JPH081433B2 - ハプテンの免疫測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はハプテンの免疫測定法に関する。さらに詳し
くは血清または血漿中のハプテンの免疫測定法に関す
る。

［従来の技術］ 従来、ハプテンの免疫測定法としては、試料中のハプ
テンと標識されたハプテンを同時に抗体に対して競合反
応させる方法が知られている（例えばロイ エフ シャ
ル エト オール Clin.Chem.24,1801（1978））。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来測定法では、試料中のハプテンと
標識されたハプテンが接触した状態で抗体と反応するた
め、特殊な検体を測定する際、その検体中の血清成分の
影響により酵素活性または発光もしくは蛍光の発現が著
しく阻害される場合がある。その結果、測定値異常が生
じ、測定結果が臨床所見と一致しないという重大な問題
を生じる。

［課題を解決するための手段］ 本発明者等は測定値異常の発生という問題のない、ハ
プテンの免疫測定法について鋭意検討した結果、本発明
に到達した。すなわち本発明は血清または血漿中のハプ
テンを定量する免疫測定法において、 （１）血清または血漿を、血清または血漿中に含まれる
ハプテンとキャリアー蛋白との結合を解離する解離剤を
含む緩衝液とともに、不溶化されたハプテンに対する抗
体と接触させ、不溶化されたハプテンに対する抗体とハ
プテンとの複合体（Ｄ）を反応、形成させ、 （２）前記（１）の工程における未反応物を洗浄、除去
し、 （３）複合体（Ｄ）をハプテンまたはその類縁体の標識
物と反応、接触させ、 （４）前記（３）の工程における未反応標識物を洗浄、
除去し、 （５）不溶化されたハプテンに対する抗体に結合した標
識物の量を測定し、 （６）前記（５）の工程において測定した標識物の量を
血清または血漿中のハプテン量と相関させることにより
ハプテン量を測定するハプテンの免疫測定法である。

本発明において、測定対象となるハプテンとしては、
甲状腺ホルモン（T3、T4）、ステロイドホルモン（コー
チゾール、エストラジオール、テストステロン、アルド
ステロン、プロゲステロンおよびそれらの誘導体な
ど）、薬剤（ジゴキシン、ジギトキシン、ジフェニルヒ
ダントイン、テオフィリン、モルフィンなど）が挙げら
れる。

ハプテンと結合しているキャリアー蛋白としては、甲
状腺ホルモンとサイロキシン結合蛋白（TBP）、アルド
ステロン、プロゲステロン、およびテストステロンと性
ホルモン結合グロブリン、ジフェニルヒダントインとア
ルブミン、コーチゾールとコーチゾール結合蛋白などが
挙げられる。

ハプテンは血液中では一部は遊離状態で存在するが、
大部分はそのハプテンに特異的なキャリアー蛋白に結合
した状態で存在する。本発明においては、ハプテンとは
遊離状態で存在するものと、キャリアー蛋白に結合した
状態で存在するものの総和を指す。

解離剤を含む緩衝液において、解離剤はハプテンとキ
ャリアー蛋白の結合を切断するものであれば特に限定さ
れない。例えばT3およびT4の測定の際に用いられる８−
アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸塩およびサリチル
酸塩などが挙げられる。

緩衝液としてはバルビタール緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、グリシン−塩酸緩
衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられるが、特にこ
れらに限定されるものではない。緩衝液のうち、好まし
いものはT3およびT4の測定の際に用いられるバルビター
ル緩衝液であり、ステロドホルモンの測定においてはグ
ルタミン酸緩衝液およびグリシン−塩酸緩衝液であり、
さらに薬剤測定の際に用いられるリン酸緩衝液、トリス
−塩酸緩衝液である。

解離剤の緩衝液中の濃度は解離剤の種類にかかわらず
通常0.005〜0.5w/v％、好ましくは0.01〜0.3w/v％であ
る。

緩衝液のpHはそれぞれの緩衝液で最も緩衝能力が高
く、ステロイドホルモンおよび薬剤の測定においては、
キャリアー蛋白との解離能を高めるpHを選択することが
重要である。即ち、好ましくは、バルビタール緩衝液に
おいてはpH8〜９、リン酸緩衝液においてはpH6〜８、ホ
ウ酸緩衝液においてはpH7.5〜8.5、グルタミン酸緩衝液
およびグリシン−塩酸緩衝液においてはpH2〜５、トリ
ス−塩酸緩衝液においてはpH7.5〜8.5である。

不溶化されたハプテンに対する抗体において、抗体は
ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも可能で
ある。これらの抗体を得る免疫動物はウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、マウス、モルモット、ブタ、サルが好ましい。

不溶化されたハプテンに対する抗体として、このハプ
テンに対する抗体を固相化担体に結合させたものを使用
することができる。

この固相化担体としてはケイ酸質無機担体［ガラス
（ポーラス、ツヤ消しガラスなど）、シリカゲル、ベン
トナイトなど］、磁性体、有機高分子化合物もしくはポ
リマー担体（ポリエチレン、ポリスチレン、デキストラ
ン、ロ紙など）などが挙げられる。これらのうち、好ま
しいものは、ガラス、有機高分子化合物もしくはポリマ
ー担体である。

その形態としてはビーズ、チューブ、試験管などが挙
げられる。

いずれの固相化担体においてもサンドブラスト加工な
どにより表面積をおおきくする処置を施したものを使用
することも可能である。

この抗体を固相化担体に結合させる方法としては、抗
体を化学的に結合させる方法［シランカップリング剤、
架橋剤（グルタルアルデヒドなど）を用いて担体と共有
結合させる方法など］、物理吸着により結合させる方
法、容器（試験管、チューブ、トレイなど）の内表面の
一部に抗体を塗布する方法が挙げられる。

不溶化されたハプテンに対する抗体（Ｃ）と解離剤を
含む緩衝液（Ｂ）と血清または血漿（Ａ）とを接触さ
せ、不溶化されたハプテンに対する抗体とハプテンとの
複合体（Ｄ）を形成させるには、（Ａ）と（Ｂ）と
（Ｃ）を適当な容器中で５〜50℃で５分〜２日程度、反
応、接触させる方法で行うことができる。接触、反応に
より不溶化された抗体とハプテンとの複合体を得る。

次いで、上記反応における未反応物［（Ａ）、（Ｂ）
など）を洗浄、除去する。洗浄は通常脱イオン水、生理
食塩水、リン酸緩衝液などの緩衝液で行い、洗浄回数は
通常１〜10回である。

次いで、複合体（Ｄ）をハプテンまたはその類縁体の
標識物（Ｅ）と反応、接触させる。上記ハプテンの類縁
体としてはT3、T4のアミノ基がアシル型あるいはウレタ
ン型の保護基で修飾されたものなどが挙げられる。

ハプテンまたはハプテンの類縁体の標識物（Ｅ）とし
ては酵素、蛍光体または発光体による標識物が挙げられ
る。酵素、蛍光体および発光体はいずれも公知のものを
使用することができる。例えば酵素としてはホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼなど；蛍光体としてはユーロピウ
ム誘導体など；発光体としてはＮ−メチルアクリジウム
誘導体などが挙げられる。標識物の製造は従来の方法と
同様な方法で行うことができる。

反応、接触は通常、（Ｄ）と（Ｅ）を適当な容器中で
５〜50℃で５分〜２日程度、反応、接触させる。

次いで、上記反応における未反応物［（Ｄ）、（Ｅ）
など］を洗浄、除去する。洗浄は通常脱イオン水、生理
食塩水、リン酸緩衝液などの緩衝液で行い、洗浄回数は
通常１〜10回である。

不溶化された抗体に結合した標識物の量の測定は適当
な基質（ｏ−フェニレンジアミン／過酸化水素など）と
反応させ、酵素活性または吸光度、発光強度、蛍光強度
を測定することにより行うことができる。

測定した標識物の量は血清、血漿中のハプテン濃度に
反比例するので予め作成された適当な検量線から血清、
血漿中のハプテン量を読みとり、求めることができる。

［実施例］ 以下、実施例により、本発明をさらに説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ T3（トリヨードサイロニン）の測定 抗T3抗体結合スリガラスビーズの調製 サンドブラスト処理をしたスリガラスビーズ100gを0.
5％３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下γ−A
PSと略す）アセトン溶液に10時間浸漬し、ガラスビーズ
表面にアミノ基を導入する。未反応のγ−APSを脱イオ
ン水を用い洗浄した後、アミノ化ガラスビーズを５％グ
ルタルアルデヒド（以下GAと略す）水溶液に浸漬しガラ
スビーズ表面にアルデヒド基を導入した。未反応のGAを
脱イオン水により洗浄した後、ビーズを0.05mg/ml抗T3
抗体溶液に浸漬し、抗体をガラスビーズ表面に結合させ
た。反応終了後ビーズを0.1％牛血清アルブミン、0.2M
塩化ナトリウムを含有する0.02Mリン酸緩衝液（pH7.2）
に一夜浸漬し、抗T3抗体結合ガラスビーズを得た。

酵素標識T3の合成 東洋紡社製ペルオキシダーゼ（以下PODと略す）10mg
を0.02Mリン酸緩衝液（pH8.0）2mlに溶解し、これに1.5
％グルタルアルデヒド水溶液200μｌを投入、室温で20
時間反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブに
入れ、0.02Mリン酸緩衝液（pH8.0）を外液として透析を
行い未反応のグルタルアルデヒドを除去し、活性化POD
を得た。

T3（カルバイオケミストリー社製）1mgにジメチルホ
ルムアミド（以下DMFと略す）（1ml）を加え、攪拌、溶
解した。そのT3/DMF溶液全量を先の活性化POD溶液に投
入し、室温で12時間反応させた。

反応終了後、反応混合物をセファデックスＧ−25カラ
ムに通し、酵素活性および免疫活性の両方を有する画分
を集めて酵素標識T3とした。

標準サンプルの作製 標準サンプルについては、T3をDMFに溶解させたもの
適当量をT3フリー血清に添加し調製した。

血清または血漿中T3濃度の測定 （ａ）で得たPOD標識T3を0.2％BSA、0.05％８−アニ
リノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム含有0.12
Mバルビタール緩衝液（pH8.6）で希釈し、測定に必要な
濃度に調整した。

（ｂ）測定操作 試験管に標準液または検体（血清または血漿）を50μ
ｌサンプリングし、（ａ）で調製した0.2％BSA、0.05％
８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム
含有0.12Mバルビタール緩衝液（pH8.6）500μｌを加
え、よく攪拌し、均一溶液とした。これに抗T3抗体結合
ガラスビーズ１個を加え攪拌した後、37℃で15分間振
盪、攪拌した。反応終了後、反応液を吸引除去し、生理
食塩水2mlを加えて再び吸引除去した。この操作を２回
繰り返し検体中の様々な血清成分を除去した。

その後、このビーズを新しい試験管に移し（ａ）の酵
素標識抗原T3液500μｌを加え37℃で15分間振盪、攪拌
した。反応終了後、反応液を吸引除去し、生理食塩水2m
lを加えて再び吸引した。この操作を２回繰り返した
後、抗体結合ガラスビースを別の試験管に移し3mg/mlの
ｏ−フェニレンジアミンと0.02％の過酸化水素を基質と
して含む0.1Mのクエン酸緩衝液（pH4.8）を500μｌ加
え、37℃で15分間振盪、攪拌した。

反応終了後、1.5N硫酸を3ml加え、反応停止後、492nm
における吸光度を測定した。グラフ用紙に標準ポイント
とそのポイントにおける吸光度をプロットした検量線
（Fig.−１）から検体（血清または血漿）中のT3濃度を
読みとった。

実施例２ T4（サイロキシン）の測定 抗T4抗体結合スリガラスビーズの調製 サンドブラスト処理をしたスリガラスビーズ100g0.5
％３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下γ−AP
Sと略す）アセトン溶液に10時間浸漬し、ガラスビーズ
表面にアミノ基を導入する。未反応のγ−APSを脱イオ
ン水を用い洗浄した後、アミノ化ガラスビーズを５％グ
ルタルアルデヒド（以下GAと略す）水溶液に浸漬しガラ
スビーズ表面にアルデヒド基を導入した。未反応のGAを
脱イオン水により洗浄した後、ビーズを0.05mg/ml抗T4
抗体溶液に浸漬し、抗体をガラスビーズ表面に結合させ
た。反応終了後ビーズを0.1％牛血清アルブミン、0.2M
塩化ナトリウムを含有する0.02Mリン酸緩衝液（pH7.2）
に一夜浸漬し、抗T4抗体結合ガラスビーズを得た。

酵素標識T4の合成 東洋紡社製ペルオキシダーゼ（以下PODと略す）10mg
を0.02Mリン酸緩衝液（pH8.0）2mlに溶解し、これに1.5
％グルタルアルデヒド水溶液200μｌを投入、室温で20
時間反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブに
入れ、0.02Mリン酸緩衝液（pH8.0）を外液として透析を
行い未反応のグルタルアルデヒドを除去し、活性化POD
を得た。

T4（カルバイオケミストリー社製）1mgにDMF（1ml）
を加え、攪拌、溶解、した。そのT4/DMF溶液全量を先の
活性化POD溶液に投入し、室温で12時間反応させた。

反応終了後、反応混合物をセファデックスＧ−25カラ
ムに通し、酵素活性および免疫活性の両方を有する画分
を集めて酵素標識T4とした。

標準サンプルの作製 標準サンプルについては、T4をDMFに溶解させたもの
適当量をT4フリー血清に添加し調製した。

血清または血漿中T4濃度の測定 （ａ）で得たPOD標識T4を0.2％BSA、0.05％８−アニ
リノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム含有0.12
Mバルビタール緩衝液（pH8.6）で希釈し、測定に必要な
濃度に調製した。

（ｂ）測定操作 試験管に標準液または検体（血清または血漿）を20μ
ｌサンプリングし、（ａ）で調製した0.2％BSA、0.05％
８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム
含有0.12Mバルビタール緩衝液（pH8.6）500μｌを加
え、よく攪拌し、均一溶液とした。これに抗T4抗体結合
ガラスビーズ１個を加え攪拌した後、37℃で15分間振
盪、攪拌した。反応終了後、反応液を吸引除去し、生理
食塩水2mlを加えて再び吸引除去した。この操作を２回
繰り返し検体中の様々な血清成分を除去した。

その後、このビーズを新しい試験管に移し（ａ）の酵
素標識抗原T4液500μｌを加え37℃で15分間振盪、攪拌
した。反応終了後、反応液を吸引除去し、生理食塩水2m
lを加えて再び吸引した。この操作を２回繰り返した
後、抗体結合ガラスビーズを別の試験管に移し3mg/mlの
ｏ−フェニレンジアミンと0.02％の過酸化水素を基質と
して含む0.1Mのクエン酸緩衝液（pH4.8）を500μｌ加
え、37℃で15分間振盪、攪拌した。

反応終了後、1.5N硫酸を3ml加え反応停止後492nmにお
ける吸光度を測定した。グラフ用紙に標準ポイントとそ
のポイントにおける吸光度をプロットした検量線から検
体中のT4濃度を読みとつた。

［発明の効果］ 本発明の免疫測定法は未知の血清成分の影響受けない
ハプテンの免疫測定が可能となった方法である。即ち、
特殊な検体を測定する際でも、その検体中の血清成分の
影響により酵素活性または発光もしくは蛍光の発現が著
しく阻害されることがなく、測定結果が臨床所見と一致
する方法であり、測定値異常の発生という問題のないハ
プテンの免疫測定法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の検量線を示すグラフであり第２図は
血清測定値の相関を示すグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血清または血漿中のハプテンを定量する免
   疫測定法において、 （１）血清または血漿を、血清または血漿中に含まれる
   ハプテンとキャリアー蛋白との結合を解離する解離剤を
   含む緩衝液とともに、不溶化されたハプテンに対する抗
   体と接触させ、不溶化されたハプテンに対する抗体とハ
   プテンとの複合体（Ｄ）を反応、形成させ、 （２）前記（１）の工程における未反応物を洗浄、除去
   し、 （３）複合体（Ｄ）をハプテンまたはその類縁体の標識
   物と反応、接触させ、 （４）前記（３）の工程における未反応標識物を洗浄、
   除去し、 （５）不溶化されたハプテンに対する抗体に結合した標
   識物の量を測定し、 （６）前記（５）の工程において測定した標識物の量を
   血清または血漿中のハプテン量と相関させることにより
   ハプテン量を測定するハプテンの免疫測定法。
2. 【請求項２】ハプテンが甲状腺ホルモン、ステロイドホ
   ルモンおよび薬剤から成る群より選ばれるものである請
   求項１記載の測定法。
3. 【請求項３】標識物が酵素、蛍光体、または発光体で標
   識されたものである請求項１または２記載の測定法。
4. 【請求項４】不溶化されたハプテンに対する抗体がガラ
   スビーズまたはポリマービーズに共有結合または物理吸
   着させた抗体、または容器の内表面の一部に塗布された
   抗体である請求項１〜３のいずれか記載の測定法。