JPS6338667B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫検定に関するものでありそしてさ
らに詳しくいえば、試薬として不溶性化された抗
体またはたんぱく質抗原を含む免疫検定およびこ
のような試薬、その製法ならびにそれに有用なあ
る架橋物質に関するものである。 種種の免疫検定において不溶性化された抗体や
抗原を試薬として使うことは知られている。これ
らの試薬は通常抗原または抗体を水に不溶性の支
持体上に吸着させるかあるいは２官能性の架橋基
を使つて抗体または抗原を水に不溶性の支持体に
共有結合させるかいずれかによつて調製される。
最もありふれた２官能性架橋基にはグルタルアル
デヒドのようなジアルデヒドがある。このような
架橋基は抗体またはたんぱく質抗原中の遊離アミ
ノ基と容易に反応する。 不溶性化された抗体またはたんぱく質抗原を含
む多くの免疫検定の処理法では特殊の抗体（また
は抗原）とその相当する抗原（または抗体）との
間によく知られた免疫特性反応を含むものであ
る。このような反応に対して特異性のある局部的
活性部位がたんぱく質分子中にあることおよびこ
れらの活性部位にもしくはその隣接位置に遊離ア
ミノ基があることが知られている。したがつて標
準技法により抗体（またはたんぱく質抗原）が架
橋基の共有結合によつて不溶性化されるときに
は、その活性部位はある程度封鎖されることとな
る。これは次に行ういずれかの免疫特性反応にお
けるたんぱく質の活性を低下させる。 本発明者はこの不利益を打破る方法を見出だし
た。特に本発明者はたんぱく質内に存在するアミ
ノ基よりもいおう原子に優先的に結合する物質を
架橋剤として使い、水に不溶性の基質に抗体およ
びたんぱく質抗原を共有結合することによつてそ
れらを不溶性化できることを見出だしたのであ
る。 それゆえに本発明の１つの具体化例によれば、
抗体と抗原との間の免疫特性反応を含む免疫検定
に使うための試薬が提供される。その試薬はたん
ぱく質抗原、抗体または抗体の断片中のいおう原
子に直接結合している架橋基によつて水に不溶性
の基質に共有結合しているたんぱく質抗原、抗体
または抗体のＦ（ab′）₂断片とを含む免疫検定に使
うための試薬から成るものである。 また他の具体化例では、本発明は本発明の試薬
を使い、抗原と抗体またはそのＦ（ab′）₂断片との
間の免疫特性反応を行う段階を含む免疫検定法を
提供する。 さらにまた他の具体化例では、本発明は本発明
の試薬の製法を提供する。それは抗原、抗体また
は抗体の断片中のいおう原子に架橋剤を直接に共
有結合させるようにたんぱく質抗原または抗体も
しくはそのＦ（ab′）₂断片を架橋剤試薬と反応さ
せ、そしてこの反応の前または後で架橋剤を水に
不溶性の基質に共有結合させることから成る方法
である。 抗体免疫グロブリンはジスルフイド結合による
間隔で結合した多数のポリペプチド鎖から成る。
この鎖自身もまたジスルフイド基を含んでいても
よい。本発明の好ましい具体例ではこのジスルフ
イド結合はおだやかな還元を受けてスルフヒドリ
ン基―SHを形成し、次でこれは２官能性の架橋
剤の１つの官能基と反応する。この１つの官能基
が遊離のアミノ基に優先して―SH基と反応する
官能基である。好ましいこのような官能基はクロ
ルアセチル基であり、例えばモノクロルアセチル
基―CO―CH₂―Cl（）である。 ２官能性架橋剤の他の反応性の官能基は水に不
溶性の基質（抗体またはたんぱく質抗原が結合す
べきものである）と反応する。この反応性の官能
基の性質は選ばれる基質の性質に左右されるもの
であり、そして多くの適当な基質（ならびにそれ
と反応性のある官能基）が当業界では知られてい
る。基質は例えばシートまたはチユーブの形状で
あることができる。後者の場合には抗原または抗
体はチユーブの内側または外側もしくはその両側
に固定される。しかしもつと普通には基質は粒子
の形状でありそしてその場合本発明の試薬は例え
ば緩衝液を適当に含んでいてもよい水性液体中に
懸濁した粒子から成ることができる。１つの好ま
しい取合せでは、粒子状の基質は磁場をかけるこ
とによつて混合物から容易に分離されうるように
磁気で引き付けられるようになつている。粒子状
の物質を使用することは免疫検定ではよく知られ
ている。特に好ましい粒子状基質はラテツクス粒
子である。 基質が作られている物質の性質は、それが架橋
剤の１つの端または部分と反応することができな
ければならないということを除いては別に問題と
なるものではない。水に不溶性のの合成重合体物
質は基質を作るのに使うことができ、そして通常
このような基質は反応性のコーチング例えばたん
ぱく質コーチングが施されている。この目的に使
用できる代表的なたんぱく質はアルブミンであ
る。このような場合架橋基は、１つの官能基とし
てアルブミンと容易に反応する基を含んでいる。
数種のこのような基が知られているが、次式の無
水物基を使う。 このような基はアルブミンのようなたんぱく質
の遊離アミノ基と容易に反応するものである。 抗体またはたんぱく質抗原がアルブミンのよう
なたんぱく質に共有結合している本発明の試薬を
作るためには、一端にクロルアセチル基（）そ
して他端に無水基（）をもつ２官能性の架橋剤
すなわち式 （式中のｎは１〜10の整数で好ましくは４であ
る） で表わされる一般式をもつ。これらの化合物はそ
れ自体新規でありそして本発明のさらに別の発明
を構成する。ｎが４である上記式（）の化合物
を以後“NCA”と略称する。 NCAや式（）の他の化合物におけるように、
たんぱく質アミノ基と容易に反応する官能性基を
架橋剤が含んでいる場合には、この官能性基は抗
原、抗体またはＦ（ab′）₂断片中の遊離アミノ基と
反応しないということを確かめることが重要であ
る。これは例えば先ず架橋剤を水に不溶性の支持
体と反応させそしてその後で初めて免疫グロブリ
ン抗体またはたんぱく質抗原と接触させることに
よつて確かめることができる。 本発明の試薬を作る方法の１例をここに記載す
る。ラテツクス粒子をアルブミン（またはラクト
フエリンのような他のたんぱく質もしくはポリペ
プチド）でコーチングすると、アルブミンはラテ
ツクス粒子上に吸収される。架橋基と反応するか
も知れないいおうを含むコーチングの場合、例え
ばアルブミンコーチングの場合には、コーチング
物質はそのような基を破壊するか不活性にするよ
うに（コーチング形成の前か後で）アルキル化さ
れる。アルブミンコーチングされた粒子は次いで
NCAといつしよに中性のPH（例えば7.1）で約24
時間保温される。するとNCAの無水物基はアル
ブミン上のアミノ基と反応する。（これの代りに、
NCAを先ずアルキル化されたアルブミンに結合
し、そして生成する化合物を粒子上でコーチング
することもできる。） 抗体はおだやかな還元にかけられてその中にス
ルフヒドリル基を作る（例えばジオスレイトール
で還元する）。次にそれをラテツクス―アルブミ
ン―NCA粒子と混合しそして室温で36時間保温
する。抗体はNCAの中のクロルアセチル基と反
応し、こうして（NCAを介して）アルブミンと
共有結合する。 種種の抗体免疫グロブリンの中でIgGが最もあ
りふれたものである。よく知られているように、
IgG分子は“Ｙ”という形状をとる傾向がある。
すなわちその２つの上肢〔Ｆ（ab′）₂部分〕はその
外端に抗原結合部位を含み、そして下肢〔Ｆ(c)部
分〕はとりわけ例えばRFおよびClqと反応する部
位を含む。Ｙのこの３つの肢が交差する帯域を蝶
番帯域（領域）と呼ぶ。この帯域では隣接したポ
リペフチド鎖の間にジスルフイド結合があり、そ
して本発明の好ましい架橋剤が反応するのはこれ
らの結合であると信じられる。したがつて架橋基
は分子のＦ（ab′）₂部分上の抗原結合部位に邪魔を
しないということがわかるであろう。 本発明によれば抗体（例えばIgG）または抗原
にそれが結合する基質の表面から若干の距離を置
くために少くとも５原子の長さの鎖をもつ架橋剤
（より好ましくはｎが４であるかまたはそれ以上
の式の架橋剤）を使うことが好ましい。これは
例えばシアノゲンブロミドまたはグルタルアルデ
ヒドを架橋剤として使う先行技術の方法における
よりも抗原まは抗体をもつと反応に近づき易くす
る傾向がある。すなわちNCAを使つた本発明の
試薬中における抗体の活性は同じ抗体が直接基質
に吸収されるときよりも何倍も大きいことが発見
された。例えばラテツクス―BSA―NCA―抗体
および抗原を使つた凝集検定においては、このテ
ストの感度は抗体が単に直接ラテツクスに吸収さ
れたときよりも約50倍大きかつた。〔この場合抗
原は馬のフエリチン（含鉄たんぱく質）、抗体は
兎のアンチフエリチンでありそして“BSA”は
牛の血清のアルブミンを意味する。〕 本発明者らの特開昭52−119292号には全体免疫
グロブリンの代りにそのＦ（ab′）₂断片を使つた免
疫検定法が記載されている。本発明の試薬は抗体
の代りにそのＦ（ab′）₂断片を含むことができる。
このような試薬は式（）の化合物好ましくは
NCAを使つて次のように非常に有利な方法で作
ることができる。先に記述したようにして（例え
ば抗体がIgGである）ラテツクス―アルブミン―
NCA―抗体を作つた後粒子ををペプシンで消化
する。その結果ラテツクス―アルブミン―NCA
―Ｆ（ab′）₂が生成し、すなわちＦ(c)断片はもはや
存在しない。最も好ましくはIgGのＦ（ab′）₂断片
を含む本発明の試薬が相当する全IgGおよびＦ(c)
断片を実質的に含まないことである。免疫検定に
おけるＦ（ab′）₂断片の使用のさらに詳細について
は前記の特開昭52−119292を参照されたい。 本発明の試薬は当業者には明白であるように広
い種類の免疫検定法に使うことができる。液体中
の抗原の分析に対する本発明の方法は次の工程か
ら成る。 (a) 検定下で抗原と結合する抗体またはそのＦ
（ab′）₂断片から成る本発明の試薬と液体の試薬
との混合物を作り、 (b) この混合物を保温して反応の起るにまかせ、
そして (c) 混合物を分析してその反応の程度およびそれ
によつて液体試料中の抗原の量を定める。 Ｆ（ab′）₂断片から成る本発明の試薬が使われる
ときには、反応混合物は相当する免疫グロブリン
およびＦ(c)断片を実質的に含まないことが好まし
い。 抗体と結合する相当するたんぱく質抗原を使つ
て、同様な方法を液体中の抗体の検定に使うこと
ができる。 本発明の非常に好ましい検定はラテツクス凝集
検定である。この検定ではラテツクス粒子の懸濁
体の形の試薬が使われ、この粒子は分析される抗
原または抗体と反応すると凝集するのである。反
応の程度は凝集の量を観察することによつて決定
され、そして凝集の量から検定する試料液体中の
抗原または抗体の量を定めることができる。最も
好ましい方法は、反応混合物中に残つている未凝
集ラテツクス粒子を選択計数することによつて凝
集量を決定する方法である。 本発明の他の好ましい検定では、試薬は粒子か
ら成り、それは次に反応混合物から分離されそし
て分離された粒子かまたは残つている混合物のど
ちらか（あるいは多分両方共）を分析して検定さ
れる抗原まは抗体の量を決定するのである。この
粒子は磁気的に引き付けられそして磁場を使用し
て分離されることが好ましい。このような工合に
磁気粒子を使用することは本発明者らの特開昭52
−141697に記載されているので詳細はそれを参照
されたい。 本発明の検定法は各種の液体に行うことができ
るが、最も普通には血液、血清または血漿のよう
な人間の体液が検定される。 本発明の方法は不連続の手作業法でもまたは自
動化法例えばいわゆる連続流れ式技法ででも行う
ことができる。この後者の方法では反応混合物の
個個のセグメントが導管を通り、不活性セグメン
ト（例えば空気）によつてそして所望によつては
洗液のセグメントによつて分離される。これにつ
いては米国特許第2797149号明細書に記載されて
いるのでそれについて詳細を参照されたい。 一般に本発明の粒状試薬はどんな便宜的な粒径
でもよい。大抵の目的に対しては約１〜20μの粒
径が適当である。ことに（しかしこれに限らない
が）連続流れ式技法の場合には粒子の比重は約
1.4〜3.2（あるいは少くとも反応混合物の液体の
それに近いもの）であることが好ましい。それは
流れる液体反応混合物中において粒子が浮き沈み
するのを避けるためである。 本発明をさらに充分に理解されるように、次の
実施例を示して説明する。 例 １ 測定されるべき抗原を含んだ血清または血漿の
試料を、その上で抗原に抗体が結合するラテツク
ス粒子の懸濁液と混合する。この混合物を空気で
区分して導管中に通す。混合物は強い凝集を促進
するように時間遅れコイル中に保たれ、15〜20分
間50Hzで振動させられる。ラテツクス粒子を１：
80そして１：80と連続的に希釈して最終的には
１：64000の希釈にする。すべての非単量体を拒
否するように特に電子工学的に変えられた自動計
数器に粒子を通す。 単量体数の減少は存在する抗原の濃度に正比例
する。

【表】
↓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ たんぱく質抗原、抗体または抗体のＦ（ab′）₂
   断片を、その中のいおう原子に直接結合している
   式（） （式中、ｎは１〜10の整数である） で表わされる化合物から誘導された架橋基を介し
   て、水に水溶性の基質に共有結合した状態で含ん
   で成る、免疫検定用試薬。 ２ 抗体が免疫グロブリンＧである前項１に記載
   の試薬。 ３ 断片が免疫グロブリンＧのＦ（ab′）₂断片であ
   り、免疫グロブリンＧおよびそのＦ(c)断片を実質
   的に含まない前項１に記載の試薬。 ４ 基質が架橋基の直接結合しているたんぱく質
   から成る前項１に記載の試薬。 ５ 基質がシート状の形または中空のチユーブの
   形をしたものであるか、あるいは粒子状物質であ
   る前項１に記載の試薬。 ６ 基質がラテツクスであるかまたは磁気吸引可
   能な粒子状物質である前項５に記載の試薬。 ７ 式（）で表わされる化合物のクロルアセチ
   ル基がたんぱく質抗原、抗体または免疫グロブリ
   ンＧのＦ（ab′）₂断片の中のいおう原子に直接結合
   し、式（）で表わされる化合物の無水物基が液
   体中に懸濁している水不溶性の粒子状物質のたん
   ぱく質コーチングと共有結合している前項１に記
   載の試薬。 ８ ｎが４である前項７に記載の試薬。 ９ (a) たんぱく質抗原、抗体または抗体のＦ
   （ab′）₂断片を、その中のいおう原子に直接結合
   している式（） （式中、ｎは１〜10の整数である） で表わされる化合物から誘導された架橋基を介
   して、水に水溶性の基質に共有結合した状態で
   含んで成る、免疫検定用試薬と液体試料との混
   合物を作り、 (b) 混合物をインキユベートして免疫特異反応を
   起させ、そして (c) この反応の程度をそれ自体公知の方法によつ
   て検定する、 各工程から成る、液体試料の免疫検定方法。 １０ 試薬として磁気吸引可能な粒子状としたも
   のを使い、反応後に反応混合物の残分からその粒
   子を磁場の適用によつて分離して反応の程度を検
   定する前項９に記載の方法。 １１ 連続流れ方式で行う前項９に記載の方法。 １２ ヒトの血清中の抗原または抗体を検定する
   前項９に記載の方法。 １３ 試薬としてＦ（ab′）₂断片を含むものを使
   い、液体試料としてこの断片が得られたたんぱく
   質抗体およびその相当するＦ(c)断片を含まないも
   のを使う前項９に記載の方法。 １４ 試薬としてラテツクス粒子懸濁物の形状と
   したものを使い、反応の程度を粒子の凝集量の観
   察によつて検定する前項９に記載の方法。 １５ 粒子の凝集量をを反応混合物中に残つてい
   る未凝集ラテツクス粒子の選択的計数によつて検
   定する前項１４に記載の方法。 １６ たんぱく質抗原または抗体もしくはそのＦ
   （ab′）₂断片であつてそのいおう原子がスルフヒド
   リル基に還元されているものと、式（） （式中、ｎは１〜10の整数である） で表わされる化合物のクロルアセチル基とを反応
   させ、この反応の前または後で式（）で表わさ
   れる化合物の無水物基と、水に不溶性の基質とし
   ての遊離アミノ基を含むもののその遊離アミノ基
   とを共有結合させることから成る、免疫検定用試
   薬の製法。 １７ 免疫グロブリンＧ中のいおう原子をスルフ
   ヒドリン基に還元したものと、式（） （式中、ｎは１〜10の整数である） で表わされる化合物のクロルアセチル基とを反応
   させ、この反応の前または後で式（）で表わさ
   れる化合物の無水物基と、水に不溶性の基質とし
   ての遊離アミノ基を含むもののその遊離アミノ基
   とを共有結合させ、そして免疫グロブリンＧ中の
   Ｆ(c)断片を遊離させるように反応生成物をペプシ
   ンで消化することから成る、免疫検定用試薬の製
   法。