von der
Anzahl der Milchabsonderung, von Streß, von Ernährungsproblemen usw. beeinflußt werden
können, sind solche Tests nicht sehr spezifisch. Weiterhin ist diese Art des Testens unbequem,
in vielen Fällen teuer und nicht für die Verwendung an der Seite der Kuh geeignet.
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Eine der dramatischsten Änderungen, die man bei von Mastitis befallener Milch im Vergleich
zur normalen Milch gesehen hat, ist das Verhältnis Lymphozyten : Neutrophilen :
Epithelialzellen. In der normalen Milch beträgt das Verhältnis 1 : 1,5 : 14. In der von Mastitis befallenen
Milch ist das Verhältnis signifikant erhöht, zum Beispiel 1 : 10 : 10. Diese Zunahme an
Neutrophilen ist anscheinend spezifisch für Mastitis, und ein schneller immundiagnostischer Test für
die Quantifizierung von Rinderneutrophilen in der Milch würde einen beträchtlichen Nutzen bei
der Diagnose dieses Zustandes darstellen. Weiterhin wird 1989 auf Grund von Vorschriften der
EG Milch mit 500000 somatischen Zellen pro ml nicht akzeptabel sein und 1990 wird diese
Zahl 400000 betragen. Ein spezifischer Test, der Neutrophile quantifizieren würde, würde dem
Landwirt die Tiere mit subklinischer Mastitis anzeigen. Solche Tiere könnten mit
entsprechenden Antibiotika behandelt werden, was Milchverluste verhindern würde.
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Ein Verfahren, um Hexose-(Abzweigungs (shunt))-Dehydrogenase-Aktivität in aus
Rindermilch isolierten Leukozyten zu bestimmen, ist als Indikation für Mastitis entwickelt worden
(Ritter et al. Journal of Dairy Science, Band 60, Nr. 12, S. 1987). Eine lineare Beziehung
zwischen G6P-erzeugtem reduziertem NADP&spplus; und der Leukozyteitkonzentration in der Milch
wurde gefunden, was die Autoren (Seite 1989) als einen ersten Schritt in der Entwicklung
eines neuen Tests für Mastitis identifizieren. Die Autoren schließen (Seite 1990), daß zwei
weitere Schritte notwendig sind, um die Hexose- Abzweigungsoxidation von G6P und die
Reduktion von NADP&spplus; durch Leitkozyten der Milch, vor allem durch polymorphkernige
Neutrophilen (PMN), in ein praktisch es Verfahren für die Bestimmung der Schwere der
Mastitis zu verwandeln.
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Monoklonale Antikörper sind gegen Neutrophilen im Rinderblut entwickelt worden und sind
für die Identifizierung von Subpopulation davon verwendet worden (M.J. Paape et al. Journal
of Dairy Science, Band 71, Supplement 1, 1988 S. 258). Ein monoklonaler Antikörper ist
ebenfalls für die Identifizierung voll Rinderneutrophilen in der Milch entwickelt worden.
(Lostrie-Trussart et al.; Annales de Medicine Veterinaire, Band 131, Nr. 1, 1987, S. 49). Eine
weitere Serie von monoklonalen Antikörpern gegen Rinderneutrophilen, die nicht ausführlich
charakterisiert wurden, sind hergestellt worden und wurden als ein Weg vorgeschlagen, um die
Art und die Anzahl der Antikörperbindungsstellen auf Neutrophilen von Rinderblut und
Rindermilch zu untersuchen, als ein Verfahren, um zwischen diesen Zeilen zu unterscheiden,
und als Verwendung bei der Identifizierung von neutrophilen Subpopulationen, die wichtig für
die Resistenz gegen Mastitis sind (Nickerson et al. Journal of Dairy Science, Band 66, Nr. 7,
1983, S. 1547). Eine Zellinie, die monoklonale Antikörper mit einzigartiger Spezifität gegen
menschliche Neutrophilen herstellt, ist außerdem entwickelt worden. Der monoklonale
Antikörper weist keine Reaktivität gegen andere menschliche periphere Blutzellen und keine
Reaktivität gegen Vorläufer von Granulozyten oder anderen Zellen im Knochenmark auf
(International Publication Nr. WO 88/04320). Doch keines dieser vier Zitate beschreibt oder
schlägt die Verwendung von solchen monoklonalen Antikörpern in einem diagnostischen
Assay für Mastitis vor. Dieses ist nicht unerwartet, da es vordem nicht anerkannt wurde, daß
Neutrophilen-ähnhche Zellen die wichtigen Zellen sind, um Mastitis zu überwachen. Es ist jetzt
gefunden worden, und wie nachstehend gezeigt wird, daß für den Fall, daß eine Milchprobe
mehr als 250000 somatische Zellen/ml hat, die Zellen im Überschuß fast ausschließlich aus
Neutrophilen bestehen.
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Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Assay für den Nachweis von Mastitis
einschließlich subklinischer Mastitis bereitzustellen, die durch einen ätiologischen Stoff
verursacht ist, welcher die zuvor erwähnten Nachteile überwindet und der ohne weiteres von
Landwirten und Veterinären und außerdem von Laborpersonal durchgeführt werden kann.
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Die Erfindung umfaßt ein Immunassayverfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von
Mastitis oder subklinischer Mastitis, wobei das Verfahren das Einfangen von Neutrophilen
oder Fragmenten oder löslichen Produkten davon in einer Milchprobe auf einer unlöslich
gemachten Form eines korrespondierenden Antikörpers und das Bestätigen des Vorliegens der
Neutrophilen oder Fragmente oder löslichen Produkte davon, welche an den unlöslich
gemachten Antikörper gebunden sind, umfaßt.
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Ganze Neutrophilen können durch einen Airtikörper auf einer Festphase in Übereinstimmung
mit dem oben genanntell Verfahren gemäß der Erfindung eingefängen werden, die Neutrophile
sind jedoch anfällig dafür, daß sie von der Festphase durch Waschschritte abgelöst werden,
welche gewöhnlicherweise ein Bestandteil des Verfahrens sind.
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Die löslichen neutrophilen Produkte, die durch monoklonale und polyklonale Antikörper
gemäß der Erfindung nachgewiesen werden, werden reichlich in die von Mastitis befallene
Milch abgesondert, und es ist wahrscheinlich, daß solche löslichen Produkte Abbauprodukte
des Neutrophils darstellen. Die Menge dieses Abbauproduktes kann variieren, was die
Quantifizierung etwas erschwert. Außerdem können Antikörper, wie IgA-Antikörper und
andere Proteine, an die betroffenen Epitope binden.
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Entsprechend stellt die Erfindung ein Immunassayverfahren zum Nachweis oder zur
Bestimmung von Mastitis oder subklinischer Mastitis auf der Basis von Neutrophilen in der Milch
bereit, welches Verfahren das Unterziehen einer Milchprobe der Lyse, Einfangen neutrophiler
Fragmente oder löslicher Produkte davon mittels einer unlöslich gemachten Form eines
korrespondierenden Antikörpers und Messen des Vorliegens der neutrophilen Fragmente oder
löslichen Produkte davon in der Probe durch Bestimmen der gebundenen neutrophilen
Fragmente oder löslichen Produkte davon umfaßt.
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Die Milchproben können auf verschiedene Arten lysiert werden. Zum Beispiel können die
Zellen der Milchprobe zunächst durch Einfrieren der Milchprobe und anschließendem Auftauen
lysiert werden. Andere Techniken der Lyse wie Ultraschall können außerdem verwendet
werden.
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Die Lyse kann außerdem durch verschiedene Lysemittel ermöglicht werden, die hohe oder
niedrige Konzentrationen an entsprechenden Salzen, Tensiden, insbesondere Detergentien,
Enzymen und Komplement fixierenden Antikörpern und verschiedenen Dissoziationsmitteln
einschließen.
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Die meisten der oben genannten Lysesysteme stören nicht das Einfangen der neutrophilen
Fragmente oder löslichen Produkte von Neutrophilen durch monoklonale Antikörper oder
polyklonale Antikörper, so daß die Lysereaktion in situ als Tell des speziellen Tests stattfinden
kann, der durchgeführt wird.
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Tenside für die Verwendung als Lysemittel gemäß der Erfindung können aus irgendeinem
geeigneten anionischen, kationischen oder nicht-ionischen Tensid gewählt werden.
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Geeignete Tenside schließen Polyoxyethylenester von Fettsäuren, Polyoxyethylensorbitanester,
Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylenisoalkohole, Polyoxyethylenester, Polyoxyethylen-p-t-
octylphenole oder Octylphenyl-ethylenoxid-Kondensate, Ethylenoxid-Kondensate mit
Fettalkoholen, Polyoxyethylennonylphenole, Natrium-N-lauroylsarcosinat, Natriumdodecyl-N-
sarcosinat, Natriumdodecylsulfat, Cetyltrimethylammoniumbromid, Dodecylpyridiniumchlorid,
Palmitoyllysolecithin, Dodecyl-N-betain, Natriumdodecylsulfat, Tetradecylammoniumbromid
und Saponin oder eine Mischung davon ein.
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Nicht ionische Tenside werden besonders bevorzugt. Solche bevorzugten nicht-ionischen
Tenside sind:
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Polyoxyethylensorbitanester, verkauft unter dem Warenzeichen TWEEN, insbesondere
Polyoxyethylensorbitanmonolaureat oder TWEEN 20, aber auch TWEEN 60 und TWEEN 80;
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Polyoxyethylenether, verkauft unter dem Warenzeichen TRITON, wie TRITON X100,
TRITON X114, TRITON X110E und TRITON N101 und BRIJ;
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Ocytylphenyl-ethylenoxid-Kondensat, verkauft unter dem Warenzeichen NONIDET P40; und
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Ethylenoxid-Kondensate von Fettalkoholen, verkauft unter dem Warenzeichen LUBROL,
insbesondere LUBROL PX.
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Geeignete Dissoziationsmittel für die Verwendung als Lysemittel gemäß der Erfindung werden
aus Thiocyanaten, Hydrochloriden, Bromiden, Chloriden, Sulfaten, und Harnstoffen und
insbesondere die Natrium-, Kalium, Ammonium- und Guanidinsalze davon gewählt.
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Besonders geeignete Dissoziationsmittel werden aus Kaliumthiocyanat, Natriumthiocyanat,
Guanidinthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Kaliumiodid, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat
und Harnstoff oder einer Mischung davon gewählt.
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Während Tenside oder Dissoziationsmittel allein als Lysemittel gemäß der Erfindung
verwendet werden können, ist es gefunden worden, daß die Verwendung einer Kombination
eines Tensids und eines Dissoziationsmittel einen synergistischen Effekt ausübt.
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In den Fällen, in denen das Lysemittel eine Kombination eines Tensids und eines
Dissoziationsmittel darstellt, werden das Tensid und das Dissoziationsmittel vorzugsweise aus
den vorher spezifisch erwähnten ausgewählt.
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Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Mastitis
oder subklinischer Mastitis auf der Basis von Neutrophilen in Milch bereit, wobei das
Verfahren das Beschichten einer Oberfläche mit Neutrophilen oder Fragmenten oder löslichen
Produkten davon oder lysiertem Zellmaterial, hergestellt durch ein hierin vorher spezifiziertes
Verfahren, das Zusetzen einer Menge von Antikörper zu den Neutrophilen oder Fragmenten
oder löslichen Produkten davon, das Ablaufenlassen der immunchemischen Reaktion und das
Bestimmen der Menge an gebundenem Antikörper umfaßt.
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Monoklonale Antikörper für die Verwendung in einem Immunassayverfahren gemäß der
Erfindung zum Nachweis oder zur Bestimmung von Mastitis oder subklinischer Mastitis
reagieren geeigneterweise a) mit Neutrophilen oder Fragmenten oder löslichen Produkten
davon, aber b) reagieren nicht mit irgendwelchen anderen Arten von Zellen, die in der Milch
oder den Fragmenten oder löslichen Produkten davon gefunden werden.
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Die monoklonalen Antikörper können geeigneterweise monoklonale menschliche Antikörper,
Maus- oder Rattenantikörper sein, die mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, die
solche Verfahren einschließen, die zur Zeit für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern
im kommerziellen Maßstab, von durch Gentechnlk hergestellten monoklonalen Antikörpern
oder Antikörperfragmenten oder von mittels in vitro-Immunisierung geeigneter Zellen
hergestelften Antikörpern zur Verfügung stehen.
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Vorzugsweise gehört der monoklonale Antikörper zur Klasse IgG.
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Der monoklonale Antikörper für die Verwendung in den Verfahren gemäß der Erfindung kann
durch ein Hybridom gebildet durch Fusion von Milzzellen eines Menschen, einer Maus oder
einer Ratte, die zuvor mit Neutrophilen oder Fragmenten oder löslichen Produkten davon
immunisiert wurde, mit Zellen einer Myelomlinie, die aus einer Myelomlinie des Menschen, der
Maus oder Ratte gewählt wurde, hergestellt werden.
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Der monoklonale Antikörper ist geeigneterweise einer, der mit Rinderneutrophilen oder
Fragmenten oder löslichen Produkten davon reagiert. Solch ein monoklonaler Antikörper wird
vorzugsweise aus einem Hybridom, wie hierin definiert, hergestellt.
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Es wird jedoch zuerkannt werden, daß der monoklonale Antikörper außerdem von einem
geeigneten Fab-Fragment, das durch eine DNA-Sequenz gemäß dem Verfahren von Skerra, A.
und Plückthun, A, (1988); Science 240, 1038-1041, oder mittels der Technik der
Polymerasekettenreaktion (PCR) gemäß des Verfahrens von Orlandi, R. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 86, 3833-3837, hergestellt werden kann.
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Der monoklonale Antikörper reagiert vorzugsweise mit wämelabilem Proteinmaterial, welches
spezifisch für Neutrophilen ist und ein Molekulargewicht im Bereich von 10000 - 20000
Dalton, insbesondere 12000 - 16000 Dalton besitzt.
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Ein besonders bevorzugter monoklonaler Antikörper für die Verwendung gemäß der
Erfindung ist der durch das Hybridom des Klons 3G5 U.C.D. erhaltene, der nachstehend in
Beispielen 1 und 3 beschrieben wird. Eine Probe des als 3G5 U.C.D. bekannten Hybridom
wurde am 5. September, 1989 in Porton Down hinterlegt und der "Zell-Hinterlegungs-Nr.
89090501" zugeordnet. Wie nachstehend gezeigt wird, stellt der Klon 3G5 U.C.D.
monoklonale IgG-Antikörper her, die spezifisch gegen Rinderneutrophilen oder Fragmenten
öder löslichen Produkten davon sind, reagiert aber nicht signifikant mit anderen Arten von
Zellen, die in der Milch vom Rind gefunden werden, nämlich T-Lymphozyten, B-Lymphozyten
und Epithelialzellen.
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Monoklonale Antikörper von Säugern für die Verwendung gemäß der Erfindung können durch
ein Verfahren hergestellt werden, das folgendes umfaßt:
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i) das Immunisieren des Säugers mit Neutrophilen oder Fragmenten oder löslichen Produkten
davon;
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ii) das Entfernen der Milz vom genannten Säuger und Herstellen einer Suspension von
Milzzellen;
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iii) das Fusionieren von genannten Milzzellen mit entsprechenden Myelomzellen vom Säuger;
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iv) das Screenen der resultierenden Hybridoma in getrennten Vertiefungen bzw. Schalen in
einem Medium, das die nicht füsionierten Myelomzellen nicht unterhält bezüglich solcher im
Überstand enthaltenden Antikörpern, die selektiv an die Neutrophilen oder Fragmenten oder
löslichen Produkten davon binden;
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v) das Auswählen und Klonieren von Hybridoma, die den gewünschten Antikörper herstellen;
und
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vi) a) das Wiedergewinnen des Antikörpers aus dem Überstand der oben genannten Klone oder
in alternativer Weise
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vi) b) das Transferieren der genannten Klone intraperitonal in ein Säuger und Ernten des
malignen Aszites von den genannten Säugern.
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In irgendeinem der oben genannten Verfahren werden die Sänger günstigerweise mit
Neutrophilen vom Rind oder Fragmenten oder löslichen Produkten davon immunisiert.
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In Bezug zu den oben genannten Verfahren können als Tiersysteme beispielsweise Mensch-
Mensch, Maus-Maus, Ratte-Maus und Ratte-Ratte verwendet werden. Eine offensichtliche
Ausnahme wäre irgendein Verfahren, welches den Transfer von Klonen intraperitonal in
Menschen und das Ernten der malignen Aszites oder andere Verfahren umfaßt, die als
unethisch beim Menschen betrachtet werden.
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Der Antikörper für die Verwendung bei den Verfahren gemäß der Erfindung ist
geeigneterweise ein monoklonaler Antikörper, wie er vorstehend beschrieben wurde. Solche
Antikörper können aus dem Überstand eines Hybridoms oder Myeloms, wie vorstehend
definiert und hergestellt, herrühren, oder sie können von maligner Aszites gemäß dem
vorstehend spezifizierten Verfahrens herrühren. Alternativ und üblicher wird der monoklonale
Antikörper mittels zur Zeit verfügbaren Verfahren für die Herstellung von monoklonalen
Antikörpern in großen Mengen oder mit Hilfe der Genteclniik hergestellt werden.
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In anderen Fällen kann der Antikörper für die Verwendung in irgendeinem der
Immunassayverfahren, wie vorstehend spezifiziert wurde, polyklonale Antisera darstellen, wie
zuvor angezeigt wurde.
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Das Immunassayverfahren gemäß der Erfindung kann unter Verwendung von irgendeinem
bekannten Format, wie zum Beispiel von Platten, von Teilchen, von Streifen, von Perlen, von
Stäben, von Tauchstäben, von Membranen usw., durchgeführt werden.
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Zum Beispiel wird der uhlöslich gemachte oder auf einer Festphase befindliche Antikörper, wie
hierin verwendet, geeigneterweise an einen Tauchstab, einem Teilchen, einer Platte, einer
Schale, einer Membran, einem Röhrchen, einer Perle, einem Stab oder dergleichen aus
Plastikmaterial oder Glas gemäß einer Weise, die per se bekannt ist, gebunden. Perlen aus
Latex, Nylon oder irgendeinem anderen geeigneten Material können außerdem verwendet
werden sowie auch Liposomen, gemäß der Verfahren, die per se bekannt sind.
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Spezifischer umfaßt die unlöslich gemachte Form des Antikörpers den genannten Antikörper,
der auf einer Öberfläche adsorbiert ist, die für die Proteinadsorption geeignet ist. Die genannte
Oberfläche kann ein Teilchen, eine Schale, eine Membran, ein Röhrchen, eine Perle, ein Stab,
ein Liposom oder dergleichen sein und besteht aus einem Material, wie es vorstehend
spezifiziert wurde.
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Unter Laborbedingungen umfaßt die Oberfläche geeigneterweise eine Mikrotitrationsplatte
oder einen Mikrotitrationsstreifen aus Plastik für die Proteinadsorption, worin die
immunchemische Reaktion und die Bestimmung des Antigens im Anschluß an das Einfangen des
Antigens oder an das Freiwerden des Antigens auf der unlöslich gemachten Form des
Antikörpers stattfinden kann, je nachdem welches Verfahren verwendet wurde. Besonders
geeignete Mikrotitrationsplatte sind γ-bestrahlte Mikrotitrationsplatten. Beispiele für solche γ-
bestrahlten Mikrotitrationsplatten sind aus flachen Vertiefungen bestehende
Mikrotitrationsplatten aus Polystyrol, die von DYNATECH unter dem Warenzeichen MICROELISA
vermarktet werden, und solche, die unter dem Warenzeichen "NUNC" "IMMULON" verkauft
werden. Beispiele für Streifen sind Streifen, die von DYNATECH unter dem Warenzeichen
REMOVAWELL vermarktet werden.
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Die relevante Oberfläche kann direkt mit einer optimalen Verdunnung von polyklonalem
Antikörper, hergestellt durch Trennen der relevanten Immunglobulinfraktion des Antiserums,
oder in anderen Fällen mit monoklonalem Antikörper gemäß der Erfindung beschichtet
werden.
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Die Bestimmung des aus der Probe stammenden gebundenen Antikörpers kann mittels eines
enzymatischen, fluorometrischen, luminometrischen oder radiometrischen Assays unter
Verwendung von Enzymen, Fluorochromen, Licht emittierenden Sonden bzw. Radiomarkern
durchgeführt werden. In qualitativen und semiquantitativen Assays kann die Bestimmung auch
per Auge durchgeführt werden, zum Beispiel wenn der Assay die Verwendung von gefärbten
Perlen oder dergleichen, wie hierin beschrieben, umfaßt.
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Die markierten Stoffe für die Verwendung in den Assays gemäß der Erfindung werden auf
herkömmliche Weise hergestellt, wie nachstehend in den Beispielen beschrieben wird, oder
werden von entsprechenden Herstellern gekauft. Solche markierten Stoffe liegen
normalerweise in der Form von Konjugaten vor, wie mit einem Enzym markierter Antikörper für die
Verwendung in einem kompetitiven Bindungsassay. Der markierte Stoff ist außerdem
geeigneterweise ein an einen Radiomarker kovalent gebundener Antikörper zur Verwendung in
einem radiometrischen Assay, wenn die Assays unter Laborbedingungen durchgeführt werden.
Der Radiomarker ist vorzugsweise ¹²&sup5;J.
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Unter Laborbedingungen wird die Bestimmung des gebundenen Antikörpers bevorzugt durch
ein Enzym-Immunassay unter Verwendung eines auf geeignete Weise mit Peroxidase
markierten Antikörpers oder anderen geeigneten Peroxidasekonjugaten durchgeführt. Eine geeignete
Peroxidase ist die Meerrettich-Peroxidase. Ein anderes so geeignetes Peroxidasekonjugat ist
ein Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex, der mit einem Antkörper-Biotinkonjugat zur
Verstärkung des Enzymassays auf herkömmliche Art verwendet werden kann. In solch einem
Enzymassay bindet das Antigen, das auf einem auf einer Festphase befindlichen Antikörper
unlöslich gemacht wurde, an einen Antikörper-Biotinkomplex, welcher wiederum an den
Avidin/Streptavidin-Biotin-Peroxidise-Komplex bindet, worauf die Aktivität von Peroxidase
gemessen wird.
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Das Immunassayverfahren gemäß
der Erfindung kann außerdem die Verwendung von farbigen
Perlen oder eines in Liposomen oder anderen Teilchen eingeschlossenen farbigen Materials
einschließen, wobei an die Perlen, Liposomen oder Partikel ein Antikörper gebunden ist und so
adaptiert sind, daß sie sich relativ zu einem weiteren auf einer Trägermembran unlöslich
gemachten Antikörper bewegen und mit diesem in Kontakt kommen, wenn eine Milchprobe,
die das Antigen enthält, mit den genannten Perlen, Liposomen oder Teilchen in Kontakt
kommt. Die Methodologie, die in solch einem Assay verwendet wird, ist zum Beispiel in EP-
A-0 154 749 (Becton Dickinson and Company) beschrieben. Solch ein System ist besonders
für die Verwendung als Test an der Seite der Kuh oder für die Verwendung durch auf dem
Gebiet tätige Veterinäre geeignet, da die Verwendung eines solchen Systems einfach ist und
ein positives Ergebnis farbig angezeigt wird, wie in dem Beispiel 10 näher beschrieben wird.
Ein System dieser Art, welches ein Einschritt-Assay-Verfahren darstellt, kann außerdem als
semiquantitativer Test verwendet werden, wenn man eine Reihe von Schranken verwendet, die
jede eine vorher bestimmte Menge des weiter genannten unlöslich gemachten Antikörper in
durch einen Abstand getrennte Beziehung entlang genannter Trägermembran umfaßt und so,
daß genannte Perlen sich in progressiver Weise entlang genannt er Trägermembran bewegen,
bis die ganzen Bindungsstellen auf dem weiter unlöslich gemachten Antikörper, der die
genannten Schranken definiert, besetzt sind, und somit einen Hinweis auf die Menge des
genannten Antikörpers in der genannten Probe gibt. Der weitere Antikörper kann mit dem
Antikörper identisch sein, der an den Perlen oder Liposomen oder Teilchen oder an dem
Antikörper gegen den gebundenen Antikörper gebunden ist.
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Die Erfindung stellt außerdem eine Reihe von Test-Kits oder Test-Packungen bereit, die die
notwendigen Komponenten/Zutaten zur Durchfühning der Verfahren gemäß der Erfindung
enthalten. Solch ein Test-Kit oder solch eine Test-Packung kann Antikörper-beschichtete
Röhrchen einschließen, die die ganzen Komponenten zur Durchfrung der Verfahren gemäß
der Erfindung enthalten, wenn eine Milchprobe hierzu gegeben wird. In anderen Fällen kann
ein Röhrchen bereitgestellt werden, das ein lysierendes Pufferreagenz und ein Antikörper-
Enzym-Konjugat enthält, zu dem man eine Milchprobe gibt, wobei das Röhrchen mit einem
Antikörper-beschichteten Tauchstab für einen kompetitiven Enzyrn-Immunassay verwendet
wird.
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Ein Streifen, der alle notwendigen Komponenten/Zutaten zur Durchführung eines schnellen
Einschritt-Assays gemäß der Erfindung enthält, wenn eine Milchprobe darauf aufgetragen
wird, ist oben beschrieben und ist weiterhin im Beispiel 10 erläutert.
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Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum qualitativen, zum quantitativen oder zum
semiquantitativen Nachweis von Neutrophilen oder Fragmenten oder löslichen Produkten
davon bereit, wobei Immunassays mit monoklonalen Antikörpern, wie vorstehend beschrieben,
oder polyklonale Antikörper verwendet werden. Die Verfahren gemäß der Erfindung sind
imstande, zwischen Milchproben von normalen gesunden Tieren, von Tieren mit Mastitis und,
am wichtigsten, von Tieren mit subklinischer Mastitis zu unterscheiden. Somit kann dadurch
verhindert werden, daß die Milch solcher Tiere große Mengen von Milch kontaminiert, und die
Tiere können behandelt werden, bevor die Infektion zu weit fortgeschritten ist. Da Infektionen
früher erkannt werden würden, könnten für kürzere Zeit wirkende Antibiotika verwendet
werden, so daß die Tiere für die Milchproduktion früher zur Verfügung stehen. Rückstände
von Antibiotika sind in vielen Ländern verboten.
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Die beigefügte Zeichnung stellt einen Graph der optischen Dichte aufgetragen gegen die
Anzahl der somatischen Zellen in einem Einfangassay gemäß der Erfindung dar, wie in
Beispielen 7 und 8 beschrieben wiid.
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Die Erfindung wird weiterhin durch folgende Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Produktion der monoklonalen Antikörper
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Der monoklonale Antikörper Nr. 3G5 U.C.D., der oben genannt und spezifisch gegen
Neutrophilen vom Rind ist, wurde wie folgt entwickelt:
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Neutrophile für die Immunisierung und das Screening wurden aus peripherem Blut von Kühen
durch das Verfahren von Carison G. P. und Kaneko J.J. 1973, PSEBM, Band 142, S. 853-856
isoliert.
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Das lysierte Zellruaterial wurde unter der Verwendung eines lysierenden Puffers, der aus 0, 155
M Ammoniumchlorid, 0,001 M Kaliumhydrogencarbonat und 0,00013 M Mononatrium
EDTA, pH 7,3 besteht, hergestellt, dem ein Einfiieren bei -20 ºC folgte.
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Eine sechs Wochen alte BALB/c-Maus wurde intraperitonal (i.p.) mit 10&sup7; Neutrophilenzellen
vom Rind in mit Phosphat gepuffertem Saizpuffer (PBS) immunisiert, worauf sechs Wochen
später drei i.p.-Injektionen von 35 ug an lysiertem Material von Neutrophilen in
unvollständigem Freund's Adjuvant in Intervallen von zehn Tagen folgten. Drei Tage nach
einem letzten i.p.-Schuß ("boost") von 35 ug an lysiertem Material von Neutrophilen in
unvollständigem Freund's Adjuvant wurde die Milz entnommen.
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Die Fusion der Miizzellen der Maus mit SP&sub2;/O-Mausmyelomzellen wurde durch
Standardverfahren durchgeführt (Köhler G und Milstein C, 1975. Nature, Band 256, S 495).
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Die Hybridom enthaltenden Antikörper, die mit lysierten Neutrophilen vom Rind reagierten,
wurden ausgewählt und durch limitierende Verdunnung in der Anwesenheit von ernährenden
Zellen der Milz dreimal geklont.
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Der Klon 3G5 U.C.D. enthält den monoklonalen IgG-Antikörper, der spezifisch mit
Neutrophilenfragmenten vom Rind und löslichen Produkten davon reagiert und der nicht
signifikant mit anderen Typen von Zellen und Epithelialzellen reagiert. Die follgenden Beispiele
erläutern diese Eigenschaften und deren Verwendbarkeit in Tests für Mastitis.
Beispiel 2
Indirekter ELISA mit lysierten Neutrophilen vom Rind und lysierten Lymphozytenantigenen
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50 ng von dem lysierten Zellmaterial, das gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt
wurde, wurde als Festphase auf Mikrotiterplatten aufgetragen und eine Nacht lang bei 4 ºC
stehen gelassen. Die Platten wurden dreimal mit PBS, der 0,05 % TWEEN 20 (PBST) enthielt,
gewaschen und PBS, der 0,3 % TWEEN 20 enthielt, für 1 h bei Raumtemperatur ausgesetzt.
100 ul-Hybridoma- oder SP&sub2;/O-Myelomaüberstände wurden zu jeder Vertiefung während 1,5
h bei Raumtemperatur gegeben. Die Platten wurden fünfmal mit PBST gewaschen. 100 ul an
Anti-Maus-Ig vom Hasen, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRPO) (Dako), die zuvor
mit 3 % normalem Serum vom Menschen während 30 min inkubiert worden war, wurden mit
einer Verdünnung von 1/500 während 1,5 h bei Raumtemperatur zugegeben. Die Platten
wurden siebenmal mit PBST gewaschen und o-Phenylendiamin(OPD)chromogen, das 0,3 %
Wasserstoffperoxid in einem Zitratphosphatpuffer mit pH 5,5 enthielt, wurde zu jeder Schale
(100 ul) während 30 min gegeben. Die Reaktion wurde mit 5 N H&sub2;SO&sub4; (50 ul) gestoppt, und
die Platten wurden bei 492 nm gemessen.
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Die Ergebnisse sind in Table 1 beschrieben.
Table 1
Festphase
Lysierte Neutrophilen
Lysierte Lympliozyten*
* Die Zubereitungen der Lymphozyten sind wahrscheinlich mit einigen Neutrophilen
kontaminiert.
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Die oben genannten Ergebnisse zeigen ein gutes Maß an Spezifität des 3G5 U. C.D.
monoklonalen Antikörpers gegen Neutrophile vom Rind.
Beispiel 3
Charakterisierung und Sensitivität vom 3G5 U.C.D. moiiokloiialen Antikörper
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Das Molekulargewicht des Zielproteins des Neutrophilen wurde mit Hilfe der Western
Blot-Technik bestimmt, wobei gereinigte Neutrophile vom Rind und Lymphozytenproteine, die
durch herkömmliche SDSPAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Electrophorese) auf
einem 12,5 % Acrylamidgel hergestellt wurden, verwendet wurden. Der monoklonale 3G5
U.C.D.-Antikörper reagierte nur stark mit einem Protein mit ungefährem Molektilargewicht
von 14000 Dalton aus der gereinigten Zubereitung von Neutrophilen, wie in dem Beispiel 1
beschrieben und wie durch das HRPO-markierte Anti-Maus-Ig unter Verwendung von 4-
Chlornaphtol als Substrat nachgewiesen wurde.
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Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 3G5 U.C.D. wurde durch Immundiffusion mit Hilfe
eines CN Immunobiologicals Mouse Monoclonal Typing Kit, Kat. Nr. C46901 bestimmt und
als Typ IgG, Unterklasse IgGl, klassifiziert.
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Ein Experiment wurde durchgeführt, weiches demonstrierte, daß der 3G5 U.C.D. monoklonale
Antikörper (MAB) nur mit Neutrophilen und wahrscheinlich nur mit einer
Membrankomponente davon reagiert.
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Paramagnetisch tosylierte DYNABEADS M280 (DYNABEADS ist ein Warenzeichen - Dynal
Ltd., Liverpool) wurden mit einem Antikörper (Dako) vom Hasen und mit dem 3G5 U.C.D.
MAB aus Gewebekulturflüssigkeit gemäß den Anweisungen des Herstellers beschichtet.
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3 ml von frischer mäßig von Mastitis befallener Milch wurden mit 7,5 ul beschichteten
DYNABEADS gemischt, und 3 ml der gleichen Milch wurden mit 7,5 ul Hasen-Anti-Maus Ig
M280 DYNABEADS, die nicht mit 3G5 U.C.D. MAB beschichtet waren, als Kontrolle
gemischt. 1 ml von der 60 h alten von Mastitis befallenen Milch, die viele lysierte oder
degradierte Zellen enthält, wurde außerdem mit 5 ul mit MAB 3G5 beschichteten Perlen gemischt.
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Die so hergestellten Mischungen wurden bei leichtem Schütteln bei 4 ºC während 1 h
inkubiert, und danach wurden die Zellen von der Suspension mit Hilfe eines starken Magneten
herausgezogen (entfernt) und anschließend zweimal in PBS ausgewaschen. Eine schlichte
Zubereitung zentrifitgierter Zellpellets wurde außerdem hergestellt.
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Jede dieser Zubereitung wurde auf eine mikroskopische Trägerplatte geschmiert, durch
Glutaraldehyd oder durch Trocknen fixiert und mit DIFFQUICK (DIFFQUICK ist ein Warenzeichen
von Marz and Dade AG) angefärbt. Eine zweite Reihe von Platten wurde einer Differential-
Esterase-Zählfärbung ausgesetzt, um die Neutrophilen von den Lymphozyten zu unterscheiden.
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Die erhaltenen Ergebnisse zeigten,
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a.) daß die große Mehrheit von Zellen, die aus der von Mastitis befallenen Milch mit den 3G5
MAB beschichteten Perlen herausgezogen wurden, neutrophile polymorphkernige
Granulozyten waren;
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b.) daß wenige Zellen in der unbeschichteten Perlenzubereitung von derselben von Mastitis
befallenen Milch gefunden wurden:
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c.) daß es sehr wenige Zellen der von Mastitis befallenen Probe gab, die nicht in Kontakt mit
den beschichteten Perlen standen; und
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d.) daß es sehr viele große Klumpen von Perlen mit Zelltrümmern und amorph gefärbtem
Protein von der 60 h alten Milchprobe gab.
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Die Behandlung
des neutrophilen Antigens, das äus gereinigten Neutrophilen aus Rinderblut
hergestellt und auf eine Festphase aufgetragen war, mit Trypsin oder Pronase reduziert den
O.D.-Wert von einem Anfangswert von 1,87 auf 0,44 bzw. 0,23, was zeigt, daß das Antigen
vorwiegend Protein ist. Es wurde auch gefunden, daß das Antigen wärmelabil ist, wobei der
O.D.-Wert von einem Anfangswert von 1,77 bei 20ºC auf 0,81 nach 20 min bei 60ºC reduziert
wird, was außerdem ein Beweis darstellt, daß das Antigen ein Protein ist.
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Entsprechend weist das Experiment darauf hin, daß 3G5 U.C.D. MAB mit einem wärmelabilen
Protein mit ungefährem Molekulargewicht von 14000 Dalton reagiert, welches reichlich
vorhanden und spezifisch für neutrophile Granulozyten ist.
Beispiel 4
Indirekter ELISA von Milchproben
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100 ul der Milchproben, zu welchen entweder 100 ul Detergenz, lysierender Puffer (wie in
Beispiel 7 hergestellt), destilliertes Wasser oder PBS, wie in Table 2 nachstehend spezifiziert
wird, gegeben wurde, wurden auf Mikrotiterplatten während 2 h bei Raumtemperatur
aufgetragen. Die Platten wurden zwei- bis siebenmal mit PBST gewaschen und mit 0.3 %
TWEEN 20 in PBS während 1 h bei Raumtemperatur abgeblockt. 100 ul monoklonaler 3G5
U.C.D.-Antikörper oder Myelomaüberstand (SP&sub2;/O-Kontrolle) wurden zu jeder Vertiefung
während 1,5 h bei 37 ºC gegeben. Die Platten wurden vier- bis siebenmal mit PBST
gewaschen. 100 ul Hasen-Anti-Maus-Ig, konjugiert mit HRPO (Dako), der in 3 % normalem
Humanserum während 30 min absorbiert worden war, wurde mit einer Verdünnung von 1/500
während 1.5 h bei 37 ºC zugegeben. Die Platten wurden wiederum vier- bis siebenmal mit
PBST gewaschen. OPD-Substrat, das wie in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde während zehn
bis dreißig Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln zugegeben. Die Reaktion wurde mit 50 ul 5
N H&sub2;SO&sub4; gestoppt, und die Platten wurden bei 492 nm gemessen.
Tabelle 2
3G5 UC.D. + Antigen
Normale gesunde Milch
stark mit Mastitis befallene Milch
Nur milch
Milch + 1% NP40*
Milch + 10% NP40
Milch + 1% T20**
Milch + 10% T20
Milch + Lysepuffer
Milch + 1 H&sub2;O
Milch + PBS
Kontrollen
SP&sub2;/O-Überstand + Antigen
Milch mit 3G5 U.C.D. +
Substrat allein
Milch + SP&sub2;/O + Substrat allein
Milch + zweiter Antikörper + Substrat
* Nonidet P40 ; ** TWEEN 20
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Die oben genannten Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, daß 3G5 U.C.D. MAB mit von
Mastitis befallenen Milch und nicht mit normaler gesunder Milch reagiert.
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Die Ergebnisse zeigen außerdem, daß das nachgewiesene Neutrophilenprodukt sowohl in oder
auf den Zellen vorkommt und außerdem als natürliches Abbauprodukt von Neutrophilen in der
flüssigen Phase der Milch abgesondert wird oder dort vorkommt.
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Da normale Milch Lymphozyten und Epithelialzellen und einige Neutrophile enthält, zeigt der
Mangel an Reaktionen mit normaler Milch, daß der monoklonale Antikörper NICHT
signifikant mit diesen anderen Zelltypen reagiert.
Beispiel 5
Indirekter ELISA auf Zellpellets und Überständen von normaler mit von Mastitis befallener
Milch und Milch im Zwischenbereich
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Milchproben wurden mit 5000 U/min während 15 min dreimal in PBS zentrifügiert. Die Pellets
wurden heftig in lysierendem Puffer (hergestellt wie in dem Beispiel 1) vor dem Auftragen auf
Platten aufgewirbelt. Die restlichen Schritte des indirekten ELISA wurden, wie in dem Beispiel
4 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Table 3 gezeigt und demonstrieren, daß
das Antigen "löslich" ist und in den Überstand der Mich abgesondert wird.
Tabelle 3
Probe
Erster Antikörper
Überstände
Mit Mastitis befallene Milch
Normale Milch
Zwischenbereich 1
Zwischenbereich 2
Lysierte gewaschene Pellets
Beispiel 6
Indirekter ELISA-Test von 48 Rindern von einer Molkerei
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Der indirekte Enzym-Immunassay-Test (EIA) aus Beispiel 4 wurde mit 48 Rindern von einer
Molkerei in County Wicklow, Irland durchgeführt.
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Proben von jedem der vier Euterviertel wurden für jede Kuh gemischt. Die Viertel von jeder
reaktiven Kuh wurden individuell mit Proben, die einen Tag später entnommen wurden,
getestet. Die von Mastitis befallenen Kühe waren den Erfindem bis nach dem Experiment
unbekannt.
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Der EIA-Test identifizierte korrekterweise vier der achtundvierzig Kühe, die entweder
klinische Mastitis zum Zeitpunkt des Testes hatten oder die gegen Mastitis innerhalb der
vorigen acht Wochen behandelt wurden (drei Kühe).
Beispiel 7
EINFANG EIA-System für den Nachweis von mit Mastitis befallener Milch
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Festphasenschalen werden mit 100 ul reinem Gewebekultur-3G5 U.C.D.-Überstand oder einer
optimalen Verdünnung von Aszites-Flüssigkeit, die gemäß eines bekannten Verfahrens per se
(wie Sulfatpräzipitation oder Ionenaustausch-Chromatographie) hergestellt wurden über Nacht
bei 4ºC beschichtet. Die beschichtete Festphase wird danach zweimal mit PBST gewaschen
und gelöscht, indem die Schalen mit "normaler" nicht von Mastitis befallenen Milch während 1
h bei 37 ºC aulgefüllt wurden (wie mittels einer Gesamtzählung der somatischen Zellen von
nur 6000 Zellen/ml bestimmt wurde).
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Der polyklonale Antikörper für das Konjugat wird durch konventionelle
Innokulationsverfahren in einem Hasen hergestellt. Die IgG-Fraktion von diesem Antikörper wird isoliert
und mit HPRO mittels einer Modifikation des Verfahrens von Smith und Tedder (J. Virol.
Methods, 1981, 3, 1-11) ohne die Verwendung von Dinitrofluorbenzol konjugiert.
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Ein lysierender Puffer wird hergestellt, indem 3 ml von 6 M Natriumthiocyanat langsam zu 6
ml von normaler Milch gegeben wird. 0,9 ml von TWEEN 20 wird danach zugegeben. Die
Lösung wird während 30 min bei Raumtemperatur gerollt und dann durch eine 0,22 um
Acrodisc (Acrodisc ist ein Warenzeichen; Gelmann) filtriert, um parktikuläres Material zu
entfernen. In anderen Fällen werden die Proben durch Einfrieren auf -20 ºC und anschheßendes
Auftauen auf 37 ºC lysiert.
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Festphasenschalen werden dreimal mit PBST gewaschen. 50 ul der Testproben werden zu jeder
Schale gegeben, und eine positive von Mastitis befallene Kontrollprobe und vier negative
Kontrollproben werden bei jedem Testablauf mit hinzugenommen. 50 ul des lysierenden
Puffers werden zu jeder Schale gegeben, und die Schalen werden während 1.5 h bei 37 ºC
inkubiert. In anderen Fällen werden 100 ul von eingefrorener/aufgetauter Milch verwendet.
Die Vertiefungen werden viermal mit PBST gewaschen, und danach wird 150 ul an Konjugat,
das in PBST, der 40 % normale Milch und 10 % Ovalbumin enthält, verdünnt ist, zu jeder
Schale gegeben. Die Schalen werden dann während 1.5 h in einem Wasserbad bei 37 ºC
inkubiert. Die Vertiefungen werden viermal mit PBST gewaschen und 100 ul TMB- oder
OPD-Substrat während 30 min bei Raumtemperatur zugegeben. Die Reaktion wird mit 50 ul
5N H&sub2;SO&sub4; gestoppt, und die Proben werden in einem dualen Spektrophotometer bei 450 nm
(TMB) oder 492 nm (OPD), Referenz bei 620 oder 690 nm, gemessen.
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Der Ausschluß dieses Labortests wird gemäß allgemein bekannter Arbeitsweisen definiert, so
daß der Ausschluß = mittlere negative Kontrolle + drei Standardabweichungen, die aus einem
Minimum von 200 negativen Kontrollen bestimmt wurden, ist. Diese negativen Kontrollen
sollten so bestimmt werden ,daß sie durch herkömmliche spezifische Techniken der
Zellzählung ein Verhältnis von Neutrophilen der Milch zu Lymphozyten von nicht mehr als 2:1
enthalten oder eine Gesamtanzahl der somatischen Zellen ≤ 6000 besitzt. Die Empfindlichkeit
von diesen Assays kann durch ein Variieren der Konzentration des Antikörpers auf der
Festphase und/oder des Konjugats angepaßt werden.
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Durch ein geeignetes Anpassen der Konzentrationen des Antikörpers auf der Festphase und
des konjugierten Antikörpers ist es möglich, die Probe, zusammen mit dem lysierenden Puffer
und dem Antikörper auf der Festphase und dem Konjugat gleiclizeitig zu mischen, so daß ein
schnellerer Test resultiert. Der Antikörper auf der Festphase und das Konjugat werden an
lysierte Abbauprodnkte voll Zellen auf eine semiquantitative Art binden. Um eine Sättigung
von Neutrophilen durch das Konjugat zu verhindern, sollte die Milchprobe als letztes oder
simultan mit der Festphase zu der Schale gegeben werden.
Beispiel 8
Die Verwendung des Einfangassays für Milchproben von individuellen Rindern und für einen
Tank für große Mengen einer Molkerei - ein Feldversuch
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Der Einfangassay, wie er in dem Beispiel 7 beschrieben wurde, wurde für Milchproben von 23
Kühen und für Milchproben eines Tanks für große Mengen von einer Farm in County
Wicklow, Irland, während eines Zeitraums von sechs Wochen angewandt. Die Ergebnisse sind in
Tab.4 gezeigt. Die Zählungen somatischer Zellen wurden durch Premier Dairies, Dublin,
durchgeführt.
Tabelle 4
Zeit
Woche
Kuh
Großtank
Chronisch positiv
niedrig 8-9 Monate früher
Schlüssel zu Tabelle 4:
-
*CC = Zählungen somatischer Zellen x 10³
-
+/- O.D. beim Auschluß des Testes
-
+ in den obenstehenden Tests, wo die O.D. über die O.D. von 500.000 Zellen/ml auf einer
Titrationskurve steigt.
-
++ ist eine O.D., die etwa doppelt so hoch wie die vom + - Punkt ist.
-
^ = Eine O.D., die anzeigt, das Neutrophile nicht über 500.000 vorliegen, aber oberhalb der
niedrigeren Zählungen liegen.
-
ntb = nicht vorher getestet
-
** = dieses ist das einzige widersprüchliche Ergebnis, d.h. wo der EIA-Test negativ war,
jedoch der SCC anscheinend über 500.000 Zellen/ml lag.
-
Im Falle der Großtank-Messung sind die Ergebnisse als exakte O.D.-Ablesungen angegeben.
Beispiel 9
Vergleich der Sensitivität und Spezifität des indirekten ELISA im Vergleich zu dem
Einfangassay von Milchproben
-
Es wurden Experimente durchgeführt, um die Sensitivität und Spezifität des indirekten ELISA,
der in dem Beispiel 4 beschrieben wurde, im Vergleich zu dem Einfangassay, der in dem
Beispiel 7 beschrieben wurde, zu ermitteln. Unter der Verwendung der Zählung der
somatischen Zellzahl als akzeptierter Standard mit 500.000 Zellen als der Ausschluß für
"positive" ergeben sich folgende Sensitivitäten und Spezifitäten für die beiden Assays, die
durch Plotlinien der besten Annäherung berechnet wurden:
Sensitivität
Spezifität
Indirekter Assay (188 proben)
Einfangassay (95 Proben)
-
woraus ersichtlich ist, daß der Einfangassay viel sensitiver und sehr viel spezifischer als der
indirekte Assay ist. Die Daten aus Beispiel 8 sind in dem beiliegendem Graphen aufgetragen.
Beispiel 10
Schneller Einschritt-Assay für die Bestimmung von mit Mastitis oder von mit subklinischer
Mastitis befallenen Milch von Rindern
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Gefärbte Latexpartikel werden mit dem 3G5 U.C.D. monoklonalen Antikörper auf eine
herkönmlliche Art beschichtet. Ein Festphasenteil, wie ein Stück Nitrocellulose oder
Nylonmembran, wird mit demselben monoklonalen Antikörper oder dem polyklonalen Anti-
Rind-Neutrophilen-Antikörper in der Form eines Querstreifens beschichtet. Das nentrophile
Antigen ist ausreichend vorhanden in der von Mastitis befallenen Milch, so daß sich ein
Antigen-Antikörper-"Einfang"-Sandwich zwischen den mit monoklonalem Antikörper
beschichteten gefärbten Perlen und der mlt monoklonalem Antikörper beschichteten Festphase
bildet, um ein deutlich erkennbares sichtbares Band zu bilden. Es ist kein sichtbares Band zu
sehen, wenn das neutrophile Antigen abwesend ist oder in gelingen Mengen vorliegt. Unter der
Verwendung von mehreren Streifen oder Bändern ist ein semiquantitativer Assay möglich. Das
Festphasenteil enthält eine Schale oder einen Applikationsort, um eine Milchprobe
aulzunehmen. Die Schale oder Ort kann eine Menge an Lysemittel enthalten oder, in anderen
Fällen, liegt das Lysemittel in einer aufgeplatzten bzw. aufplatzbaren Blase oder Tüte an der
Seite der Schale vor, um nach Bedarf zum Zeitpunkt der Verwendung hiereinzufließen.