SE445150B - Forfarande och reagens for immunoanalys varvid kovalent bindning sker via en bryggbildande grupp till svavelatomer i antikropp eller proteinantigen - Google Patents

Description

ZU 25 30 35 79ÛÛ662-š 2 den välkända innunospecifika reaktionen mellan en särskild antikropp (eller ett särskilt antigen) och motsvarande antigen (eller antikropp). Det är känt, att det i proteinmolekylerna finns lokala aktiva centra, som är specifika för sådana reaktion- er, och att det finns fria aminogrupper i eller nära dessa aktiva centra. När en antikropp (eller ett proteinantigen) insolubilí- seras genom kovalent bryggbildning med vanliga metoder, blir de aktiva oenLra därför i viss män blockerade. Detta minskar proteinets aktivitet i en följande immunospecifik reaktion, t.ex. i en immunoanalys, vilket är olägligt.

Uppfinningen avser ett sätt att övervinna eller minska denna olägenhet. Det har visat sig, att man kan insolu- bilisera antikroppar och proteinantígener genom att kovalent binda dem vid en vattenolöslig bärare under användning såsom bryggbildningsmedel av en substans, som binds vid svavelatomer i proteinet i högre grad än vid aminogrupper däri.

Uppfinningen avser ett reagens för användning vid immunoanalyser, som innebär en immunospecifik reaktion mellan en antikropp och ett antigen, vilket reagens innehåller ett , proteinantigon, en antikropp eller F(ab')2-fragment av en antikropp, som bundits kovalent vid en vattenolöslig bärare medelst en bryggbildande grupp, som är direkt bunden till svaveb atomer i antigenet, antikroppen eller fragmenten.

Uppfinningen avser även ett förfarande för immuno- analys, vilket innefattar åtgärden att åstadkomma en immuno- specifik reaktion mellan ett antigen och en antikropp eller F(ab')2-fragment därav under användning av ett rvagmnu enligt uppfinningen.

Uppfinningen avser vidare ett förfarande för fram- ställning av ett reagens enligt ovan, vilket består i att om- sätta ett proteinantigen eller en antikropp eller F(ab'),- fragment därav med ett bryggbildningsmedel för att kovalent binda bryggbildningsmedlet direkt vid svavelatomer i antigenet, antikroppen eller fragmenten och att före eller efter nämnda omsättning binda bryggbildningsmedlet kovalent vid en vatten- olöslig bärare. M Antikroppsimmunoglobuliner innehåller ett antal polypeptidkedjor, vilka med vissa intervall är hopkopplade in 10 20 25 30 '7900662-5 medelst diuulfidbindningar. Kedjorna själva kan också inne- hälla disulfidgrupper. 1 ett föredraget utförande av uppfinning- en utššíšâ: man disulfidbindningarna för mild reduktion, så att det sulfhydrylgrupper (-SH), och omsätter sedan dessa med den una funktionen i ett bifunktionellt bryggbildnings- uk:du1. l)crun1 Ixuflxlitnx 31-1-n Lxun rwu|n«wuJr-1nv hellre än med fria amínogrupper. En föredragen sådan funktion är en kloroacetylgrupp, t.ex. en monokloroacetylgrupp ' -co-cnz-cl (I) Den andra reaktiva funktionen i det bifunktionella bryggbildningsmedlet reagerar med den vattenolösliga bäraren (Vid vilksïantikroppen eller proteinantigenet skall bindas).

Denna reaktiva funktions beskaffenhet beror på den valda bärarens beskaffenhet, och många lämpliga bärare (och därmed reaktiva funktionella grupper) är kända. Bäraren kan exempel- vis ha formen av en folie eller en slang. I senare fallet kan antigenet eller antikroppen immobiliseras på slangens insida eller utsida eller på båda sidorna. Vanligen är bäraren emellertid partikelformig, och reagenset enligt uppfinningen kan i så fall bestå av partiklarna suspenderade i nn vatten- haltig vätska, som lämpligen kan innehålla en buffert. I ett föredraget utförande är den partikelformiga bäraren magnetiskt attraherbar, så att den lätt kan skiljas från en blandning genom påläggning av ett magnetiskt fält. En särskilt föredragen partikelformig bärare utgöres av latexpartiklar.

Beskaffenheten av dei material varav bäraren består är inte betydelsefull bortsett från att det mäste kunna rea- gera med ena änden eller delen av bryggbildningsmedlet. Syn- tetiska polymermaterial, som är vattenolösliga, kan användas i bäraren, och vanligen förses sådana bärare med en reaktiv beläggning, t.ex. en proteinbeläggning. Ett typiskt protein, som är lämpligt för detta syfte, är albumin. I sådana fall innehåller den bryggbildande substansen såsom den ena funk- tionen en grupp, som lätt reagerar med albumin. Det finns flera kända sådana grupper, och enligt ett föredraget ut- förande av uppfinningen använder man en anhydridgrupp, före- trädesvis med formeln . __... _. ..._ ...e-e Ut 10 20 30 vsuaßßz-5 4 CU - 0 I \ I /F=O (II) -CH - NH En sådan grupp reagerar lätt med fria aminogrupper i ett protein, såsom nlbumin.

För framställning av ett reagens enligt uppfinningen, i vilket en antikropp eller ett proleínantigrn har bundits kovalent till ett protein, såsom albumin, använder man helst en bifunktionell bryggbildande substans, som vid ena änden har en kloroacetylgrupp I och vid andra änden en anhydrid~ grupp II. En synnerligen lämplig klass av bryggbildningsmedel utgörs av föreningar med formeln 3 f“lH CO-CH-(CH2)n-NHCOCH2Cl (III) där n är ett heltal inom omrâdet 1 - 10, företrädesvis H. Dessa föreningar är nya och är föremål för uppfinningen. Den förening av formel III, där n är 4, betecknas i det följande "NCA".

När bryggbildningsmedlet innehåller en funktionell grupp, som lätt reagerar med aminogrupper i proteiner, såsom är fallet med NCA och andra föreningar av formel III, är det av vikt att säkerställa, att denna funktionella grupp inte reagerar med fria aminogrupper i antigenet, antikroppen eller F(ab')2-fragmenten. Detta kan man ernâ genom att först omsätta bryggbildningsmedlet med den vattenolösliga Läraren och där- efter bringa den i kontakt med immunoglobulinantikroppen eller proteinantigenet.

Pörfarandet för framställning av ett reagens flnligt uppfinningen kan genomföras exempelvis på följande sätt. Latex- partiklar belägga med albumin (eller något annat protein eller någon annan polypeptid, såsom laktoferrin), som absorberas på latexpartiklarna. När man använder en beläggning innehållande svavelgrupper, som skulle kunna reagera med bryggbildnings- medlet, t.ex. en albuminbeläggning, alkylerar man beläggnings- materialet (före eller efter bildningen av beläggningen) för att förstöra eller inaktivera sådana grupper. De albumin- belagda partiklarna inkuberas med NCA under ca 24 h vid neutralt pH (t.ex. 7,1), och anhydridgrupperna i NCA reagerar med . . _ _ __......___......_.... ,..--._.......,_.......,_@.-_. (p 10 15 20 w L. 30 i79ooss2-3 aminogrupperna i albuminet. Alternativt kan man först koppla NCA till det alkylerade albuminet och sedan belägga partiklarna med den erhållna föreningen.

Antikropp utsätts för mild reduktion (t.ex. med ätiotreitol), sa att sulfhydrylgrupper bildas däri. Den blandas sedan med latex~albumin-NCA-partiklarna, och blandningen in- kuberas vid rumstemperatur under 36 h. Antikroppen reagerar med kloroacetylgruppen i NCA och binds sålunda kovalent (över NCA) vid albuminet.

Bland de olika antikroppsimmunoglobulinerna är IgG det vanligaste. Som bekant strävar IgG-molekylerna att anta formen av ett Y, vars båda övre armar (F(ab')2-partierna) vid sina yttre ändar har antigenbindningscentra och vars undre arm (F(c)-partiet) bl.a. innehåller centra som reagerar med exempelvis reumatoidfaktor (RF) och Clq. Det område, där Y-ets tre armar sammanstrålar, kallas ledområdet. I detta område finns disulfidbindningar mellan närliggande polypeptidkedjor, och det torde vara med dessa bindningar som de föredragna bryggbildningsmvdlen enligt uppfinningvn reagerar. Det inses därför, aLL bryggbildningsgruppen inte stör antigcnbindnings- centra i molekylens F(ab')2-partier.

Det är att föredra enligt uppfinningen att använda en bryggbildande substans, som innehåller en kedja av minst 5 atomers längd (helst bryggbildningsmedel av formel Ill, vari n är minst 4), för att anbringa molekylerna av antikroppen (t.ex. lgG) eller antigenet på ett visst avstånd från den bär- yta varvid de är bundna. Därvid får antigenet eller antikroppen bättre tillgänglighet för reaktion än vid kända förfaranden, där exempelvis cyanbromid eller glutaraldehyd används som bryggbildningsmedel. Sålunda har det visat sig, att aktiviteten av en antikropp i ett enligt uppfinningen med hjälp av NCA framställt reagens är många gånger så stor som när samma anti- kropp absorberas direkt på bäraren. Exempelvis var i en agglu- tinationsanalys med latex-BSA-NCA-antikropp och antigen provets känslighet ca 50 gånger så stor som när antikroppen var enbart direkt absorberad på latexen. I detta fall var antigenet häst- ferritin och antikroppen var kaninantiferritin. Med "BSA" avses bovinserumalbumin. .._.-.-____.._.-. 10 15 20 30 7900662-3 e I denšamtidigt härmed inlämnade svenska patent- ansökan med prioritet från brittiska patentansökan 3237/58 av den 26 januari 1978 beskrivs ett immunoanalysförfarande, i vilket man i stället för helt immunoglobulin använder F(ab')2- fragment därav. Reagensen enligt uppfinningen kan i stället för antikropp innehålla F(ab')2-fragment därav. Sådana reagens kan beredas på mycket fördelaktigt sätt med hjälp av föreningar av formel Ill, särskilt NCA. Sedan man har framställt latex- albumin-NCA-antikroppspartiklar (vari antikroppen är exempelvis IgG) på ovan närmare skildrat sätt, digererar man partiklarna med pepsin. Resultatet är att det bildas latex-albumin-NCA- F(ab')2, enligt uppfinningen, vilka innehåller F(ab')2-fragment av immuno- dvs. F(c)-fragmentet förekommer ej längre. Reagens globulin, är företrädesvis i huvudsak fria från motsvarande immunoglobulin och F(c)-fragment. Användningen av F(ab')2- fragment vid immunoanalys beskrivs närmare i nyssnämnda patent- ansökan. I Reagensen enligt uppfinningen kan användas i många slags immunoanalysmetoder, såsom inses av fackmännen. Ett för- farande enligt uppfinningen för analys av en vätska på ett antigen innefattar åtgärderna att (a) bereda en blandning av ett prov av vätskan med ett reagens enligt uppfinningen, inne- hållande en antikropp, som är ägnad att bindas till det antigen som skall bestämmas, eller F(ab')2-fragment därav, (b) inkubera 'blandningen, så att reaktion kan inträffa, och (0) undersöka blandningen för att bestämma omfattningen av reaktionen och därmed mängden antigen i vätskeprovet. När man använder ett F(ab')2-fragment innehållande reagens enligt uppfinningen, bör reaktionsblandningen helst vara fri från motsvarande immunoglo- bulin och F(c)-fragment.

Man kan tillämpa en liknande metod för att bestämma en antikropp i en vätska, varvid man använder ett motsvarande proteinantigen för bindning vid antikrqppen.

En synnerligen föredragen analysmetod enligt upp- finningen är latexagglutinationsanalys. Vid denna analys använder man ett reagens i form av en latexpartíkelsuspension, vars partiklar agglutineras vid reaktion med det antigen eller den antikropp som skall bestämmas. Reaklionenu omfattning be tämu 10 20 35 7 7900662-3 genom observation av agglutinatbnsgraden, varur mängden antigen eller antikropp i det fëranalys utsatta provet kan bestämmas.

Lämpligen bestäms agglutinationsgraden genom selektiv räkning av de i reaktionsblandningen kvarvarande oagglutinerade partiklarna.

I en annan föredragenanalysmetod enlig;uppfinningen innefattar reagenset partiklar, vilka efter reaktionen skiljs från reaktionsblandningen. Den avskilda partikelmassan eller den återstående blandningen (eventuellt bådadera) undersöks för bestämning av mängden antigen eller antikropp. Företrädesvis är partiklarna magnetiskt attraherbara och avskiljs med hjälp av ett magnetiskt fält. Användningen av magnetiska partiklar på detta sätt beskrivs närmare i belgiska patentskriften 852 327.

Analysmetoderna enligt uppfinningen kan utföras på många slags vätskor, men vanligast analyseras mänskliga kropps- vätskor, såsom blod, blodserum eller plasma. förfarandena enligt uppfinningen kan genomföras manuellt och intermittent eller automatiskt, t.ex. genom analys under kontinuerlig strömning, där individuella segment av reaktionsblandningen framförs genom en ledning, åtskilda av inerta segment (t.ex. luftsegment) och eventuellt tvättvätske- segment. Detta beskrivs i amerikanska patentskfiften 2 797 1H9.

Generellt kan partikelformiga reagens enligt upp- finningen ha vilken lämplig partikelstorlek som helst. För de flesta ändamål är det lämpligt med en storlek inom området 1 - 20 um. I synnerhet (men inte enbart) för användning vid analys under kontinuerlig strömning bör partiklarna företrädesvis ha en densitet av 1,4 - 3,2 g/ml (eller åtminstone nära reaktions- blandningsvätskans densitet), så att flotering eller sedimen- tering av partiklarna i den strömmande vätskan undviks.

Uppfinningen belyses av följande exempel. Éxempel 1 Ett serum- eller plasmaprov innehållande antigen, som skall bestämmas, blandas med en suspension av latexpartiklar, vid vilka antikroppar mot antígenet är bundna. Blandningen införs i en ledning och segmenteras med luft. Blandningen hålls i en fördröjningsslinga, som vibreras med HU Hz, under 15 - 2U min, så att en stark agglutinering päskyndas. Latexpartikelsuspensionen 10 20 h) 01 7snnee2~s 8 späds två gånger i följd i förhållandet 1:80, så att en slutlig spädning av 1:6H000 erhålls. Partiklarna leds sedan genom en "AutoCounter", som speciellt modifierats, så att den elektroniskt förkastar alla agglutinerade tartiklar. Minskningen av antalet oagglutinerade partiklar är direkt proportionell mot koncentra- tionen av antigen.

Tillsater Serum Latex Buffert (antigen) (antikropp) utspädningsmedel \ |1 su ooo Analytisk * ( 20 ~+ - Latexmono~ process min merer räknade Uttag Agglutinerad latex (elektroniskt borträknad) Exempel 2 Reagensberedning Latexpartiklar Dow, 0.79U um diameter, SD 0,044 um, nr H1 QH3, Serva, Feinbiochemica, Heidelberg, Tyskland (10-proc. suspensionl Alkylerat bovinserumalbumin Alkylerat bovinserumalbumin (BSA) framställs på följande sätt. En lösning av BSA i fosfatbuffert (0,1 M, pH 8,5) blandas med ett 5-molart överskott av ditíotreitol och får stå 1 h vid 3700. Ditiotreitolen reducerar BSA. Därpå tillsätts jodoättiksyra i en mängd av 10 gångers överskott över ditiotreitolen. Efter 2 h vid rumstemperatdr avskiljs BSA, och den alkaliska delen ekvilibreras på "Sephadex G25" i fosf fatbuffertlösning (0,1 M, pH 7,2). ' I Koppling av NCA till-BSA _ Aikyierar BSA 1 fosfarbuffepr inkuberas med 1/7 av sin vikt NCA vid HOC över natten. Proteinet kan användas direkt efter dialys vid pH 7 eller lyofiliseras efter dialys till ammoniumbikarbonat.

Koppling av BSA/NCA till latex 0,4 ml fosfatbuffert (pH 7,1) blandas i ett glasrör med 250 mg BSA/NCA i fosfatbuffert och 50 ml 10-procenti¿ r...... _v-___..._.. .... V. 10 15 20 h) (rv 30 33 7900662-3 latexsuspension. Strax före användning tvättas latexen med buffert av pH 9,6 (0,1 M) och omsuspenderas sedan i samma buffertlösning.

Alkylering av_lg§ Färantiferritinantiserum reduceras skonsamt i dítiotreitol på följande sätt. IgG inkuberas 1h i närvaro av ett 2-molart överskott av ditiotreitol i en lösning av 0,1 M bikarbonat vid pH 8,5.

Latex-BSA-NCA-IgG 50 mol 10-Pï0C@HïÉ latex-BSA-NCA-suspension blandas med 1 mg reducerat IgG. Blandningen genombläses med kväve under 30 min och förseglas under ett tryck av mindre än 5 mm Hg i ett glasrör och förvaras i mörker. Före användning tvättas den två gånger med 1 ml buffert innehållande 0,17 M natriumklorid, 0,1 M glycin (pH 9,2) och 0,05 % "Tween 20" och omsuspenderas sedan i 1 % BSA i samma buffert (0,27 M), men i frånvaro av "Tween 20".

Analys Agglutinationsanalys på ferritin i serum utförs på ovan beskrivet sätt. Sera med 27 olika ferritinhalter analyser- ades, och varje serum kördes flera gånger. Sera analyserades också med radíoimmunoanalys enligt RAMCO. Korrelationskoefficient- en mellan de båda analysmetoderna var 0,92. Serumproven under- söktes vid en utspädning av 20:1 och hade en normal halt av 20 - 30 ng/l ferritin.

Exemgel 3 Framställning av NCA vid 25% löses lm mg (o,0o12a moi) e-N-kloroacefyi- a-karbobensoxi-L-lysin i 1 ml dioxen. Lösningen blandas med 80 ml blandning av bensen och etyleter (volymförhållande 1:1), och den erhållna blandningen sammanföra med 256 mg fosforpenta- klorid vid ZSÛC under 3 h i torr atmosfär. Lösningsmedlet av- drivs vid 25OC vid ett tryck av 30 mm Hg under ca 2 h i torr atmosfär, och den erhållna vätskan tvättas två gånger med 10 ml etyleter. Eten avdrivs, och återstoden indunstas till torrhet.

Den löses sedan i 5 ml etylacetat och fälles vid ROC med 20 ml petroleumeter (kp. H0 - 60oC). Elementaranalys ger följande. 7909662-3 10 Beräknad H3,H7 % C, 5,27 % H, 11,26 % N *funnen namn c, 5,31 H, 11,27 N Detta motsvarar analysen av NCA, dvs. 9 H O-C-NH ä l CO-CH-(CH2)n~NHCOCH2Cl där n är 4.

För att framställa liknande föreningar, vari n är exempelvis större än 4, använder man ett derivat av en a-amíno- syra, som innehåller en andra aminogrupp i den långa kedjan, eller framställer en passande amíd med en S-, Y- eller 6-amino- syra, exempelvis e-NH2+HO0C-(CH2)n-NH-COCH2Cl som ger a-NH-CO-(CH2)n-NH-C0CH2Cl

Claims (12)

10 15 20 25 30 35 7900662-3 11 EEÉÉÉÄÄÅLX

1. Reagens för användning vid immunoanalys, k ä n n e- t e c k n a t av att däzinnehåller ett proteinantigen, en antikropp eller F(ab')2-fragment av en antikropp, som kovalent bundits till en vattenolöslig bärare medelst en bryggbildande grupp, vilken är direkt bunden vid svavelatomer i antigenet, antikroppen eller fragmenten, varvid den del av den brygg- bildande gruppen, som är direkt bunden vid svavelatomen, härrör från en monokloroacetylgrupp.

2. Reagens enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k- n a t av att fragmenten är F(ab')2~fragment av ett immuno- globulin G och att reagenset är fritt från detta immunoglobu- lin G och F(c)~fragment därav.

3. Reagens enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e- t e c k n a t av att bäraren utgöres av ett protein, vartill den bryggbildande gruppen är direkt bunden, och att den vid bärarens protein bundna delen av den bryggbildande gruppen här- rör från en anhydridgrupp.

4. H. Reagens enligt något av patentkraven 1 - 3, k ä n n e- t e c k n a t av att den bryggbildande gruppen härrör från en förening av formeln 0-CO-NH cllol-fcn-(cnfn-Nficocflzcl där n är ett heltal inom området 1 - 10.

5. Reagens enligt något av patentkraven 1 - H, k ä n n e- t e c k n a t av att bäraren äremt partikelformig material eller ett folíematerial eller har formen av ett rör.

6. Förfarande för immunoanalys, varvid man åstadkommer en immunospecifik reaktion mellan ett antigen och en antikropp eller F(ab')2-fragment därav, k ä n n e t e c k n a t av att man använder ett reagens, som innehåller ett proteinantígen, en antikropp eller P(ab')2-fragment av en antikropp, som kova- lent bundits till en vattenolöslig bärare medelst en brygg- bildande grupp, vilken är direkt bunden vid svavelatomer i antigenet, antikroppen eller fragmenten, varvid en del av den bryggbildande gruppen, som är direkt bunden vid svavelatomen, härrör från en monoklnronuetvlgrupp, ovh den vid bäraren bundna 10 15 20 25 30 35 7900662-3 12 delen av den bryggbildande gruppen härrör från en anhydridgrupp.

7. Förfarande enligt patentkravet 6 för bestämning av en antikropp i en vätska, k ä n n e t e c k n a t av att man (a) bereder en blandning av ett prov av vätskan och ett reagens av angivet slag innehållande ett proteinantigen, som är ägnat att bindas vid antikroppen, (b) inkuberar blandningen, så att reaktion kan inträffa, och (c) undersöker blandningen för att bestämma reaktionens omfattning och därmed mängden antikropp i provet.

8. Förfarande enligt patentkravet 6 eller 7, k ä n n e- t e c k n a t ,av att reagenset innehåller magnetiskt attraher- bara partiklar och att partiklarna efter reaktionen skiljs från reaktionsblandningen i övrigt genom päläggning av ett magnetfält.

9. Förfarande enligt något av patentkraven 6 - 8, k ä n- n e t e c k n a t av att det utföres under kontinuerlig strömning.

10. Förfarande enligt något av patentkraven 6 - 9, k ä n- n e t e c k n a-ta av ett antigen eller en antikropp i mänsk- ligt serum bestäms.

11. n e t e c k n a t av aU:reagenset har formen av en latex- Förfarande enligt något av patentkraven 6 - 10, k ä n- partikelsuspension, att reaktionen framkallar agglutinering av partiklarna och att reaktionens omfattning bestäms genom observation av agglutineríngens omfattning.

12. Förfarande för framställning av ett reagens för använd- ning vid immunoanalys, k ä n n e t e c k n a t av att man omsätter ett proteinantigen eller en antikropp eller P(ab')2- fragment därav med ett bryggbildningsmedel för att kovalent binda bryggbildningsmedlet direkt vid svavelatomer i anti- genet, antikroppen eller fragmenten och attföre eller efter omsättningen binda bryggbildningsmedlet kovalent vid en vattenolöslig bärare, varvid bryggbildningsmedlut innehåller en terminal kloroacetylgrupp, svavclatomcrna L antígcnet, anti- kroppen eller F(ab')è-fragmenten reduceras till sulfhydroxyl- grupper, och kloroacetylgrupperna i bryggbildningsmedlet rea- gerar med sulfhydroxylgrupperna för att kovalent binda brygg- hildníngsmudlet vid nntigonut, antikrbppen eller P(ab')?” FIwigJncn1LLn1.