CN118311263A - 免疫荧光检测方法、试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及免疫荧光检测方法、试剂及其应用。本发明提供的方法使用简便，并且可在同一体系中同时检测不同抗原。此外，本发明提供的试剂稳定性强，信号持续时间长，适用于生物标志物的各种免疫检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及免疫荧光检测方法、试剂及其应用。
背景技术
随着全球经济的发展、人们保健意识的提高以及全球多数国家医疗保障政策的完善，体外诊断行业持续发展。免疫诊断是体外诊断常用方法之一，在体外诊断领域中占据重要的地位。
目前常见的检测方法主要包括放射免疫分析法(RIA)、胶体金法、酶联免疫法(ELISA)、时间分辨荧光免疫法(TRFIA)和化学发光免疫法(CLIA)。其中，放射免疫分析法需要使用放射性物质，对环境造成污染；胶体金法的检测灵敏度不高，不能满足临床检测的各种需要；酶联免疫法是把反应所需的酶偶联到抗体上，对试剂保存的条件要求高(保持酶的活性)，且需要加入底物进行反应，操作程序多；时间分辨荧光法灵敏度高，但极易受外源因素干扰，比如环境中的稀土元素；化学发光法对设备依赖性强，稳定性不够，通常不能在同一试管中同时检测不同目的分子。
这些检测方法的核心步骤主要包括两个部分，其一为通过免疫反应实现对待测物的识别，其二为使免疫反应产物产生信号并对其进行识别和报告。检测的特异性主要依赖于识别待测物/标记物的抗体的特异性；检测的灵敏度主要取决于标记抗体(例如酶标记抗体)产生的信号强度。目前来说，化学发光法具有较高的灵敏度。但化学发光法常用的发光试剂的发光过程十分短暂，例如罗氏E601型全自动电化学发光免疫分析系统使用的三联吡啶钌，直接发光时间仅约为25秒，贝克曼(Beckman Coulter)的DxI 800免疫分析系统使用的碱性磷酸酶(ALP)–金刚烷(adamantine,AMPPD)，酶促发光时间仅约为5秒。因此，样品反应后需要迅速测量或直接放在检测仪器内部进行反应。此外，常用的鲁米诺和吖啶酯类发光试剂释放的光子波长比较接近，因此，无法在同一反应体系中区别测量，也就无法在同一体系中同时检测两种或多种抗原。而电化学发光法中交叉污染为潜在问题，对环境因素和其它非特异性反应过于敏感。
免疫荧光法是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光分子制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查相应抗原或抗体。免疫荧光技术于上世纪40年代被提出，受限于荧光标记技术与荧光本身性能的提高，一直以来存在非特异性染色、结果判定客观性不足、技术程序复杂、荧光性能较低等诸多缺陷，难以实现高灵敏度的定量检测。
使用荧光分子标记抗体的过程中，对荧光分子性能、抗体纯度、标记技术等要求苛刻，存在荧光分子与其它蛋白结合反应等问题。通常情况下，荧光测定结果的本底较高，用于定量测定有一定困难。
因此，需要发展一种操作简单、灵敏度高、能同时检测多种标志物的免疫检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种免疫荧光检测方法、试剂及其应用。本发明提供的方法解决了一直以来免疫荧光技术存在的非特异性染色问题。此外，该方法使用简便，可对不同抗原或抗体标记不同的荧光，实现在同一体系中同时检测不同的抗原或抗体。该方法还可以很方便地对同一种抗体标记不同的荧光染料，用于不同的检测目的。此外，本发明提供的试剂稳定性强，荧光持续时间长，反应后在较长时间内，例如24小时内进行信号检测均可，对操作的要求低，具有更强的应用性。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
在第一方面，本发明提供一种检测抗原的方法，包括步骤：
(1)提供捕获抗体包被的固相基质、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的亲和素；
(2)将待测样品与所述捕获抗体包被的固相基质、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的亲和素相接触；
(3)分离所述固相基质，以获得与所述固相基质结合的复合物；和
(4)检测所述复合物的荧光强度；
其中，所述捕获抗体和所述检测抗体结合所述抗原的不同位点，以及所述复合物荧光强度指示所述抗原是否存在和/或所述抗原的量。
本发明中，捕获抗体和检测抗体都是能够与抗原特异性结合的抗体。通常捕获抗体与检测抗体成对使用，结合同一个抗原的不同位点，例如不同的抗原决定簇。本发明中捕获抗体与检测抗体可互换使用，例如，同一抗体，在一些实施方案中与磁珠偶联作为捕获抗体，在另一些实施方案中被生物素标记作为检测抗体。
在一个实施方案中，步骤(2)中生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的亲和素先接触并反应，然后与待测样品相接触。即，先对检测抗体进行荧光标记，然后与待测样品和捕获抗体反应。
在另一个实施方案中，所述固相基质包被亲和素，所述捕获抗体为生物素标记的捕获抗体，所述生物素标记的捕获抗体通过与所述亲和素的结合连接于所述固相基质，即，捕获抗体通过生物素-亲和素的作用偶联到固相基质上。
在另一个实施方案中，同时检测两种或更多种抗原时，使用两种或更多种捕获抗体和两种或更多种生物素标记的检测抗体，每种检测抗体通过与不同荧光分子标记的亲和素相接触而被标记不同荧光分子，然后与待测样品反应。其中，每种所述不同荧光分子分别发射各自可区分的荧光，这些各自可区分的荧光可被检测并区分。通过这种方式，可以在同一样本中同时检测不同抗原，不同检测抗体因为标记的荧光不同而被区分。
在第二方面，本发明提供一种检测抗原的方法，包括步骤：
(1)提供抗体包被的固相基质、生物素标记的抗原和荧光分子标记的亲和素；
(2)将待测样品与所述抗体包被的固相基质相接触，以获得复合物I；
(3)将步骤(2)的反应体系与所述生物素标记的抗原和所述荧光分子标记的亲和素相接触，以获得复合物II；和
(4)检测所述复合物II的荧光强度；
其中，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，以及所述复合物II的荧光强度指示所述抗原是否存在和/或所述抗原的量。
在一个实施方案中，步骤(3)的所述生物素标记的抗原和所述荧光标记的亲和素在与步骤(2)的反应体系相接触之前，先接触并反应，然后与步骤(2)的反应体系相接触。
在另一个实施方案中，同时检测两种或更多种抗原，使用两种或更多种抗体包被的固相基质和两种或更多种生物素标记的抗原，每种生物素标记的抗原通过与不同荧光分子标记的亲和素相接触而被标记不同荧光分子，每种所述不同荧光分子分别发射各自可区分的荧光，然后与待测样品反应。通过这种方式，可以在同一样本中同时检测不同抗原。
在第三方面，本发明提供一种检测抗原的方法，包括步骤：
(1)提供生物素标记的抗体、生物素标记的抗原、荧光分子标记的亲和素和亲和素包被的固相基质；
(2)将待测样品与所述生物素标记的抗体和荧光标记的亲和素相接触，以获得复合物A；
(3)将所述生物素标记的抗原与亲和素包被的固相基质相接触，以获得复合物B；
(4)将步骤(2)的反应体系与所述复合物B相接触，以获得复合物C；和
(5)检测所述复合物C的荧光强度；
其中，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，以及所述复合物C的荧光强度指示所述抗原是否存在和/或所述抗原的量。
在一个实施方案中，同时检测两种或更多种抗原，使用两种或更多种生物素标记的抗原和两种或更多种生物素标记的抗体，不同生物素标记的抗体通过与不同荧光分子标记的亲和素相接触而被标记荧光分子，每种所述不同荧光分子分别发射各自可区分的荧光，然后与待测样品反应。通过这种方式，可以在同一样本中同时检测不同抗原。
在一些实施方案中，本发明所述的亲和素选自卵白亲和素(Avidin)、链霉亲和素(Streptavidin)、中性链亲和素(NeutrAvidinTM)及类亲和素，优选为链霉亲和素(Streptavidin)。
在另一些实施方案中，本发明所述的荧光分子选自香豆素类(Coumarin Dyes)、荧光素类(Fluorescein Dyes)、罗丹明类(Rhodamine Dyes)、碳花青类(Cyanine Dyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，包括Cy系列菁染料(例如Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物)，Alexa FluorTM系列染料(例如Alexa Fluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、647、680、700、750)，iFluorTM系列染料(例如iFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、647、680、700、750)，荧光素(FITC)和蛋白类染料(例如PE、PC、APC、preCP、PE-Cy3/Cy5/Cy7、APC-Cy7、PerCP-Cy5.5)。优选地，所述荧光分子为FAM、CY3、CY5、CY7、AF488或AF647。
在另一些实施方案中，本发明所述的固相基质选自磁珠和玻璃珠，优选地，所述固相基质为磁珠。
在第四方面，本发明提供一种试剂盒，其包含捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的链霉亲和素，所述试剂盒用于根据权利要求第一方面所述的方法来检测抗原。在一个实施方案中，所述试剂盒包含人胰岛素捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的人胰岛素检测抗体和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
在另一个实施方案中，所述试剂盒包含两种或更多种捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的链霉亲和素。例如对肺癌抗原进行检测时，通常需要检测CEA、Cyfra21-1和SCCA抗原。在一个实施方案中，所述试剂盒包含CEA捕获抗体包被的磁珠、Cyfra21-1捕获抗体包被的磁珠、SCCA捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的CEA检测抗体、生物素标记的Cyfra21-1检测抗体、生物素标记的SCCA检测抗体，以及Alexa488标记的链霉亲和素、CY3标记的链霉亲和素和Alexa610标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。使用本发明的方法和试剂盒，可在一个血清样本中同时检测这三种抗原，在采用少量样品的情况下短时间内同时获得三种抗原的检测结果，简化了操作，加快了诊断。
在第五方面，本发明提供一种试剂盒，其包含链霉亲和素包被的磁珠、生物素标记的捕获抗体、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的链霉亲和素，所述试剂盒用于根据第一方面所述的方法来检测抗原。在一个实施方案中，所述试剂盒包含链霉亲和素包被的磁珠、生物素标记的细胞角蛋白捕获抗体、生物素标记的细胞角蛋白检测抗体和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
在一个实施方案中，所述试剂盒其包含两种或更多种生物素标记的捕获抗体、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的链霉亲和素，用于同时检测同一样本中的两种或更多种抗原。
在第六方面，本发明提供一种试剂盒，其包含抗体包被的磁珠、生物素标记的抗原和荧光分子标记的链霉亲和素，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，所述试剂盒用于根据第二方面所述的方法来检测抗原。在一个实施方案中，所述试剂盒包含四碘甲状腺素抗体包被的磁珠、生物素标记的四碘甲状腺素和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含两种或更多种抗体包被的磁珠、生物素标记的抗原和荧光分子标记的链霉亲和素，用于同时检测同一样本中的两种或更多种抗原。
在第七方面，本发明提供一种试剂盒，其包含链霉亲和素包被的磁珠、生物素标记的抗原、生物素标记的抗体和荧光分子标记的链霉亲和素，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，所述试剂盒用于根据第三方面所述的方法来检测抗原。在一个实施方案中，所述试剂盒包含链霉亲和素包被的磁珠、生物素标记的三碘甲状腺原氨酸、生物素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含两种或更多种生物素标记的抗原、生物素标记的抗体和荧光分子标记的链霉亲和素，用于同时检测同一样本中的两种或更多种抗原。
本发明中，术语“荧光染料”、“荧光分子”、“荧光素”和“荧光标记物”可互换使用，指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。荧光染料可以单独使用，也可以组合成复合荧光染料使用。荧光信号的检测可采用现有技术可以测量荧光强度的仪器进行，无具体限制，例如可使用流式细胞仪。
本发明中，术语“磁珠”和“磁微粒”可互换使用，指可以通过磁力进行分离的微粒。可采用本领域已知的技术将蛋白(例如抗体或抗原)连接到磁珠上，对磁珠无特殊限制，适用于本方法的磁珠均可使用。
附图说明
图1示本发明用荧光分子间接标记抗体的一个实施方案。
图2示本发明夹心法免疫荧光检测抗原的一个实施方案。
图3示本发明竞争法免疫荧光检测抗原的一个实施方案。
图4示本发明竞争法免疫荧光检测抗原的又一个实施方案。
图5示实施例2的胰岛素标准曲线。
图6示实施例3的Cyfra21-1标准曲线。
图7示实施例4的T4标准曲线。
图8示实施例5的FT4标准曲线
图9示实施例8中的胰岛素检测结果相关性示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。
本文使用的术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。
本发明用荧光分子间接标记抗体的一个实施方案如图1所示。用生物素标记抗体，标记方法可采用本领域已知的方法。每个抗体分子可被一个或更多个生物素分子标记，每个生物素分子可与至少一个亲和素分子结合，即，每个抗体可结合一个或多个亲和素。同时，一个亲和素分子可被多个荧光分子标记，这种方式大大增加了标记到抗体上的荧光染料数，提高了检测时的荧光信号，相应提高了检测的灵敏度。
本发明夹心法免疫荧光检测抗原的一个实施方案如图2所示。其中，捕获抗体偶联于磁珠，与含待测抗原的样品接触；同时，生物素标记的检测抗体与荧光染料标记的亲和素接触；二者混合反应后，分离获得的复合物，用可检测荧光的仪器进行检测。也可以是，几种成分同时混合，一起反应。
本发明竞争法免疫荧光检测抗原的一个实施方案如图3所示。竞争法主要用于小分子抗原或半抗原的检测。采用生物素标记抗原，并使其与样品中的待测抗原竞争结合有限的抗体分子，从而使结合后的标记抗原强度与样品中的待测抗原浓度呈负相关。在竞争法反应体系中，抗体的量是固定的，且抗体结合位点少于待测抗原与标记抗原的总量。
本发明竞争法免疫荧光检测抗原的另一个实施方案如图4所示。其中，磁珠为亲和素标记，抗原为生物素标记，生物素化的抗体被荧光标记的亲和素所标记。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的一些优选的实施方式和方面。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：材料和方法
本发明实施例使用的试剂均在市场上购买获得或通过合成得到。
磁珠
本领域常规的用于偶联抗体的磁珠均可用于本发明。可以为羧基磁珠、氨基磁珠或巯基磁珠，粒径100nm-5μm均可，优选1-3μm。可根据实际情况使用EDC一步活化法或EDC-NHS两步活化法对磁珠进活化处理。可选地，对活化后的磁珠进行封闭处理，封闭剂(例如TBST缓冲液)能够达到更好的降低背景的效果。
捕获抗体
捕获抗体是能够与靶标特异性结合的抗体。
抗体的预处理:如果抗体溶液含有其他氨基、巯基的杂质分子，需先通过透析、G-25等手段将杂质分子去除。
磁珠-抗体复合物的制备
偶联反应：将磁珠放入偶联反应瓶中，加入缓冲液，然后加入抗体(例如，磁珠量:抗体量(mg)＝20:1，可根据需要调整用量)；将偶联反应瓶关上后放入恒温摇床中，恒温25℃震荡1-6小时，保证震荡混匀；
封闭：向偶联反应瓶中加入缓冲液清洗(利用磁性分离磁珠，弃上清液)，加入3-5％BSA封闭没有完全反应的活性基团，2-8℃冰箱保存。
检测抗体
检测抗体是能够与靶标特异性结合的抗体，通常与捕获抗体成对使用。
实施例2：采用双抗体夹心免疫法检测抗原，捕获抗体包被磁珠
本实施例示采用双抗体夹心免疫法检测样品中的抗原。用捕获抗体包被磁珠，形成磁珠偶联捕获抗体的固相，依次加入血清样品、生物素标记的检测抗体以及荧光基团标记的链霉亲和素，通过抗原与抗体以及生物素与亲和素的特异性结合形成免疫复合物：磁珠偶联捕获抗体—抗原—生物素标记检测抗体—荧光基团标记链霉亲和素。参见图2。
可使用流式细胞仪检测样本中免疫复合物的荧光强度，荧光强度与血清样本中的抗原浓度呈正相关，标准品与其对应荧光信号可拟合成剂量-反应标准曲线，根据曲线方程可计算出样本中的抗原浓度。
主要试剂参见表1。
表1
| 试剂1[R1a] | 包被捕获抗体的磁微粒 |
| 试剂2[R1b] | 生物素标记的检测抗体 |
| 试剂3[R1c] | 荧光标记的链霉亲和素 |
试剂制备方法：
试剂1[R1a]包被捕获抗体的磁微粒试剂
1.1采用磁微粒作为固相载体
粒径：1μm,3μm,或5μm；粒径均一性：CV<4％；溶剂：去离子水；表面功能基团：羧基(-COOH)；羧基密度：200μmol/g。
1.2磁珠表面羧基活化
将磁珠在溶液中混匀后，取适量至离心管中，吸去上清，用配置好的MEST缓冲液(例如，50mM MES(吗啉乙磺酸，购自阿拉丁试剂，货号M108951)缓冲液，pH 6.0～6.7，0.05％Tween 20)洗涤磁珠3次。取适量新配的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，购自阿拉丁试剂，货号E106172)溶液和等体积的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，购自阿拉丁试剂，货号H109330)溶液分散磁珠(优选的，EDC溶液浓度为50mg/mL，NHS溶液浓度为50mg/mL)，25℃条件下，活化40min。
1.3磁珠与捕获抗体偶联
将适量的捕获抗体分散在MEST缓冲液中，并以此溶液分散活化后的磁珠，于25℃条件偶联3小时或4℃条件下过夜。偶联后，磁分离弃上清，加入含有TBST缓冲液(例如，1MTris-盐酸缓冲液，PH 8，0.05％Tween 20)，25℃条件下，旋转混合20分钟，淬灭多余的羧基。磁分离弃上清，加入BSA的缓冲液(例如，1％、3％、5％BSA-PBS溶液)，重新分散磁珠，25℃条件下旋转混合1小时，以封闭未反应的活化羧基。封闭后，磁分离去上清，用PBST缓冲液(例如，1×PBS，PH 7.4，0.05％Tween 20)洗涤磁珠3次，加入保存液(PBST，0.01％～0.1％BSA，<0.1％叠氮钠，<0.1％ Proclin 300)并重新分散，保存于2-8℃条件下。
试剂2[R1b]生物素标记的检测抗体试剂
2.1检测抗体
选择两个针对抗原上不同决定簇的单克隆抗体，分别作为捕获抗体和检测抗体，用于磁微粒交联和生物素标记。
2.2用于标记的生物素试剂
NHS-生物素(生物素-N-琥珀酰亚胺基酯)试剂能够简单有效的对溶液中的蛋白质(例如抗体)和其他含伯胺的大分子进行生物素标记。NHS活化的生物素与PH 7～9缓冲液中的伯氨基(-NH2)能够有效反应，形成稳定的酰胺键。抗体在赖氨酸残基的侧链中具有几个伯胺，并且每条多肽的N末端可以作为NHS活化的生物素试剂进行标记的靶标。
常用NHS-生物素试剂为：
生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(NHS-Biotin)分子量：341.38，间隔臂：
生物素-epsilon-氨基己酸-N-羟基丁二酰亚胺活化酯(NHS-LC-Biotin)分子量：454.54，间隔臂：
磺基琥珀生物素(Sulfo-NHS-Biotin)分子量：443.43，间隔臂：
2.3生物素标记检测抗体步骤
2.3.1将冷藏的生物素标记试剂平衡至室温；用分析天平称取一定量生物素标记试剂溶于二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)等有机溶剂中。优选的，制备10mM生物素试剂溶液。
2.3.2加适量生物素试剂溶液到待标记的检测抗体中，25℃避光条件下，孵育30分钟。调节生物素与抗体的摩尔比以控制标记的掺入水平。一般情况，作为大蛋白质的抗体，通常会在每个IgG分子中标记8～12个生物素分子。优选的，使用20倍摩尔比的生物素试剂来标记2mg/mL抗体溶液或使用12倍摩尔比的生物素试剂来标记10mg/mL抗体溶液。
2.3.3加入1mol/L氯化铵溶液(优选的，每25μg生物素标记试剂加入1μL)，在25℃条件下旋转混合10分钟，终止标记反应，防止检测抗体因标记生物素分子太多而失活。
2.3.4选用合适的截留分子量的透析袋，在4℃条件下对生物素标记检测抗体反应溶液充分透析，以除去游离的生物素。优选的，透析缓冲液是1×PBS，PH 7.4。持续透析的过程中，至少要进行3次全部更换透析液。
试剂3[R1c]荧光标记的链霉亲和素试剂
3.1荧光标记物
采用带有马来酰亚胺活性基团的荧光染料来标记硫醇或巯基(-SH)，以连接带巯基的蛋白或生物分子。马来酰亚胺活性基团的荧光染料包括Cy系列菁染料(例如Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物)，Alexa FluorTM系列染料(例如Alexa Fluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、647、680、700、750)，iFluorTM系列染料(例如iFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、647、680、700、750)，荧光分子(FITC)和蛋白类染料(例如PE、PC、APC、preCP、PE-Cy3/Cy5/Cy7、APC-Cy7、PerCP-Cy5.5)。
3.2链霉亲和素
链霉亲和素(Streptavidin)是一种52.8kDa大小的四聚体蛋白，链霉亲和素对生物素(Biotin)具有极高的亲和力。采用巯基修饰的链霉亲和素(Streptavidin-Thiol)作为被标记物，马来酰亚胺基团将与巯基反应形成共价键，使荧光分子与链霉亲和素通过稳定的硫酯键连接。优选的，巯基修饰链霉亲和素分子量60kDa，溶解度1mg/ml，纯度95％。
3.3荧光基团标记链霉亲和素步骤
3.3.1在室温条件下，将巯基修饰的链霉亲和素溶解在PH 7.0～7.5的合适缓冲液(例如1×PBS、Tris、HEPES)中，制备待标记溶液A。在该PH范围内，蛋白质硫醇基团具有非常强的亲核性。
3.3.2在室温条件下，将带马来酰亚胺活性基团的荧光染料溶解在无水DMSO或DMF中，制成1～10mM储备溶液B。通过移液或涡旋混合均匀，用锡箔纸包裹，整个过程需要注意避光。
3.3.3偶联反应：搅拌待标记溶液A，将储备溶液B逐滴加入其中。建议使用马来酰亚胺活性基团的荧光染料与巯基修饰链霉亲和素的摩尔比为10：1，具体根据实际情况分别以5:1，15:1和20:1确定最佳染料与链霉亲和素比例。
3.3.4在避光条件下，旋转或摇动反应混合物，室温反应0.5～2h，或4℃偶联过夜。
3.3.5偶联反应结束后，加入过量巯基乙醇或其他可溶性低分子量硫醇，室温、避光条件下，旋转混合反应30min，以消耗过量的荧光染料，中止偶联反应。
3.3.6纯化：过凝胶过滤柱，优选Sephadex G-25柱上分离偶联缀合物；或在适当缓冲液中在4℃、避光下进行透析。
下面以人胰岛素为例，采用本实施例所述的方法进行检测。
1)制备试剂1[R1a]胰岛素单克隆捕获抗体包被的顺磁性微粒。采用MagCOOH羧基磁珠(苏州知益微球，货号20210623)，按1.2-1.3所述制备流程，偶联人胰岛素单克隆抗体Anti-Insulin McAb(coating)(上海领潮生物科技，货号L3I00501)，加入保存液并重新分散，终浓度0.0625mg/mL。置于2～8℃条件下存放。
2)制备试剂2[R1b]生物素化的胰岛素检测抗体。采用人胰岛素单克隆抗体Anti-Insulin McAb(labeling)(上海领潮生物科技，货号L3I00502)，按2.3所述标记流程，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(上海生工生物工程有限公司，货号C100212-0250)标记至抗体上，加入保存液，终浓度6.24mg/L。置于2～8℃条件下存放。
3)制备试剂3[R1c]Alexa488标记链霉亲和素。采用巯基化链霉亲和素(西安齐岳生物，货号Q-0094867)，按3.3所述标记流程，将Alexa488马来酰亚胺(麦克林试剂，货号A849879)标记在链霉亲和素上，加入保存液，终浓度9mg/L。置于2～8℃条件下存放。
4)配置胰岛素抗原校准品的浓度梯度溶液。梯度浓度标准品分别含有0、5、10、20、40、80、160、320mIU/L的胰岛素抗原(上海领潮生物科技，货号L4I001)，所用溶液为PBSPH7.2-7.4，含1％BSA，5％海藻糖，0.5％吐温20，1％EDTANa2，0.1％ Proclin300。置于2～8℃条件下存放。
5)取50μL血清样本(中南大学湘雅第三医院检验科提供)，加入20μL试剂1[R1a]、50μL试剂2[R1b]、20μL试剂3[R1c]，在37℃条件下，避光混合孵育30分钟。反应混和液磁分离，加入PBST(PH 7.4，0.05％吐温20)缓冲液洗涤1次。加入PBS(1×，PH 7.4)重悬磁珠。
6)采用流式细胞仪(型号BD LSRFortessaTM，FITC通道)测量结果，通过流式分析软件得出荧光强度数值。
将步骤5)中血清样本的荧光强度数值代入步骤4)校准品的标准曲线，计算得出待测样本中的胰岛素浓度，与用化学发光免疫分析方法(检验科用的方法)检测结果基本一致，参见表2。
表2
试剂分析性能评估
1)灵敏度。参照YY T1250-2014文件推荐的实验方案检测试剂的灵敏度，测得本实施例检测方法和试剂对人胰岛素最低检出量不高于0.2mIU/L。
2)线性范围。人胰岛素校准品各浓度梯度的平均荧光强度如表3所示。根据校准品的信号值与浓度值按Logistic四参数曲线拟合，绘制剂量反应曲线。标准曲线如图5所示，线性范围在[5，320]mIU/L浓度区间内，剂量-反应曲线线性相关系数(r)≥0.9900。
表3
| 浓度(mIU/L) | 0 | 5 | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 | 320 |
| 荧光强度(a.u.) | 80.9 | 169 | 286 | 487 | 879 | 1345 | 1877 | 2413 |
3)稳定性。各试剂按37℃放置10天进行检测，结果符合各项目规定的要求。
4)精密度。将上述制备的人胰岛素检测试剂(偶联有捕获抗体的磁珠、生物素化的检测抗体和Alexa488标记的链霉亲和素)分装为3批试剂盒，每个试剂盒均包含这3种试剂。配置浓度为20mIU/L和160mIU/L两个胰岛素样本，每个样本每个浓度重复测定10次，用三批试剂盒分别进行检测。结果表明试剂盒批内差2.4％，批间差5.7％。
5)分析特异性。用本实施例的试剂盒检测如表4所示的干扰物质，结果显示，在所列浓度范围内的干扰物质对检测结果无影响。
表4
采用本实施例方法和人胰岛素检测试剂检测表5所示浓度下的结构类似物，交叉反应结果如表5所示。该结果表明本实施例方法和试剂具有良好的分析特异性。
表5
| 交叉物质 | 浓度 | 交叉反应 |
| 猪胰岛素 | 9000pmoL/L | 20.7％ |
| 人前胰岛素 | 1000ng/mL | 0.62％ |
| C肽 | 100ng/mL | 未检测到 |
| 胰高血糖素 | 1000pg/mL | 未检测到 |
| 生长抑素 | 100pg/mL | 未检测到 |
| IGF-1 | 1000pg/mL | 0.01％ |
由以上检测结果可知，本实施例方法和试剂具有较高的灵敏度，较宽的线性范围，良好的稳定性。
实施例3：采用双抗体夹心免疫法检测抗原，链霉亲和素包被磁珠
与实施例2不同的是，本实施例采用链霉亲和素包被磁珠，捕获抗体和检测抗体均为生物素标记。
主要试剂参见表6。
表6
| 试剂1[M] | 链霉亲和素包被的磁微粒， |
| 试剂2[R1a] | 生物素标记的捕获抗体(bio-Antibody coating) |
| 试剂3[R1b]： | 生物素标记的检测抗体(bio-Antibody labeling) |
| 试剂4[R1c] | 荧光标记链霉亲和素 |
试剂制备方法：
1.试剂1[M]链霉亲和素包被的磁微粒试剂
采用链霉亲和素磁珠作为固相。
优选的，材质：四氧化三铁；粒径：0.6μm，1μm，2.8μm，3μm；粒径均一性：CV<3％；表面修饰：链霉亲和素；分散介质：纯水。
优选的，适用于生物素标记抗体/蛋白的缓冲液：PBS pH＝7.4，0.05％
Tween-20，0.01％～0.1％ BSA。
2.试剂2[R1a]和3[R1b]生物素标记的单克隆捕获抗体/检测抗体试剂，制备方法同实施例2的2.1-2.3记载的方法。
3.试剂4[R1c]荧光标记链霉亲和素试剂，制备方法同实施例2的3.1-3.3记载的方法。
下面以细胞角蛋白为例，采用本实施例所述的方法进行检测。cyfra21-1是细胞角蛋白19的可溶性片段，主要用做肿瘤标志物。
1)制备试剂1[M]链霉亲和素包被的微粒。采用MagSA链霉亲和素磁珠(苏州知益微球，货号20210321)，清洗并加入保存液并重新分散，终浓度0.05mg/mL。置于2～8℃条件下存放。
2)制备试剂2[R1a]生物素化的细胞角蛋白单克隆捕获抗体。采用细胞角蛋白单克隆抗体Anti-Cyfra21-1 McAb(coating)(上海领潮生物科技，货号L1C00706)，按实施例2所述标记流程，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(上海生工生物工程有限公司，货号C100212-0250)标记在抗体上，加入保存液，终浓度1.5mg/L。置于2～8℃条件下存放。
3)制备试剂3[R1b]生物素化的细胞角蛋白单克隆检测抗体。采用细胞角蛋白单克隆抗体Anti-Cyfra21-1 McAb(labeling)(上海领潮生物科技，货号L1C00705)，按实施例2所述标记流程，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(上海生工生物工程有限公司，货号C100212-0250)标记在抗体上，加入保存液，终浓度6.24mg/L。置于2～8℃条件下存放。
4)制备试剂4[R1c]Alexa488标记链霉亲和素。采用巯基化链霉亲和素(西安齐岳生物，货号Q-0094867)，按实施例2所述标记流程，将Alexa488马来酰亚胺(麦克林试剂，货号A849879)标记在链霉亲和素上，加入保存液，终浓度9mg/L。置于2～8℃条件下存放。
5)配置重组角蛋白抗原校准品的浓度梯度溶液。梯度浓度标准品分别含有0、0.1、1、10、50、100、300ng/mL的重组角蛋白抗原(上海领潮生物科技，货号L2C00802)，所用溶液为PBS PH7.2-7.4，含1％BSA，5％海藻糖，0.5％吐温20，1％EDTANa2，0.1％ Proclin300。置于2～8℃条件下存放。
6)取50μL血清样本(中南大学湘雅第三医院检验科提供)加入20μL试剂1[M]、20μL试剂2[R1a]，在37℃条件下，避光混合孵育15分钟。再加入50μL试剂3[R1b]、20μL试剂4[R1c]避光混合孵育20分钟。反应混和液磁分离，加入PBST(PH 7.4，0.05％吐温20)缓冲液洗涤1次。加入1×PBS(PH 7.4)重悬磁珠。
7)采用流式细胞仪(型号BD LSRFortessaTM，FITC通道)测量结果，通过流式分析软件得出荧光强度数值。
将步骤6)中血清样本的荧光强度数值代入步骤5)校准品的标准曲线，计算得出待测样本中Cyfra21-1的浓度，与用化学发光免疫分析方法(检验科用的方法)检测结果基本一致，参见表7。
表7
试剂分析性能评估
1)灵敏度。取零值校准品进行20次测定，取其平均值减去两倍标准差，所得相对荧光强度带入标准曲线计算本实施例方法和试剂的灵敏度为0.1ng/mL。
2)线性范围。非小细胞肺癌相关抗原Cyfra21-1校准品各浓度梯度的平均荧光强度如表8所示。根据校准品的信号值与浓度值按Logistic四参数曲线拟合，绘制标准曲线。本实施例方法和试剂的线性范围在[0.1，300]ng/mL浓度区间内，剂量-反应曲线线性相关系数(r)≥0.9900。
表8
| 浓度(ng/mL) | 0 | 0.1 | 1 | 10 | 50 | 100 | 300 |
| 荧光强度(a.u.) | 60.7 | 90 | 874 | 1668 | 4961 | 7110 | 9862 |
3)稳定性。各试剂按37℃放置10天进行检测，结果符合各项目规定的要求。
4)精密度。将本实施例制备的Cyfra21-1检测试剂分装为3批试剂盒，每个试剂盒均包含表5所列的4种试剂。配置浓度为1ng/mL和100ng/mL两个Cyfra21-1样本，每个样本每个浓度重复测定10次，用三批试剂盒分别进行检测。结果表明试剂盒批内差2.4％，批间差6.9％。
5)分析特异性。用本实施例的试剂盒检测如表9所示的干扰物质，结果显示，在所列的干扰物质浓度范围内，回收率在初始值±10％以内，Cyfra21-1测量结果基本不受干扰。
表9
| 干扰物 | 浓度 |
| 胆红素 | 50mg/dL |
| 血红蛋白 | 500mg/dL |
| 甘油三酯 | 1000mg/dL |
| 生物素 | 50ng/dL |
采用本实施例方法和Cyfra21-1检测试剂检测表10所示浓度的结构类似物，交叉反应结果如表10所示。在所列浓度下，Cyfra21-1检测试剂与细胞角蛋白8和18之间没有交叉反应性，与癌胚抗原CEA、神经元特异性烯醇化酶NSE交叉反应<0.05％，具有良好的分析特异性。
表10
| 交叉物质 | 浓度 | 交叉反应 |
| 细胞角蛋白8 | 100ng/mL | 未检测到 |
| 细胞角蛋白18 | 100ng/mL | 未检测到 |
| CEA | 500ng/mL | 0.012％ |
| NSE | 300pg/mL | 0.03％ |
由以上检测结果可知，本实施例方法和试剂具有较高的灵敏度，较宽的线性范围，良好的稳定性。
实施例4：采用竞争免疫法检测抗原，抗体包被磁珠
本实施例示采用竞争法的方式来检测抗原，参见图3。
基本步骤：1)将待测样本与一定量包被有抗体的超顺磁性磁微粒混合孵育反应，形成复合物Ⅰ：抗体-抗原；2)向步骤1)的反应体系中加入生物素标记的抗原和荧光标记的链霉亲和素，混合孵育反应，此时，超顺磁性磁微粒包被的抗体中未与待测样本中抗原结合的将与生物素标记的抗原结合，形成复合物Ⅱ；3)在磁场作用下，磁分离洗去未结合的物质，获得复合物Ⅱ：磁珠交联抗体-生物素标记抗原-荧光标记链霉亲和素。
使用流式细胞仪检测最后形成的复合物II的荧光强度。待测样本中抗原含量与流式细胞仪检测到的荧光强度(MFI)呈反比关系，测试结果通过校准曲线确定。
主要试剂如表11所示。
表11
| 试剂1[R1a] | 包被有抗体的顺磁性微粒 |
| 试剂2[R1b] | 生物素标记的抗原(bio-Antigen) |
| 试剂3[R1c] | 荧光标记的链霉亲和素 |
试剂制备方法：
1.试剂1[R1a]包被有抗体的顺磁性微粒试剂
制备方法参见实施例2。
2.试剂2[R1b]生物素标记的抗原试剂
2.1待标记抗原
一般选择用SDS-PAGE或HPLC测定抗原，纯度一般大于95％。
2.2生物素标记试剂
参见实施例2。NHS-生物素试剂能够简单有效的对溶液中的蛋白质进行。调节生物素与蛋白质的摩尔比可控制标记的掺入水平，一般情况每个蛋白质分子标记3～5个生物素分子。
2.3生物素标记抗原步骤
参见实施例2，与生物素标记检测抗体的步骤基本相同。
3.试剂3[R1c]荧光标记的链霉亲和素试剂
制备方法参见实施例2。
下面以四碘甲状腺素为例，采用本实施例所述的竞争免疫法进行检测。
1)制备试剂1[R1a]四碘甲状腺素(T4)多克隆抗体包被的磁微粒。采用MagCOOH羧基磁珠(苏州知益微球，货号20210623)，按实施例2所述制备流程，偶联四碘甲状腺素多克隆抗体Goat Anti T4 PcAb(上海领潮生物科技，货号L1G00302)，加入保存液并重新分散，置于2～8℃条件下存放。
2)制备试剂2[R1b]生物素化的四碘甲状腺素抗原。采用四碘甲状腺素抗原T4(上海领潮生物科技，货号L2G01002)，按实施例2标记抗体的方法进行操作，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(上海生工生物工程有限公司，货号C100212-0250)标记在抗原上，加入保存液置于2～8℃条件下存放。
3)制备试剂3[R1c]Alexa488标记链霉亲和素。采用巯基化链霉亲和素(西安齐岳生物，货号Q-0094867)，按实施例2所述标记流程，将Alexa488马来酰亚胺(麦克林试剂，货号A849879)标记在链霉亲和素上，加入保存液置于2～8℃条件下存放。
4)配置T4抗原校准品的浓度梯度溶液。梯度浓度标准品分别含有0、1、10、20、30μg/dL的T4抗原，所用溶液为PBS PH7.2-7.4，含0.3％BSA，5％海藻糖，0.5％吐温20，1％EDTANa2，0.1％ Proclin300。置于2～8℃条件下存放。
5)取50μL血清样本(中南大学湘雅第三医院检验科提供)，加入20μL试剂1[R1a]，在37℃条件下，避光混合孵育20分钟。再加入50μL试剂2[R1b]、20μL试剂3[R1c]避光混合孵育20分钟。反应混和液磁分离，加入PBST(PH 7.4，0.05％吐温20)缓冲液洗涤1次。加入PBS(1×，PH 7.4)重悬磁珠。
6)采用流式细胞仪(型号BD LSRFortessaTM，FITC通道)测量结果，通过流式分析软件得出荧光强度数值。
将步骤5)中待测血清样本的荧光强度数值代入步骤4)校准品的标准曲线，计算得出待测样本中的四碘甲状腺素(T4)浓度，与用化学发光免疫分析方法(检验科用的方法)检测结果基本一致，参见表12。
表12
试剂分析性能评估
1)灵敏度。本实施例方法和试剂的最低检出量不高于0.1μg/dL。
2)线性范围。以T4梯度校准品浓度的Log值为横坐标，荧光强度MF I的Logit值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线如图7所示，线性范围在[0.1，
30]μg/dL浓度区间内，剂量-反应曲线线性相关系数绝对值|(r)|≥0.9900。
表13
| 浓度(μg/dL) | 0.1 | 0.5 | 1 | 10 | 20 | 30 |
| 荧光强度(a.u.) | 5510 | 4813 | 4126 | 1380 | 642 | 420 |
3)稳定性。各试剂按37℃放置10天进行检测，结果符合各项目规定的要求。
4)精密度。将上述制备的T4检测试剂分装为3批试剂盒，每个试剂盒均包含上述3种检测试剂。配置浓度为1μg/dL和10μg/dL两个T4样本，每个样本每个浓度重复测定10次，用三批试剂盒进行检测。结果表明试剂盒批内差3.4％，批间差7.9％。
5)分析特异性。用本实施例的试剂盒检测如表14所示的干扰物质，结果显示，在所列的干扰物质浓度范围内，回收率在初始值±10％以内，没有发现显著的干扰性。
表14
| 干扰物 | 浓度 |
| 胆红素 | 10mg/dL |
| 血红蛋白 | 500mg/dL |
| 甘油三酯 | 2000mg/dL |
采用本实施例方法和试剂检测表15所示浓度的结构类似物(交叉物质)，交叉反应结果如表15所示。在所列浓度下，T4检测试剂与三碘甲腺原氨酸T3和反三碘甲腺原氨酸rT3之间的交叉反应<0.03％，具有良好的分析特异性。
表15
由以上检测结果可知，本实施例方法和试剂具有较高的灵敏度，较宽的线性范围，良好的稳定性。
实施例5：采用竞争免疫法检测抗原，链霉亲和素包被磁珠
与实施例4不同的是，本实施例采用链霉亲和素包被的磁珠，标记抗原和检测抗体均为生物素标记，参见图4。步骤如下：
1)将待测样本、一定量生物素标记的抗体、荧光标记链霉亲和素混合孵育反应，形成复合物A：抗原—生物素标记抗体—荧光标记链霉亲和素。
2)将包被链霉亲和素的超顺磁性磁微粒、生物素标记的抗原反应，形成复合物B：链霉亲和素包被的磁珠—生物素标记抗原，在磁场作用下，磁分离洗去未结合的多余的生物素标记抗原。
3)将步骤1)的反应体系加入到复合物A中，其中未与待测抗原结合的剩余抗体将与生物素标记的抗原结合，在磁场作用下，磁分离洗去未结合的物质，获得复合物C：链霉亲和素包被的磁珠—生物素标记抗原—生物素标记抗体—荧光标记链霉亲和素。。
使用流式细胞仪检测复合物C的荧光强度。待测样本中抗原含量与流式细胞仪检测到的荧光强度(MFI)呈反比关系，测试结果通过校准曲线确定。
主要试剂参见表16。
表16
| 试剂1[M] | 链霉亲和素包被的磁微粒 |
| 试剂2[R1a]： | 生物素标记的抗原(bio-Antigen) |
| 试剂3[R1b]： | 生物素标记的抗体(bio-Antibody labeling) |
| 试剂4[R1c] | 荧光标记的链霉亲和素 |
试剂制备方法：
试剂1[M]链霉亲和素包被的磁微粒的制备方法参见实施例3；试剂2[R1a]生物素标记的抗原试剂的制备方法参见实施例4；试剂3[R1b]生物素标记的抗体试剂的制备方法参见实施例2；试剂4[R1c]荧光标记链霉亲和素试剂的制备方法参见实施例2。
下面以三碘甲状腺原氨酸(FT4)为例，采用本实施例所述的竞争免疫法进行检测。
1)制备试剂1[M]链霉亲和素包被的微粒。采用MagSA链霉亲和素磁珠(苏州知益微球，货号20210321)，清洗并加入保存液并重新分散，终浓度0.05mg/mL。置于2～8℃条件下存放。
2)制备试剂2[R1a]生物素化的游离三碘甲状腺原氨酸(FT4)抗原。采用游离三碘甲状腺原氨酸FT3(上海领潮生物科技，货号L2G01001)，按实施例2所述标记流程，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(上海生工生物工程有限公司，货号C100212-0250)标记在抗原上，加入保存液置于2～8℃条件下存放。
3)制备试剂3[R1b]生物素化的游离三碘甲状腺原氨酸检测抗体。采用游离三碘甲状腺原氨酸多克隆抗体Goat Anti FT3 PcAb(上海领潮生物科技，货号L1G00202)，按实施例4所述标记流程，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(上海生工生物工程有限公司，货号C100212-0250)标记在抗体上，加入保存液置于2～8℃条件下存放。
4)制备试剂4[R1c]Alexa488标记链霉亲和素，同实施例2。
5)配置FT3抗原校准品的浓度梯度溶液。梯度浓度标准品分别含有0、0.1、0.5、1、20、30、50pg/mL的FT3抗原，所用溶液为PBS PH7.2-7.4，含1％BSA，5％海藻糖，0.5％吐温20，1％EDTANa2，0.1％ Proclin300。置于2～8℃条件下存放。
6)取50μL血清样本(中南大学湘雅第三医院检验科提供)加入50μL试剂3[R1b]、20μL试剂4[R1c]，标记管Ⅰ，在37℃条件下，避光混合孵育20分钟；同步的取20μL试剂2[R1a]，加入20μL试剂1[M]，标记管Ⅱ，避光混合孵育20分钟；将反应管Ⅱ混和液磁分离；将标记管Ⅰ中反应混合液加入反应管Ⅱ中，在37℃条件下，避光混合孵育20分钟。加入PBST(PH 7.4，0.05％吐温20)缓冲液洗涤1次。加入PBS(1×，PH 7.4)重悬磁珠。
7)采用流式细胞仪(型号BD LSRFortessaTM，FITC通道)测量结果，通过流式分析软件得出荧光强度数值。
将步骤6)中血清样本的荧光强度数值代入步骤5)校准品的标准曲线，计算得出待测样本中FT4的浓度，与用化学发光免疫分析方法(检验科用的方法)检测结果基本一致。结果参见表17。
表17
试剂分析性能评估
1)灵敏度。本实施例方法和试剂的最低检出量不高于0.8pg/mL。
2)线性范围。FT4校准品各浓度梯度的平均荧光强度如表18所示。以梯度校准品浓度的Log值为横坐标，荧光强度MF I的Logit值为纵坐标绘制标准曲线，如图8所示，线性范围在[0.1，50]pg/mL浓度区间内，剂量-反应曲线线性相关系数绝对值|(r)|≥0.9900。
表18
| 浓度(pg/mL) | 0.1 | 0.5 | 1 | 20 | 30 | 50 |
| 荧光强度(a.u.) | 5296 | 4689 | 4288 | 711 | 428 | 231 |
3)稳定性。各试剂按37℃放置10天进行检测，结果符合各项目规定的要求。
4)精密度。将上述制备的FT4检测试剂分装为3批试剂盒，每个试剂盒均包含上述4种检测试剂。配置浓度为0.5pg/mL和30pg/mL两个FT4样本，每个样本每个浓度重复测定10次，用三批试剂盒进行检测。结果表明试剂盒批内差3.4％，批间差7.5％。
5)分析特异性。用本实施例的试剂盒检测如表19所示的干扰物质，结果显示，在所列的干扰物质浓度范围内，回收率在初始值±10％以内，干扰物质对检测结果无显著影响。
表19
采用本实施例方法和试剂检测表20所示浓度的交叉反应物，结果如表20所示。在所列交叉反应物浓度下，四碘甲状腺素T4检测结果为0.9pg/mL，反三碘甲腺原氨酸rT3检测结果0.17pg/mL，均满足国标要求，具有良好的分析特异性。
表20
| 交叉反应物 | 浓度 | 交叉反应检测结果 |
| T4 | 1000ng/mL | 0.9pg/mL |
| rT3 | 100ng/mL | 0.17pg/mL |
由以上检测结果可知，本实施例方法和试剂具有较高的灵敏度，较宽的线性范围，良好的稳定性。
实施例6：在同一样本中同时检测多种抗原
本实施例示采用本发明的方法在同一样本中同时检测多种抗原。实验过程基本与实施例2相同，区别在于，本实施例使用两种或更多种抗体，分别与不同的荧光试剂先结合，再与样本反应。根据不同荧光物质的波长，可以同时检测同一样品中的不同抗原，实现多种病症指标检测。
检测方法。将不同种类的生物素标记检测抗体试剂分别与不同波长的荧光标记链霉亲和素试剂反应，分别分离纯化，混合得到溶液Ⅰ；将与磁珠交联的捕获抗体试剂(种类对应于检测抗体)与血清样本混合反应，得到溶液Ⅱ；再将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合孵育反应，通过流式细胞仪对不同波长荧光信号进行检测，实现同一个血清样本中同时检测多个症状指标。
检测流程。以多种癌症标志物同时检测为例，同时检测肺癌样本中的CEA、Cyfra21-1、SCCA三种标志物。试剂组成如表21所示。其中，A试剂为磁珠交联抗体试剂，B试剂为生物素标记抗体试剂，C试剂为荧光标记链霉亲和素试剂。B试剂与C试剂的混合反应可以是交叉的，只要不同的B试剂标记不同的C试剂即可，表21只是举例说明。
表21
1.将三种B试剂分别与不同的C试剂混合反应，在37℃条件下避光孵育20分钟，标记为管Ⅰ、管Ⅱ、管Ⅲ。原则上C试剂量大于B试剂量，以保证所有B试剂被标记。
2.将三种A试剂加入待测样本中，37℃条件下孵育20分钟。标记为管Ⅳ。
3.将管Ⅰ、管Ⅱ、管Ⅲ中反应混合液加入管Ⅳ中，在37℃条件下避光孵育20分钟，加入PBST(PH 7.4，0.05％吐温20)缓冲液洗涤1次。加入1×PBS
(PH 7.4)重悬磁珠。
4.用流式细胞仪检测。一般采用3激光12通道配置，可测试不同波长的荧光。
作为示例，配置样品溶液，包含肺癌联检中的CEA、Cyfra21-1、SCCA三种标志物。
1)制备试剂A磁珠交联抗体试剂。采用MagCOOH羧基磁珠(苏州知益微球，货号20210623)，按实施例2所述制备流程，A1组偶联CEA单克隆抗体(上海领潮生物科技，货号L1C00202)，A2组偶联Cyfra21-1单克隆抗体(上海领潮生物科技，货号L1C00706)，A3组偶联SCCA单克隆抗体(上海领潮生物科技，货号L1C01401)，分别加入保存液，终浓度0.0625mg/mL。
置于2～8℃条件下存放。
2)制备试剂B生物素标记抗体试剂。分别对三种不同的抗体进行生物素标记，CEA单克隆检测抗体(上海领潮生物科技，货号L1C00205)，Cyfra21-1单克隆检测抗体(上海领潮生物科技，货号L1C00705)，SCCA单克隆检测抗体(上海领潮生物科技，货号L1C01402)，按实施例2所述标记流程，将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(上海生工生物工程有限公司，货号C100212-0250)标记在抗体上，终浓度6.24mg/L加入保存液于2～8℃条件下存放。
3)制备试剂C荧光标记链霉亲和素试剂。采用巯基化链霉亲和素(西安齐岳生物，货号Q-0094867)，按实施例2所述标记流程，分别将Alexa488马来酰亚胺(麦克林试剂，货号A849879)，CY3马来酰亚胺(麦克林试剂，货号A634179)，Alexa610马来酰亚胺(麦克林试剂，货号A849873)标记在链霉亲和素上，加入保存液，终浓度9mg/L。置于2～8℃条件下存放。
4)准备三份血清样本，其中两份肺癌患者血清样本JY1123、JY1317，一份健康人血清样本JY3215，均来源中南大学湘雅第三医院检验科。
5)取2)中制备的三种生物素标记抗体试剂各50μL，分别加入不同的荧光标记链霉亲和素试剂各20μL，在37℃条件下避光混合反应20分钟。按表21对应关系。标记为管Ⅰ、管Ⅱ、管Ⅲ。
6)将1)中制备的A1、A2、A3三种磁珠交联试剂各取10μL加入血清样本JY1123中，在37℃条件下孵育20分钟。标记为管Ⅳ。
7)将管Ⅰ、管Ⅱ、管Ⅲ中反应混合液加入管Ⅳ中，在37℃条件下避光孵育20分钟，加入PBST(PH 7.4，0.05％吐温20)缓冲液洗涤1次。加入1×PBS
(PH 7.4)重悬磁珠。
8)按5)～7)步骤同样的处理血清样本JY1317、JY3215。
9)采用流式细胞仪(型号BD LSRFortessaTM，FITC通道)测量结果，通过流式分析软件得出荧光强度数值，根据标准曲线计算各样品平均荧光强度，如表22、表23、表24所示。
表22
| 血清样本JY1123 | 实测浓度 |
| CEA | 16.38ng/mL |
| Cyfra21-1 | 9.63ng/mL |
| SCCA | 12.01ng/mL |
表23
| 血清样本JY1317 | 实测浓度 |
| CEA | 21.17ng/mL |
| Cyfra21-1 | 8.11ng/mL |
| SCCA | 4.69ng/mL |
表24
从表22、表23、表24的检测结果可以看出，使用两种或更多种抗体，分别与不同荧光试剂结合，根据不同荧光物质的波长，可以同时检测同一样品中的不同抗原，极大地提高了检测效率，且结果互不干扰。
实施例7：与化学发光法的信号稳定性比较
以雅培胰岛素检测试剂盒(化学发光)(雅培贸易(上海)有限公司，试剂目录号8K41)为例，对比化学发光法与本发明检测方法信号的稳定性。
按雅培胰岛素检测试剂盒说明书，对20mIU/L和160mIU/L两个浓度的胰岛素样本进行测定，在反应后2秒、1分钟、5分钟和2小时的时候记录测量结果。
按实施例2所述方法对相同的抗原样本进行测定，在反应后2秒、1分钟、5分钟和2小时的时候记录测量结果。
两种试剂盒的测量结果参见表25。
表25
从表25的结果可以看出，采用化学发光法检测时，只有在较短时间内测量得到的数值比较准确，1分钟之后就几乎检测不到信号。而本发明的方法采用的是较为稳定的荧光分子，反应后2小时仍然可以检测到明显荧光信号，且荧光强度与2秒时无显著差别。该结果表明，相比于化学发光法，本发明的检测方法稳定性好，对操作要求低，可在较长时间内读取结果，或多次读取，确保结果的准确性。
实施例8：与化学发光法的检测性能比较
以雅培胰岛素检测试剂盒(化学发光)(雅培贸易(上海)有限公司，试剂目录号8K41)为例，对比化学发光法与本发明检测方法的检测性能。
用实施例2方法制备的胰岛素试剂盒和雅培胰岛素检测试剂盒对80份临床血清样本(来源中南大学湘雅第三医院检验科，其中包含40例正常随机血清样本、40例糖尿病患者血清样本)同时进行检测。
检测操作流程严格按照雅培胰岛素检测试剂盒说明书及实施例2相关操作规范。
检测结果见图9。以本发明试剂盒测定的血清样本中胰岛素结果为横坐标，以雅培胰岛素检测试剂盒(化学发光)测定血清样本中胰岛素结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：Y＝0.9987X+1.8071，相关系数r2＝0.9849。经统计学处理结果表明，两个试剂盒测得的临床血样中胰岛素值相关性良好。
综合实施例7和实施例8的结果可以看出，本发明实施例2所示检测方法在具有与市场上可获得的、流行的化学发光法试剂相当的灵敏度的同时，信号的稳定性远远优于化学发光法，显示了优异的技术效果。本发明其它实施例所示的方法和试剂也与市场上流行的化学发光法试剂盒进行了比较，均具有相当的检测灵敏度，但显著延长的检测信号稳定性，且操作简单，显示了良好的市场应用前景。
以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
Claims (24)
1.一种检测抗原的方法，包括步骤：
(1)提供捕获抗体包被的固相基质、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的亲和素；
(2)将待测样品与所述捕获抗体包被的固相基质、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的亲和素相接触；
(3)分离所述固相基质，以获得与所述固相基质结合的复合物；和
(4)检测所述复合物的荧光强度；
其中，所述捕获抗体和所述检测抗体结合所述抗原的不同位点，以及所述复合物荧光强度指示所述抗原是否存在和/或所述抗原的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)中生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的亲和素先接触并反应，然后与待测样品相接触。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述固相基质包被有亲和素，所述捕获抗体为生物素标记的捕获抗体，所述生物素标记的捕获抗体通过与所述亲和素的结合连接于所述固相基质。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其中，同时检测两种或更多种抗原，使用两种或更多种捕获抗体和两种或更多种生物素标记的检测抗体，每种检测抗体通过与不同荧光分子标记的亲和素相接触而被标记荧光分子，每种所述不同荧光分子分别发射各自可区分的荧光。
5.一种检测抗原的方法，包括步骤：
(1)提供抗体包被的固相基质、生物素标记的抗原和荧光分子标记的亲和素；
(2)将待测样品与所述抗体包被的固相基质相接触，以获得复合物I；
(3)将步骤(2)的反应体系与所述生物素标记的抗原和所述荧光分子标记的亲和素相接触，以获得复合物II；和
(4)检测所述复合物II的荧光强度；
其中，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，以及所述复合物II的荧光强度指示所述抗原是否存在和/或所述抗原的量。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤(3)中的所述生物素标记的抗原和所述荧光标记的亲和素先接触并反应，然后与步骤(2)的反应体系相接触。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，同时检测两种或更多种抗原，使用两种或更多种抗体包被的固相基质和两种或更多种生物素标记的抗原，每种生物素标记的抗原通过与不同荧光分子标记的亲和素相接触而被标记荧光分子，每种所述不同荧光分子分别发射各自可区分的荧光。
8.一种检测抗原的方法，包括步骤：
(1)提供生物素标记的抗体、生物素标记的抗原、荧光分子标记的亲和素和亲和素包被的固相基质；
(2)将待测样品与所述生物素标记的抗体和荧光标记的亲和素相接触，以获得复合物A；
(3)将所述生物素标记的抗原与亲和素包被的固相基质相接触，以获得复合物B；
(4)将步骤(2)的反应体系与所述复合物B相接触，以获得复合物C；和
(5)检测所述复合物C的荧光强度；
其中，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，步骤(2)和步骤(3)的顺序可互换，以及所述复合物C的荧光强度指示所述抗原是否存在和/或所述抗原的量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，同时检测两种或更多种抗原，使用两种或更多种生物素标记的抗原和两种或更多种生物素标记的抗体，每种生物素标记的抗体通过与不同荧光分子标记的亲和素相接触而被标记荧光分子，每种所述不同荧光分子分别发射各自可区分的荧光。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其中，所述亲和素选自卵白亲和素(Avidin)、链霉亲和素(Streptavidin)、中性链亲和素(NeutrAvidinTM)及类亲和素，优选为链霉亲和素(Streptavidin)。
11.根据权利要求1-10任一所述的方法，其中，所述荧光分子选自香豆素类(CoumarinDyes)、荧光素类(Fluorescein Dyes)、罗丹明类(Rhodamine Dyes)、碳花青类(CyanineDyes)、新型染料Tide Flour(TF)或其组合，优选地，所述荧光分子为FAM、CY3、CY5、CY7、AF488或AF647。
12.根据权利要求1-11任一所述的方法，其中，所述固相基质选自磁珠和玻璃珠，优选地，所述固相基质为磁珠。
13.一种试剂盒，其包含捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的链霉亲和素，所述试剂盒用于根据权利要求1-4和权利要求10-12任一所述的方法来检测抗原。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其包含人胰岛素捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的人胰岛素检测抗体和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其包含两种或更多种捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的检测抗体和荧光分子标记的链霉亲和素。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其包含CEA捕获抗体包被的磁珠、Cyfra21-1捕获抗体包被的磁珠、SCCA捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的CEA检测抗体、生物素标记的Cyfra21-1检测抗体、生物素标记的SCCA检测抗体，以及Alexa488标记的链霉亲和素、CY3标记的链霉亲和素和Alexa610标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
17.根据权利要求13或15所述的试剂盒，其中所述磁珠包被有链霉亲和素，所述捕获抗体为生物素标记的捕获抗体，所述生物素标记的捕获抗体通过与所述亲和素的结合连接于所述磁珠，所述试剂盒用于根据权利要求3-4和权利要求10-12任一所述的方法来检测抗原。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其包含链霉亲和素包被的磁珠、生物素标记的细胞角蛋白捕获抗体、生物素标记的细胞角蛋白检测抗体和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
19.一种试剂盒，其包含抗体包被的磁珠、生物素标记的抗原和荧光分子标记的链霉亲和素，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，所述试剂盒用于根据权利要求5-7和权利要求10-12任一所述的方法来检测抗原。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其包含四碘甲状腺素抗体包被的磁珠、生物素标记的四碘甲状腺素和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
21.根据权利要求19所述的试剂盒，其包含两种或更多种抗体包被的磁珠、生物素标记的抗原和荧光分子标记的链霉亲和素。
22.一种试剂盒，其包含链霉亲和素包被的磁珠、生物素标记的抗原、生物素标记的抗体和荧光分子标记的链霉亲和素，所述生物素标记的抗原与待测抗原为同一抗原，所述试剂盒用于根据权利要求8-9和权利要求10-12任一所述的方法来检测抗原。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其包含链霉亲和素包被的磁珠、生物素标记的三碘甲状腺原氨酸、生物素标记的三碘甲状腺原氨酸抗体和Alexa488标记的链霉亲和素，任选地，包含洗涤缓冲液。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其包含两种或更多种生物素标记的抗原、生物素标记的抗体和荧光分子标记的链霉亲和素。
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