CN118057959A - 一种膜化学发光层析检测技术及其应用 - Google Patents

一种膜化学发光层析检测技术及其应用 Download PDF

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Abstract

一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法，包括固相膜、捕获剂、化学发光标记物、助检液、化学发光反应液和化学发光检测仪。捕获剂包被到固相膜上，化学发光标记物流经固相膜与捕获剂结合并固定，未被捕获结合的化学发光标记物经由流经固相膜的助检液清洗，形成在固相膜上的化学发光标记物与待检物的复合物被特异性捕获结合，并经化学发光反应液和化学发光检测仪进行发光量的定量检测，完成待检物的定量分析。该技术适用于多种免疫分析指标的层析检测，具有检测效率高、便捷、准确和快速等多种特点，具有重要的临床意义。

Description

一种膜化学发光层析检测技术及其应用
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，特别涉及一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法及其应用。
背景技术
免疫学检测技术已被广泛用于医学和研究领域，以及环境、药物、食品和工业分析，用于通过抗体或抗原在溶液中确定大分子或小分子的存在或浓度是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。免疫分析的目标被检测的分子称为待检物，也称为抗原，通常为蛋白质，具有被抗体识别并特异结合的能力，也可以是一种大分子复合物。除了抗体与其待检物的结合外，产生可测量信号以响应这种结合的方式也是免疫分析的另一个非常重要的特征，包括辐射发射、改变颜色、在光下发光或诱发发光。常用的有免疫比浊法、免疫化学发光法、免疫荧光法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法和乳胶免疫层析法，为免疫检测中的常规分析提供了简单、快速、高灵敏度和易于使用的方法。
免疫比浊法用于测定抗体和抗原的可溶性复合物，其中抗原-抗体复合物聚集形成可被光度计光学检测的颗粒，然后给出吸光度测量结果，以计算溶液中待检物的浓度。免疫层析法，也称为侧向流检测，是一种通过固相膜反应检测液体样本中待检物的存在或浓度的简单快速分析方法。。常用双抗体夹心一步法，检测中使用的可测量的指示剂包括胶体金、荧光染料、荧光微球、彩色乳胶微球和磁性纳米微球。指示剂标记的抗体标记复合物作为指示剂标记物并涂布在结合垫上，配对的非标记抗体用作捕获物并涂布于固相膜上。当样品加载到结合垫上时，样品中的待检物特异性地与指示剂标记的抗体结合，形成抗原-指示剂标记抗体的复合物，然后复合物在固相膜上层析流动，被配对的非标记抗体捕获并固定在固相膜上，在检测线上出现一个可测量的条带，用于进一步测量。该技术的特点是简单、快速、灵敏、成本低、易于操作。
化学发光免疫分析(CLIA)是一种免疫分析技术，指示剂采用可诱导发光的化学分子，是临床检测中应用最广泛的免疫分析方法，包括使用化学发光物质标记的直接化学发光分析方法和采用化学发光诱导酶标记的间接化学发光分析方法。直接化学发光法使用的标记用化学发光物质为吖啶酯类，而间接方法中使用的标记酶为辣根过氧化物酶时，反应底物为鲁米诺或其衍生物；为碱性磷酸酶时，底物为1，2-二氧环乙烷衍生物AMPPD。这些合成分子以及添加增敏剂可以进一步提高以磁珠为反应载体的免疫分析系统的分析灵敏度(mol-16/L)，这远远优于其他免疫分析方法，如RIA、ELISA、免疫层析和荧光免疫酶法等。目前常用化学发光管道磁微粒检测技术，但检测反应时间长，对检测设备的要求高，仪器操作路径复杂，检测通量相对降低，试剂需要冷链运输等影响其使用。
因此，建立一种与免疫层析技术相结合的化学发光免疫分析方法将更具有简单、经济、快速和易于使用等特点。然而，结合使用时检测噪声背景高和缺乏有效的线性检测范围是这种结合所面临的主要技术问题。因此，建立一种低噪声背景和高线性检测范围的化学发光免疫层析分析方法对进一步应用非常重要。
发明内容
本发明的目的是解决建立膜层析化学发光检测技术中所面临的无法建立有效的线性检测区间的技术障碍，具有检测灵敏度高、快速、成本低、操作方便等优点，提高了检测质量。
本发明提供了一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法，特征在于，包括：固相膜、捕获剂、化学发光指示剂、化学发光标记物、助检液、化学发光反应液和化学发光检测仪，其中：所述捕获剂以分散分布的方式包被在所述固相膜上，所述捕获剂在所述固相膜上分散分布包被的面积与所述化学发光免疫层析检测的线性检测范围呈正相关关系。
上述检测方法中，所述的检测方法包括：所述的固相膜、捕获剂、化学发光指示剂、化学发光标记物、助检液、化学发光反应液和化学发光检测仪，其中：
1)所述化学发光标记物为采用化学反光物质标记的待检物特异性第一免疫结合物；
2)所述捕获剂为非标记的与所述待检物特异性第一免疫结合物具有待检物特异性配对结合特性的待检物特异性第二免疫结合物；
3)所述固相膜粘贴于支撑底片上，所述捕获剂以分散分布的方式包被在所述固相膜上，所述捕获剂在所述固相膜上分散分布包被的面积与所述化学发光免疫层析检测的线性检测范围呈正相关关系，且所述捕获剂在所述固相膜上单位面积的包被量以所述捕获剂在所述固相膜上分散分布并且不形成叠加聚集的包被状态为优选；
4)所述化学发光标记物与待检样本混合形成样本混合物，在样本混合物内的所述第一免疫结合物与所述待检物进行特异性结合形成待检物-化学发光标记物的第一复合物，然后样本混合物被加载并通过固相膜向前流动，并被远端的吸水结构吸收，目标分析物被固体膜上的第二免疫结合物捕获，形成化学发光标记物-待检物-第二免疫结合物的第二复合物，并被固定在所述固体膜上；
5)所述助检液为水溶性缓冲盐溶液，在完成捕获固定的所述固相膜上加载、流经并被远端的吸水结构吸收，清洗残留在所述固相膜上未被捕获固定的游离的所述指示剂和化学发光标记物，完成所述固相膜的清洗过程；
6)所述吸水结构吸收流经所述固相膜的水，位于所述固相膜的远端，并与所述固相膜形成直接连接，优选吸水纸垫；
7)所述固相膜在完成所述助检液的清洗过程后，置于所述化学发光反应液内，用所述化学发光检测仪进行发光量检测。
上述检测方法中，所述捕获剂在固相膜上以分散分布的方式包被，并包括三种不同的包被方式，均匀分散分布包被、梯度分散分布包被、节段性分散分布包被。
均匀分散分布的包被是指捕获试剂以相同浓度和相同包被量包被固相膜，形成包被捕获试剂在固相膜上均匀分布的包被。梯度分散分布的包被是指捕获试剂在固体膜上从近侧到远侧的包被浓度逐渐增加，形成包被捕获试剂在固相膜上呈梯度分布。节段性分散分布的包被是指将固相膜分成不同的区域，并在某些区域用一定浓度的捕获试剂包被，而在其他区域完全不含捕获试剂，形成固相膜上的分段、薄片状或零散分布的包被。
上述检测方法中，所述固相膜为硝酸纤维素膜和具有与硝酸纤维膜相似的蛋白质结合能力的其他多孔膜，包括硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜(PVDF)、尼龙膜和DEAE纤维素膜。
上述检测方法中，所述化学发光指示剂选择微粒结构，包括乳胶微球、彩色微球、磁微粒。彩色微珠包括彩色聚合物微珠和胶体金溶液。
上述检测方法中，所述化学发光标记物和所述捕获剂两者均含有免疫结合物，所述免疫结合物包括抗体、抗原、生物素、亲和素及其类似物。对于亲和素的类似物，streptavidin是此检测的常见选择。
上述检测方法中，标记制备所述化学发光标记物采用的化学发光指示剂可以是直接化学发光标记，如吖啶酯和吖啶磺酰胺，酶促化学发光标记，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，电化学发光标记，如三联吡啶钌。
临床检测中最常用的化学发光免疫分析方法包括使用化学发光物质标记的直接测定或使用酶标记的间接测定。在直接测定中，使用的化学发光指示剂是吖啶和钌酯，与碱性状态的过氧化氢底物一起使用；而在间接方法中使用的酶标记包括使用1,2-二氧环己基苯酚酸酯(AMPPD)底物的碱性磷酸酶和使用luminol或其衍生物作为底物的辣根过氧化物酶。
上述检测方法中，所述化学发光反应液包括碱性状态的含有过氧化氢的直接发光反应液，以鲁米诺及其衍生物为发光底物的酶促化学发光反应溶液，以及三联吡啶钌类结构标记物所致直接电极反应的电化学发光反应液。
上述检测方法中，所述化学发光标记物的储存形态为冻干粉剂。
上述检测方法中，所述固相膜的近端设置有血细胞过滤结构，与所述固相膜的近端形成直接连接，所述血细胞过滤结构包括血细胞过滤膜或经红细胞抗体处理膜垫。
上述检测方法中，所述固相膜的近端设置有液相分散膜，与所述固相膜的近端形成直接连接，所述液相分散膜优选玻璃纤维素膜或多聚酯纤维素膜。
本发明的检测结构可以组装成三种可能的组合：1)所述固相膜粘贴于支撑底片上，其近端为液相分散膜、血细胞过滤结构，连接硝酸纤维素膜，远端为吸水垫，也连接硝酸纤维素膜；2)所述固相膜粘贴于支撑底片上，其近端为液相分散膜，连接硝酸纤维素膜，远端为吸水垫，也连接硝酸纤维素膜；3)所述固相膜粘贴于支撑底片上，其近端为血细胞过滤结构，连接硝酸纤维素膜，远端为吸水垫，也连接硝酸纤维素膜。这些组合可以在使用时连接，不使用时分离。
上述检测方法中，所述检测试剂条的制备还包括生物素/亲和素反应系统，所述样本混合物包括化学发光物质标记的第一免疫结合物和生物素标记第二免疫结合物，所述硝酸纤维素膜上包被有非标记的亲和素及其类似物。
上述检测方法中，所述的检测方法配置有化学发光定量检测仪，能够定量检测从固相膜发出的光量。
上述检测方法中，所述的检测方法的操作使用，包括如下步骤：
1)取包被有所述捕获剂的所述固相膜结构，在近端依次放置液相分散膜和/或血细胞过滤结构，在远端加载吸水结构，水平放置于平面；
2)取待检样本，加入至含有化学发光标记物的试管中，并加入适量的助检液，混合，制成待检样本混合液；
此时，样本中的待检物与化学发光标记物中的所述第一免疫结合物(第一抗体)结合，形成化学发光标记物+待检物的第一复合物，即化学发光物质-第一免疫结合物(第一抗体)-待检物(抗原)复合物，完成第一级检测反应。
3)将待检样本混合液加载至液相分散膜，向前流经血细胞过滤结构和固相膜，并被吸收到吸水垫中；
此时，所述第一复合物被包被固定在所述硝酸纤维素膜上的所述捕获剂捕获并固定，形成化学发光标记物+待检物+捕获剂的第二复合物，即化学发光物质-第一免疫结合物(第一抗体)-待检物(抗原)-第二免疫结合物(第二抗体)的复合物，完成第二级检测反应。
4)取助检液加载至液相分散膜，向前流经血细胞过滤结构、固相膜，被吸水垫吸收；
此时，所述助检液清洗特异结合和固定在固体膜上的化学发光物质及其复合物，形成低噪音的非特异性检测本底，完成第三级测试反应。
5)取所述固相膜，将其转移到化学发光反应液中，采用化学发光检测仪以定量检测固相膜上的发光量；
6)根据标准曲线，计算待检样本中待检物的浓度，完成检测。
所述的一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法在免疫检测试剂产品开发中的应用。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
1、本发明通过设计固相膜作为免疫化学发光检测的反应载体，全部待检物分离反应过程都在固相膜上完成，使化学发光检测反应的分离操作过程仅由向固相膜加载液相的简单操作步骤完成，进而使操作简单化，提高检测设备的检测通量。免疫化学发光检测包括待检物分离过程和分离后的待检物定量检测过程。市场常用的管道磁微粒化学发光检测技术其待检物分离过程均需要在磁微粒上完成，需要磁微粒标记及磁微粒在管道内的温控反应、磁微粒在管道内的转移和清洗等过程。本技术将待检物分离过程集中在固相膜上，全部结合、分离、清洗的过程均通过简单的检测液相在固相膜上的层析流动方式完成，不需要温控、不需要固相膜的转移，使检测过程简单化，不仅降低了检测成本，有效提高免疫检测技术产品临床检测的及时性和普及推广的可行性。
2、本发明通过设计在固相膜上采用分散分布方式包被并固定捕获剂，使捕获剂在固相膜上捕获固定的化学发光标记物得以充分的暴露，提高了化学发光标记物的发光检测效率，有效避免了现有膜层析检测技术中捕获剂集中喷线包被，检测时形成局部化学发光标记物的捕获聚集，使发光产生局部遮盖和淬灭，导致发光检测效率不足的技术障碍。
3、本发明通过设计捕获剂在固相膜上的分散分布方式包被，避免了化学发光标志物在固相膜上的聚集对发光检测的影响，进而实现了通过扩大包被面积提高待检物的线性检测区间的目的，满足多种样本检测的需求。
4、本发明采用固相膜作为待检物承载的载体，使待检物的捕获、分离和检测过程都在固相膜上完成。由于发明使用的固相膜，如硝化纤维膜，是多孔材料，固相膜的表面容积显著大于目前使用的磁微粒的表面容积，因而，提高了待检物的承载容积，扩大了化学发光检测中待检物的线性检测范围。
5、本发明设计了将液体溶液加载到测试膜上作为检测的唯一主要操作步骤，它节省了目前的管式磁性颗粒程序中的多个步骤，如温度控制、孵育、悬浮和磁分离。同时，由测试缓冲液进行的清洗过程也旨在加快流程，因此达到测试的反应平台所需的时间非常短且非常快。
6、本发明设计了化学发光标记物以冻干粉剂的形式储存，这简化了存储和运输过程，并可以在室温下存储，从而能够避免目前在化学发光检测试剂中使用的冷链运输。。
7、本发明设置了化学发光检测仪，可用于多种环境下的定量检测，提高了临床应用价值。
术语说明：
1、固相膜：指硝化纤维膜和具有相似蛋白结合性、多孔且不溶于水的膜结构材料。市场上常用的材料包括硝化纤维膜、聚偏氟乙烯膜(PVDF)、尼龙膜和DEAE纤维素膜。。
2、指示剂：也称为标记、化学发光物质，指在检测技术中能够用于直接检测并获得定量数值的可作为标记物使用的物质。本发明采用化学发光物质作为指示剂，包括酶化学发光免疫测定(CLEIA)的辣根过氧化酶和碱性磷酸酶，直接化学发光免疫测定(CLIA)的吖啶酯类和吖啶磺酰胺类，电化学发光免疫测定(ECLI)的三联吡啶钌及其衍生N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯。
3、免疫结合物：指能够与待检物直接或间接形成特异性结合的物质，包括抗原、抗体、生物素、亲和素等。
4、捕获剂：指能够包被固定的固相膜上并对待检物具有特异性免疫结合特性的物质，包括抗原、抗体、生物素、亲和素等；并与第一免疫结合物具有配对结合特性的物质，包括抗原、抗体、生物素、亲和素及其类似物，在本发明中也称为第二免疫结合物。
5、待检物：指特定的目标检测物质，存在于待检样本中，也称为目标待检物。
6、分散分布包被：指捕获剂分子以分散或分散分布的方式包被在固相膜上，捕获剂分子之间没有明显的叠加、聚集、重叠和堆积，这与现有的免疫膜层析检测技术中捕获剂通过喷线包被所形成的局部高浓度聚集包被的特征有着显著不同。
7、均匀分散分布包被：指捕获剂在固相膜上的包被呈均匀的分散分布的方式。
8、梯度分散分布包被：指捕获剂以纵向密度逐渐增加且横向密度均匀分布的方式渐进包被在固相膜上。
9、节段性分散分布包被：指捕获剂以片状或分段或零散分布的方式包被在固体膜上。它只覆盖部分固相膜，而不是以一种连续涂覆的方式包被。优选水平密度均匀分布的方式。
10.标记物：用指示剂标记的标记产物，也称为检测剂，在本发明中，指化学发光物质作为指示剂标记免疫结合物，形成的化学发光标记物。
11.免疫层析法：也称为侧向流检测，是一种旨在通过固相膜反应检测液体样本中待检物的存在或浓度的简单快速的检测方法。
附图说明
图1为本发明的操作流程示意图；
图2为本发明的基本结构示意图；
图3为本发明的均匀分散分布包被的基本结构示意图；
图4为本发明的梯度分散分布包被的基本结构示意图；
图5为本发明的节段性分散分布包被的基本结构示意图；
图6为本发明的含有血细胞过滤结构的检测结构示意图；
图7为本发明的组合检测结构的示意图。
图中标记如下：
固相膜1；捕获剂2；吸水结构3；液相分散膜4；支撑底片5；均匀分散分布包被6；梯度分散分布包被7；节段性分散分布包被8；血细胞过滤结构9；化学发光标记物冻干粉10；化学发光标记物装载结构11；助检液12；助检液装载结构13；化学发光反应液14；待检样本15；化学发光标记物加样结构16；助检液加样结构17；化学发光检测仪18；化学发光测量室19。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下所述实施例结合附图对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于以下说明。
如图1所示，本发明的技术流程示意图，取PVC支撑底片，在上面粘贴固相膜(常用硝酸纤维素膜)，取第二抗体或抗原(免疫结合物)的捕获剂，以分散分布方式包被在固相膜上；取化学发光物质(常用三类直接发光标记物吖啶酯类化合物、吖啶磺酰胺类化合物，酶促发光标记物辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，电化学发光标记物三联吡啶钌标记物)标记第一抗体或抗原，以制备化学发光标记物；配制助检液。使用时，取包被后的固相膜卡，在固相膜的远端连接吸水结构(常用吸水纸垫)，在固相膜的近端连接液相分散膜(常用玻璃纤维素膜和多聚酯纤维素膜)，形成试剂条；取待检液相样本，加入化学发光标志物，制成待检混合液，启动第一级检测反应，形成待检物-化学发光标记物的第一复合物；将配制的待检混合液，加载至液相分散膜，向前流经固相膜、吸水垫，此时，待检物复合物被包被固定在固相膜上的所述第二免疫结合物所捕获并固定，形成化学发光标记物-待检物-第二免疫结合物的第二复合物，完成第二级检测反应；取配制的助检液，加载至液相分散膜，向前流经固相膜、吸水垫，重复一次以上，残留在固相膜上的未被结合和未固定的化学发光物质从固相膜清洗掉。取固相膜，用化学发光反应溶液和化学发光检测仪完成化学发光测量，并获得测试结果。免疫分析检测中检测到的分子通常被称为“待检物”。
如图2所示，本发明以膜为基础的化学发光免疫层析的基本结构包括，PVC支撑底片5上粘贴有固相膜1，固相膜1上有分散分布方式包被的捕获剂2，远端与吸水垫3，近端与液相分散膜4连接。它包括一体化结构和分体结构。一体化结构是指各结构部分互相连接的结构，如液体分散膜4与固相膜1连接，固相膜1与吸水垫3连接的顺序。分体结构是指各结构部分分离设置的结构，在使用时将分离状态的结构部分进行组装。与现有的含有指示剂标记物的层析技术不同，指示剂标记物是单独提供的。也不像现有层析技术，在固相膜上不设置有高浓度测试线(T线)。
如图3、图4、图5所示，本发明捕获剂在固相膜上分散分布包被的三种方式，图3为均匀分散分布包被6，捕获剂以均匀分散分布的方式包被在固相膜上；图4为梯度分散分布包被7，捕获剂以纵向密度梯度增加，横向密度分布均匀的方式分散分布包被在固相膜上；图5为节段性分散分布包被8，捕获剂以纵向密度梯度增加，横向密度分布均匀的方式在固相膜上进行节段性分散分布包被而不是全部的固相膜。
如图2、图6所示，本发明的含有血细胞过滤结构的检测结构，PVC支撑底片5上粘贴有固相膜1，固相膜1上有分散分布方式包被的捕获剂2，远端与吸水垫3，近端与血细胞过滤结构9连接。它包括一体化结构和分体结构。一体化结构是指各结构部分互相连接的结构，如血细胞过滤结构9与固相膜1连接，固相膜1与吸水垫3连接的顺序。分体结构是指各结构部分分离设置的结构，在使用时将分离状态的结构部分进行组装。固相膜1上不包被有现有技术常用的高浓度测试线(T线)，但近端与血细胞过滤结构9连接的部位可连进一步连接液相分散膜4。
如图7所示，本发明的组合检测结构，包括固相膜1、捕获剂2、吸水结构3、液相分散膜4、支撑底片5、血细胞过滤结构9、化学发光标记物10、化学发光标记物装载结构11、助检液12、助检液装载结构13、化学发光反应液14、待检样本15、化学发光标记物加样结构16、助检液加样结构17、化学发光检测仪18、化学发光测量室19，其中：捕获剂2分散分布包被在固相膜1上，固相膜1粘贴在支撑底片5上，固相膜1两侧分别连接液相分散膜4、血细胞过滤结构9和吸水结构3。化学发光标记物10装载于化学发光标记物装载结构11内，助检液12装载于助检液装载结构13内，并分别设有化学发光标记物加样结构16和助检液加样结构17。同时配有化学发光反应液14、化学发光检测仪18和位于化学发光检测仪18内用于发光定量检测的化学发光测量室19。检测时配有待检样本15。
这样在实际操作时包括如下步骤，首先取固相膜1粘贴至PVC支撑底片5上，稀释配制含有低浓度捕获剂2的包被溶液，包被固相膜1，采用全覆盖式或节段式。取分散分布包被有所述捕获剂2的固相膜1结构，在近端依次连接液相分散膜4和/或血细胞过滤结构9，在远端加载连接吸水结构3，形成本发明的检测结构。然后将采集待检样本15加入至含有化学发光标记物10的装载结构11内，并加入适量的助检液12，将样品与化学发光标记物10(第一抗体或抗原)混合以制备待检样本混合液，启动第一次测试反应并形成待检物-化学发光标记物的第一复合物。再将待检样本混合液加载至液相分散膜4，向前流经血细胞过滤结构9、固相膜1、吸水垫3，此时，所述第一复合物被包被固定在固相膜1上的所述待检物特异性捕获剂(第二抗体或抗原)所特异性捕获并固定，形成化学发光标记物+待检物+第二免疫结合物的第二复合物，即化学发光物质-第一免疫结合物-待检物-第二免疫结合物的复合物，完成第二级检测反应。取助检液12加载至液相分散膜4，向前流经血细胞过滤结构9、固相膜1、吸水垫3，此时，助检液12清除残留在固相膜1上未被特异性结合的所述化学发光物质及其复合物，形成低水平的非特异性检测本底，完成第三级检测反应。取固相膜结构，加载化学发光反应液14，采用化学发光定量检测仪18，定量测定来自固相膜结构的发光量，完成检测。
本发明的实验研究：
下述实验说明本发明的检测方法及其效果，但不是对本发明的限定。下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验一：本发明与常规酶化学发光实验的比较：
一、酶化学发光标记物制备：
采用常规辣根过氧化酶(HRP)标记方法，过碘酸钠氧化法，制备HRP标记抗人肌红蛋白单克隆抗体溶液，先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与单克隆抗体上的氨基相结合，形成HRP标记抗人肌红蛋白单克隆抗体。具体称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋中，在1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯HRP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg抗人肌红蛋白第一单克隆抗体在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时，将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4磷酸盐缓冲液透析，4℃过夜，透析后过分子筛纯化。使用前用0.15M PH7.4磷酸盐缓冲液稀释至1000万发光单位(RLUs)/ul，5ul/管分装使用。
二、包被固相膜制备：
取与抗人肌红蛋白第一单克隆抗体具有配对结合特性的抗人肌红蛋白第二单克隆抗体，用50mM磷酸盐缓冲液pH7.4稀释制备浓度为1.0mg/ml常规包被液，用含有0.1mg/ml鼠IgG的50mM磷酸盐缓冲液pH7.4稀释制备浓度为250ug/ml本发明第一包被液、62.5ug/ml本发明第二包被液、15.6ug/ml本发明第三包被液。
常规包被：启动印膜仪，装载1.0mg/ml常规包被液，取贴有宽度5mm硝酸纤维素膜的PVC片，开始划线印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度10mm/秒，液体推进速度1.5μl/cm。将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
本发明均匀分散分布包被：取贴有宽度5mm硝酸纤维素膜的PVC片，均匀涂布250ug/ml的本发明第一包被液。将涂布好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
本发明梯度分散分布包被：取贴有宽度5mm硝酸纤维素膜的PVC片，标记为上、中、下三个区间，分别包被250ug/ml的本发明第一包被液、62.5ug/ml本发明第二包被液和15.6ug/ml本发明第三包被液。启动印膜仪，开启加压氮气，分别装载15.6ug/ml本发明第三包被液、62.5ug/ml本发明第二包被液和250ug/ml的本发明第一包被液，开始喷膜包被，设定印膜条件为：喷笔移动速度10mm/秒，液体推进速度5.0μl/cm；将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥6小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
本发明节段分散分布包被：取贴有宽度5mm硝酸纤维素膜的PVC片，标记为上、中、下三个区间，分别在上区间包被250ug/ml本发明第二包被液，在下区间包被15.6ug/ml本发明第三包被液，留中间区间为空白。启动印膜仪，开启加压氮气，分别装载15.6ug/ml本发明第三包被液和250ug/ml的本发明第一包被液，开始喷膜包被，设定印膜条件为：喷笔移动速度10mm/秒，液体推进速度5.0μl/cm；将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥6小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
三、半成品组装：
启动除湿机使操作室内的湿度降低至25％以下，在包被固相膜两端分别粘贴吸水纸膜垫及玻璃纤维液相分散膜。置粘贴好的检测片于切条机上，切成4.0mm试剂条。将试剂条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签。配制助检液为含有30mMTris pH8.5、1％NP40、1M氯化钠和0.5％酪蛋白钠的水溶液。
四、实验材料准备：
实验用2ml保存管作为化学发光标记物装载结构和助检液装载结构，硝酸纤维素膜采用赛多利斯CN140，玻璃纤维素膜采用上海金标的SB08。印膜仪采用美国ImagenTechnology公司的ISOF Flow喷膜印膜一体机。切条机采用韩感中国CE切条机。化学发光定量检测仪采用Promega公司的Glomax Multi Jr化学发光检测仪。酶化学发光反应液采用Thermo Scientific公司的West Femto Peroxide Solution。
五、实验方法：
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液(1％BSA，100mM甘氨酸，50mM PBS,150mM NaCl，pH7.4)稀释配置3、30、100、300、1000、3000ng/ml的系列人肌红蛋白溶液。
实验组：将上述配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液，分别以50ul/管加入不同的上述制备的酶化学发光标记物管内，形成标记物混合液。取上述制备的本发明三种包被试剂条，向液相分散膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白标记物混合液50ul，静置2分钟，再向液相分散膜上滴加助检液25ul，静置1分钟后再滴加助检液25ul，静置5分钟，去除试剂条的液相分散膜和吸水垫，将硝酸纤维素膜分别放置于含有酶化学发光反应液的检测管内，在化学发光定量检测仪上读取发光值(RLUs)，实验重复三次，结果取平均值。
对照组：取上述制备的常规包被试剂条，采用上述实验组的方法进行测试，并计算结果。
六、实验结果
本发明以固相膜作为化学反应承载载体，采用捕获剂均匀分散分布包被、梯度分散分布包被和节段分散分布包被进行实验，结果见表1，本发明实验组三种包被制品的肌红蛋白检测均呈现良好的浓度-发光量相关关系，当检测上限值设为3000ng/ml，线性检测范围为3-3000ng/ml时，均匀分散分布包被的相关系数r2为0.977，梯度分散分布包被的相关系数r2为0.968，节段分散分布包被的相关系数r2为0.985，线性反应良好；对照检测组采用常规包被试剂条也呈现浓度-发光量反应关系，但其线性范围远低于本发明组，当选择线性检测范围为3-3000ng/ml时，仅浓度在3-30ng/ml之间有线性反应，无法满足临床检测。说明本发明技术优于现有技术，适用于酶化学发光检测。
表1、本发明与常规酶化学发光实验的比较
实验二：本发明与常规直接化学发光实验的比较
一、直接化学发光标记物制备：
采用吖啶酯(NSP-SA-NHS)作为直接化学发光物质，与含有一级氨基的蛋白单克隆抗体发生反应，在碱性条件下，吖啶酯NHS与蛋白质单克隆抗体反应，形成稳定的酰胺键，吖啶酯标记抗人肌红蛋白单克隆抗体。具体操作先配制2.5mg/ml吖啶酯-DMSO母液，使用0.2MNaHCO3(pH＝9.0)溶液配制0.5mg/ml抗体反应液。取10μL稀释吖啶酯母液(2.5mg/ml)，加入90μL无水DMSO稀释10倍，配成吖啶酯工作液(0.25mg/ml)。使用0.2M NaHCO3(pH＝9.0)溶液稀释50μg的抗体至300μL，加入10μL吖啶酯工作液(0.25mg/ml)。室温避光标记1h。封闭，加入100μL标记终止缓冲液(10％赖氨酸，0.2MNaHCO3，PH9.0)，室温混匀30分钟。在10mM PBPH 6.5缓冲液中透析，4℃过夜，透析后过分子筛纯化。使用前用0.15M PH7.4磷酸盐缓冲液稀释至1000万发光单位(RLUs)/ul，5ul/管分装使用。
二、包被固相膜制备：
同“实验一”中的“常规包被”和“本发明均匀分散分布包被”。
三、半成品组装：
同“实验一”。
四、实验材料准备：
同“实验一”。
五、实验方法：
人肌红蛋白溶液的配制：同“实验一”。
实验组：同“实验一”，采用本实验制备的直接化学发光标记物和“实验一”方法制备的本发明均匀分散分布包被试剂条进行检测，反应完成后，去除试剂条的液相分散膜和吸水垫后，将硝酸纤维素膜放置于检测管内，插入加样导管并与外置的装有吖啶酯化学发光反应液的柱推器连接，然后将检测管放入化学发光定量检测仪的发光测量室内，启动检测，加注吖啶酯化学发光反应液，自动计数发光5秒，取平均值(RLUs)，实验重复三次，结果取平均值。
对照组：使用直接化学发光标记物，用“实验一”常规包被试剂条进行测试和本实验的“研究组”方法进行测试，然后计算平均值。
六、实验结果
本发明以固相膜作为化学反应承载载体，采用捕获剂均匀分散分布包被的固相膜进行实验，结果见表2，本发明直接化学发光免疫肌红蛋白检测实验也呈现良好的浓度-发光量相关关系，当检测上限值设为3000ng/ml，线性检测范围为3-3000ng/ml时，相关系数r2为0.962，线性反应良好。对照检测组采用常规包被试剂条也呈现浓度-发光量反应关系，但其线性范围远低于本发明组，当选择检测范围为3-3000ng/ml时，仅浓度在3-30ng/ml之间有线性反应。说明本发明技术优于现有技术，适用于直接化学发光检测。
表2、本发明与常规直接化学发光实验的比较
实验三：本发明与常规乳胶微球标记实验的比较
一、乳胶微球酶化学发光标记物制备：
采用常规乳胶微球抗体标记方法，用“实验一”制备的辣根过氧化酶(HRP)标记抗人肌红蛋白第一单克隆抗体进行乳胶微球标记，制备HRP-抗体-乳胶微球标记物。具体操作，取2.0ml管，加入初洗液(10mM MESPH 5.5，T200.05％)1ml，加入12.5微升度生物公司粒径300nm乳胶微球原液，混匀，10000rpm离心20min；用初洗液配置50mg/ml的EDC与NHS溶液，离心后去上清，加入750微升初洗液，超声溶解，加入100微升EDC溶液与150微升NHS溶液，混匀，37摄氏度活化15min后，10000rpm离心20min；离心后去上清，加入1ml偶联缓冲液(10mMMES PH 5.0，PC3000.04％)超声混匀后10000rpm离心20min；离心后去上清，加入1ml偶联液超声混匀，加入50ug HRP标记抗人肌红蛋白第一单克隆抗体，37摄氏度偶联2h后，超声2min后，10000rpm离心20min；离心后去上清，加入1ml封闭液超声混匀，37摄氏度封闭30min，10000rpm离心20min；离心后去上清，加入1ml终洗液超声混匀，10000rpm离心20min；离心后去上清，加入1ml复溶液(复溶液为10mM Tris PH8.5、0.4％酪蛋白钠、0.02％吐温20、10％海藻糖的水溶液)超声混匀，4℃保存备用。使用前用复溶液稀释至1000万发光单位(RLUs)/ul，5ul/管分装使用。
二、包被固相膜制备：
同“实验一”中的“常规包被”和“本发明均匀分散分布包被”。
三、半成品组装：
同“实验一”。
四、实验材料准备：
同“实验一”。
五、实验方法：
人肌红蛋白溶液的配制：同“实验一”。
实验组：同“实验一”，采用本实验制备的乳胶微球酶化学发光标记物和“实验一”方法制备的“本发明均匀分散分布包被”试剂条进行检测。
对照组：同“实验一”，采用本实验制备的乳胶微球酶化学发光标记物和“实验一”方法制备的“常规包被”试剂条进行检测。
六、实验结果
本发明以固相膜作为化学反应承载载体，采用捕获剂均匀分散分布包被的固相膜进行实验，结果见表3，本发明乳胶微球标记酶化学发光肌红蛋白检测实验呈现良好的浓度-发光量相关关系，当检测上限值设为3000ng/ml，检测范围为3-3000ng/ml时，相关系数r2为0.987，呈良好的线性反应。对照检测组采用常规包被试剂条也呈现浓度-发光量反应关系，但其线性范围远低于本发明组，当选择检测范围为3-3000ng/ml时，仅浓度在3-30ng/ml之间有线性反应。说明本发明技术优于现有技术，适用于乳胶微球标记化学发光检测。
表3、本发明与常规乳胶微球标记实验的比较
实验四：本发明与常规胶体金微粒标记实验的比较
一、胶体金酶化学发光标记物制备：
采用常规胶体金微粒抗体标记方法，用胶体金微粒标记“实验一”制备的辣根过氧化酶(HRP)标记抗人肌红蛋白第一单克隆抗体，制备HRP-抗体-胶体金微粒标记物。具体操作，取1.5ml离心管，加入粒径50nm胶体金溶液1ml，加入3.6ul 0.1M碳酸钾，搅拌均匀，加入HRP标记抗人肌红蛋白第一单克隆抗体5ug，反应10min后，加入20％BSA 10ul/ml，再反应10min后，用10000r/min离心15分钟，去上清，沉淀用1ml胶体金复溶液(30mM Tris、0.4％酪蛋白钠、3％海藻糖、3％蔗糖、0.25％BSA)混悬，10000r/min离心15分钟，去上清，沉淀再次用胶体金复溶液混悬，终体积为0.5ml。使用前用胶体金复溶液稀释至1000万发光单位(RLUs)/ul，5ul/管分装使用。
二、包被固相膜制备：
同“实验一”中的“常规包被”和“本发明均匀分散分布包被”。
三、半成品组装：
同“实验一”。
四、实验材料准备：
同“实验一”。
五、实验方法：
人肌红蛋白溶液的配制：同“实验一”。
实验组：同“实验一”，采用本实验制备的胶体金酶化学发光标记物和“实验一”方法制备的“本发明均匀分散分布包被”试剂条进行检测。
对照组：同“实验一”，采用本实验制备的胶体金酶化学发光标记物和“实验一”方法制备的“常规包被”试剂条进行检测。
六、实验结果
本发明以固相膜作为化学反应承载载体，采用捕获剂均匀分散分布包被的固相膜进行实验，结果见表4，本发明胶体金标记酶化学发光肌红蛋白检测实验呈现良好的浓度-发光量相关关系，当检测上限值设为3000ng/ml，检测范围为3-3000ng/ml时，相关系数r2为0.979，呈良好的线性反应。对照检测组采用常规包被试剂条也呈现浓度-发光量反应关系，但其线性范围远低于本发明组，当选择检测范围为3-3000ng/ml时，仅浓度在3-30ng/ml之间有线性反应。说明本发明技术优于现有技术，适用于胶体金标记化学发光检测。
表4、本发明与常规胶体金微粒标记实验的比较
实验五：本发明捕获剂包被面积与线性区间的比对实验
一、胶体金酶化学发光标记物制备：
同“实验四”。
二、包被固相膜制备：
取与抗人肌红蛋白第一单克隆抗体具有配对结合特性的抗人肌红蛋白第二单克隆抗体作为捕获剂，用含有0.1mg/ml鼠IgG的50mM磷酸盐缓冲液pH7.4稀释制备浓度为1.0mg/ml包被液、0.5mg/ml包被液、250ug/ml包被液、125ug/ml包被液、62.5ug/ml包被液。启动印膜仪，装载1.0mg/ml包被液，取贴有宽度10mm硝酸纤维素膜的PVC片，印膜喷线1次；装载0.5mg/ml包被液，取10mm硝酸纤维素膜PVC片，非重叠印膜喷线2次；装载250ug/ml包被液，取10mm硝酸纤维素膜PVC片，非重叠印膜喷线4次；装载125ug/ml包被液，取10mm硝酸纤维素膜PVC片，非重叠印膜喷线8次；装载62.5ug/ml包被液，取10mm硝酸纤维素膜PVC片，非重叠印膜喷线16次。设定印膜条件为：喷笔移动速度10mm/秒，液体推进速度1.5μl/cm。将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
三、半成品组装：
同“实验一”，采用本实验包被固相膜。
四、实验材料准备：
同“实验一”。
五、实验方法：
人肌红蛋白溶液的配制：同“实验一”。
实验组：同“实验一”，采用本实验制备的胶体金酶化学发光标记物和本实验制备的“包被固相膜”试剂条进行检测。
六、实验结果
本发明以固相膜作为化学反应承载载体，采用包被液喷线分散分布包被的固相膜进行实验，结果见表5，本发明实验采用相同的捕获剂包被量但不同的包被面积，进行捕获剂包被面积与线性区间大小的分析实验，结果肌红蛋白检测的线性检测区间随着包被面积的增大而检测区间范围增加。当采用1.0mg/ml包被液喷线面积为1条时，检测范围为3-100ng/ml时，相关系数r2为0.952；当采用0.5mg/ml包被液喷线面积为2条时，检测范围为3-300ng/ml时，相关系数r2为0.967；当采用250ug/ml包被液喷线面积为4条时，检测范围为3-3000ng/ml时，相关系数r2为0.958；当采用125ug/ml包被液喷线面积为8条喷线时，检测范围为3-3000ng/ml时，相关系数r2为0.964；当采用62.5ug/ml包被液喷线面积为16条喷线时，检测范围为3-3000ng/ml时，相关系数r2为0.969。说明本发明技术增加捕获剂分散分布方式的包被面积可以增加以膜为基础的化学发光检测的线性检测区间。
表5、本发明捕获剂包被面积与线性区间的比对实验
实验六：本发明捕获剂包被浓度与检测线性的比对实验
一、酶化学发光标记物制备：
同“实验四”
二、包被固相膜制备：
取与抗人肌红蛋白第一单克隆抗体具有配对结合特性的抗人肌红蛋白第二单克隆抗体作为捕获剂，用50mM磷酸盐缓冲液pH7.4稀释制备浓度为2.0mg/ml包被液、1.0mg/ml包被液、0.5mg/ml包被液、250ug/ml包被液、125ug/ml包被液、62.5ug/ml包被液、31.3ug/ml包被液、15.6ug/ml包被液。取贴有宽度5mm硝酸纤维素膜片，用切条机切割为宽2mm长5mm的硝酸纤维素膜片，分别用上述配置的包被液进行膜的整体均匀分散分布包被。将包被好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
三、半成品组装：
同“实验一”。
四、实验材料准备：
同“实验一”。
五、实验方法：
人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液(1％BSA，100mM甘氨酸，50mM PBS,150mM NaCl，pH7.4)稀释配置3000ng/ml的人肌红蛋白溶液。
实验组：同“实验一”，采用本实验制备的胶体金酶化学发光标记物和本实验制备的“包被固相膜”试剂条进行检测，不同测试都采用3000ng/ml一个浓度的人肌红蛋白溶液进行。
六、实验结果
本发明以固相膜作为化学反应承载载体，采用捕获剂均匀分散分布包被不同浓度的包被液进行实验，结果见表6，本发明实验采用同一剂量的酶化学发光标记物，但不同的捕获剂包被浓度，当捕获剂包被浓度由高到低时，发光值检测出现先低、再高、后又逐渐降低的趋势。肌红蛋白的检测线性在高浓度区间随着包被浓度的增加其发光量降低，而在中低浓度区间，随着包被浓度的降低其发光量也相应降低，表现为中间高两边低的弓背向上的弧线形变化，在2.0mg/ml高浓度包被液的固相膜的反应近端可以看到有明显的红色胶体金颗粒聚集带的形成。说明当捕获剂包被浓度高时，固相膜上的捕获剂呈叠加聚集态，形成酶化学发光标记物的聚集捕获，使有效的发光检测面积缩小，进而降低发光量；但当捕获剂包被浓度中低时，固相膜上的捕获剂呈分散分布方式，酶化学发光标记物被捕获结合后，呈分散状态分布，不形成聚集捕获，保持正常的有效发光检测面积，则其发光检测量直接与酶化学发光标记物的捕获量正相关，进而出现发光量与捕获剂包被浓度的正相关关系。
表6、本发明捕获剂包被浓度与检测线性的比对实验
实验七：本发明生物素/亲和素系统的比较实验：
一、酶化学发光标记物制备：
同“实验四”。
二、生物素标记物制备：
取抗人肌红蛋白第二单克隆抗体，用10mM PBS PH7.4稀释到1.0mg/ml；取活化生物素(Sigma)，用EP管称量，用10mM PBS PH7.4溶解，终浓度为20mM；按每2mg抗人肌红蛋白第二单克隆抗体加入20mM生物素13.3ul，混匀，室温反应60min；反应结束后用10mM PBSPH7.4过夜透析，以备进一步使用。
三、包被固相膜制备：
取链亲和素(Sigma)，用50mM磷酸盐缓冲液pH7.4稀释制备浓度为100ug/ml常规包被液，用50mM磷酸盐缓冲液pH7.4稀释制备浓度为20ug/ml本发明链亲和素包被液。
对照组包被：启动印膜仪，装载100ug/ml常规包被液，取贴有宽度5mm硝酸纤维素膜的PVC片，开始划线印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度10mm/秒，液体推进速度1.5μl/cm。将印制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
实验组包被：取20ug/ml本发明链亲和素包被液。取贴有宽度5mm硝酸纤维素膜的PVC片，均匀涂布20ug/ml本发明链亲和素包被液。将涂布好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
四、半成品组装：
同“实验一”。
五、实验材料准备：
同“实验一”。
六、实验方法：
人肌红蛋白溶液的配制：同“实验一”。取酶化学发光标记物和生物素标记物进行混合(标记抗体量以标记物产率估算约7:3比例混合)，制备标记物混合液管。将上述配制的不同浓度的人肌红蛋白溶液，分别以50ul/管加入不同的上述制备的标记物混合液管内，形成不同浓度的人肌红蛋白标记物混合液。
实验组：取上述制备的本发明均匀分散分布包被试剂条，向液相分散膜上滴加配制的不同浓度的人肌红蛋白标记物混合液50ul，静置2分钟，再向液相分散膜上滴加助检液25ul，静置1分钟后再滴加助检液25ul，静置5分钟，去除试剂条的液相分散膜和吸水垫，将硝酸纤维素膜放置于含有酶化学发光反应液的检测管内，在化学发光定量检测仪上读取发光值(RLU)，实验重复三次，结果取平均值。
对照组：取上述制备的对照组包被的亲和素试纸条，使用本实验中的研究组方法进行测试，并计算平均值。
六、实验结果
本发明以固相膜作为化学反应承载载体，采用捕获剂均匀分散分布包被进行实验，结果见表7，本发明生物素/亲和素胶体金标记酶化学发光肌红蛋白检测实验中肌红蛋白检测呈现良好的浓度-发光量相关关系，当检测上限值设为3000ng/ml，检测范围为3-3000ng/ml时，相关系数r2为0.978，呈良好的线性反应。对照检测组采用常规包被试剂条也呈现浓度-发光量反应关系，但其线性范围远低于本发明组，仅浓度在3-30ng/ml之间有线性反应。说明本发明技术优于现有技术，适用于生物素/亲和素系统化学发光检测。
表7、本发明生物素/亲和素系统的比较实验
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (15)

1.一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法，特征在于，包括：固相膜、捕获剂、化学发光指示剂、化学发光标记物、助检液、化学发光反应液和化学发光检测仪，其中：所述捕获剂以分散分布的方式包被在所述固相膜上，所述捕获剂在所述固相膜上分散分布包被的面积与所述化学发光免疫层析检测的线性检测范围呈正相关关系。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括：所述的固相膜、捕获剂、化学发光指示剂、化学发光标记物、助检液、化学发光反应液和化学发光检测仪，其中：
1)所述化学发光标记物为采用化学反光物质标记的待检物特异性第一免疫结合物；
2)所述捕获剂为非标记的与所述待检物特异性第一免疫结合物具有待检物特异性配对结合特性的待检物特异性第二免疫结合物；
3)所述固相膜粘贴于支撑底片上，所述捕获剂以分散分布的方式包被在所述固相膜上，所述捕获剂在所述固相膜上分散分布包被的面积与所述化学发光免疫层析检测的线性检测范围呈正相关关系，且所述捕获剂在所述固相膜上单位面积的包被量以所述捕获剂在所述固相膜上分散分布并且不形成叠加聚集的包被状态为优选；
4)所述化学发光标记物与待检样本混合形成样本混合物，在样本混合物内的所述第一免疫结合物与所述待检物进行特异性结合形成待检物-化学发光标记物的第一复合物，然后样本混合物被加载并通过固相膜向前流动，并被被远端的吸水结构吸收，所述待检物被固相膜上的第二免疫结合物捕获，形成化学发光标记物-待检物-第二免疫结合物的第二复合物，并被固定在所述固体膜上；
5)所述助检液为水溶性缓冲盐溶液，在完成捕获固定的所述固相膜上加载、流经并被远端的吸水结构吸收，清洗残留在所述固相膜上未被捕获固定的游离的所述指示剂和化学发光标记物，完成所述固相膜的清洗过程；
6)所述吸水结构吸收流经所述固相膜的水，位于所述固相膜的远端，并与所述固相膜形成直接连接，优选吸水纸垫；
7)所述固相膜在完成所述助检液的清洗过程后，置于所述化学发光反应液内，用所述化学发光检测仪进行发光量检测。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述捕获剂在固相膜上以分散分布的方式包被，并包括三种不同的包被方式，均匀分散分布包被、梯度分散分布包被、节段性分散分布包被。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述固相膜为硝酸纤维素膜和具有与硝酸纤维膜相似的蛋白质结合能力的其他多孔膜，包括硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜(PVDF)、尼龙膜和DEAE纤维素膜。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述化学发光指示剂选择微粒结构，包括乳胶微球、彩色微球、磁微粒。彩色微珠包括彩色聚合物微珠和胶体金溶液。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述化学发光标记物和所述捕获剂两者均含有免疫结合物，所述免疫结合物包括抗体、抗原、生物素、亲和素及其类似物。对于亲和素的类似物，streptavidin是此检测的常见选择。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，标记制备所述化学发光标记物采用的化学发光物质可以是直接化学发光标记，如吖啶酯和吖啶磺酰胺，酶促化学发光标记，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，电化学发光标记，如三联吡啶钌。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述化学发光反应液包括碱性状态的含有过氧化氢的直接发光反应液，以鲁米诺及其衍生物为发光底物的酶促化学发光反应溶液，以及三联吡啶钌类结构标记物所致直接电极反应的电化学发光反应液。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述化学发光标记物的储存形态为冻干粉剂。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述固相膜的近端设置有血细胞过滤结构，与所述固相膜的近端形成直接连接，所述血细胞过滤结构包括血细胞过滤膜或经红细胞抗体处理膜垫。
11.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述固相膜的近端设置有液相分散膜，与所述固相膜的近端形成直接连接，所述液相分散膜优选玻璃纤维素膜或多聚酯纤维素膜。
12.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测试剂条的制备还包括生物素/亲和素反应系统，所述样本混合物包括化学发光物质标记的第一免疫结合物和生物素标记第二免疫结合物，所述硝酸纤维素膜上包被有非标记的亲和素及其类似物。
13.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法配置有化学发光定量检测仪，能够定量检测从固相膜发出的光量。
14.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法的操作使用，包括如下步骤：
1)取包被有所述捕获剂的所述固相膜结构，在近端依次放置液相分散膜和/或血细胞过滤结构，在远端加载吸水结构，水平放置于平面；
2)取待检样本，加入至含有化学发光标记物的试管中，并加入适量的助检液，混合，制成待检样本混合液；
3)将待检样本混合液加载至液相分散膜，向前流经血细胞过滤结构和固相膜，并被吸收到吸水垫中；
4)取助检液加载至液相分散膜，向前流经血细胞过滤结构、固相膜，被吸水垫吸收；
5)取所述固相膜，将其转移到化学发光反应液中，采用化学发光检测仪以定量检测固相膜上的发光量；
6)根据标准曲线，计算待检样本中待检物的浓度，完成检测。
15.所述的一种以膜为基础的化学发光免疫层析检测方法在免疫检测试剂产品开发中的应用。
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