JP2001247580A - 活性化固相物質への分子の共有結合及び該物質を用いた装置 - Google Patents
活性化固相物質への分子の共有結合及び該物質を用いた装置Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 試験サンプル中の被検体の存在を検出するた
めの横流および他の試験法に適し、湿度が変動しても安
定で、かつ長期の貯蔵後でも遊離第１または第２アミン
あるいはスルフヒドリル基を含む分子と安定な共有結合
を作る共役体の提供。 【解決手段】 構造式（１）或いは（２）を有する共役
体であって、 Ｘが水酸基を有する固相物質；Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（Ｎ
Ｈ（ＣＨ２）ｍ）ｐで表され、ｎは２乃至８、ｍは２乃
至８、ｐは０乃至３であり、Ｒ６、Ｒ７がアルキル基、
環式アルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる
群より選択され、０乃至８の水酸基、ヒドロキシカルボ
ニル基またはアミノカルボニル基を含み、およびＱが遊
離第１または第２アミン基を含むいずれかの分子であり
またＬがスルフヒドリル基を含むいずれかの分子である
共役体。
めの横流および他の試験法に適し、湿度が変動しても安
定で、かつ長期の貯蔵後でも遊離第１または第２アミン
あるいはスルフヒドリル基を含む分子と安定な共有結合
を作る共役体の提供。 【解決手段】 構造式（１）或いは（２）を有する共役
体であって、 Ｘが水酸基を有する固相物質；Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（Ｎ
Ｈ（ＣＨ２）ｍ）ｐで表され、ｎは２乃至８、ｍは２乃
至８、ｐは０乃至３であり、Ｒ６、Ｒ７がアルキル基、
環式アルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる
群より選択され、０乃至８の水酸基、ヒドロキシカルボ
ニル基またはアミノカルボニル基を含み、およびＱが遊
離第１または第２アミン基を含むいずれかの分子であり
またＬがスルフヒドリル基を含むいずれかの分子である
共役体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、固相物質上への分
子の固定化、より詳細には誘導体化した固相物質および
該誘導体化した固相物質への分子の共有結合、ならびに
該物質を用いて作成した装置に関する。
子の固定化、より詳細には誘導体化した固相物質および
該誘導体化した固相物質への分子の共有結合、ならびに
該物質を用いて作成した装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】過去２０年間、多様な病気の治療への薬
の使用可能度、病原体に関連した広範な化合物の同定、
および環境及び産業廃液中の少量な汚染物質の検出の必
要性、が高まっている。それゆえ、臨床および法医学、
環境試験、食品品質保証、並びに医薬品使用試験および
関連分野等の領域において、試験サンプル中に被検体が
存在するかどうかを検出するための分析法が必要とされ
ており、使用されている。
の使用可能度、病原体に関連した広範な化合物の同定、
および環境及び産業廃液中の少量な汚染物質の検出の必
要性、が高まっている。それゆえ、臨床および法医学、
環境試験、食品品質保証、並びに医薬品使用試験および
関連分野等の領域において、試験サンプル中に被検体が
存在するかどうかを検出するための分析法が必要とされ
ており、使用されている。
【０００３】様々な生物学的サンプル（例えば、尿、血
清、血漿、血液、唾液）および環境サンプル（例えば、
天然水および工場廃水）を用いて生理学的および病理学
的状態（例えば、妊娠、ガン、内分泌疾患、感染症）を
日常的に同定しまたは監視するための様々な診断検査が
開発されている。こうした診断検査法の多くは、特定の
結合対の間での非常に特異的な相互作用に基づいてい
る。こうした結合対の例には、抗原／抗体、ハプテン／
抗体、レクチン／炭水化物、アポタンパク質／コファク
ター、およびビオチン／ストレプトアビジンが含まれ
る。更に、こうした検査法の多くは、ラテックスビー
ズ、ガラス繊維、ガラスビーズ、帯状セルロース、また
はニトロセルロース膜といった可動または固定の固相物
質に付着した結合対からなる１以上の部材を用いた装置
（例えば、横流試験片、貫流試験）を含む。抗体、抗
原、ビオチンまたはストレプトアビジンといった分子を
固相物質へ付着するには、通常受動的に吸着したりまた
は共有結合したりすることが関与している。
清、血漿、血液、唾液）および環境サンプル（例えば、
天然水および工場廃水）を用いて生理学的および病理学
的状態（例えば、妊娠、ガン、内分泌疾患、感染症）を
日常的に同定しまたは監視するための様々な診断検査が
開発されている。こうした診断検査法の多くは、特定の
結合対の間での非常に特異的な相互作用に基づいてい
る。こうした結合対の例には、抗原／抗体、ハプテン／
抗体、レクチン／炭水化物、アポタンパク質／コファク
ター、およびビオチン／ストレプトアビジンが含まれ
る。更に、こうした検査法の多くは、ラテックスビー
ズ、ガラス繊維、ガラスビーズ、帯状セルロース、また
はニトロセルロース膜といった可動または固定の固相物
質に付着した結合対からなる１以上の部材を用いた装置
（例えば、横流試験片、貫流試験）を含む。抗体、抗
原、ビオチンまたはストレプトアビジンといった分子を
固相物質へ付着するには、通常受動的に吸着したりまた
は共有結合したりすることが関与している。
【０００４】分子（例えば、ペプチド類やタンパク質
類）を微多孔質固相物質（例えば、横流や貫流の装置に
おけるニトロセルロース）に付着させる現行の方法論に
は、しばしば分子を固相物質へ受動的に吸着させること
が含まれている。付着した分子と固相物質との間の相互
作用は、ファンデルワールス力に基づき、または水素結
合により、本質的には主として疎水性である。受動的吸
着にはいくつかの制限がある。タンパク質相互作用特性
を一貫して保つためには、ニトロセルロース膜のような
固相物質は、水和状態を保ち、温度湿度が制御された安
定した環境下で保管しなければならない。更に、薬剤、
ホルモンおよび小ペプチド類（ローリツェンLauritzen
ら、J. Immunol. Methods、１３１（２）：２５７−
２６７（１９９０）参照）といった小さな分子（≦１０
００ダルトン）または核酸ハイブリダイゼーションおよ
び回文的配列の折りたたみにつながるような構造の核酸
ポリマーを形態上固定化する場合には、受動的吸着は効
果的でない。こうした受動的吸着上の制限のため、小さ
な分子（≦１０００ダルトン）、核酸ポリマーおよびい
くつかのタンパク質を、固相物質に共有結合をし、安定
性を高め、回文的配列の折りたたみを回避することが好
ましい。また、横流処理に適した流動特性を有する微多
孔質固相物質に、前記の分子を結合することが好まし
い。
類）を微多孔質固相物質（例えば、横流や貫流の装置に
おけるニトロセルロース）に付着させる現行の方法論に
は、しばしば分子を固相物質へ受動的に吸着させること
が含まれている。付着した分子と固相物質との間の相互
作用は、ファンデルワールス力に基づき、または水素結
合により、本質的には主として疎水性である。受動的吸
着にはいくつかの制限がある。タンパク質相互作用特性
を一貫して保つためには、ニトロセルロース膜のような
固相物質は、水和状態を保ち、温度湿度が制御された安
定した環境下で保管しなければならない。更に、薬剤、
ホルモンおよび小ペプチド類（ローリツェンLauritzen
ら、J. Immunol. Methods、１３１（２）：２５７−
２６７（１９９０）参照）といった小さな分子（≦１０
００ダルトン）または核酸ハイブリダイゼーションおよ
び回文的配列の折りたたみにつながるような構造の核酸
ポリマーを形態上固定化する場合には、受動的吸着は効
果的でない。こうした受動的吸着上の制限のため、小さ
な分子（≦１０００ダルトン）、核酸ポリマーおよびい
くつかのタンパク質を、固相物質に共有結合をし、安定
性を高め、回文的配列の折りたたみを回避することが好
ましい。また、横流処理に適した流動特性を有する微多
孔質固相物質に、前記の分子を結合することが好まし
い。
【０００５】米国特許第３，８５７，９３１号は、ペプ
チド類およびタンパク質類が表面にカルボキシル基を持
ったラテックスビーズに化学結合できることを示してい
る。カルボジイミドはラテックス上のカルボキシル基と
直接反応し、過渡的に活性化したアシル・イソウレア中
間体を作り、次いでこれが分子上のアミノ基と反応し、
安定したアミド結合を形成する。このアミド結合は、ペ
プチドまたはタンパク質をラテックス粒子の表面に共役
する。この方法の短所は、タンパク質分子上にも存在す
るカルボニル基とカルボジイミドとの望ましくなくかつ
無差別な反応を制御することができない点にある。それ
ゆえ、タンパク質上のカルボジイミド活性化カルボキシ
ル基は、タンパク質上のアミノ基と反応し、タンパク質
内またはタンパク質間架橋を起こすおそれがある。タン
パク質またはペプチドが、比較的多量のアスパラギン酸
およびグルタミン酸を含んでいる場合特に、架橋が発生
する。こうしたアミノ酸は遊離カルボキシル基を含んで
いるからである。架橋は、後に装置の感度に影響するよ
うな、タンパク質分子の形態上または構造上の変形を引
き起こし得る。
チド類およびタンパク質類が表面にカルボキシル基を持
ったラテックスビーズに化学結合できることを示してい
る。カルボジイミドはラテックス上のカルボキシル基と
直接反応し、過渡的に活性化したアシル・イソウレア中
間体を作り、次いでこれが分子上のアミノ基と反応し、
安定したアミド結合を形成する。このアミド結合は、ペ
プチドまたはタンパク質をラテックス粒子の表面に共役
する。この方法の短所は、タンパク質分子上にも存在す
るカルボニル基とカルボジイミドとの望ましくなくかつ
無差別な反応を制御することができない点にある。それ
ゆえ、タンパク質上のカルボジイミド活性化カルボキシ
ル基は、タンパク質上のアミノ基と反応し、タンパク質
内またはタンパク質間架橋を起こすおそれがある。タン
パク質またはペプチドが、比較的多量のアスパラギン酸
およびグルタミン酸を含んでいる場合特に、架橋が発生
する。こうしたアミノ酸は遊離カルボキシル基を含んで
いるからである。架橋は、後に装置の感度に影響するよ
うな、タンパク質分子の形態上または構造上の変形を引
き起こし得る。
【０００６】米国特許第４，０４５，３８４号は、カル
ボキシル化ラテックスが、水溶性カルボジイミドおよび
N-ヒドロキシベンゾトリアゾールのような可水溶化N-ヒ
ドロキシ化合物と反応し、活性エステル・ラテックスを
作ることができるということを記載している。この活性
化エステル・ラテックスがタンパク質のアミノ基と反応
し、アミド結合を介しての３段階反応により、タンパク
質をラテックスビーズに共有結合し、タンパク質の架橋
副反応をなくす。しかし、この方法は横流処理には不適
当である。
ボキシル化ラテックスが、水溶性カルボジイミドおよび
N-ヒドロキシベンゾトリアゾールのような可水溶化N-ヒ
ドロキシ化合物と反応し、活性エステル・ラテックスを
作ることができるということを記載している。この活性
化エステル・ラテックスがタンパク質のアミノ基と反応
し、アミド結合を介しての３段階反応により、タンパク
質をラテックスビーズに共有結合し、タンパク質の架橋
副反応をなくす。しかし、この方法は横流処理には不適
当である。
【０００７】アミンを有する固相物質を、長さを延した
ヘテロ二官能性性架橋試薬を用いて化学的に誘導体化
し、チオールを有するペプチド類またはタンパク質類と
共有結合するような活性化固相物質を作ることができ
る。Ｂｉｅｎｉａｒｚらの米国特許第５，００２，８８
３号および第５，０６３，１０９号を参照のこと。この
ような固相物質には、第1級、第2級または第3級アミン
基を含むポリマー類、ガラス類および天然物質が含まれ
る。また、ニトリル基を持つ固相物質は還元されてアミ
ン基となり、アミンを有する固相物質を生成する。しか
し、アミンを有する固相物質は、横流処理には不適当で
ある。
ヘテロ二官能性性架橋試薬を用いて化学的に誘導体化
し、チオールを有するペプチド類またはタンパク質類と
共有結合するような活性化固相物質を作ることができ
る。Ｂｉｅｎｉａｒｚらの米国特許第５，００２，８８
３号および第５，０６３，１０９号を参照のこと。この
ような固相物質には、第1級、第2級または第3級アミン
基を含むポリマー類、ガラス類および天然物質が含まれ
る。また、ニトリル基を持つ固相物質は還元されてアミ
ン基となり、アミンを有する固相物質を生成する。しか
し、アミンを有する固相物質は、横流処理には不適当で
ある。
【０００８】アミノ基を含む分子を共有結合させる目的
で、活性化微多孔膜が市販されている。例えば、ウルト
ラバインドTM（Ｕｌｔｒａ ＢｉｎｄTM）膜（ポールゲ
ルマン・ラボラトリー、ミシガン州アン・アーバー）
は、アミノ基を含んだ分子との共有結合を形成可能な高
濃度のアルデヒド活性部位を持つポリスルホン／ポリア
クロレイン・タイプの膜である。Ｐｅｍａｗａｎｓａら
のバイオ・テクニックス９（３）：３５２−３５５およ
びＰｅｍａｗａｎｓａらの米国特許第４，８２４，８７
０号、第４，９６１，８５２号、第５，１６０，６２６
号を参照のこと。また、Ｇｓｅｌｌらの米国特許第４，
８８６，８３６号、ＭａｒｌｏｗらのＪ．Ｉｍｍｕｎ
ｏ， Ｍｅｔｈｏｄｓ１０１：１３３−１３９（１９８
７）およびＣａｎａｓらのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１１：１７９−１８２（１９
９３）において論じられているように、活性化ナイロン
（バイオダインTM（ＢｉｏｄｙｎｅTM）およびイミュノ
ダインTM（ＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅTM）、ポールコーポレ
ーション、ニューヨーク州グレンコーブ）および活性化
ポリビニリデン・ジフルオライド（イモビロンTM（Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｏｎTM）、ミリポア、マサチューセッツ州ベ
ッドフォード）もタンパク質の共有結合に使用可能であ
る。前述した膜は、ブロット処理には適しているが、流
れ特性が悪く、横流処理には最小限しか用いられない。
ニトロセルロース膜は、横流処理には一般的により好適
であり、各種の孔径のものが市販されている。しかしな
がら、非処理状態において、ニトロセルロースまたはガ
ラス繊維のような、液体浸透性の微多孔質固相物質は、
アミノ基を含む分子との共有結合をさせるのに必要な有
機官能性を欠く。
で、活性化微多孔膜が市販されている。例えば、ウルト
ラバインドTM（Ｕｌｔｒａ ＢｉｎｄTM）膜（ポールゲ
ルマン・ラボラトリー、ミシガン州アン・アーバー）
は、アミノ基を含んだ分子との共有結合を形成可能な高
濃度のアルデヒド活性部位を持つポリスルホン／ポリア
クロレイン・タイプの膜である。Ｐｅｍａｗａｎｓａら
のバイオ・テクニックス９（３）：３５２−３５５およ
びＰｅｍａｗａｎｓａらの米国特許第４，８２４，８７
０号、第４，９６１，８５２号、第５，１６０，６２６
号を参照のこと。また、Ｇｓｅｌｌらの米国特許第４，
８８６，８３６号、ＭａｒｌｏｗらのＪ．Ｉｍｍｕｎ
ｏ， Ｍｅｔｈｏｄｓ１０１：１３３−１３９（１９８
７）およびＣａｎａｓらのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１１：１７９−１８２（１９
９３）において論じられているように、活性化ナイロン
（バイオダインTM（ＢｉｏｄｙｎｅTM）およびイミュノ
ダインTM（ＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅTM）、ポールコーポレ
ーション、ニューヨーク州グレンコーブ）および活性化
ポリビニリデン・ジフルオライド（イモビロンTM（Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｏｎTM）、ミリポア、マサチューセッツ州ベ
ッドフォード）もタンパク質の共有結合に使用可能であ
る。前述した膜は、ブロット処理には適しているが、流
れ特性が悪く、横流処理には最小限しか用いられない。
ニトロセルロース膜は、横流処理には一般的により好適
であり、各種の孔径のものが市販されている。しかしな
がら、非処理状態において、ニトロセルロースまたはガ
ラス繊維のような、液体浸透性の微多孔質固相物質は、
アミノ基を含む分子との共有結合をさせるのに必要な有
機官能性を欠く。
【０００９】活性化したニトロセルロースにペプチド類
およびタンパク質類を共有結合させる方法については、
科学文献において報告がされてきた。例えば、ジアミノ
アルケン隔膜を通してニトロセルロースにペプチド類と
タンパク質類を共有結合させる方法が、免疫化学的用途
のために開発された。Ｍａｓｓｏｎらによる電気泳動
（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）１４（９）：８６
０−８６５（１９９３）を参照のこと。また、ジビニル
スルホン、エチレンジアミン隔壁、およびグルタルアル
デヒドが、活性化ニトロセルロースを製造するのに用い
られている。アミノ基と遊離アルデヒド基との反応によ
り、ペプチド類がこの活性化ニトロセルロースに付着
し、非還元型シッフ塩基結合を形成する。Ｌａｕｒｉｔ
ｚｅｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ１３１
（２）：２５７−２６７（１９９０）および電気泳動１
４（９）：８５２−８５９（１９９３）参照のこと。
およびタンパク質類を共有結合させる方法については、
科学文献において報告がされてきた。例えば、ジアミノ
アルケン隔膜を通してニトロセルロースにペプチド類と
タンパク質類を共有結合させる方法が、免疫化学的用途
のために開発された。Ｍａｓｓｏｎらによる電気泳動
（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）１４（９）：８６
０−８６５（１９９３）を参照のこと。また、ジビニル
スルホン、エチレンジアミン隔壁、およびグルタルアル
デヒドが、活性化ニトロセルロースを製造するのに用い
られている。アミノ基と遊離アルデヒド基との反応によ
り、ペプチド類がこの活性化ニトロセルロースに付着
し、非還元型シッフ塩基結合を形成する。Ｌａｕｒｉｔ
ｚｅｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ１３１
（２）：２５７−２６７（１９９０）および電気泳動１
４（９）：８５２−８５９（１９９３）参照のこと。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、試験
サンプル中の被検体の存在を検出するための横流および
他の試験法に適し、湿度が変動しても安定で、かつ長期
の貯蔵後でも遊離第１または第２アミンあるいはスルフ
ヒドリル基を含む分子と安定な共有結合を作ることので
きる、微多孔質固相物質を開発することである。本発明
は、構造式１に示す化学的に誘導体化した固相物質に関
する。
サンプル中の被検体の存在を検出するための横流および
他の試験法に適し、湿度が変動しても安定で、かつ長期
の貯蔵後でも遊離第１または第２アミンあるいはスルフ
ヒドリル基を含む分子と安定な共有結合を作ることので
きる、微多孔質固相物質を開発することである。本発明
は、構造式１に示す化学的に誘導体化した固相物質に関
する。
【化９】 構造式１において、Ｘは水酸基を有する固相物質（例え
ば、ニトロセルロース、セルロース、ガラス繊維および
多孔質ガラスビーズ）であり、Ｒ５は（ＣＨ２） ｎ（Ｎ
Ｈ（ＣＨ２）ｍ）ｐで、ｎが２乃至８、ｍが２乃至８お
よびｐが０乃至３である。Ｒ６は、アルキル基、環式ア
ルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる群より
選択され、０乃至８個の水酸基、ヒドロキシカルボニル
基またはアミノカルボニル基を含む。Ｒ６は、無水コハ
ク酸、無水グルタル酸、エチレングリコールービス（コ
ハク酸スクシンイミジル）、またはエチレングリコール
ービス（コハク酸スルホサクシンイミジル）といった架
橋剤から得ることができる。ＹおよびＺは、それぞれ独
立に水素、アルキル基、アルキルカルボニル基、芳香族
カルボニル基、またはヘテロ環式カルボニル基である
か、あるいはＮ、ＹおよびＺかつ一緒になって、
ば、ニトロセルロース、セルロース、ガラス繊維および
多孔質ガラスビーズ）であり、Ｒ５は（ＣＨ２） ｎ（Ｎ
Ｈ（ＣＨ２）ｍ）ｐで、ｎが２乃至８、ｍが２乃至８お
よびｐが０乃至３である。Ｒ６は、アルキル基、環式ア
ルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる群より
選択され、０乃至８個の水酸基、ヒドロキシカルボニル
基またはアミノカルボニル基を含む。Ｒ６は、無水コハ
ク酸、無水グルタル酸、エチレングリコールービス（コ
ハク酸スクシンイミジル）、またはエチレングリコール
ービス（コハク酸スルホサクシンイミジル）といった架
橋剤から得ることができる。ＹおよびＺは、それぞれ独
立に水素、アルキル基、アルキルカルボニル基、芳香族
カルボニル基、またはヘテロ環式カルボニル基である
か、あるいはＮ、ＹおよびＺかつ一緒になって、
【化１０】 で表される化合物で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水
素、アルキル基、カルボキシル基、スルホン基、芳香族
基またはヘテロ環式基からなる群より選択される。
素、アルキル基、カルボキシル基、スルホン基、芳香族
基またはヘテロ環式基からなる群より選択される。
【００１１】また、本発明は構造式２に示す化学的に誘
導体化した固相物質にも関する。
導体化した固相物質にも関する。
【化１１】 構造式２において、ＸおよびＲ５は、前述の構造式１に
対して定義した通りである。Ｒ７は、アルキル基、環式
アルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる群よ
り選択され、０乃至８個の水酸基、ヒドロカルボニル基
またはアミノカルボニル基を含む。Ｒ７は、何れの二官
能性架橋試薬が使われるかによって異なる。Ｊは、
対して定義した通りである。Ｒ７は、アルキル基、環式
アルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる群よ
り選択され、０乃至８個の水酸基、ヒドロカルボニル基
またはアミノカルボニル基を含む。Ｒ７は、何れの二官
能性架橋試薬が使われるかによって異なる。Ｊは、
【化１２】 からなる群より選択される。構造式２に代表されるタイ
プの構造を産生できる二官能性の架橋試薬の例には、ス
クシンイミジル・６−マレイミジルヘキサノアート、ス
クシンイミジル・６−（６−（（（ヨードアセチル）ア
ミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノエート、スクシ
ンイミジル・６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサ
ノアート、スクシンイミジル・４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサンー１−カルボキシレート、Ｎ−γ
―マレイミドブチリルオキシースクシンイミド・エステ
ル、およびＮ−γ―マレイミドブチリルオキシースルホ
スクシンイミド・エステルを含む。
プの構造を産生できる二官能性の架橋試薬の例には、ス
クシンイミジル・６−マレイミジルヘキサノアート、ス
クシンイミジル・６−（６−（（（ヨードアセチル）ア
ミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノエート、スクシ
ンイミジル・６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサ
ノアート、スクシンイミジル・４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサンー１−カルボキシレート、Ｎ−γ
―マレイミドブチリルオキシースクシンイミド・エステ
ル、およびＮ−γ―マレイミドブチリルオキシースルホ
スクシンイミド・エステルを含む。
【００１２】本発明は、また構造式３の共役体にも関す
る。
る。
【化１３】 構造式３において、Ｘ、Ｒ５およびＲ６は、前述の構造
式１に対して定義した通りである。Ｑは、遊離第１また
は第２アミン基を含む任意の分子、あるいは遊離第１ま
たは第２アミン基が共有結合している任意の分子をそれ
自体に含む任意の分子のいずれかである。
式１に対して定義した通りである。Ｑは、遊離第１また
は第２アミン基を含む任意の分子、あるいは遊離第１ま
たは第２アミン基が共有結合している任意の分子をそれ
自体に含む任意の分子のいずれかである。
【００１３】本発明は、また構造式４の共役体にも関す
る。
る。
【化１４】 構造式４において、Ｘ、Ｒ５およびＲ７は前述の構造式
２に対して定義した通りである。Ｌは、遊離スルフヒド
リル基を含む任意の分子、あるいは遊離スルフヒドリル
基が共有結合した任意の分子をそれ自体に含む任意の分
子のいずれかである。
２に対して定義した通りである。Ｌは、遊離スルフヒド
リル基を含む任意の分子、あるいは遊離スルフヒドリル
基が共有結合した任意の分子をそれ自体に含む任意の分
子のいずれかである。
【００１４】本発明は、また構造式３および／または４
の共役体を含む装置も提供する。この装置のより詳細な
例としては、横流装置を用いて生物的サンプル中の被検
体を定量または半定量するために作られたものであり、
該被検体には固定化した結合配位子に結合するα−ドメ
インと標識結合配位子に結合するβ−ドメインの二つの
結合ドメインを含まれていた。該装置は、標識結合配位
子および対照結合配位子を含むパッドを備えていた。該
標識結合配位子には、視覚的、分光光度的、比色定量的
または蛍光定量な特性を持った標識信号生成系を含ませ
た。該標識結合配位子は、被検体のβ−ドメインに特異
的な結合配位子をその表面に固定化していた。該対照結
合配位子は、標識結合配位子と異なったスペクトル領域
において対照をなす視覚的、分光光度的、比色定量的ま
たは蛍光定量的な特性を持った対照信号生成系を備え
た。該対照結合配位子は、固定結合配位子に特異的に結
合する分子ドメインをその表面に固定化していた。該装
置は、また該パッドおよび該サンプルと液移送接触した
多孔質膜も含み、それによって標識結合配位子および対
照結合配位子は毛管現象により該多孔質膜を通って拡散
する。該装置は、また該多孔質膜上に被検体試験帯も含
んでいた。該試験帯は、一定の限定数の固定化したα−
ドメインに特異的な結合部位を含み、該限定数のα−ド
メイン固有の結合部位を、構造式３および／または４の
共役体との反応により、多孔質膜上に固定化した。
の共役体を含む装置も提供する。この装置のより詳細な
例としては、横流装置を用いて生物的サンプル中の被検
体を定量または半定量するために作られたものであり、
該被検体には固定化した結合配位子に結合するα−ドメ
インと標識結合配位子に結合するβ−ドメインの二つの
結合ドメインを含まれていた。該装置は、標識結合配位
子および対照結合配位子を含むパッドを備えていた。該
標識結合配位子には、視覚的、分光光度的、比色定量的
または蛍光定量な特性を持った標識信号生成系を含ませ
た。該標識結合配位子は、被検体のβ−ドメインに特異
的な結合配位子をその表面に固定化していた。該対照結
合配位子は、標識結合配位子と異なったスペクトル領域
において対照をなす視覚的、分光光度的、比色定量的ま
たは蛍光定量的な特性を持った対照信号生成系を備え
た。該対照結合配位子は、固定結合配位子に特異的に結
合する分子ドメインをその表面に固定化していた。該装
置は、また該パッドおよび該サンプルと液移送接触した
多孔質膜も含み、それによって標識結合配位子および対
照結合配位子は毛管現象により該多孔質膜を通って拡散
する。該装置は、また該多孔質膜上に被検体試験帯も含
んでいた。該試験帯は、一定の限定数の固定化したα−
ドメインに特異的な結合部位を含み、該限定数のα−ド
メイン固有の結合部位を、構造式３および／または４の
共役体との反応により、多孔質膜上に固定化した。
【００１５】本発明のこれらおよび他の特徴は、詳細な
説明において明確にする。
説明において明確にする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】Ｉ．固相物質 本発明は、遊離第１若しくは第２アミン基またはスルフ
ヒドリル基を含む任意の分子、あるいはアミン基または
スルフヒドリル基が共有結合している任意の分子の固相
物質への共有結合に使用可能な新規の結合基を持ち誘導
体化した固相物質に関する。該固相物質は、試験サンプ
ル中に被検体が存在することの検出法に適した、ニトロ
セルロース、セルロースおよびガラスを含む、水酸基を
持った固相物質のいずれでもよい。本発明は、こうした
物質を持った装置にも関する。
ヒドリル基を含む任意の分子、あるいはアミン基または
スルフヒドリル基が共有結合している任意の分子の固相
物質への共有結合に使用可能な新規の結合基を持ち誘導
体化した固相物質に関する。該固相物質は、試験サンプ
ル中に被検体が存在することの検出法に適した、ニトロ
セルロース、セルロースおよびガラスを含む、水酸基を
持った固相物質のいずれでもよい。本発明は、こうした
物質を持った装置にも関する。
【００１７】実施例は、微多孔質固相物質を膜、帯およ
びパッドの形態で通常取り扱うが、繊維状、ビーズ、球
体および同様のものを含み、これに限定されない、他の
固相構造を使うこともできる。例えば、水酸基を含む固
相物質を、繊維状、球状またはビーズ状で入手可能なら
ば、該繊維、球またはビーズを実施例１、２および３の
記載に従って誘導体化することができ、抗体のようなタ
ンパク質を該誘導体化した固相物質に結合させることが
できる。結合した物質を、次いで縫いまたは編み、ある
いは布、マットまたは折りこみ若しくは非折りこみ濾材
といった固定支持材に取り付けまたは組み込むことがで
きる。また、実施例６および７で説明する通り、固相物
質をポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）または同様の固定支持材
上に積層してもよい。
びパッドの形態で通常取り扱うが、繊維状、ビーズ、球
体および同様のものを含み、これに限定されない、他の
固相構造を使うこともできる。例えば、水酸基を含む固
相物質を、繊維状、球状またはビーズ状で入手可能なら
ば、該繊維、球またはビーズを実施例１、２および３の
記載に従って誘導体化することができ、抗体のようなタ
ンパク質を該誘導体化した固相物質に結合させることが
できる。結合した物質を、次いで縫いまたは編み、ある
いは布、マットまたは折りこみ若しくは非折りこみ濾材
といった固定支持材に取り付けまたは組み込むことがで
きる。また、実施例６および７で説明する通り、固相物
質をポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）または同様の固定支持材
上に積層してもよい。
【００１８】Ａ．定義 本発明において「アミノシラン」とは、有機シラン、ガ
ンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｈ２ＮＣＨ
２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３）を指す。他
の有機シランまたはアミノシランの替わりに用いてもよ
い架橋剤の例には、ガンマ−アミノプロピルトリメトキ
シシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）
３）；Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプ
ロピルトリメトキシシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ
Ｈ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）；およびトリア
ミノ官能性シラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ
２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）を含
む。文献（米国特許第３，５１９，５３８号、第４，１
０２，７４６号および第４，１６９，０１４号）におい
て報告されている通り、多孔質ガラスまたはセラミック
ビーズのような珪酸含有の物質に、通常酵素であるタン
パク質を結合または付着させるのに、有機シラン系架橋
剤を用いることができる。また、前述の有機官能性シラ
ンのニトロセルロースへの付着は、ユニオンカーバイド
によるユニオンカーバイド（登録商標）有機官能性シラ
ン製品と応用例、特殊化学薬品、有機シリコン製品情報
（１９９３）において報告されている。
ンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｈ２ＮＣＨ
２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３）を指す。他
の有機シランまたはアミノシランの替わりに用いてもよ
い架橋剤の例には、ガンマ−アミノプロピルトリメトキ
シシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）
３）；Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプ
ロピルトリメトキシシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ
Ｈ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）；およびトリア
ミノ官能性シラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ
２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）を含
む。文献（米国特許第３，５１９，５３８号、第４，１
０２，７４６号および第４，１６９，０１４号）におい
て報告されている通り、多孔質ガラスまたはセラミック
ビーズのような珪酸含有の物質に、通常酵素であるタン
パク質を結合または付着させるのに、有機シラン系架橋
剤を用いることができる。また、前述の有機官能性シラ
ンのニトロセルロースへの付着は、ユニオンカーバイド
によるユニオンカーバイド（登録商標）有機官能性シラ
ン製品と応用例、特殊化学薬品、有機シリコン製品情報
（１９９３）において報告されている。
【００１９】「二官能性架橋試薬」とは二つの反応基を
持つ試薬を指し、該試薬はそれにより二つの目標基を共
有結合的に架橋する能力を有する。架橋剤の反応基は、
スクシンイミジル・エステル、マレイミドおよびヨード
アセトアミドのようなハロアセトアミドを含んだ官能基
類に典型的には属する。
持つ試薬を指し、該試薬はそれにより二つの目標基を共
有結合的に架橋する能力を有する。架橋剤の反応基は、
スクシンイミジル・エステル、マレイミドおよびヨード
アセトアミドのようなハロアセトアミドを含んだ官能基
類に典型的には属する。
【００２０】ホモ型二官能性架橋試薬は、同一の反応基
を持ち、二つのチオール基または二つのアミン基といっ
た標的基との結合に主として用いる。
を持ち、二つのチオール基または二つのアミン基といっ
た標的基との結合に主として用いる。
【００２１】ヘテロ型二官能性架橋試薬は、異なった化
学的性質を持つ複数の反応基を含み、それゆえ異なった
官能基の間に架橋を作ることができる。
学的性質を持つ複数の反応基を含み、それゆえ異なった
官能基の間に架橋を作ることができる。
【００２２】本明細書において、「ＤＩＣＤ」とは、
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドを指す。
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドを指す。
【００２３】「ＤＭＦ」とは、ジメチルホルムアミドで
ある。
ある。
【００２４】「ＥＤＡＣ」とは、１−エチルー３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、（Ｃ
Ｈ３）２―Ｎ―ＣＨ２―ＣＨ２―ＣＨ２―Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−
ＣＨ２―ＣＨ３を指す。
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、（Ｃ
Ｈ３）２―Ｎ―ＣＨ２―ＣＨ２―ＣＨ２―Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−
ＣＨ２―ＣＨ３を指す。
【００２５】「ＨＢＴ」とは、下記に示す１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾールを指す。
シベンゾトリアゾールを指す。
【化１５】 これは、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールとしても知
られている。
られている。
【００２６】「脱離基」とは、置換分子（例えば抗体上
のα−またはε−アミノ基）により化学結合を離脱し
て、より安定な新しい化学結合を作る分子（例えば、Ｎ
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールの置換誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキルヒド
ロキシルアミン、１−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドおよびＮ−ヒドロキシフタルイミ
ド）を指す。
のα−またはε−アミノ基）により化学結合を離脱し
て、より安定な新しい化学結合を作る分子（例えば、Ｎ
−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールの置換誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキルヒド
ロキシルアミン、１−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドおよびＮ−ヒドロキシフタルイミ
ド）を指す。
【００２７】「水溶性カルボジイミド」とは、次の構造
式で表されるものを指し、
式で表されるものを指し、
【化１６】 水に対して１ｍｇ／ｍｌより大きな溶解度を持ち、Ｒお
よびＲ’は同じでも異なってもよく、環に５乃至６個の
炭素原子を持った環式アルキル基；２乃至１２の炭素原
子を持ったアルキル基（例えば、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、第２ブチル、イソブチ
ル、第３ブチル、アミル、ヘキシル、ヘプチル、オクチ
ル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシル）；モ
ノアリール置換下級アルキルラジカル（例えば、ベンジ
ル、α−およびβ−フェニルエチル）；モノアリールラ
ジカル（例えば、フェニル、モルフォリノ、ピペリジ
ル）；モルフォリニル置換下級アルキルラジカル（例え
ば、エチルモルフォリニル）；ピペリジル置換下級アル
キルラジカル（例えばエチルピペリジル）；下級ジアル
キルアミノ；下級アルキルラジカル；ピペリジル置換下
級アルキルラジカル（例えば、α、βおよびλメチルま
たはエチルピリジル）；酸付加塩；および第４級アミン
よりなる群から選択される。
よびＲ’は同じでも異なってもよく、環に５乃至６個の
炭素原子を持った環式アルキル基；２乃至１２の炭素原
子を持ったアルキル基（例えば、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、第２ブチル、イソブチ
ル、第３ブチル、アミル、ヘキシル、ヘプチル、オクチ
ル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシル）；モ
ノアリール置換下級アルキルラジカル（例えば、ベンジ
ル、α−およびβ−フェニルエチル）；モノアリールラ
ジカル（例えば、フェニル、モルフォリノ、ピペリジ
ル）；モルフォリニル置換下級アルキルラジカル（例え
ば、エチルモルフォリニル）；ピペリジル置換下級アル
キルラジカル（例えばエチルピペリジル）；下級ジアル
キルアミノ；下級アルキルラジカル；ピペリジル置換下
級アルキルラジカル（例えば、α、βおよびλメチルま
たはエチルピリジル）；酸付加塩；および第４級アミン
よりなる群から選択される。
【００２８】Ｂ．考察 本発明の方法の実施態様の一つは、中間有機シラン架橋
または結合剤を直接固相物質に共有的に結合することに
より、液体透過性微多孔質固相物質に脂肪族アミンの官
能性を付与することに関する。有用な有機シランの例に
は、アミノシラン、ガンマ−アミノプロピルトリメトキ
シシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）
３）；Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプ
ロピルトリメトキシシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ
Ｈ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）；およびトリア
ミノ官能性シラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ
２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）を含む
が、これに限定されない。脂肪族アミンの官能性を付与
するには、該固相物質を水に約５乃至１５％の有機シラ
ンを含んだｐＨ約３．０乃至３．５の溶液中に、温度を
室温（２０乃至３０℃）で、約２乃至４時間という、結
合を形成するのに十分な時間浸漬することにより行うこ
とができる。該固相物質を、次いで有機シラン溶液より
取り出し、例えば０．０１％のモノラウリン酸ポリオキ
シエチレンソルビタン（ツィーン２０、シグマケミカ
ル、ミズーリ州セントルイス）を含んだ１０ｍＭのリン
酸ナトリウム緩衝液をｐＨ８．０乃至９．０にしたもの
で２度洗浄する。
または結合剤を直接固相物質に共有的に結合することに
より、液体透過性微多孔質固相物質に脂肪族アミンの官
能性を付与することに関する。有用な有機シランの例に
は、アミノシラン、ガンマ−アミノプロピルトリメトキ
シシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）
３）；Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプ
ロピルトリメトキシシラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ
Ｈ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）；およびトリア
ミノ官能性シラン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ
２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）を含む
が、これに限定されない。脂肪族アミンの官能性を付与
するには、該固相物質を水に約５乃至１５％の有機シラ
ンを含んだｐＨ約３．０乃至３．５の溶液中に、温度を
室温（２０乃至３０℃）で、約２乃至４時間という、結
合を形成するのに十分な時間浸漬することにより行うこ
とができる。該固相物質を、次いで有機シラン溶液より
取り出し、例えば０．０１％のモノラウリン酸ポリオキ
シエチレンソルビタン（ツィーン２０、シグマケミカ
ル、ミズーリ州セントルイス）を含んだ１０ｍＭのリン
酸ナトリウム緩衝液をｐＨ８．０乃至９．０にしたもの
で２度洗浄する。
【００２９】各種の化学薬品をアミノシラン架橋の脂肪
族アミノ基に作用させ、スルフヒドリル基または遊離第
１若しくは第２アミン基を含んだ分子を、化学的に誘導
体化した固相物質に共有結合させることができる。例え
ば、固相表面の脂肪族アミノ基をアシル化（ｐＨ８．０
乃至１０．０の炭酸塩またはリン酸塩の緩衝液中で、無
水コハク酸、無水グルタル酸または両者の誘導体等によ
って）し、固相物質の表面に脂肪族カルボキシル基を形
成することができる。このようにして形成した脂肪族カ
ルボキシル基を、脱イオン水または余剰の緩衝液により
洗浄し、全ての未反応物質および副生成物を取り除いて
乾燥する。固相物質表面の脂肪族カルボキシル基は、Ｎ
−ヒドロキシ化合物（例えば、Ｎ−ヒドロキシベンゾト
リアゾール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの置換
誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキルヒドロキシルアミン、１−
ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
およびＮ−ヒドロキシフタルイミド）と結合することが
できる。この結合は、例えば、水溶性カルボジイミドの
存在下で、通常室温以下で、通常約２乃至５℃で結合が
達せられるのに十分な時間、例えば約２乃至４時間の間
で、反応性エステルを生成して行うことができる。生成
した反応性エステルを０．０５％のツィーン２０で洗浄
し、乾燥して、無水コハク酸とＨＢＴについて次に示す
式図示した、構造式１の定義内に入る、化学的に誘導体
化した液体浸透性の微多孔質固相物質を生成することが
できる。
族アミノ基に作用させ、スルフヒドリル基または遊離第
１若しくは第２アミン基を含んだ分子を、化学的に誘導
体化した固相物質に共有結合させることができる。例え
ば、固相表面の脂肪族アミノ基をアシル化（ｐＨ８．０
乃至１０．０の炭酸塩またはリン酸塩の緩衝液中で、無
水コハク酸、無水グルタル酸または両者の誘導体等によ
って）し、固相物質の表面に脂肪族カルボキシル基を形
成することができる。このようにして形成した脂肪族カ
ルボキシル基を、脱イオン水または余剰の緩衝液により
洗浄し、全ての未反応物質および副生成物を取り除いて
乾燥する。固相物質表面の脂肪族カルボキシル基は、Ｎ
−ヒドロキシ化合物（例えば、Ｎ−ヒドロキシベンゾト
リアゾール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの置換
誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキルヒドロキシルアミン、１−
ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
およびＮ−ヒドロキシフタルイミド）と結合することが
できる。この結合は、例えば、水溶性カルボジイミドの
存在下で、通常室温以下で、通常約２乃至５℃で結合が
達せられるのに十分な時間、例えば約２乃至４時間の間
で、反応性エステルを生成して行うことができる。生成
した反応性エステルを０．０５％のツィーン２０で洗浄
し、乾燥して、無水コハク酸とＨＢＴについて次に示す
式図示した、構造式１の定義内に入る、化学的に誘導体
化した液体浸透性の微多孔質固相物質を生成することが
できる。
【化１７】
【００３０】構造式１の化学的に誘導体化した固相物質
を調製するもう一つの方法としては、固相物質表面のア
ミノシラン架橋の脂肪族アミノ基と、二つのアミン反応
基を含むホモ型二官能性架橋剤（例えば、スクシニル・
ジ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、エチレングリ
コールビス−（コハク酸スクシンイミジル）、エチレン
グリコールビス−（コハク酸スルホスクシンイミジ
ル）、酒石酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスルホスク
シンイミジル、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリ
ン酸ジスクシンイミジル）との反応に関する。例えば、
コハク酸とＨＢＴとをＤＭＦおよびＤＩＣＤのような水
溶性カルボジイミドの存在下で、２乃至５℃で２乃至４
時間反応させて、スクシニル・ジ−Ｎ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールを調製してもよい。混合液を遠心分離
し、上澄みを取ることによって反応中に生成した白色で
不溶性の尿素副生成物（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＮＨ−Ｃ
（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＨ３）２をスクシニル・ジ−
Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールから分離することが
できる。次いで、ＤＭＦ中の上澄みを取ったスクシニル
・ジ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、水溶性緩
衝液でｐＨ８．０乃至１０．０に調製し、固相表面で脂
肪族アミノ基と２０乃至３０℃で１乃至２時間反応させ
る。固相物質を溶液から取り出し、脱イオン水およびツ
ィーン２０で洗浄し、乾燥して、次式で図示した、構造
式１の定義内にある、化学的に誘導体化した液体浸透性
の微多孔質固相物質を生成する。
を調製するもう一つの方法としては、固相物質表面のア
ミノシラン架橋の脂肪族アミノ基と、二つのアミン反応
基を含むホモ型二官能性架橋剤（例えば、スクシニル・
ジ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、エチレングリ
コールビス−（コハク酸スクシンイミジル）、エチレン
グリコールビス−（コハク酸スルホスクシンイミジ
ル）、酒石酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスルホスク
シンイミジル、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリ
ン酸ジスクシンイミジル）との反応に関する。例えば、
コハク酸とＨＢＴとをＤＭＦおよびＤＩＣＤのような水
溶性カルボジイミドの存在下で、２乃至５℃で２乃至４
時間反応させて、スクシニル・ジ−Ｎ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールを調製してもよい。混合液を遠心分離
し、上澄みを取ることによって反応中に生成した白色で
不溶性の尿素副生成物（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＮＨ−Ｃ
（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＨ３）２をスクシニル・ジ−
Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールから分離することが
できる。次いで、ＤＭＦ中の上澄みを取ったスクシニル
・ジ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、水溶性緩
衝液でｐＨ８．０乃至１０．０に調製し、固相表面で脂
肪族アミノ基と２０乃至３０℃で１乃至２時間反応させ
る。固相物質を溶液から取り出し、脱イオン水およびツ
ィーン２０で洗浄し、乾燥して、次式で図示した、構造
式１の定義内にある、化学的に誘導体化した液体浸透性
の微多孔質固相物質を生成する。
【化１８】
【００３１】構造式１の誘導体化した固相物質は十分に
安定であるので、水溶液で十分な時間洗浄し、全ての残
余反応物を取り除くことができる。好ましくない副反応
を避けるために、構造式１の誘導体化した固相物質を洗
浄した後に、目的の分子を該誘導体化した固相物質に結
合することが好ましい。洗浄および乾燥の後、構造式１
の誘導体化した固相物質は、乾燥剤と共に貯蔵すれば、
６乃至１２ヶ月間安定である。
安定であるので、水溶液で十分な時間洗浄し、全ての残
余反応物を取り除くことができる。好ましくない副反応
を避けるために、構造式１の誘導体化した固相物質を洗
浄した後に、目的の分子を該誘導体化した固相物質に結
合することが好ましい。洗浄および乾燥の後、構造式１
の誘導体化した固相物質は、乾燥剤と共に貯蔵すれば、
６乃至１２ヶ月間安定である。
【００３２】アミノシラン架橋の脂肪族アミノ基と一つ
のアミン反応基および一つのスルフヒドリル反応基［例
えば、スクシンイミジル・６−マレイミジルヘキサノア
ート；スクシンイミジル・６−（６−（（（ヨードアセ
チル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノアー
ト；スクシンイミジル・６−（（ヨードアセチル）アミ
ノ）ヘキサノアート；スクシンイミジル・４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）環式ヘキサン−１−カルボキシレー
ト；Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミ
ドエステル；およびＮ−γ−マレイミドブチリルオキシ
−スルホスクシンイミドエステル］を含むヘテロ型二官
能性性架橋剤とを反応させて、構造式２の誘導体化した
固相物質を調製することができる。例えば、該固相物質
表面のアミノシラン架橋の脂肪族アミノ基とスクシンイ
ミジル・６−マレイミジルヘキサノアートとをｐＨ８．
０乃至１０．３で、２０乃至３０で、℃２乃至４時間反
応させて、構造式２の化学的に誘導体化した固相物質を
調製することができる。次いで、固相物質を溶液から取
り出し、脱イオン水およびツィーン２０で洗浄し、乾燥
して、次に示す模式図で図示した、構造式２の定義にあ
る、化学的に誘導体化した液体浸透性の微多孔質固相物
質を生成する。
のアミン反応基および一つのスルフヒドリル反応基［例
えば、スクシンイミジル・６−マレイミジルヘキサノア
ート；スクシンイミジル・６−（６−（（（ヨードアセ
チル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノアー
ト；スクシンイミジル・６−（（ヨードアセチル）アミ
ノ）ヘキサノアート；スクシンイミジル・４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）環式ヘキサン−１−カルボキシレー
ト；Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミ
ドエステル；およびＮ−γ−マレイミドブチリルオキシ
−スルホスクシンイミドエステル］を含むヘテロ型二官
能性性架橋剤とを反応させて、構造式２の誘導体化した
固相物質を調製することができる。例えば、該固相物質
表面のアミノシラン架橋の脂肪族アミノ基とスクシンイ
ミジル・６−マレイミジルヘキサノアートとをｐＨ８．
０乃至１０．３で、２０乃至３０で、℃２乃至４時間反
応させて、構造式２の化学的に誘導体化した固相物質を
調製することができる。次いで、固相物質を溶液から取
り出し、脱イオン水およびツィーン２０で洗浄し、乾燥
して、次に示す模式図で図示した、構造式２の定義にあ
る、化学的に誘導体化した液体浸透性の微多孔質固相物
質を生成する。
【化１９】
【００３３】構造式１の微多孔質固相物質を、横流装置
を含んだ診断検査に用いる前に、目的の分子（ここでは
Ｑと表す）と結合させる。分子Ｑは通常、遊離第１また
は第２アミン基を含むか、あるいは分子Ｑは、アミノ基
が共有結合している分子である。通常水溶液である溶液
状態の分子Ｑを吸収転移法または直接構造式１の誘導体
化物質に加えることにより、構造式１の固相物質に直接
結合させることによって、構造式３の共役体を形成する
ことができる。目的の分子Ｑが固相物質１に結合した
後、誘導体化した固相物質の未反応部分は全て、ブロッ
キング剤（ここではＱ’と表す）により反応を阻止して
もよい。ブロッキング剤としては、トリ（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３）また
は目的の分子以外のタンパク質、例えばカゼインまたは
ウシ血清アルブミンが好ましい。Ｑ分子と構造式１の誘
導体化物質との反応を、次に示す化学式にて説明する。
を含んだ診断検査に用いる前に、目的の分子（ここでは
Ｑと表す）と結合させる。分子Ｑは通常、遊離第１また
は第２アミン基を含むか、あるいは分子Ｑは、アミノ基
が共有結合している分子である。通常水溶液である溶液
状態の分子Ｑを吸収転移法または直接構造式１の誘導体
化物質に加えることにより、構造式１の固相物質に直接
結合させることによって、構造式３の共役体を形成する
ことができる。目的の分子Ｑが固相物質１に結合した
後、誘導体化した固相物質の未反応部分は全て、ブロッ
キング剤（ここではＱ’と表す）により反応を阻止して
もよい。ブロッキング剤としては、トリ（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３）また
は目的の分子以外のタンパク質、例えばカゼインまたは
ウシ血清アルブミンが好ましい。Ｑ分子と構造式１の誘
導体化物質との反応を、次に示す化学式にて説明する。
【化２０】 構造式３の共役体が、上に述べ図示したように準備した
後、結合したＱと固相物質を乾燥してもよい。共役体を
乾燥した後、後述の横流装置を含んだ診断検査に使用す
るのに備えて貯蔵する前に、共役体を水性緩衝液で洗浄
して未反応の物質を取り除き、再度乾燥する。
後、結合したＱと固相物質を乾燥してもよい。共役体を
乾燥した後、後述の横流装置を含んだ診断検査に使用す
るのに備えて貯蔵する前に、共役体を水性緩衝液で洗浄
して未反応の物質を取り除き、再度乾燥する。
【００３４】構造式２の微多孔質固相物質を、横流装置
を含んだ診断検査に用いる前に、スルヒドリル基を含ん
だ、またはスルヒドリル基が共有的に結合している分子
を含んだ目的の分子（ここではＬと表す）と結合させ
る。水溶液等の溶液状態の分子Ｌを、吸収転移法または
構造式２の固相物質に直接加えることにより、分子Lと
構造式２の固相物質とを直接結合し、構造式４の共役体
を形成することができる。目的の分子Ｌが固相物質２に
結合した後、誘導体化した固相物質の未反応部分は全
て、ブロッキング剤（ここではＬ’と表す）により反応
を阻止してもよい。ブロッキング剤としては、システイ
ンまたは目的の分子以外のタンパク質、例えばカゼイン
またはウシ血清アルブミンが好ましい。Ｌおよび構造式
２の誘導体化物質との反応を、次に示す化学式にて説明
する。
を含んだ診断検査に用いる前に、スルヒドリル基を含ん
だ、またはスルヒドリル基が共有的に結合している分子
を含んだ目的の分子（ここではＬと表す）と結合させ
る。水溶液等の溶液状態の分子Ｌを、吸収転移法または
構造式２の固相物質に直接加えることにより、分子Lと
構造式２の固相物質とを直接結合し、構造式４の共役体
を形成することができる。目的の分子Ｌが固相物質２に
結合した後、誘導体化した固相物質の未反応部分は全
て、ブロッキング剤（ここではＬ’と表す）により反応
を阻止してもよい。ブロッキング剤としては、システイ
ンまたは目的の分子以外のタンパク質、例えばカゼイン
またはウシ血清アルブミンが好ましい。Ｌおよび構造式
２の誘導体化物質との反応を、次に示す化学式にて説明
する。
【化２１】
【００３５】ここに示した例は、単に説明をするための
ものであって、これに限定するものではない。
ものであって、これに限定するものではない。
【００３６】
【実施例】Ｃ．実施例 実施例１ ＨＢＴを用いたニトロセルロースの活性化 アミノシリル化したニトロセルロースの調製―ニトロセ
ルロースの帯片（２４×２．５ｃｍ）を３−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン（ｐＨ３．０）の５％溶液１０
０ｍｌに浸漬し、攪拌しながら室温で２時間反応させ
た。ニトロセルロースの帯片を溶液より取り出し、ツィ
ーン２０を０．０１％含んだ１０ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。その後、５０
℃にて乾燥した。
ルロースの帯片（２４×２．５ｃｍ）を３−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン（ｐＨ３．０）の５％溶液１０
０ｍｌに浸漬し、攪拌しながら室温で２時間反応させ
た。ニトロセルロースの帯片を溶液より取り出し、ツィ
ーン２０を０．０１％含んだ１０ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。その後、５０
℃にて乾燥した。
【００３７】無水コハク酸およびＨＢＴを用いたアミノ
シリル化したニトロセルロースの活性化―アミノシリル
化したニトロセルロースの帯片を１ｍｇ／ｍｌの無水コ
ハク酸溶液（ｐＨ８．１）１００ｍｌに浸漬し、３５℃
で２時間反応させた。ニトロセルロース帯片を取り出
し、脱イオン水で２回洗浄し、乾燥した。次いで、該ニ
トロセルロース帯片を１００ｍｌの脱イオン水に浸漬
し、１００μｌのＨＢＴ（１００μｌのＤＭＦに５０ｍ
ｇを溶解したもの）を加え、さらに１００μｌのＥＤＣ
Ａ溶液（１００μｌの脱イオン水に２０ｍｇを溶解した
もの）を加えた。帯片を入れた溶液を攪拌してよく混
ぜ、５℃で１晩貯蔵した。ニトロセルロース帯片を溶液
より取り出し、脱イオン水で２回洗浄し、乾燥した。帯
片を３μｌ／ｍｍ２の０．０４％ツィーン２０で処理
し、５０℃で５分間乾燥した。活性化したニトロセルロ
ース帯片は、後の使用に備え、密封容器に入れ、室温で
保管した。
シリル化したニトロセルロースの活性化―アミノシリル
化したニトロセルロースの帯片を１ｍｇ／ｍｌの無水コ
ハク酸溶液（ｐＨ８．１）１００ｍｌに浸漬し、３５℃
で２時間反応させた。ニトロセルロース帯片を取り出
し、脱イオン水で２回洗浄し、乾燥した。次いで、該ニ
トロセルロース帯片を１００ｍｌの脱イオン水に浸漬
し、１００μｌのＨＢＴ（１００μｌのＤＭＦに５０ｍ
ｇを溶解したもの）を加え、さらに１００μｌのＥＤＣ
Ａ溶液（１００μｌの脱イオン水に２０ｍｇを溶解した
もの）を加えた。帯片を入れた溶液を攪拌してよく混
ぜ、５℃で１晩貯蔵した。ニトロセルロース帯片を溶液
より取り出し、脱イオン水で２回洗浄し、乾燥した。帯
片を３μｌ／ｍｍ２の０．０４％ツィーン２０で処理
し、５０℃で５分間乾燥した。活性化したニトロセルロ
ース帯片は、後の使用に備え、密封容器に入れ、室温で
保管した。
【００３８】実施例２ コハク酸ジ−ＨＢＴを用いたよるニトロセルロースの活
性化 コハク酸ジ−ＨＢＴの調製―コハク酸（０．３５ｇ、３
ミリモル）およびＨＢＴ（１．５ｇ、１１ミリモル）を
５ｍｌのＤＭＦに溶解した。該混合液を５℃に冷却した
後、０．７５ｍｌのＤＩＣＤを滴下した。該混合液を２
乃至５℃で４時間反応させた。該混合液を１０，０００
ｘｇで１５分間遠心分離した後、上澄み液を取り出し、
ＤＭＦで希釈して５ｍｌ溶液（およそ１ｍｌ当たり１０
０ｍｇのコハク酸ジ−ＨＢＴ）とした。該コハク酸ジ−
ＨＢＴを１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．
０）を用いて１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
性化 コハク酸ジ−ＨＢＴの調製―コハク酸（０．３５ｇ、３
ミリモル）およびＨＢＴ（１．５ｇ、１１ミリモル）を
５ｍｌのＤＭＦに溶解した。該混合液を５℃に冷却した
後、０．７５ｍｌのＤＩＣＤを滴下した。該混合液を２
乃至５℃で４時間反応させた。該混合液を１０，０００
ｘｇで１５分間遠心分離した後、上澄み液を取り出し、
ＤＭＦで希釈して５ｍｌ溶液（およそ１ｍｌ当たり１０
０ｍｇのコハク酸ジ−ＨＢＴ）とした。該コハク酸ジ−
ＨＢＴを１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．
０）を用いて１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００３９】コハク酸ジ−ＨＢＴを用いたアミノシリル
化したニトロセルロースの活性化―アミノシリル化した
ニトロセルロース帯片（実施例１によって調製されたも
の）を５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌコハク酸―ＨＢＴ溶液に加
え、２０℃で１時間反応させた。該帯片をコハク酸―Ｈ
ＢＴより取り出し、１０ｍｌの脱イオン水で３回洗浄
し、乾燥した。該帯片を３μｌ／ｍｍ２の０．０４％ツ
ィーン２０で処理し、５０℃で５分間乾燥した。活性化
したニトロセルロース帯片は、後の使用に備え、密封容
器に入れ、室温で保管した。
化したニトロセルロースの活性化―アミノシリル化した
ニトロセルロース帯片（実施例１によって調製されたも
の）を５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌコハク酸―ＨＢＴ溶液に加
え、２０℃で１時間反応させた。該帯片をコハク酸―Ｈ
ＢＴより取り出し、１０ｍｌの脱イオン水で３回洗浄
し、乾燥した。該帯片を３μｌ／ｍｍ２の０．０４％ツ
ィーン２０で処理し、５０℃で５分間乾燥した。活性化
したニトロセルロース帯片は、後の使用に備え、密封容
器に入れ、室温で保管した。
【００４０】実施例３ コハク酸ジ−ＨＢＴを用いたガラス繊維の活性化 アミノシリル化したガラス繊維パッド（２４×２．５ｃ
ｍ）を、実施例１のニトロセルロースに準じて調製し
た。次いで、アミノシリル化したガラス繊維パッドを、
実施例２に従ってコハク酸ジ−ＨＢＴを用いて活性し
た。
ｍ）を、実施例１のニトロセルロースに準じて調製し
た。次いで、アミノシリル化したガラス繊維パッドを、
実施例２に従ってコハク酸ジ−ＨＢＴを用いて活性し
た。
【００４１】実施例４ ストレプトアビジン−ＦＩＴＣとニトロセルロースの共
有結合 活性化したニトロセルロース（実施例１に従って調製し
たもの）を１５×５ｍｍのパッドに切断した。５ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中１５μｌの０．１、０．
５、０．２５および０．１２５ｍｇ／ｍｌのフルオレセ
イン・イソチオシアネート標識ストレプトアビジン（Ｓ
Ａ−ＦＩＴＣ）が入ったものをニトロセルロースパッド
に加えた。これらは、それぞれ２００、１００、５０、
２５ｎｇ／ｍｍ２に相当する。ＳＡ−ＦＩＴＣを含んだ
パッドを室温で１時間反応させた。次いで、パッドを
０．０１％のツィーン２０を含んだ１０ｍＭのＮａＣｌ
溶液２０ｍｌ中で３０秒間超音波処理して４回洗浄し
た。受動吸収を調べるため、一組のパッドをそれぞれ
０．２５ｍｌの１％ＳＤＳで処理し、６０秒間超音波処
理した。もう一組のパッドを０．０１規定ＮａＯＨ溶液
で３８℃２時間加水分解し、３０秒間超音波処理して共
有結合を定量した。それぞれのパッドの溶液を希釈し、
ＳＡ−ＦＩＴＣの濃度を定量した。受動的に吸着および
共有的に結合したＳＡ−ＦＩＴＣのニトロセルロースか
らの回収率（表１にまとめた）は、結合状態が主として
共有であることを示している。
有結合 活性化したニトロセルロース（実施例１に従って調製し
たもの）を１５×５ｍｍのパッドに切断した。５ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中１５μｌの０．１、０．
５、０．２５および０．１２５ｍｇ／ｍｌのフルオレセ
イン・イソチオシアネート標識ストレプトアビジン（Ｓ
Ａ−ＦＩＴＣ）が入ったものをニトロセルロースパッド
に加えた。これらは、それぞれ２００、１００、５０、
２５ｎｇ／ｍｍ２に相当する。ＳＡ−ＦＩＴＣを含んだ
パッドを室温で１時間反応させた。次いで、パッドを
０．０１％のツィーン２０を含んだ１０ｍＭのＮａＣｌ
溶液２０ｍｌ中で３０秒間超音波処理して４回洗浄し
た。受動吸収を調べるため、一組のパッドをそれぞれ
０．２５ｍｌの１％ＳＤＳで処理し、６０秒間超音波処
理した。もう一組のパッドを０．０１規定ＮａＯＨ溶液
で３８℃２時間加水分解し、３０秒間超音波処理して共
有結合を定量した。それぞれのパッドの溶液を希釈し、
ＳＡ−ＦＩＴＣの濃度を定量した。受動的に吸着および
共有的に結合したＳＡ−ＦＩＴＣのニトロセルロースか
らの回収率（表１にまとめた）は、結合状態が主として
共有であることを示している。
【表１】
【００４２】実施例５ ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣの活性化したガラス繊維への共有
結合 活性化したガラス繊維（ジ−ＨＢＴ）を実施例３に従っ
て調製した。異なる濃度（０．３、０．６および１．５
ｍｇ／ｍｌ）のフルオレセイン・イソチオシアネート標
識ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣ）２５μｌを活性化
したガラス繊維片１５×５ｍｍに均等に塗布した。室温
で２時間放置した後、パッドを０．０１％のツィーン２
０を含んだリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄
し、乾燥した。受動吸収を調べるため、一組のパッドを
それぞれ０．２５ｍｌの１％ＳＤＳで処理し、６０秒間
超音波処理した。もう一組のパッドを０．０１規定Ｎａ
ＯＨ溶液で３８℃２時間加水分解し、３０秒間超音波処
理して共有結合を定量した。それぞれのパッドの溶液を
希釈し、ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣの濃度を定量した。受動的
に吸着され共有的に結合したｈＩｇＧ−ＦＩＴＣのガラ
ス繊維からの回収率（表２にまとめた）は、結合状態が
主として共有であることを示している。
結合 活性化したガラス繊維（ジ−ＨＢＴ）を実施例３に従っ
て調製した。異なる濃度（０．３、０．６および１．５
ｍｇ／ｍｌ）のフルオレセイン・イソチオシアネート標
識ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣ）２５μｌを活性化
したガラス繊維片１５×５ｍｍに均等に塗布した。室温
で２時間放置した後、パッドを０．０１％のツィーン２
０を含んだリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄
し、乾燥した。受動吸収を調べるため、一組のパッドを
それぞれ０．２５ｍｌの１％ＳＤＳで処理し、６０秒間
超音波処理した。もう一組のパッドを０．０１規定Ｎａ
ＯＨ溶液で３８℃２時間加水分解し、３０秒間超音波処
理して共有結合を定量した。それぞれのパッドの溶液を
希釈し、ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣの濃度を定量した。受動的
に吸着され共有的に結合したｈＩｇＧ−ＦＩＴＣのガラ
ス繊維からの回収率（表２にまとめた）は、結合状態が
主として共有であることを示している。
【表２】
【００４３】実施例６ ビオチンの活性化したニトロセルロースへの共有結合 コハク酸ジ−ＨＢＴを活性化したニトロセルロース膜の
調製―脱イオン水にアミノシランを５％溶解した溶液
（ｐＨ３．０）を使用日に調製した。ニトロセルロース
膜をＰＶＣのカード上に積層し、室温で２時間、前述の
溶液１００ｍｌに浸漬した。該カードを溶液から取り出
し、３7℃の乾燥オーブン中で15分間乾燥した。乾燥した
カードを０．０２％のビオタージ（Ｂｉｏｔｅｒｇｅ）
を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌ
を用いて、２回洗浄した。次いで、カードを、０．０２
％のビオタージを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）にコハク酸ジ−ＨＢＴ（４０μｌ／ｍｌ）加え
たもの１００ｍｌに浸漬し、回転装置上で２時間洗浄し
た。０．０４％のビオタージおよび０．０４％のツィー
ン２０を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中
で２回（１回５分）洗浄した後、該カードを３７℃の乾
燥オーブン中で１５分間乾燥した。
調製―脱イオン水にアミノシランを５％溶解した溶液
（ｐＨ３．０）を使用日に調製した。ニトロセルロース
膜をＰＶＣのカード上に積層し、室温で２時間、前述の
溶液１００ｍｌに浸漬した。該カードを溶液から取り出
し、３7℃の乾燥オーブン中で15分間乾燥した。乾燥した
カードを０．０２％のビオタージ（Ｂｉｏｔｅｒｇｅ）
を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌ
を用いて、２回洗浄した。次いで、カードを、０．０２
％のビオタージを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）にコハク酸ジ−ＨＢＴ（４０μｌ／ｍｌ）加え
たもの１００ｍｌに浸漬し、回転装置上で２時間洗浄し
た。０．０４％のビオタージおよび０．０４％のツィー
ン２０を含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中
で２回（１回５分）洗浄した後、該カードを３７℃の乾
燥オーブン中で１５分間乾燥した。
【００４４】ビオチン・アミン帯片の調製―バイオドッ
ト（ＢｉｏＤｏｔ）ＸＹ−３０００型噴霧器を用い、ビ
オチン・カダベリン溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）中に１７μｌ／ｍｌとしたもの）をジ−コハク
酸ＨＢＴ活性化ニトロセルロース膜上の４箇所に噴霧す
る。各箇所を粒子径約２０ナノリッターで０．６２５μ
ｌ／ｃｍで噴霧する。噴霧後、ニトロセルロース膜を含
むカードを３７℃の乾燥オーブン中で１５分間乾燥させ
た。次いで、ニトロセルロース膜を５０ｍＭのトリス
（Ｔｒｉｓ）で１時間濡らして反応を阻止した。過剰の
トリスを膜から吸収した後、カード（取り付けられた膜
と一緒に）を、最低５分間、０．０２％ビオタージを含
んだ５０ｍＭリン酸緩衝液中で、２回洗浄した。次い
で、カードを３７℃の乾燥オーブンで１５分間乾燥し
た。１０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）
で阻止した、集積パッドをカードの底部に取り付けた。
芯をカードの頂点に取り付けた。組み立てた後、完成し
たカードをバイオドットのカッターで５ｍｍ幅に切断
し、該帯片を乾燥剤と共にプラスチック袋に入れて保管
した。
ト（ＢｉｏＤｏｔ）ＸＹ−３０００型噴霧器を用い、ビ
オチン・カダベリン溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）中に１７μｌ／ｍｌとしたもの）をジ−コハク
酸ＨＢＴ活性化ニトロセルロース膜上の４箇所に噴霧す
る。各箇所を粒子径約２０ナノリッターで０．６２５μ
ｌ／ｃｍで噴霧する。噴霧後、ニトロセルロース膜を含
むカードを３７℃の乾燥オーブン中で１５分間乾燥させ
た。次いで、ニトロセルロース膜を５０ｍＭのトリス
（Ｔｒｉｓ）で１時間濡らして反応を阻止した。過剰の
トリスを膜から吸収した後、カード（取り付けられた膜
と一緒に）を、最低５分間、０．０２％ビオタージを含
んだ５０ｍＭリン酸緩衝液中で、２回洗浄した。次い
で、カードを３７℃の乾燥オーブンで１５分間乾燥し
た。１０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）
で阻止した、集積パッドをカードの底部に取り付けた。
芯をカードの頂点に取り付けた。組み立てた後、完成し
たカードをバイオドットのカッターで５ｍｍ幅に切断
し、該帯片を乾燥剤と共にプラスチック袋に入れて保管
した。
【００４５】試験手順―１１０μｌの１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０、ショ糖４％およびＢＳＡ０．５％を
含む）を２本の１２×７５ｍｍのホウケイ酸試験管の各
々に加えた。５μｇのコロイド状金ＢＳＡ−ビオチン
（４ｍｇ／ｍｌ溶液を１．２５μ）を１本に加えてコン
トロールサンプルとした。５μｇのコロイド状金ストレ
プトアビジン（４ｍｇ／ｍｌ溶液を１．２５μ）をもう
一本に加えて試験サンプルとした。試験片を各試験管に
浸漬し、１５分間現像した。現像した試験片を試験管か
ら取り出し、乾燥してミノルタＣＲ−２４１帯片リーダ
ーで読み取った。表３にまとめた結果は、小さな分子
（分子量２２４）のビオチンが帯片上に固定化されたこ
とを示している。
衝液（ｐＨ８．０、ショ糖４％およびＢＳＡ０．５％を
含む）を２本の１２×７５ｍｍのホウケイ酸試験管の各
々に加えた。５μｇのコロイド状金ＢＳＡ−ビオチン
（４ｍｇ／ｍｌ溶液を１．２５μ）を１本に加えてコン
トロールサンプルとした。５μｇのコロイド状金ストレ
プトアビジン（４ｍｇ／ｍｌ溶液を１．２５μ）をもう
一本に加えて試験サンプルとした。試験片を各試験管に
浸漬し、１５分間現像した。現像した試験片を試験管か
ら取り出し、乾燥してミノルタＣＲ−２４１帯片リーダ
ーで読み取った。表３にまとめた結果は、小さな分子
（分子量２２４）のビオチンが帯片上に固定化されたこ
とを示している。
【表３】
【００４６】実施例７ 共有結合した抗体を含むニトロセルロース帯片の安定性 共有結合した抗体を持つニトロセルロースの調製―ニト
ロセルロース膜（２５．４×３００ｍｍ）を７０×３０
０ｍｍのＰＶＣカード上に積層し、次いで実施例６に従
ってコハク酸ジ−ＨＢＴを用いて活性化した。ヤギ抗マ
ウス抗体を１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に入
れ２ｍｇ／ｍｌとしたものをバイオドットＸＹ−３００
０を用いて該膜上に６本の線を塗布した。それぞれの線
は約０．６２５μｌ／ｃｍで塗布した。３７℃のオーブ
ンで１５分間乾燥した後、該膜を５０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）で１時間濡らして反応を阻止した。次いで、膜
を０．０２％のバイオタージを含んだ５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で、最低５分間２回洗浄し、３7℃
のオーブンで１５分間乾燥した。
ロセルロース膜（２５．４×３００ｍｍ）を７０×３０
０ｍｍのＰＶＣカード上に積層し、次いで実施例６に従
ってコハク酸ジ−ＨＢＴを用いて活性化した。ヤギ抗マ
ウス抗体を１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に入
れ２ｍｇ／ｍｌとしたものをバイオドットＸＹ−３００
０を用いて該膜上に６本の線を塗布した。それぞれの線
は約０．６２５μｌ／ｃｍで塗布した。３７℃のオーブ
ンで１５分間乾燥した後、該膜を５０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）で１時間濡らして反応を阻止した。次いで、膜
を０．０２％のバイオタージを含んだ５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で、最低５分間２回洗浄し、３7℃
のオーブンで１５分間乾燥した。
【００４７】受動結合した抗体を持つニトロセルロース
の調製―前述の通り、しかし活性化しないで、ニトロセ
ルロース膜をＰＶＣカード上に積層した。２ｍｇ／ｍｌ
ヤギ抗マウス抗体溶液で前述のように６本線を膜に付し
た。線を付したら直ちに、バイオドットＸＹ−３０００
空気ジェットを用いて、ＢＳＡ０．５％およびショ糖
４．０％を含んだ１５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ７．４）を塗布し、該膜の反応を阻止した。次いで、
膜を３７℃のオーブンで１５分間乾燥した。
の調製―前述の通り、しかし活性化しないで、ニトロセ
ルロース膜をＰＶＣカード上に積層した。２ｍｇ／ｍｌ
ヤギ抗マウス抗体溶液で前述のように６本線を膜に付し
た。線を付したら直ちに、バイオドットＸＹ−３０００
空気ジェットを用いて、ＢＳＡ０．５％およびショ糖
４．０％を含んだ１５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ７．４）を塗布し、該膜の反応を阻止した。次いで、
膜を３７℃のオーブンで１５分間乾燥した。
【００４８】試験片の組立て−吸い取り紙（事前に、１
００ｍＭリン酸ナトリウムおよびトリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００を１％含んだｐＨ７．４の阻止溶液で処
理し、乾燥したもの）を、受動結合したニトロセルロー
スを含むＰＶＣカードの上流側に積層した。吸い取り紙
（事前に、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよびトリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を１％含んだｐＨ７．４の
阻止溶液で処理し、乾燥したもの）を、共有結合したニ
トロセルロースを含むＰＶＣカードの上流側に積層し
た。未処理の吸い取り紙をそれぞれのカードの下流側に
積層した。吸い取り紙は全て、ニトロセルロースの頂部
および底部の端と２ｍｍ重なるように取り付けた。積層
したカードを５ｍｍ幅の帯状に切断した。該帯片を乾燥
剤と共に試験管に入れて室温で保管した。
００ｍＭリン酸ナトリウムおよびトリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００を１％含んだｐＨ７．４の阻止溶液で処
理し、乾燥したもの）を、受動結合したニトロセルロー
スを含むＰＶＣカードの上流側に積層した。吸い取り紙
（事前に、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよびトリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を１％含んだｐＨ７．４の
阻止溶液で処理し、乾燥したもの）を、共有結合したニ
トロセルロースを含むＰＶＣカードの上流側に積層し
た。未処理の吸い取り紙をそれぞれのカードの下流側に
積層した。吸い取り紙は全て、ニトロセルロースの頂部
および底部の端と２ｍｍ重なるように取り付けた。積層
したカードを５ｍｍ幅の帯状に切断した。該帯片を乾燥
剤と共に試験管に入れて室温で保管した。
【００４９】試験手順―各群の試験片を底に少量の水を
入れた密封湿度チャンバーに入れ、３７℃に保温した。
２４時間保温した後、各試験群より一枚の試験片を湿度
チャンバーより取り出し、３７℃で１５分間乾燥した。
試験片を、湿気にさらしていないコントロール片と共
に、後述のように試験した。
入れた密封湿度チャンバーに入れ、３７℃に保温した。
２４時間保温した後、各試験群より一枚の試験片を湿度
チャンバーより取り出し、３７℃で１５分間乾燥した。
試験片を、湿気にさらしていないコントロール片と共
に、後述のように試験した。
【００５０】サンプル希釈液（ｐＨ７．４の０．７％リ
ン酸ナトリウム緩衝液１００μｌで、ＢＳＡ１．０％お
よびアジ化ナトリウム０．１％を含む）および５μｇの
コロイド状金／ストレプトアビジン（サンプル希釈液中
に１００μｇ／ｍｌとなるようにしたもの５０μｌ）を
１２×７５ｍｍのホウケイ酸試験管に加え、各試験片を
試験できるようにした。ボルテックス中に、６００ｎｇ
のマウスＩｇＧ−ビオチン（サンプル希釈液中に４０μ
ｇ／ｍｌとなるようにしたもの１５μｌ）を加えた。次
いで、該溶液をサンプル希釈液で１２０μｌにした。そ
の後、試験液を入れた試験管に帯片を入れ（一本に一
枚）、１５分間保温してミノルタＣＲ−２４１帯片リー
ダーを用いて試験線の総色度を分析した。表４にまとめ
た結果より、２４時間湿気にさらした場合、共有結合し
た抗体を持つ帯片の方が、受動結合した抗体を持つ帯片
よりも安定であることが分かる。
ン酸ナトリウム緩衝液１００μｌで、ＢＳＡ１．０％お
よびアジ化ナトリウム０．１％を含む）および５μｇの
コロイド状金／ストレプトアビジン（サンプル希釈液中
に１００μｇ／ｍｌとなるようにしたもの５０μｌ）を
１２×７５ｍｍのホウケイ酸試験管に加え、各試験片を
試験できるようにした。ボルテックス中に、６００ｎｇ
のマウスＩｇＧ−ビオチン（サンプル希釈液中に４０μ
ｇ／ｍｌとなるようにしたもの１５μｌ）を加えた。次
いで、該溶液をサンプル希釈液で１２０μｌにした。そ
の後、試験液を入れた試験管に帯片を入れ（一本に一
枚）、１５分間保温してミノルタＣＲ−２４１帯片リー
ダーを用いて試験線の総色度を分析した。表４にまとめ
た結果より、２４時間湿気にさらした場合、共有結合し
た抗体を持つ帯片の方が、受動結合した抗体を持つ帯片
よりも安定であることが分かる。
【表４】
【００５１】II． 横流装置 前述の物質を用いて各種の製品および装置を作ることが
できる。一例としては、単独または複数被検体半定量／
定量迅速診断横流試験システムである。該システムは、
計器を用いてまたは計器を用いずに視覚的な終点に対し
てＬＦＤ中で背景および対照試薬を用いた、単独または
複数被検体型式の改善された免疫学的および他の特定の
結合定量法ならびに装置を提供する。
できる。一例としては、単独または複数被検体半定量／
定量迅速診断横流試験システムである。該システムは、
計器を用いてまたは計器を用いずに視覚的な終点に対し
てＬＦＤ中で背景および対照試薬を用いた、単独または
複数被検体型式の改善された免疫学的および他の特定の
結合定量法ならびに装置を提供する。
【００５２】Ａ．単独試験線をもったサンドイッチ状Ｌ
ＦＤ 水性サンプル中の大きな分子の被検体の定量および半定
量に用いる、単独試験線を持ったサンドイッチ形式の横
流装置（ＬＦＤ）を図１に示す。何れの図でも、各種の
寸法は必ずしも縮尺どおりに描かれていない。
ＦＤ 水性サンプル中の大きな分子の被検体の定量および半定
量に用いる、単独試験線を持ったサンドイッチ形式の横
流装置（ＬＦＤ）を図１に示す。何れの図でも、各種の
寸法は必ずしも縮尺どおりに描かれていない。
【００５３】ＬＦＤ１０には、例えばニトロセルロー
ス、ガラス繊維またはナイロンでできた多孔質膜１２を
含む。孔径、結合能力、特定の水性サンプルおよび分析
手順といった特性によっては、他の適当な膜素材を使う
ことができる。通常、多孔質膜１２の孔径は２乃至１０
ミクロンでよい。有用な形状では、多孔質膜１２の長さ
はおよそ５０乃至１００ｍｍで、幅はおよそ３．５乃至
８．０ｍｍとなる。また、多孔質膜１２は、厚みが、例
えばおよそ５０乃至３００ミクロンで、水溶液に関して
およそ１０乃至５０ｍｍ／ｍｉｎの毛管上昇特性を有す
る。しかしながら、多孔質膜１２に関してのこの具体的
性質ならびに大きさは臨界的ではなく、速度に関する所
望の結果および積極的試験結果を得るために必要であれ
ば変更してもよい。
ス、ガラス繊維またはナイロンでできた多孔質膜１２を
含む。孔径、結合能力、特定の水性サンプルおよび分析
手順といった特性によっては、他の適当な膜素材を使う
ことができる。通常、多孔質膜１２の孔径は２乃至１０
ミクロンでよい。有用な形状では、多孔質膜１２の長さ
はおよそ５０乃至１００ｍｍで、幅はおよそ３．５乃至
８．０ｍｍとなる。また、多孔質膜１２は、厚みが、例
えばおよそ５０乃至３００ミクロンで、水溶液に関して
およそ１０乃至５０ｍｍ／ｍｉｎの毛管上昇特性を有す
る。しかしながら、多孔質膜１２に関してのこの具体的
性質ならびに大きさは臨界的ではなく、速度に関する所
望の結果および積極的試験結果を得るために必要であれ
ば変更してもよい。
【００５４】図１に示す通り、芯材パッド１４は多孔質
膜１２の端部１６で多孔質膜１２と重なっており、多孔
質膜１２と液移送接触している。芯材パッド１４をガラ
ス繊維、繊維状セルロースまたは他の適当な物質で作る
ことができる。芯材パッドの大きさは通常臨界的ではな
く、通常長さが２０乃至５０ｍｍ、幅が３．５乃至８ｍ
ｍおよび厚さが０．５乃至２．０ｍｍである。
膜１２の端部１６で多孔質膜１２と重なっており、多孔
質膜１２と液移送接触している。芯材パッド１４をガラ
ス繊維、繊維状セルロースまたは他の適当な物質で作る
ことができる。芯材パッドの大きさは通常臨界的ではな
く、通常長さが２０乃至５０ｍｍ、幅が３．５乃至８ｍ
ｍおよび厚さが０．５乃至２．０ｍｍである。
【００５５】ＬＦＤ１０は結合領域１８を備える。結合
領域１８は、芯材パッド１４または多孔質膜１２の一部
の領域、若しくは芯材パッド１４または多孔質膜１２と
液移送接触している１以上の分離した試薬パッドであっ
てもよい。芯材パッド１４、多孔質膜１２および結合領
域１８は、テープ片（図示していない）により固定する
ことができる。他の実施態様においては、芯材パッド１
４、多孔質膜１２および結合領域１８を、接着性物質に
より、またはＬＦＤの部品を格納したコンタミネーショ
ンを防止する容器（図示していない）が自然に収縮する
ことにより適所に固定することができる。
領域１８は、芯材パッド１４または多孔質膜１２の一部
の領域、若しくは芯材パッド１４または多孔質膜１２と
液移送接触している１以上の分離した試薬パッドであっ
てもよい。芯材パッド１４、多孔質膜１２および結合領
域１８は、テープ片（図示していない）により固定する
ことができる。他の実施態様においては、芯材パッド１
４、多孔質膜１２および結合領域１８を、接着性物質に
より、またはＬＦＤの部品を格納したコンタミネーショ
ンを防止する容器（図示していない）が自然に収縮する
ことにより適所に固定することができる。
【００５６】結合領域１８には、２つの試薬を含む。第
１の試薬は対照試薬であり、対照結合配位子（ＣＬ）を
形成するために、当該技術では既知の共有またはイオン
結合、吸着あるいは他の結合方法により、目的の大型分
子被検体の一部または部分（ここでは「α領域部」とす
る）に結合する。該ＣＬは、乾燥した、復元可能な、液
体に分散可能で、拡散可能な、着色したラテックス・ビ
ーズとすることができる。通常、該ラテックス・ビーズ
は明色、例えば黄色である。着色したラテックス・ビー
ズの替わりに、背景薬剤を着色料分子、酵素と色素の組
み合わせ、または蛍光性、発光性もしくは放射性分子と
することができる。
１の試薬は対照試薬であり、対照結合配位子（ＣＬ）を
形成するために、当該技術では既知の共有またはイオン
結合、吸着あるいは他の結合方法により、目的の大型分
子被検体の一部または部分（ここでは「α領域部」とす
る）に結合する。該ＣＬは、乾燥した、復元可能な、液
体に分散可能で、拡散可能な、着色したラテックス・ビ
ーズとすることができる。通常、該ラテックス・ビーズ
は明色、例えば黄色である。着色したラテックス・ビー
ズの替わりに、背景薬剤を着色料分子、酵素と色素の組
み合わせ、または蛍光性、発光性もしくは放射性分子と
することができる。
【００５７】結合領域１８に含まれる第２の試薬は、乾
燥した、復元可能な、液体の分散可能な、拡散可能な標
識で、該標識は目的の大型分子被検体の第２領域（「β
領域」）に特異的な結合配位子に付着して、標識結合配
位子（ＩＬ）をつくる。大型分子被検体のα領域断片お
よびβ領域は、別個の非交差反応単位でなければならな
い。標識試薬は、コロイド状金粒子、酵素／色素の組み
合わせ、着色したラテックス粒子、炭素粒子、または蛍
光性、発光性もしくは放射性粒子であり、目視または他
の方法で該ＣＬと区別することのできるものである。
燥した、復元可能な、液体の分散可能な、拡散可能な標
識で、該標識は目的の大型分子被検体の第２領域（「β
領域」）に特異的な結合配位子に付着して、標識結合配
位子（ＩＬ）をつくる。大型分子被検体のα領域断片お
よびβ領域は、別個の非交差反応単位でなければならな
い。標識試薬は、コロイド状金粒子、酵素／色素の組み
合わせ、着色したラテックス粒子、炭素粒子、または蛍
光性、発光性もしくは放射性粒子であり、目視または他
の方法で該ＣＬと区別することのできるものである。
【００５８】水性サンプルが第１および第２試薬に接す
る前に、第１および第２試薬の一方または両方を結合領
域１８に均一に含浸させるか分散することができる。あ
るいは、例えば結合領域１８を試薬の一方または両方で
被覆し、水性サンプルが接すると結合領域全体に分散す
るようにもできる。また、該２試薬を結合領域１８の縦
方向に離して置き、水性サンプルが接すると結合領域全
体に分散するようにもできる。
る前に、第１および第２試薬の一方または両方を結合領
域１８に均一に含浸させるか分散することができる。あ
るいは、例えば結合領域１８を試薬の一方または両方で
被覆し、水性サンプルが接すると結合領域全体に分散す
るようにもできる。また、該２試薬を結合領域１８の縦
方向に離して置き、水性サンプルが接すると結合領域全
体に分散するようにもできる。
【００５９】図１に示す通り、ＬＦＤ１０は芯材パッド
１４の反対側、多孔質膜１２の第２端３２にある吸着パ
ッド３０を含む。吸着パッド３０と結合領域１８との間
は、ひとつの試験線２２、結合領域１８と試験線２２と
の間の空間２０、および試験線２２と吸着パッド３０と
の間の第２空間２４である。該試験線２２は、多孔質膜
１２上にあり、目的の被検体のα領域部に固有の固定化
した結合配位子を含む。
１４の反対側、多孔質膜１２の第２端３２にある吸着パ
ッド３０を含む。吸着パッド３０と結合領域１８との間
は、ひとつの試験線２２、結合領域１８と試験線２２と
の間の空間２０、および試験線２２と吸着パッド３０と
の間の第２空間２４である。該試験線２２は、多孔質膜
１２上にあり、目的の被検体のα領域部に固有の固定化
した結合配位子を含む。
【００６０】吸着パッド３０は、多孔質膜１２と液移送
接触したガラス繊維または繊維状セルロースのパッドあ
るいは他の適切な物質とすることができる。該吸着パッ
ド３０は、未反応試薬およびサンプルを捕集し、試験線
２２よりいかなる背景物質をも取り除く芯材として働
く。
接触したガラス繊維または繊維状セルロースのパッドあ
るいは他の適切な物質とすることができる。該吸着パッ
ド３０は、未反応試薬およびサンプルを捕集し、試験線
２２よりいかなる背景物質をも取り除く芯材として働
く。
【００６１】被検体を含む試験サンプルは、毛管現象に
より、図１に示す芯材パッド１４に沿い結合領域１８に
向かって動く。サンプルが結合領域１８のＩＬと接触す
ると、反応して被検体−ＩＬ錯体を作る。アルファ領域
部に付着したＣＬは、被検体または被検体−ＩＬ錯体と
共に、しかし反応はしないで、芯材パッドに沿って動
く。
より、図１に示す芯材パッド１４に沿い結合領域１８に
向かって動く。サンプルが結合領域１８のＩＬと接触す
ると、反応して被検体−ＩＬ錯体を作る。アルファ領域
部に付着したＣＬは、被検体または被検体−ＩＬ錯体と
共に、しかし反応はしないで、芯材パッドに沿って動
く。
【００６２】水性サンプルの液体前線が試験線２２に到
達すると、固定化したα領域部配位子の結合部位を巡る
争いが、ＣＬ、被検体−ＩＬ錯体、および錯体となって
いない被検体の間に発生する。説明のためにのみ、次例
では、対照試薬を黄色のラテックス・ビーズとし、標識
試薬をコロイド状金粒子とする。水性サンプル中に被検
体が無い場合、α領域部黄色ラテックス・ビーズ（Ｃ
Ｌ）のみが、試験線２２上に固定化されたα領域部に特
異的な配位子に付着し、試験線２２が黄色くなる。サン
プル中に少量の被検体がある場合、ＣＬおよびＩＬが、
試験線２２上に固定化されたα領域部に特異的な配位子
の限られた数の結合部位を巡って競合し、黄色のビーズ
が赤のコロイド状金錯体より優位になり、茶色となる。
被検体の濃度が上がるにつれ、被検体−ＩＬ錯体の濃度
も上がり、限られたα領域部に特異的な配位子結合部位
に対しより有効に競合し、試験線２２の色はより赤くな
る。
達すると、固定化したα領域部配位子の結合部位を巡る
争いが、ＣＬ、被検体−ＩＬ錯体、および錯体となって
いない被検体の間に発生する。説明のためにのみ、次例
では、対照試薬を黄色のラテックス・ビーズとし、標識
試薬をコロイド状金粒子とする。水性サンプル中に被検
体が無い場合、α領域部黄色ラテックス・ビーズ（Ｃ
Ｌ）のみが、試験線２２上に固定化されたα領域部に特
異的な配位子に付着し、試験線２２が黄色くなる。サン
プル中に少量の被検体がある場合、ＣＬおよびＩＬが、
試験線２２上に固定化されたα領域部に特異的な配位子
の限られた数の結合部位を巡って競合し、黄色のビーズ
が赤のコロイド状金錯体より優位になり、茶色となる。
被検体の濃度が上がるにつれ、被検体−ＩＬ錯体の濃度
も上がり、限られたα領域部に特異的な配位子結合部位
に対しより有効に競合し、試験線２２の色はより赤くな
る。
【００６３】前述の試験線２２の黄−茶−赤という色の
変遷は、半定量単独線試験の基礎をなす。類似の変遷
は、ラテックス・ビーズおよびコロイド状金を他の対比
標識試薬に置き換えることにより得ることができる。何
れの場合も、複数領域についても目視または他の方法で
検出可能な試験線２２、または色信号の変化により、試
験が陰性であるか陽性であるかが明らかになり、試験の
有効性の手順的対照として供せられる。
変遷は、半定量単独線試験の基礎をなす。類似の変遷
は、ラテックス・ビーズおよびコロイド状金を他の対比
標識試薬に置き換えることにより得ることができる。何
れの場合も、複数領域についても目視または他の方法で
検出可能な試験線２２、または色信号の変化により、試
験が陰性であるか陽性であるかが明らかになり、試験の
有効性の手順的対照として供せられる。
【００６４】試験線２２に入った後、結合していないサ
ンプルの成分および試薬は全て、多孔質膜１２を上昇し
続け、芯材として働きサンプルを上昇させる吸着パッド
３０に入り、これによって試験線２２の背景物質があれ
ば洗い流す。
ンプルの成分および試薬は全て、多孔質膜１２を上昇し
続け、芯材として働きサンプルを上昇させる吸着パッド
３０に入り、これによって試験線２２の背景物質があれ
ば洗い流す。
【００６５】Ｂ．捕捉領域を持ったサンドイッチ構造Ｌ
ＦＤ 高濃度の被検体用に、図１の試験線２２にサンプルが到
達する前に、被検体の一部を途中で捕まえる捕捉領域を
作成することにより、被検体を測定するレンジを増やす
ことができる。捕捉抗体または他の捕捉分子を芯材パッ
ド１４に付着させるか、または、例えば既知の方法によ
り多孔質膜１２上の空間２０に付着させる。捕捉分子に
より、被検体の一部を取り除くことによって、試験水溶
性サンプル中の被検体の濃度を下げ、それによって試験
線２２で検出される色または他の信号の変遷域が拡大す
る。捕捉領域で取り除かれた被検体の分画は、ＬＦＤ１
０および特定の被検体についての製造および品質管理の
工程の間に、経験的に確立することができる。
ＦＤ 高濃度の被検体用に、図１の試験線２２にサンプルが到
達する前に、被検体の一部を途中で捕まえる捕捉領域を
作成することにより、被検体を測定するレンジを増やす
ことができる。捕捉抗体または他の捕捉分子を芯材パッ
ド１４に付着させるか、または、例えば既知の方法によ
り多孔質膜１２上の空間２０に付着させる。捕捉分子に
より、被検体の一部を取り除くことによって、試験水溶
性サンプル中の被検体の濃度を下げ、それによって試験
線２２で検出される色または他の信号の変遷域が拡大す
る。捕捉領域で取り除かれた被検体の分画は、ＬＦＤ１
０および特定の被検体についての製造および品質管理の
工程の間に、経験的に確立することができる。
【００６６】ＡＭＺについては、単独試験ラインを持つ
サンドイッチ構造ＬＦＤ向けに、実施例８においてより
詳細に説明するが、ＡＭＺは試験のレンジを拡大するも
のである。また、ＡＭＺは他のサンドイッチ構造ＬＦＤ
形式にも用い、適用することができる。
サンドイッチ構造ＬＦＤ向けに、実施例８においてより
詳細に説明するが、ＡＭＺは試験のレンジを拡大するも
のである。また、ＡＭＺは他のサンドイッチ構造ＬＦＤ
形式にも用い、適用することができる。
【００６７】Ｃ．基準線を持ったサンドイッチ構造ＬＦ
Ｄ 図１のサンドイッチ形式ＬＦＤを変更して、図３に示す
ように参照線２２６を入れることもできる。機能上、参
照線２２６により被検体を微量含むサンプルを確認す
る。
Ｄ 図１のサンドイッチ形式ＬＦＤを変更して、図３に示す
ように参照線２２６を入れることもできる。機能上、参
照線２２６により被検体を微量含むサンプルを確認す
る。
【００６８】構造上、図３のＬＦＤ２１０と図１のＬＦ
Ｄ１０は、以下の点で異なる。結合領域２１８には異な
る２種類の背景試薬を使用している。第１の種類は、図
１について前述した目的の被検体のＣＬである。第２の
種類は、特異的捕捉結合対を持った捕捉可能な標識に対
比試薬を付着させて作る。こうした捕捉可能な標識と捕
捉結合対との一例としては、ビオチンとストレプトアビ
ジンである。他の適切な標識と結合対とは、当業界で既
知であり、標準方法で取り込むことができる。
Ｄ１０は、以下の点で異なる。結合領域２１８には異な
る２種類の背景試薬を使用している。第１の種類は、図
１について前述した目的の被検体のＣＬである。第２の
種類は、特異的捕捉結合対を持った捕捉可能な標識に対
比試薬を付着させて作る。こうした捕捉可能な標識と捕
捉結合対との一例としては、ビオチンとストレプトアビ
ジンである。他の適切な標識と結合対とは、当業界で既
知であり、標準方法で取り込むことができる。
【００６９】捕捉結合対を多孔質膜２１２上に固定化
し、参照線２２６を形成する。参照線２２６は、多孔質
膜２１２の第２端２３２にあり、結合領域２１８と吸着
パッド２３０の間にある。参照線２２６は通常、結合領
域より約２乃至４ｍｍ、吸着パッド２３０より約５乃至
５０ｍｍ離れており、多孔質膜２１２上に第１空間２２
４および第２空間２２８を作る。
し、参照線２２６を形成する。参照線２２６は、多孔質
膜２１２の第２端２３２にあり、結合領域２１８と吸着
パッド２３０の間にある。参照線２２６は通常、結合領
域より約２乃至４ｍｍ、吸着パッド２３０より約５乃至
５０ｍｍ離れており、多孔質膜２１２上に第１空間２２
４および第２空間２２８を作る。
【００７０】サンプルが、結合領域２１８より多孔質膜
２１２を上昇すると、背景試薬も一緒に移動する。α領
域部に結合した対象試薬は、図１について前述した被検
体−ＩＬ錯体と、ＡＴＺ２２２上の固定化したα領域部
に特異的な配位子結合部位を争う。捕捉標識に付着して
いる対照試薬は、参照線２２６に固定化した捕捉結合対
に結合する。
２１２を上昇すると、背景試薬も一緒に移動する。α領
域部に結合した対象試薬は、図１について前述した被検
体−ＩＬ錯体と、ＡＴＺ２２２上の固定化したα領域部
に特異的な配位子結合部位を争う。捕捉標識に付着して
いる対照試薬は、参照線２２６に固定化した捕捉結合対
に結合する。
【００７１】説明のためにのみ、対照試薬を黄色いラテ
ックス・ビーズとし、標識試薬をコロイド状金粒子とす
る。サンプル中に被検体が無い場合、参照線２２６と試
験線２２２の色は同じである。サンプル中に被検体があ
ると、参照線２２６は黄色で、一方試験線２２２は、サ
ンプル中の被検体の濃度により、茶から赤の間の色とな
る。したがって、参照線２２６の色により、試験線２２
２の色との色比較の基準ができる。類似の基準線と試験
線の比較を、他の対照および標識試薬を用いて行うこと
ができる。
ックス・ビーズとし、標識試薬をコロイド状金粒子とす
る。サンプル中に被検体が無い場合、参照線２２６と試
験線２２２の色は同じである。サンプル中に被検体があ
ると、参照線２２６は黄色で、一方試験線２２２は、サ
ンプル中の被検体の濃度により、茶から赤の間の色とな
る。したがって、参照線２２６の色により、試験線２２
２の色との色比較の基準ができる。類似の基準線と試験
線の比較を、他の対照および標識試薬を用いて行うこと
ができる。
【００７２】Ｄ．複数試験線を持ったサンドイッチ構造
ＬＦＤ 水性サンプル中の免疫学的に反応する大型分子被検体の
定量および滴定用の、複数並行試験領域を持ったサンド
イッチＬＦＤ形式を図２に図示した。この形式により、
色の移行帯の位置と相関した目盛を用いて、ユーザーは
被検体を０および低濃度から高濃度まで定量することが
できる。ＡＴＺ上の限られた数の固定化した結合部位へ
の被検体−ＩＬ錯体の結合により、発現した参照線は多
孔質膜上で検出可能である。
ＬＦＤ 水性サンプル中の免疫学的に反応する大型分子被検体の
定量および滴定用の、複数並行試験領域を持ったサンド
イッチＬＦＤ形式を図２に図示した。この形式により、
色の移行帯の位置と相関した目盛を用いて、ユーザーは
被検体を０および低濃度から高濃度まで定量することが
できる。ＡＴＺ上の限られた数の固定化した結合部位へ
の被検体−ＩＬ錯体の結合により、発現した参照線は多
孔質膜上で検出可能である。
【００７３】複数並行試験線を用いると、被検体の濃度
の滴定が可能となる。被検体のレベルがゼロまたは閾値
以下であると、行列内に線ができない。ＩＬが少量な
ら、一番目または二番目の線で完全に捕捉される。被検
体が多量であると、被検体は結合部位を順次飽和しなが
ら、後方の線に捕捉される。それゆえ、色信号の変遷パ
ターンにより、被検体を定量する。
の滴定が可能となる。被検体のレベルがゼロまたは閾値
以下であると、行列内に線ができない。ＩＬが少量な
ら、一番目または二番目の線で完全に捕捉される。被検
体が多量であると、被検体は結合部位を順次飽和しなが
ら、後方の線に捕捉される。それゆえ、色信号の変遷パ
ターンにより、被検体を定量する。
【００７４】ＬＦＤ１１０は、ニトロセルロース、ガラ
ス繊維、ナイロンまたは他の適当な物質でできた多孔質
膜１１２を含む。多孔質膜１１２の大きさは臨界的では
なく、所望の速度結果および積極的結果を得るのに必要
であれば、変更してもよい。
ス繊維、ナイロンまたは他の適当な物質でできた多孔質
膜１１２を含む。多孔質膜１１２の大きさは臨界的では
なく、所望の速度結果および積極的結果を得るのに必要
であれば、変更してもよい。
【００７５】図２に示す通り、芯材パッド１１４は、膜
１１２の一端１１６で多孔質膜１１２と重なっており、
多孔質膜１１２と液移送接触している。芯材パッド１１
４を、ガラス繊維、繊維状セルロースまたは他の適当な
素材で作ることができる。
１１２の一端１１６で多孔質膜１１２と重なっており、
多孔質膜１１２と液移送接触している。芯材パッド１１
４を、ガラス繊維、繊維状セルロースまたは他の適当な
素材で作ることができる。
【００７６】ＬＦＤ１１０は、結合領域１１８を含む。
図２において、図１同様、結合領域１１８は芯材パッド
１１４または多孔質膜１１２の一部であるか、芯材パッ
ド１１８または多孔質膜１１２と液移送接触した１以上
の分離したの試薬パッドでありえる。芯材パッド１１
４、多孔質膜１１２および結合領域１１８を当業界で既
知の方法により固定できる。
図２において、図１同様、結合領域１１８は芯材パッド
１１４または多孔質膜１１２の一部であるか、芯材パッ
ド１１８または多孔質膜１１２と液移送接触した１以上
の分離したの試薬パッドでありえる。芯材パッド１１
４、多孔質膜１１２および結合領域１１８を当業界で既
知の方法により固定できる。
【００７７】結合領域１１８には二つの試薬を含む。第
１の試薬は、標識対照試薬である。例えば、それは乾燥
し、着色した、液体を分散可能な、拡散可能なラテック
ス・ビーズである。標識は、例えばビオチンとストレプ
トアビジンのような、特定の結合対を持つものである。
該ビーズは通常明色で、例えば黄色である。着色したラ
テックス・ビーズの代替としては、対照試薬は、明色の
色素分子、酵素と色素の組み合わせ、または蛍光性、発
光性、もしくは放射性分子であってもよい。
１の試薬は、標識対照試薬である。例えば、それは乾燥
し、着色した、液体を分散可能な、拡散可能なラテック
ス・ビーズである。標識は、例えばビオチンとストレプ
トアビジンのような、特定の結合対を持つものである。
該ビーズは通常明色で、例えば黄色である。着色したラ
テックス・ビーズの代替としては、対照試薬は、明色の
色素分子、酵素と色素の組み合わせ、または蛍光性、発
光性、もしくは放射性分子であってもよい。
【００７８】結合領域１１８に含まれる第２の試薬は、
乾燥した、復元可能な、液体を分散可能な、拡散可能な
標識試薬で、分析する大型分子非検体のある領域（「β
領域」）に固有の結合配位子に付着したものである。標
識試薬は、コロイド状金粒子、酵素／色素の組み合わ
せ、着色したラテックス・ビーズ、炭素粒子、または蛍
光性、発光性、もしくは放射性分子で、目視または他の
方法で対照試薬と区別できるものである。
乾燥した、復元可能な、液体を分散可能な、拡散可能な
標識試薬で、分析する大型分子非検体のある領域（「β
領域」）に固有の結合配位子に付着したものである。標
識試薬は、コロイド状金粒子、酵素／色素の組み合わ
せ、着色したラテックス・ビーズ、炭素粒子、または蛍
光性、発光性、もしくは放射性分子で、目視または他の
方法で対照試薬と区別できるものである。
【００７９】第１および第２試薬の一方または両方を、
試験サンプルと接触する前に、結合領域１１８に均一に
含浸させるか、または分散させる。あるいは、例えば、
結合領域１１８を一方または両方の試薬で被覆し、サン
プルが接触すると該試薬を結合領域１１８全体に分散す
るようにできる。または、該２試薬を結合領域１１８の
縦方向に離して置き、サンプルが接すると共役体全体に
分散するようにもできる。
試験サンプルと接触する前に、結合領域１１８に均一に
含浸させるか、または分散させる。あるいは、例えば、
結合領域１１８を一方または両方の試薬で被覆し、サン
プルが接触すると該試薬を結合領域１１８全体に分散す
るようにできる。または、該２試薬を結合領域１１８の
縦方向に離して置き、サンプルが接すると共役体全体に
分散するようにもできる。
【００８０】図２に示す通り、ＬＦＤ１１０は、２から
２０の間、通常約７つの複数試験線、結合領域１１８と
試験線１２２との間の空間１２０、および試験線１２２
と多孔質幕の第２端１３２にある吸着パッド１３０を含
む。試験線１２２は、目的の被検体の第２領域（α領
域）に特異的な結合配位子で、多孔質膜１１２上に固定
化されている。大型分子被検体のαおよびβ領域は別個
の非交差反応単位でなければならない。
２０の間、通常約７つの複数試験線、結合領域１１８と
試験線１２２との間の空間１２０、および試験線１２２
と多孔質幕の第２端１３２にある吸着パッド１３０を含
む。試験線１２２は、目的の被検体の第２領域（α領
域）に特異的な結合配位子で、多孔質膜１１２上に固定
化されている。大型分子被検体のαおよびβ領域は別個
の非交差反応単位でなければならない。
【００８１】対照線１４８を多孔質膜１３２上で端部１
３２の近くに置く。該対照線１４８には、背景試薬に付
着した標識（例えばビオチン）の固定化した結合対（例
えばストレプトアビジン）を含む。
３２の近くに置く。該対照線１４８には、背景試薬に付
着した標識（例えばビオチン）の固定化した結合対（例
えばストレプトアビジン）を含む。
【００８２】吸着パッド１３０は、ガラス繊維、繊維状
セルロース、または多孔質膜１１２と液移送接触した他
の適当な物質であってよい。該吸着パッド１３０は、未
反応試薬およびサンプルを捕集し、試験線１２２よりい
かなる背景物質をも取り除く芯材として働く。
セルロース、または多孔質膜１１２と液移送接触した他
の適当な物質であってよい。該吸着パッド１３０は、未
反応試薬およびサンプルを捕集し、試験線１２２よりい
かなる背景物質をも取り除く芯材として働く。
【００８３】被検体を含む試験サンプルは、毛管現象に
より、図２に示す芯材パッド１１４に沿い結合領域１８
に向かって動く。サンプルが結合領域１１８のＩＬと接
触すると、反応して被検体−ＩＬ錯体を作る。標識対照
試薬は、被検体−ＩＬ錯体またはＩＬと共に、しかし反
応はしないで、芯材パッド１１４に沿って動く。サンプ
ルの液体前線が試験線１２２に到達すると、被検体−Ｉ
Ｌ錯体および全ての錯体となっていない被検体のみが、
試験線１２２上に固定化されたα領域に特異的な配位子
に結合する。
より、図２に示す芯材パッド１１４に沿い結合領域１８
に向かって動く。サンプルが結合領域１１８のＩＬと接
触すると、反応して被検体−ＩＬ錯体を作る。標識対照
試薬は、被検体−ＩＬ錯体またはＩＬと共に、しかし反
応はしないで、芯材パッド１１４に沿って動く。サンプ
ルの液体前線が試験線１２２に到達すると、被検体−Ｉ
Ｌ錯体および全ての錯体となっていない被検体のみが、
試験線１２２上に固定化されたα領域に特異的な配位子
に結合する。
【００８４】説明のためにのみ、背景試薬を黄色のラテ
ックス・ビーズとし、対比試薬をコロイド状金粒子とす
る。被検体が無い場合、試験線に色は無く、あるいは見
えない。水性サンプル中の被検体の濃度が上がるにつ
れ、被検体−ＩＬ錯体の濃度も上がり、試験線１２２の
多くを赤くしながら、試験線１２２の限られた数のα領
域部に特異的な配位子結合部位を飽和する。
ックス・ビーズとし、対比試薬をコロイド状金粒子とす
る。被検体が無い場合、試験線に色は無く、あるいは見
えない。水性サンプル中の被検体の濃度が上がるにつ
れ、被検体−ＩＬ錯体の濃度も上がり、試験線１２２の
多くを赤くしながら、試験線１２２の限られた数のα領
域部に特異的な配位子結合部位を飽和する。
【００８５】標識黄色ラテックス・ビーズは移動を続
け、参照線１４８上に固定化された標識の結合対と反応
する。参照線１４８は、被検体があっても無くてもどち
らでも着色する。参照線１４８の色は試験線１２２の色
と異なる。試験線１２２および参照線１４８を通過した
後、サンプルは多孔質膜１１２を上昇し続け、未反応の
試薬およびサンプルを捕捉し、芯材として働いて試験線
領域１２２より全ての背景物質を取り除く、吸着パッド
３０に達する。
け、参照線１４８上に固定化された標識の結合対と反応
する。参照線１４８は、被検体があっても無くてもどち
らでも着色する。参照線１４８の色は試験線１２２の色
と異なる。試験線１２２および参照線１４８を通過した
後、サンプルは多孔質膜１１２を上昇し続け、未反応の
試薬およびサンプルを捕捉し、芯材として働いて試験線
領域１２２より全ての背景物質を取り除く、吸着パッド
３０に達する。
【００８６】尿サンプル中のｈＣＧの検出に用いた、前
述のＬＦＤの例を、後述の実施例８．９および１０にあ
げた。
述のＬＦＤの例を、後述の実施例８．９および１０にあ
げた。
【００８７】ＡＴＺの複数試験線（図２の領域１２２に
示す）は、図１および３の形式で用いることもでき、次
いでＡＴＺの結果の色または信号の変遷パターンを既知
の被検体濃度のパターンと比較する。
示す）は、図１および３の形式で用いることもでき、次
いでＡＴＺの結果の色または信号の変遷パターンを既知
の被検体濃度のパターンと比較する。
【００８８】実施例８ 単独試験線を持ったサンドイッチ構造ＬＦＤ 試験片の調製 ガラス繊維結合パッド上のコロイド状金に結合した乾燥
抗ベータｈＣＧモノクロナール抗体を含む妊娠検査紙
（ＳＡサイエンティフィック、テキサス州サンアントニ
オ）を得た。これらの検査紙は、図１に図示したものに
似たニトロセルロース膜上の、試験線上に固定化した抗
アルファｈＣＧを、対照線上に抗マウスＩｇＧを含んで
いた。結合パッドをカミソリの刃を使って、そのままの
状態で、慎重に取り除いた。図１の空間２０に対応す
る、ニトロセルロース膜の領域に、異なる量のモノクロ
ナール抗ベータｈＣＧ捕捉抗体（０、２５０、５００、
１０００、２０００ｎｇ）を加え、乾燥し、洗浄し、再
度乾燥した。
抗ベータｈＣＧモノクロナール抗体を含む妊娠検査紙
（ＳＡサイエンティフィック、テキサス州サンアントニ
オ）を得た。これらの検査紙は、図１に図示したものに
似たニトロセルロース膜上の、試験線上に固定化した抗
アルファｈＣＧを、対照線上に抗マウスＩｇＧを含んで
いた。結合パッドをカミソリの刃を使って、そのままの
状態で、慎重に取り除いた。図１の空間２０に対応す
る、ニトロセルロース膜の領域に、異なる量のモノクロ
ナール抗ベータｈＣＧ捕捉抗体（０、２５０、５００、
１０００、２０００ｎｇ）を加え、乾燥し、洗浄し、再
度乾燥した。
【００８９】ｈＣＧ（２０ｎｇ／ｍｇラテックス）のア
フィニティ精製したα領域と共有結合させた１０ｍｇ／
ｍｌ黄色ラテックス／ビーズ溶液（粒径２００ｎｍ、カ
ルボキシル化したもの）を合計で３μｌ（１滴０．２μ
ｌ）用いて、結合パッドを慎重かつ均一に被膜した。次
いでパッドを５０℃で乾燥した。その後、結合パッドを
変更した試験片の元の位置に戻し、セロハンテープで固
定した。
フィニティ精製したα領域と共有結合させた１０ｍｇ／
ｍｌ黄色ラテックス／ビーズ溶液（粒径２００ｎｍ、カ
ルボキシル化したもの）を合計で３μｌ（１滴０．２μ
ｌ）用いて、結合パッドを慎重かつ均一に被膜した。次
いでパッドを５０℃で乾燥した。その後、結合パッドを
変更した試験片の元の位置に戻し、セロハンテープで固
定した。
【００９０】試験手順 陰性の尿サンプルをｈＣＧと共にスパイクし、０、２
５、２２５、４５０．１１００、２５００、１０，００
０および１００，０００ｍＩＵ／ｍｌの濃度を得た。ス
パイクした８つの尿サンプルのそれぞれより０．３ｍｌ
を別個のミクロチューブに加えた。各試験片の芯材パッ
ドを尿と接して置いた。各試験片は、規定量の固定化し
た捕捉抗体および前述の共役パッドを含んでいた。
５、２２５、４５０．１１００、２５００、１０，００
０および１００，０００ｍＩＵ／ｍｌの濃度を得た。ス
パイクした８つの尿サンプルのそれぞれより０．３ｍｌ
を別個のミクロチューブに加えた。各試験片の芯材パッ
ドを尿と接して置いた。各試験片は、規定量の固定化し
た捕捉抗体および前述の共役パッドを含んでいた。
【００９１】５分後に、各試験片上のＡＴＺを、黄
（Ｙ）、茶（Ｂ）、赤茶（ＲＢ）または赤（Ｒ）という
色のタイプにより視覚的に記録した。試験結果を表５に
まとめる。
（Ｙ）、茶（Ｂ）、赤茶（ＲＢ）または赤（Ｒ）という
色のタイプにより視覚的に記録した。試験結果を表５に
まとめる。
【００９２】表５の結果は、黄色のラテックスと赤のコ
ロイド状金の組み合わせ使用により半定量の可能性があ
ることを示している。また、この結果より、ＡＭＺ中の
固定化した抗βモノクロナール抗体のより高いレベル
で、過剰のｈＣＧを取り除くことにより、茶色の線で示
される濃度のレンジを改善できることが分かる。余分な
抗体が感度を損なうことはなく、コロイド状金の試験線
への非特異的な結合のため擬陽性はなかった。抗βｈＣ
Ｇ捕捉抗体が１０００および２０００ｎｇの時、茶色は
１０００ｍＩＵ／ｍｌに拡大した。これは、０ｎｇのコ
ントロール抗体片に見られるレンジの３乃至５倍にあた
る。
ロイド状金の組み合わせ使用により半定量の可能性があ
ることを示している。また、この結果より、ＡＭＺ中の
固定化した抗βモノクロナール抗体のより高いレベル
で、過剰のｈＣＧを取り除くことにより、茶色の線で示
される濃度のレンジを改善できることが分かる。余分な
抗体が感度を損なうことはなく、コロイド状金の試験線
への非特異的な結合のため擬陽性はなかった。抗βｈＣ
Ｇ捕捉抗体が１０００および２０００ｎｇの時、茶色は
１０００ｍＩＵ／ｍｌに拡大した。これは、０ｎｇのコ
ントロール抗体片に見られるレンジの３乃至５倍にあた
る。
【００９３】実施例９ 参照ラインを持ったサンドイッチ構造ＬＦＤ 参照線試験線片の調製 固定化したストレプトアビジンを含んだ参照線を持つ妊
娠準備片（ＳＡサイエンティフィック、テキサス州サン
アントニオ）は、図３に対応する試験片の準備の間、パ
ッドの損傷を避けるため、該妊娠片より結合したパッド
を一時的に取り外す必要があった。各結合パッドが取り
外されている一方、３μｌのビオチンで標識した黄色ラ
テックス・ビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびｈＣＧ（１
０ｍｇ／ｍｌ）のα領域部に共有的に結合した黄色ラテ
ックス・ビーズの被膜を、前述の実施例８に従って、試
薬パッドに加えた。
娠準備片（ＳＡサイエンティフィック、テキサス州サン
アントニオ）は、図３に対応する試験片の準備の間、パ
ッドの損傷を避けるため、該妊娠片より結合したパッド
を一時的に取り外す必要があった。各結合パッドが取り
外されている一方、３μｌのビオチンで標識した黄色ラ
テックス・ビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびｈＣＧ（１
０ｍｇ／ｍｌ）のα領域部に共有的に結合した黄色ラテ
ックス・ビーズの被膜を、前述の実施例８に従って、試
薬パッドに加えた。
【００９４】受動的吸着または当業界で既知の方法を用
いて、多孔質膜上に直接ストレプトアビジンを固定化す
ることにより、参照線２２６を調製できる。
いて、多孔質膜上に直接ストレプトアビジンを固定化す
ることにより、参照線２２６を調製できる。
【００９５】試験手順 ０．２５および１０，０００ｍＩＵ／ｍｌのサンプルの
みを分析したことを除けば、試験手順は実施例８のもの
と同一である。
みを分析したことを除けば、試験手順は実施例８のもの
と同一である。
【００９６】試験結果 陰性のサンプルでは、試験線２２２の黄色と参照線２２
６とは区別不能であった。２５ｍＩＵ／ｍｌサンプルで
は、黄色い参照線と比較して、わずかに茶色を呈してい
た。１０，０００ｍＩＵ／ｍｌのサンプルでは、はっき
りした赤色の試験線と黄色い参照線が生じた。
６とは区別不能であった。２５ｍＩＵ／ｍｌサンプルで
は、黄色い参照線と比較して、わずかに茶色を呈してい
た。１０，０００ｍＩＵ／ｍｌのサンプルでは、はっき
りした赤色の試験線と黄色い参照線が生じた。
【００９７】実施例１０ 複数試験線ＡＴＺを持ったサンドイッチ構造ＬＦＤ 試験線の調製 ニトロセルロース上に１ｍｍ間隔の７本の抗アルファｈ
ＣＧ抗体試験線を持った、図２に対応する特注の試験線
を調製した。ストレプトアビジンの線を、実施例２の参
照線２２６と同様にして、参照線１４８上に固定化し
た。
ＣＧ抗体試験線を持った、図２に対応する特注の試験線
を調製した。ストレプトアビジンの線を、実施例２の参
照線２２６と同様にして、参照線１４８上に固定化し
た。
【００９８】ビオチン（１０ｍｇ／ｍｌを３ｍｌ）と共
役した黄色ラテックスＢＳＡを抗ベータｈＣＧモノクロ
ナール抗体―コロイド状金処理共役パッドに加え、風乾
した。該パッドをセロハンテープにより試験片に固定し
た。
役した黄色ラテックスＢＳＡを抗ベータｈＣＧモノクロ
ナール抗体―コロイド状金処理共役パッドに加え、風乾
した。該パッドをセロハンテープにより試験片に固定し
た。
【００９９】７本の試験線１２２を実施例１の試験線２
２と同様にして調製した。
２と同様にして調製した。
【０１００】試験手順 以下の手順を前述のように調製した試験片を用いて３回
実施した。異なる量（０乃至５１、２００ｍＩＵ／ｍ
ｌ）のｈＣＧと共にスパイクしたｈＣＧ陰性の尿０．５
ｍｌに該片を浸漬した。該片を１０分間現像した。次い
で、該片を５０℃で２時間乾燥し、Ｙｘｙカラー・フィ
ールドを用いた比色計（ミノルタＣＲ−２４１、０．３
識別口径）により色強度を測定した。その後、Ｙ色空間
に対する最初の４本の合計（１乃至４の純量）を用いて
信号強度を計算した。データを表６に示す。図４に示す
ように、１乃至４の純量とｈＣＧ濃度の対数についてプ
ロットした。最小自乗フィッティングを用い、試験した
各ｈＣＧ濃度についてそのフィッティングから値を計算
し、既知の値（表７）と比較した。目に見える最後の赤
い線を含む線の番号による視覚的識別を前述の現像した
試験片に対して実施した。結果を表８にまとめ、平均値
を図５にプロットした。
実施した。異なる量（０乃至５１、２００ｍＩＵ／ｍ
ｌ）のｈＣＧと共にスパイクしたｈＣＧ陰性の尿０．５
ｍｌに該片を浸漬した。該片を１０分間現像した。次い
で、該片を５０℃で２時間乾燥し、Ｙｘｙカラー・フィ
ールドを用いた比色計（ミノルタＣＲ−２４１、０．３
識別口径）により色強度を測定した。その後、Ｙ色空間
に対する最初の４本の合計（１乃至４の純量）を用いて
信号強度を計算した。データを表６に示す。図４に示す
ように、１乃至４の純量とｈＣＧ濃度の対数についてプ
ロットした。最小自乗フィッティングを用い、試験した
各ｈＣＧ濃度についてそのフィッティングから値を計算
し、既知の値（表７）と比較した。目に見える最後の赤
い線を含む線の番号による視覚的識別を前述の現像した
試験片に対して実施した。結果を表８にまとめ、平均値
を図５にプロットした。
【０１０１】試験結果 複数試験線形式により、尿中のｈＣＧレベルを定量する
ことが可能になる。計算値と既知の値とは、０．６乃至
２６．３％のレンジで、平均で１３％異なっていた。視
覚的半定量法により、ユーザーは５０ｍＩＵ／ｍｌから
５０，０００ｍＩＵ／ｍｌ以上の幅のｈＣＧを５乃至７
の濃度レンジに区分することができる。
ことが可能になる。計算値と既知の値とは、０．６乃至
２６．３％のレンジで、平均で１３％異なっていた。視
覚的半定量法により、ユーザーは５０ｍＩＵ／ｍｌから
５０，０００ｍＩＵ／ｍｌ以上の幅のｈＣＧを５乃至７
の濃度レンジに区分することができる。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
【表８】
【０１０６】本発明を前記の詳細な説明および実施例を
参照して説明してきたが、本発明の精神を離れることな
く様々な改良を加えることができるのを理解しなければ
ならない。
参照して説明してきたが、本発明の精神を離れることな
く様々な改良を加えることができるのを理解しなければ
ならない。
【図１】大型分子の被検体の半定量法に適合する、単独
試験ラインを持ったサンドイッチ構造ＬＦＤの略図であ
る。
試験ラインを持ったサンドイッチ構造ＬＦＤの略図であ
る。
【図２】大型分子の被検体の半定量法に適合する、複数
試験ラインを持ったサンドイッチ構造のＬＦＤの略図で
ある。この特別な構成には、対照ラインを含む。
試験ラインを持ったサンドイッチ構造のＬＦＤの略図で
ある。この特別な構成には、対照ラインを含む。
【図３】参照ラインを持ったサンドイッチ構成のＬＦＤ
の他の実施態様の略図である。
の他の実施態様の略図である。
【図４】ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の濃度を
高めた複数試験ラインの構成（図２に示した）の、ミノ
ルタＣＲ−２４１色分析器により測定したライン１乃至
４の合計の色強度の平均を最小自乗法で近似したグラフ
図である。
高めた複数試験ラインの構成（図２に示した）の、ミノ
ルタＣＲ−２４１色分析器により測定したライン１乃至
４の合計の色強度の平均を最小自乗法で近似したグラフ
図である。
【図５】ｈＣＧの濃度を高めた複数線構成（図２に示し
た）において視覚的に見られた平均持続直線のグラフ図
である。
た）において視覚的に見られた平均持続直線のグラフ図
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｆ 7/18 Ｃ０７Ｆ 7/18 Ｎ Ｑ (72)発明者 ホイイン ウォン アメリカ合衆国 オレゴン州 97219 ポ ートランド エスダブリュー セカンド アヴェニュー 9824 (72)発明者 ティモシー パトリック ハイアット アメリカ合衆国 オレゴン州 97115 ダ ンディー エスダブリュー セヴンス ス トリート 240 (72)発明者 ポール アンドリュー ミューグラー アメリカ合衆国 オレゴン州 97223 ポ ートランド エスダブリュー ドーヴァー レイン 5110 Ｆターム(参考） 4C090 AA02 BA28 BB92 DA12 DA25 4H049 VN01 VP01 VP02 VQ37 VQ48 VQ78 VR21 VR43 VU31 VU32 VW02
Claims (58)
- 【請求項１】 構造式 【化１】 を有する共役体であって、式中、Ｘが水酸基を有する固
相物質；Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ（ＣＨ２）ｍ）ｐで
表され、ｎは２乃至８、ｍは２乃至８、ｐは０乃至３で
あり、Ｒ６がアルキル基、環式アルキル基、芳香族基ま
たはヘテロ環式基からなる群より選択され、０乃至８の
水酸基、ヒドロキシカルボニル基またはアミノカルボニ
ル基を含み、およびＱが遊離第１または第２アミン基を
含むいずれかの分子である、共役体。 - 【請求項２】 Ｘがニトロセルロース、セルロース、ガ
ラス繊維または多孔質ガラスビーズからなる群より選択
された、請求項１の共役体。 - 【請求項３】 Ｘがニトロセルロースである、請求項２
の共役体。 - 【請求項４】 Ｒ５がプロピル基である、請求項１の共
役体。 - 【請求項５】 Ｒ６がアルキル基である、請求項１の共
役体。 - 【請求項６】 Ｒ６がエチル基である、請求項５の共役
体。 - 【請求項７】 Ｑが、遊離第１または第２アミン基をそ
れ自体に含む分子、あるいは遊離第１または第２アミン
基が共有結合している分子からなる群より選択された、
請求項１の共役体。 - 【請求項８】 Ｑが遊離第１アミン基をそれ自体に含
む、請求項７の共役体。 - 【請求項９】 構造式 【化２】 を有する共役体であって、式中、Ｘが水酸基を有する固
相物質；Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ（ＣＨ２）ｍ）ｐで
あり、ｎは２乃至８、ｍは２乃至８、ｐは０乃至３であ
り、Ｒ７がアルキル基、環式アルキル基、芳香族基また
はヘテロ環式基からなる群より選択され、０乃至８の水
酸基、ヒドロキシカルボニル基またはアミノカルボニル
基を含み、およびＬがスルフヒドリル基を含むいずれか
の分子である、共役体。 - 【請求項１０】 Ｘがニトロセルロース、セルロース、
ガラス繊維または多孔質ガラスビーズからなる群より選
択された、請求項９の共役体。 - 【請求項１１】 Ｘがニトロセルロースである、請求項
１０の共役体。 - 【請求項１２】Ｒ５がプロピル基である、請求項９の共
役体。 - 【請求項１３】 Ｒ７がスクシンイミジルアルキル基で
ある、請求項９の共役体。 - 【請求項１４】 Ｒ７がスクシンイミジルブチル基であ
る、請求項１３の共役体。 - 【請求項１５】 Ｌが、スルフヒドリル基をそれ自体に
含む分子、またはスルフヒドリル基が共有結合できる分
子からなる群より選択された、請求項９の共役体。 - 【請求項１６】 Ｌがスルフヒドリル基をそれ自体に含
む、請求項１５の共役体。 - 【請求項１７】 請求項１の共役体を調製する方法で、
該方法が、構造式 【化３】 を有する化学的誘導体固相物質へ水溶液でＱを適用し、 該固相物質を乾燥し、 該乾燥した固相物質を洗浄し、かつ該洗浄した固相物質
を再乾燥することからなり、式中、Ｘが水酸基を有する
固相物質であり、Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ（ＣＨ２）
ｍ） ｐで、ｎは２乃至８、ｍは２乃至８、ｐは０乃至３
であり、Ｒ６がアルキル基、環式アルキル基、芳香族基
またはヘテロ環式基からなる群より選択され、０乃至８
個の水酸基、ヒドロキシカルボニル基またはアミノカル
ボニル基を含み、ならびにＹおよびＺがそれぞれ独立に
水素、アルキルカルボニル基、芳香族カルボニル基また
はヘテロ環式カルボニル基であり、あるいはＮ、Ｙ、Ｚ
が一緒になってスクシンイミジル、ベンゾトリアゾリー
ル、またはそれらの誘導体である、方法。 - 【請求項１８】 Ｘがニトロセルロース、セルロース、
ガラス繊維または多孔質ガラスビーズからなる群より選
択された、請求項９の方法。 - 【請求項１９】 Ｘがニトロセルロースである、請求項
１８の方法。 - 【請求項２０】 Ｒ５がプロピル基である、請求項１７
の方法。 - 【請求項２１】 Ｒ６がアルキル基である、請求項１７
の方法。 - 【請求項２２】 Ｒ６がエチル基である、請求項２１の
方法。 - 【請求項２３】 Ｎ、ＹおよびＺが一緒になってスクシ
ンイミドである、請求項１７の方法。 - 【請求項２４】 Ｎ、ＹおよびＺが一緒になってＮ−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールである、請求項２３の方法 - 【請求項２５】 請求項９の共役体を調製する方法で、
該方法が構造式 【化４】 を有する化学的誘導体固相物質へ水溶液でＬを適用し、 該固相物質を乾燥し、 該乾燥した固相物質を洗浄し、かつ該洗浄した固相物質
を再乾燥することからなり、式中、Ｘが水酸基を有する
固相物質であり、Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ（ＣＨ２）
ｍ） ｐで、ｎは２乃至８、ｍは２乃至８、ｐは０乃至３
であり、Ｒ７がアルキル基、環式アルキル基、芳香族基
またはヘテロ環式基からなる群より選択され、０乃至８
個の水酸基、ヒドロキシカルボニル基またはアミノカル
ボニル基を含み、かつＪがクロライド基、ブロミド基、
ヨージド基、クロロアセトアミジル基、ブロモアセトア
ミジル基、ヨードアセトアミジル基、マレイミジル基か
らなる群より選択された、方法。 - 【請求項２６】 Ｘがニトロセルロース、セルロース、
ガラス繊維または多孔質ガラスビーズからなる群より選
択された、請求項２５の方法。 - 【請求項２７】 Ｘがニトロセルロースである、請求項
２６の方法。 - 【請求項２８】 Ｒ５がプロピル基である、請求項２５
の方法。 - 【請求項２９】 Ｒ７がアルキル基である、請求項２５
の方法。 - 【請求項３０】 Ｒ７がブチル基である、請求項２９の
方法。 - 【請求項３１】 Ｊが、ヨードアセトアミジル基であ
る、請求項２５の方法。 - 【請求項３２】 Ｊがマレイミジル基である、請求項２
５の方法。 - 【請求項３３】 構造式 【化５】 を有する共役体を含む横流装置であって、式中、Ｘが水
酸基を有する固相物質であり、Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（Ｎ
Ｈ（ＣＨ２）ｍ） ｐで、ｎは２乃至８、ｍは２乃至８、
ｐは０乃至３であり、Ｒ７がアルキル基、環式アルキル
基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる群より選択さ
れ、０乃至８個の水酸基、ヒドロキシカルボニル基また
はアミノカルボニル基を含み、かつＱが遊離第１または
第２アミン基を含むいずれかの分子である、横流装置。 - 【請求項３４】 Ｘがニトロセルロース、セルロース、
ガラス繊維または多孔質ガラスビーズからなる群より選
択された、請求項３３の装置。 - 【請求項３５】 Ｘがニトロセルロースである、請求項
３４の装置。 - 【請求項３６】 Ｒ５がプロピル基である、請求項３３
の装置。 - 【請求項３７】 Ｒ６がアルキル基である、請求項３３
の装置。 - 【請求項３８】 Ｒ６がエチル基である、請求項３６の
装置。 - 【請求項３９】 Ｑが、遊離第１または第２アミン基を
それ自体に含む分子、あるいは第１または第２アミン基
が共有結合している分子からなる群より選択された、請
求項３３の装置。 - 【請求項４０】 Ｑが遊離第１アミン基をそれ自体に含
む、請求項３８の装置。 - 【請求項４１】 構造式 【化６】 を有する共役体を含む横流装置であって、式中、Ｘが水
酸基を有する固相物質であり、Ｒ５が（ＣＨ２）ｎ（Ｎ
Ｈ（ＣＨ２）ｍ）ｐで、ｎは２乃至８、ｍは２乃至８、
ｐは０乃至３であり、Ｒ７がアルキル基、環式アルキル
基、芳香族基またはヘテロ環式基からなる群より選択さ
れ、０乃至８の水酸基、ヒドロキシカルボニル基または
アミノカルボニル基を含み、かつＬがスルフヒドリル基
を含む分子のいずれかである、横流装置。 - 【請求項４２】 Ｘがニトロセルロース、セルロース、
ガラス繊維または多孔質ガラスビーズからなる群より選
択された、請求項４１の装置。 - 【請求項４３】 Ｘがニトロセルロースである、請求項
４２の装置。 - 【請求項４４】 Ｒ５がプロピル基である、請求項４１
の装置。 - 【請求項４５】 Ｒ７がスクシンイミジルアルキル基で
ある、請求項４１の装置。 - 【請求項４６】 Ｒ７がスクシンイミジルブチル基であ
る、請求項４１の装置。 - 【請求項４７】 Ｌが、スルフヒドリル基をそれ自体に
含む分子、またはスルフヒドリル基が共有結合できる分
子からなる群より選択された、請求項４１の装置。 - 【請求項４８】 Ｌがスルフヒドリル基をそれ自体に含
む、請求項４７の装置。 - 【請求項４９】 横流装置を用いた生物学的サンプル中
の被検体を定量的または半定量的に決定する装置で、該
被検体が、固定化した結合配位子と結合するα領域およ
び標識結合配位子と結合するβ領域の二つの結合領域を
含み、該装置が、標識結合配位子および対照結合配位子
を含むパッドであって、該標識結合配位子が、視覚的、
分光光度的、比色的または蛍光的な特性を持った標識信
号生成系を含み、該標識結合配位子が被検体のβ領域に
特異的な結合配位子を表面に固定化しており、該対照結
合配位子が視覚的、分光光度的、比色的または蛍光的な
特性を持った対照信号生成系で、該標識配位子とスペク
トルの異なる領域で対照をなす生成系を含み、該対照結
合配位子が、固定化した結合配位子に特異的に結合する
分子領域をその表面に固定化している、パッドと、 該パッドおよび該サンプルと液移送接触している多孔質
膜で、標識結合配位子および対照結合配位子が毛管現象
により該多孔質膜を通って拡散する多孔質膜と、 および、多孔質膜上の被検体試験領域とからなり、被検
体試験領域が一定の限定数の固定化したα領域に特異的
な結合部位を含み、該限定数の固定化したα領域に特異
的な結合部位が、構造式 【化７】 を有する共役体と反応して、該多孔質膜上に固定化され
ており、式中、Ｘが水酸基を有する固相物質であり、Ｒ
５が（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ（ＣＨ２）ｍ） ｐで、ｎは２乃
至８、ｍは２乃至８、ｐは０乃至３であり、Ｒ６がアル
キル基、環式アルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基
からなる群より選択され、０乃至８個の水酸基、ヒドロ
キシカルボニル基またはアミノカルボニル基を含み、か
つＱが遊離第１または第２アミン基を含む分子のいずれ
かである、装置。 - 【請求項５０】 多孔質膜と液移送接触した吸着パッド
をさらに含む、請求項４９の装置。 - 【請求項５１】 パッドと被検体試験帯との間にある多
孔質膜上に固定化された１以上の連続的に配列した捕捉
領域を含む被検体調節帯をさらに含む装置であって、該
被検体調節帯の捕捉領域が所定量の被検体結合能力を有
し、かつ該被検体調節帯の捕捉領域の被検体結合能力の
量により決まるレベルの被検体試験帯に到達する被検体
の量を減らし、該多孔質膜上に固定化された１以上の連
続的に配列した捕捉領域を共役体との反応により固定化
する、被検体調節帯をさらに含む、請求項４９の装置。 - 【請求項５２】 被検体試験帯が、多孔質膜または所定
量の被検体結合能力を持った他の液体浸透性の表面上に
固定化された１以上の連続的に配列した捕捉領域からな
り、該被検体試験帯が、被検体および被検体―標識結合
配位子（ＩＬ）錯体を固定化し、検出可能な標識領域を
形成し、該標識領域の信号パターンが被検体の濃度の違
いを反映し、該１以上の連続的に配列した捕捉領域を共
役体との反応により固定化する、請求項４９の装置。 - 【請求項５３】 被検体試験帯が、１以上の離れた試験
領域に結合部位を持つ、請求項４９の装置。 - 【請求項５４】 横流装置を用いた生物学的サンプル中
の被検体を定量的または半定量的に決定する装置で、該
被検体が、固定化した結合配位子と結合するα領域およ
び標識結合配位子と結合するβ領域の二つの結合領域を
含み、該装置が、標識結合配位子および対照結合配位子
を含むパッドで、標識結合配位子が、視覚的、分光光度
的、比色的または蛍光的な特性を持った標識信号生成系
を含み、該標識結合配位子が被検体のβ領域に特異的な
結合配位子をその表面に固定化しており、対照結合配位
子が視覚的、分光光度的、比色的または蛍光的な特性を
持った対照信号生成系で、該標識配位子とスペクトルの
異なる領域で対照をなす生成系を含み、該対照結合配位
子が、固定化した結合配位子に特異的に結合する分子領
域をその表面に固定化している、パッド；該パッドおよ
びサンプルと液移送接触し、標識結合配位子および対照
結合配位子が毛管現象により該多孔質膜を通って拡散す
る多孔質膜；および、多孔質膜上の被検体試験領域とか
らなり、被検体試験領域が一定の限定数の固定化したα
領域に特異的な結合部位を含み、該限定数の固定化した
α領域に特異的な結合部位が、構造式 【化８】 を有する共役体と反応して、該多孔質膜上に固定化され
ており、式中、Ｘが水酸基を有する固相物質であり、Ｒ
５が（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ（ＣＨ２）ｍ） ｐで、ｎは２乃
至８、ｍは２乃至８、ｐは０乃至３であり、Ｒ７がアル
キル基、環式アルキル基、芳香族基またはヘテロ環式基
からなる群より選択され、０乃至８個の水酸基、ヒドロ
キシカルボニル基またはアミノカルボニル基を含み、お
よびＬがスルフヒドリル基を含む分子のいずれかであ
る、装置。 - 【請求項５５】 多孔質膜と液移送接触した吸着パッド
をさらに含む、請求項５４の装置。 - 【請求項５６】 パッドと被検体試験帯との間にある多
孔質膜上に固定化された１以上の連続的に配列した捕捉
領域を含む被検体調節帯をさらに含む装置であって、該
被検体調節帯の捕捉領域が所定量の被検体結合能力を有
し、かつ該被検体調節帯の捕捉領域の被検体結合能力の
量により決まるレベルの被検体試験帯に到達する被検体
の量を減らし、該多孔質膜上に固定化された１以上の連
続的に配列した捕捉領域を共役体との反応により固定化
する、被検体調節帯をさらに含む、請求項５４の装置。 - 【請求項５７】 被検体試験帯が、多孔質膜または所定
量の被検体結合能力を持った他の液体浸透性の表面上に
固定化された１以上の連続的に配列した捕捉領域からな
り、該被検体試験帯が、被検体および被検体―標識結合
配位子錯体を固定化し、検出可能な標識領域を形成し、
該標識領域の信号パターンが被検体の濃度の違いを反映
し、該１以上の連続的に配列した捕捉領域を共役体との
反応により固定化する、請求項５４の装置。 - 【請求項５８】 被検体試験帯が、１以上の離れた試験
領域に結合部位を持つ、請求項５４の装置。
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