DE2324544A1

DE2324544A1 - Synthetische antigene und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2324544A1
Application number: DE19732324544
Authority: DE
Inventors: Stanley Joseph Gross
Original assignee: Biological Developments Inc
Current assignee: Biological Developments Inc
Priority date: 1972-05-15
Filing date: 1973-05-15
Publication date: 1973-11-29
Also published as: ATA426073A; AU5570273A; JPS4941526A; GB1437801A; FR2184847B1; AT340065B; FR2184847A1

Description

"Synthetische Antigene und ihre Verwendung"

Priorität: 15. Mai 1972, V.St.A.,Nr. 253 632

Die Erfindung betrifft synthetische Antigene, die die Bildung vor).¹ spezifischen Antikörpern hervorrufen. Diese durch die erfindungsgemäßen synthetischen Antigene gebildeten Antikörper sind für die iimunochemische Analyse einer Vielzahl von chemischen Substanzen, insbesondere von Substanzen mit pharmakologiseher und/ oder sozialer Bedeutung, wie Steroide, Katecholamine, Prostaglandine und Rauschgifte, geeignet.

Ein relativ neuer Versuch der biologischen Analyse beruht auf iirmunochemisehen Verfahren. In diesen Verfahren verwendet man

309848/1227

Antikörper, die mit der zu untersuchenden Verbindung reagieren. Eine bekannte Menge an Antikörper und die Probe des zu untersuchenden Menschen oder Tiers werden vermischt. Ist "nun der Antikörper für die zu untersuchende Verbindung spezifisch, d.h. geht er mit den biologisch verschiedenen Strukturhomologen oder -analogen keine Kreuzreaktion ein, so kann man theoretisch die Menge an Antikörper, die" mit der Testverbindung reagiert hat, mittels herkömmlicher Radioimmunoversuche oder kompetitiver Fluoreszenzitiethoden messen und daraus die vorhandene Menge an Testverbindung berechnen.

Bisher ist jedoch kein zuverlässiges reproduzierbares und leicht durchführbaresimmunochemisches Analysenverfahren entwickelt worden.

Für die Entxs-icklung eines praktisch durchführbaren Analysenverfahrens auf Morphin sind z.B. Morphin-spezifische Antikörper unbedingt notwendig, da man Morphin von Kodein, dem im allgemeinen verabreichten 3-Methoxymorphin, und von den wichtigen synthetischen Morphin-Surrogatea, wie Methadon, Meperidin und Pentazocin, unterscheiden muß. Das gleiche gilt für die östrogene, wo eine Kreuzreaktion zwischen östron, östradiol und Östriol die Bestimmung sehr erschwert.

Aufgabe der Erfindung war es daher, synthetische Antigene zur Herstellung von spezifischen Antikörpern, die keine Kreuzreaktion mit den biologisch deutlich verschiedenen Strukturhomologen oder

30984 871227

23245U

-analogen ihrer homologen Haptene oder Antigene eingehen, zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung sind somit synthetische Antigene der Formel

in der R ein Hupten bedeutet, bei dem ein Ringatom kovalent über eine Bindung oder Bindungsgruppe L an einenmmunogenen Träger Z gebunden ist, wobei die Bindungsgruppe L eine der nachfolgenden Strukturen hat:

a) -N=N-R¹-Y-

b) -N=N-Y-

c) -N-CH-Y-

d) -CH=N-Y-

e) -CO-R"-Y-

f) -CR"=CR"-Y-

in welchen Strukturen R¹ eine die Bildung eines Diazoniumions ermöglichende Gruppe, R" ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest and Y eine funktioneile Gruppe ist, die mit einer funktionellen Gruppe X des iiranunogensn Trägers 2 reagiert, und η eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist.

Im folgenden bedeutet "eigentliches Hapten oder Antigen" ein

3 0 Ο B A 0 / 1 2 2 Ί

strukturell, chemisch oder biologisch nicht verändertes Hapten oder Antigen.

Der Ausdruck "homologes Hapten oder Antigen" bedeutet ein Hapten oder Antigen, das spezifisch eine Antikörper-Gruppe bindet. So ist z.B. Östriol das homologe Hapten für Östriol-spezifische Antikörper.

Unter "heterologes Hapten oder Antigen" wird ein nah verwandtes StrukturanalogQn des homologen Haptens oder Antigens verstanden.

Die gereinigten Antikörper, die mit den erfindungsgemäßen synthetischen Antigenen hergestellt werden, sind in bezug auf Kreuzreaktionen mit heterologen Haptenen oder Antigenen äußerst spezifisch. Diese Spezifität wird anhand der Fluoreszenzlöschung eines Antikörpers, der unter Verwendung eines geeigneten Derivats des homologen Haptens kompetitiv mit

a) einem homologen Hapten oder Antigen und

b) verwandten heterologen Haptenen oder Antigenen hergestellt wurde, bewiesen. Im Gegensatz zum heterologen Hapten verhindert das homologe Hapten die Fluoreszenzlöschung quantitativ. In Standard-Hemm-Versuchen war es bei steigenden Konzentrationen mit bekannten, angeblich spezifischen Antikörpern nicht möglich, die homologe Verbindung von ihren nahen verwandten Analogen zu unterscheiden.

309848/1227

Wie bereits erwähnt, ist es sehr erwünscht,eine Antikörper-Gruppe zu haben, die ein homologes Hapten oder Antigen von nahe verwandten Molekülen unterscheidet. Solche Antikörper werden für inununo chemische Kompetitivversuche mittels einfacher physikalischer Verfahren und für Isotop-Versuche benötigt, um die Konzentration von kleinen Molekülen im Urin oder Serum schnell bestimmen zu können. Durch die Verwendung eines spezifischen Antikörpers sind die Versuche genau und reproduzierbar, außerdem muß man die Probe vorher nicht mehr extrahieren, wodurch sich der Zeitaufwand für derartige Radioimmunoversuche wesentlich verringert. Diese Antikörper sind auch für inmunochemische Kompetitivversu die unter Verwendung von quantitativen Fluoreszenzmessungen (z.B. Hemmung der Löschung, Verstärkung und Polarisation) geeignet.

Die Herstellung eines Antikörper-Rohgemisches eines Tieres und die Reinigung dieser Antikörper sind Gegenstand eines älteren Rechtes (P 21 28 517.6).

Für R in der Formel (R-L}· Z ist jeder Rest geeignet, der zumindest einen aromatischen, cycloolefinischen, alicyclischen oder heterocyclischen Rest aufweist_und _mit einem Ringatom kovalent an L gebunden ist. Vorzugsweise haben diese aromatischen oder cyclischen Substituenten etwa 5 bis 8 Ringatome, wobei die Ringatome Kohlenstoffatome sind. Bei heterocyclischen Substituenten ist das Heteroatom vorzugsweise ein Stickstoffatom, insbesondere loder 2 Stickstoffatome. Spezielle Beispiele für derartige Substituenten sind Histadyl-, Tryptophyl-, Tyrosyl-, Phenyl-, Cyclopentyl-,

309848/1227

Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cyclooetyl-, Cyclope.ntenyl-, Cyclohexenyl- und Cycloheptenyireste. Cyclische Substituenten können auch kondensierte Ringsysterne, wie Naphthalin, Anthracen, Phenanthren oder deren Derivate sein, wobei zwei oder drei Ring-,atome zu zwei oder mehreren Ringen gehören.

Im allgemeinen enthält der Rest R nicht mehr als 30 Atome, vor-

wobei die Anzahl der Ringatome meist 20 ist, zugsweise etwa"6 bis 20 Atome,/vorzugsweise Kohlenstoffatome oder Kohlenstoffatome mit 1 oder 2 Stickstoffatomen, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein können. Spezielle Beispiele für derartige Substituenten sind Hydroxyl-, Keto-, Carboxyl- oder Aminogruppen, Halogenatome, wie Chlor-, Brom-, Jod- oder Fluoratome, Alkylreste, im allgemeinen mit 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis k Kohlenstoffatomen, Alkenylreste, im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise niedere Alkenylreste und poly-ungesättigte Reste, wie Dienyl- oder Trienylreste,und Phenylreste. Für R geeignet sind Reste, die dadurch verändert wurden, daß man einen biologisch inaktiven Substituenten, d.h. einen nicht bestimmenden Substituenten, im allgemeinen eines Ringatoms, z.B. ein Wasserstoffatom, durch einen Substituenten L, der mit einem immunogenen Träger Z eine Bindung eingehen kann, ersetzt.

Spezielle Beispiele für R im ursprünglichen Zustand sind jedes Steroid (siehe L. Fieser und M. Fieser, "Steroids", Reinhold Publishing Corp.,New York, 1959)* insbesondere Steroide mit medizinischer Bedeutung, wie östradiol-173» östron, östriol,

309848/1227

-* *7 «■

Testosteron und Cholesterol, oder Prostaglandine (siehe J.E.Pike "Prostaglandins",Scientific American, S. 84-92, November 1971) Narkotika, wie Opiumalkaloide, z.B. Heroin, Morphin," Codein, 6-Monoacetylmorphin ,oder die Glucuronide dieser Opiumalkaloide, 'Barbiturate und andere CNS-Beruhigungsmittel, Amphetamine, z.B. Amphetamin, Methylamphetamin und p-Hydroxyamphetamin, und andere CNS-Stimulantien, isomere Tetrahydrocannabinole, Vitamine (siehe "Table of Characterized Vitamins", in Blakiston's New Gould Medical Dictionary, S. 1459-60, 2. Ausgabe, McGraw-Hill, New York, 1956), Catecholamine, z.B. 1- (3,^I}-Dihydroxyphenyl)-2-methylaminoäthanol, ß-(p-Hydroxyphenyl)-alanin, ß-(3»4-Dihydroxyphenyl)-a-alanin, 3»4-Dihydroxyphenäthylalanin, 2-Amino-1-(3>4-dihydroxyphenyl)-äthanol, Indolamine, z.B. β-3-Indoxylalanin, 5-Hydroxytryptophan oder 5-Hydroxytryptamin. Andere wichtige erfindungsgemäße Haptene sind Rauschgifte wie Antihistamin, Atropin, Belladonna, Kokain, Cyclazacin, Pentazocin, Levorphanol, LSD-25» Meperidin, Meprobamat, Mescalin, Methadon, Nolaphin, Stickoxide, Dimethyltryptamin, Psilocybin, Scopolamin, 4-Methyl-2,5-dimethoxy- *-methyl-phenäthylamin, Methedrin, Demerol, die tricyclischen Stimulantien, wie Dibenzocycloheptene, z.B. Amitriptylin und Nortriptylin, Imipramin, die Phenothiazine, die Benzochinolizine, Reserpin, die Diazepoxide, wie Librium und Valium»und Benzodiazapine.

Pur R sind auch Hormone geeignet, wie Diäthylstilbestrol, Insulin, Angiotensin, Thyroxin, Trijodthyronin, Dijodthyronin, Aldosteron, Wachstumhormon, Luteotropin, Rinderinsulin, Follikel-stimulierendes

3 098 A 8/1227

Hormon, luteinisierendes Hormon, Menschen-Choriongonadotropin, Oxytocin, Adrenocorticotropin und Thyrotropin. Auch das australische Antigen ist als Hapten R geeignet.

Ferner sind Polypeptide, die Tryptophan·^,Histidin- oder Tyrosinreste enthalten, für R geeignet (siehe M.O. Dayhoff "Atl-as of Protein Sequence and Structure", National Biomedical Research Foundation, Silver Springs, z.B. die Seiten 235-272, 1968, und Bd. 4, Seiten D67-D172, 1969).

Immunogene Substanzen für den immunogenen Träger Z sind an sich bekannt und in N.E. Cremer u.Mitarb. "Methods in Immunology, S. 65-113* W.A. Benjamine Inc., N.Y., 1963» beschrieben. Im allgemeinen sind es große Moleküle, daher ihre Antigenität, mit einem Molekulargewicht, das größer als 6OOO ist. Geeignet sind Proteine, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nucleoproteine, Polyaminosäuren, Polypeptide oder Glycoproteine, die Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfuryl- oder Aminogruppen, Arylreste, vorzugsweise mit 6 bis Ik Kohlenstoffatomen, heterocyclische Reste, vorzugsweise mit 5 bis lH Ringatomen und 1 oder 2 Stickstoffatomen, oder andere Gruppen, die für ein selektives Kuppeln an die Verbindung der Formel R-L geeignet sind, enthalten.

Die Bindungsgruppe L enthält eine reaktive funktioneile Gruppe, die für das selektive Kuppeln an eine funktioneile Gruppe des Trägers Z geeignet ist. Vorzugsweise ist das kovalent über L an den immunogenen. Träger Z gebundene Ring atom des Haptens R ein

3098 A 8/1227

"■ ⁹ "

Kohlenstoffatom, jedoch kann es auch ein Stickstoffatom sein, z.B.

L ist es, bei Barbituraten. Das heißt, die Hauptfunktion der Bindungsgruppe/ eine Bindung zwischen dem Hapten oder Antigen R und dem Träger Z herzustellen. Diese Bindung hängt 1) von der Art der Bindungsgruppe L, die an R gebunden werden kann, und 2) von den r-^ktiven, für ein Kuppeln geeigneten Gruppen auf dem Träger Z ab. Ist Z ein Protein, z.B. ein Schnecken-Hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) mit einem Molekulargewicht von etwa 7 Millionen, ein Rinderseruiualbumin . mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 oder ein Menschen-Gammaglobulin mit einem Molekulargewicht von etwa 150 000, so sind die reaktiven Gruppen auf Z, die für ein selektives Kuppeln geeignet sind, z.B. Amino- oder Carboxylgruppen. Man kann dann die Verbindung R-L so darauf abstammen, daß man z.B. eine Carboxylgruppe zum Kuppeln mit einer Aminogruppe auf dem Träger Z oder eine Aminogruppe zum Kuppeln mit einer Carboxylgruppe auf Z zur Verfügung stellt.

Die Bindungsgruppe L ist ein kovalent an R gebundener organischer Rest mit einer kovalent gebundenen funktioneilen Gruppe, z.B. R-N=N-C₆H₁J-COOH, R-N=N-C₆H₁J-CH₂-CH(NH₂)-COOH. L kann aber auch nur eine funktionelle Gruppe, z.B. R-NHp, sein.

Man kann die funktionelle Gruppe der zu kuppelnden Zwischenverbindung RL mit Y bezeichnen. Y ist entweder kovalent an L, z.B. R-L-Y, oder an R gebunden, wobei dann L und Y gleich sind und die funktionelle Gruppe darstellen. Die funktionelle Gruppe des inununogenen Trägers Z wird mit X bezeichnet, sie ist an Z kovalent

309848/12 27

gebunden. Die erfindungsgemäßen synthetischen Antigene werden durch Reagieren dieser funktionellen Gruppen X und Y unter herkömmlichen Kupplungsbedingungen hergestellt. Der Haptenrest R wird somit entweder direkt kovalent an Z gebunden, wenn Y und L gleich sind, oder über einen organischen Rest, wenn Y ein Substituent von L ist. Ein Beispiel für einen derartigen organischen Rest ist eine'Gruppe der Formel -N=N-R'-, wobei R^r eine die Bildung eines Diazoniumions ermöglichende Gruppe ist.

Für R¹ geeignet sind Reste-, die sich von Verbindungen ableiten, die bei der Umsetzung nach herkömmlichen Diazotierungsverfahren (siehe z.B. K.H. Saunders, "The Aromatic Diazo Compounds and Their Technical Applications" S. 1-104, Edward Arnold & Co, 19*19) ein stabiles, den Haptenrest R kuppelndes Diazoniumsalz R¹Np X liefern, wobei X eine konjugierte Base einer starken Säure, wie HCl, HBr, HgSO^ oder HNO , also Cl, Br, SO^, NO , ist. Im allgemeinen leiten sich die Reste R' von einem primären aromatischen Amin, insbesondere einem monocyclischen Amin, ab und enthalten etwa 6 bis etwa lH Kohlenstoffatome, z.B. Phenylen. Außerdem kann R' mit einem oder mehreren Resten substituiert sein, z.B. mit gegebenenfalls substituierten Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder mit niederen Alkylaminoresten, wie -CH₂CHNH₂-,-C₂H^CHNCH-OdBr-CH₂CHN(CH)₂-.

Bevorzugte erfindungsgemäße synthetische Antigene der Formel (R-L)- S sind Antigene, in denen die 3indungsgruppe L einen Azorest -N=N- enthält, dessen eine Seite kovalent an einen Ringkohlenstcff

309848/12 27

des organischen Restes des Haptens R und dessen andere Seite kovalent an ein Ringatom des aromatischen Restes von R¹ gebunden ist. Derartige erfindungsgemäße Antigene können durch die" Formel (R-N=N-R¹-L) -Z dargestellt werden, wobei R und Z wie oben definiert sind und η eine ganze Zahl von etwa 1 bis 50, vorzugsweise

etwa
vön7io bis etwa 30, ist. R¹ ist eine die Bildung eines Diazoniumions ermöglichende Gruppe und enthält mindestens einen anderen Substituenten, der mit der funktioneilen Gruppe des immunogenen Trägers Z zur Bindung L reagieren kann.

Tabelle I faßt Beispiele für die Bindungen L zusammen, die aus der Reaktion der funktioneilen Gruppen X und Y entstehen können. Tabelle I enthält auch die Kupplungsreagentien und die Verfahren, nach denen die Bindungen L hergestellt werden.

309848/122 7

οοο -

NH-C

s -co-πη-

-Co-O-CO-NW-

—/V/V -C S -Ai H- .

Tabelle I

"CooH

OH

"C? K

cy-öH

CjOOH

SH

-COO M

Kupplungsreagenz Verfahren

„ R-N=C=N-P'-

•CD0Hr-_n=c=IJ-_R.. COOH R-N=C=N-R¹-CGOH R-N=C=N-R¹-

68, Bs.22 u

84-92

H-C-O

-A/-C-S

Il	A
Il	A
Il	A
Il	A
Il	A
Il	A
II	A

-A/Ha.

—C H

Nach dem Kup- S.128

pein Reduktion

mit NaBH_{4 s>128}-

Alle Seitenangaben beziehen sich auf u.E. Means und R.G. Peeny "Chemical Modificatxon of Proteins", Holden-Day Inc. 1971

für weitere Carbodiimide s.S.

s. Verfahren im-Anschluß an die Tabelle

309848/1227

Tabelle I - Fortsetzung

_v w Kupplungs- verfahren

[_j ** ? reagenz

./VM-CH_x-CO- -NIU -CXXAi^l - SHM a

— " A

ο .9

K (cook).!

-CO'O-CHrCG-ca- -C-OOH -CH^-CO-Ci.^^ -

-CH^ K Ü " S.-1-iD"H'r A

Il 11 Λ

O O

ri — CHi'cooKVjr ■— ■ ν" " A

" " A ■ " A

O^ ~<*2>~SCJL - _s.ÄDi.-.Ä0? C

/ Λ

•Η H χ -Av-So_xCS ■— S.

3098Α8/1227

Tabelle I - PortSetzung

y w Kupplungs- Verfahren

-SH -F)-r

reagenz -SH —S(\ _ S.158-16o,S.221

-SH

f >^v"

s. 41 D.

^ί5· ⁴^^D

WH-

-MH-

s. 4i d

41 D

S. 41 D

X —

x -NH:

CiLO-C -(ClU-C.-OCU^S. 42 D

13... 42 D

O-'if^s·

II

S. 42 D

232A5A4

Zur Tabelle I:

(A) Eine Lösung von 200 bis 600 mg eines imirainogenen Trägers (z.D. SchneckenrHäinocyanin, Rinde rs erumalb umin oder Thyroglobulin) in 10 bis 20 ml eines 0,01 bis 0,1 m Phosphatpuffers, pH H bis 9, wird mit einer Lösung von 50 bis 500 mg des Haptens in 5 ml eines 0,01 bis 0,1 m Phosphatpuffers, pH 5 bis 9> versetzt. Die Lösung wird 12 bis 24 Stunden bei 0 bis k°C stehengelassen. Dann wird sie gegen 0,01 bis 0,1 m Phosphatpuffer bei 0 bis h°C k bis 8 Tage lang dialysiert, wobei die Dialysierlösung öfters gewechselt wird. Die Dialysate werden gefriergetrocknet, man erhält das erwünschte Antigenkonjugat.

(B) Eine Lösung von 200 bis 600 mg eines imrcunogenen Trägers (z.B. Schnecken-Hämocyanin, Rinderserumalbumin oder Thyroglobulin) in 10 bis 20 ml Wasser, das auf einen pH-Wert von 9 bis 11 eingestellt

und auf 0 bis 5°C abgekühlt wurde, wird mit einer Lösung des Diazoniumsalzes in 2 bis 5 ml auf 0 bis 5°C abgekühltem Wasser versetzt. Der pH-Wert wird während der Diazoniumsalzzugabe mit 0,1 bis In Natronlauge innerhalb des gewünschten Bereiches gehalten. Nach beendeter Zugabe wird das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde bei 0 bis 5°C stehengelassen. Anschließend wird es bei 0 bis ¹I⁰C k bis 8 Tage lang gegen 0,01 bis 0,1 m Phosphatpuffer, pH 7 bis 8, dialysiert, wobei die Dialysierlösung öfters gewechselt wird. Die Dialysate werden gefriergetrocknet, man erhält das erwünschte Konjugat.

30 98 48/1227

' ■ - 16 - ■

(C) Eine Lösung von 200 bis 600 mg eines inununogenen Trägers (z.B. Schnecken-Hämocyanin, Rinderserumalbumin oder Thyroglobulin) in 10 bis 20 ml einer 20-bis 60prozentigen Essigsäure wird mit einer Lösung von 50 bis 500 mg des Haptens versetzt. Die Lösung wird 12 bis 24 Stunden bei Q bis 4⁰C stehengelassen, dann bei 0 bis 4°C 4 bis 8 Tage lang gegen destilliertes Wasser, anschließend 4 bis 8 Tage lang gegen 0,01 bis 0,1 m Phosphatpuffer, pH 7 bis 8, dialysiert.

(D) Verfahren (A) wird wiederholt, mit dem Unterschied, daß 1

bis 1,5 Äquivalente des in Tabelle I angegebenen Kupplungsreagenzes dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Lösung von 150 mg Bernsteinsäureanhydrid in 5 nil wasserfreiem Pyridin wird erwärmt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 3l'l mg 4-Pregnen-6ß~ol-3,20-dion versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, dann langsam in eine gerührte Lösung von 2,5 ml Schwefelsäure in Eiswasser eingetropft. Der Niederschlag wird gesammelt, das Produkt 4~Pregnen-6ß-ol-3,20-dion-6-bernsteinsäure-halbester wird durch Dünnschichtchrornatographie gereinigt.

3098/4 8/122

Beispiel 2

Eine Methanollösung, die 5 Prozent Salzsäure, 302 mg iJ-Androsten-17ß-ol-3,6-dion und 15o mg p-Carboxyphenylhydrazin enthält, wird auf dem Wasserbad auf 60 bis 85⁰C 1 bis 3 Stunden lang erhitzt, die Lösung wird dann abgekühlt,, der Niederschlag wird abfiltriert. Das Produkt, i|-Androsten-17ß-ol-3,6-dion-6-[p-carboxyphenylhydrazon], wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

Beispiel 3

Eine Lösung von 323 mg 4-Androsten-6ß-chlor-17ß-ol-3~on und ¹JOO mg Bernsteinsäure-monotetraniethylaianoniumsalz in 25 ml wasserfreiem Aceton wird H bis 6 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, das Aceton wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird chromatographiert»und das Produkt,4-Androsten-17ß-ol-6-bernsteinsäure-halbester, wird durch DünnschichtChromatographie gereinigt.

Beispiel ¹I

Eine Lösung von 150 mg Bernsteinsäureanhydrid in 5 ml wasserfreiem Pyridin wird erwärmt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit

^02 mg 5-Cholesten-3ß,7ß-diol versetzt. Das Gemisch wird 2*1 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann in eine gerührte Lösung von 2,5 ml Schwefelsäure in Eiswasser eingetropft. Der Niederschlag wird gesammelt, das Produkt,5-Cholesten-3ß*7ß"diol-

309848/1227

7-bernsteinsäure-halbesterjwird durch DünnschichtChromatographie gereinigt,

Beispiel 5

Eine Methanollösung, die 5 Prozent Salzsäure, 400 mg 5-Cholesten-3ß-ol-7~on und 122 mg p-Carboxyphenylhydrazin enthält, wird auf dem Wasserbad auf 60 bis 85 C 1 bis 3 Stunden lang erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, der Niederschlag wird filtriert. Das Produkt, 5-Cholesten-3ß-ol-7-on-7"C'p-carböxyphenylhydrazon], wird durch DünnschichtChromatographie gereinigt.

Beispiel 6

Eine Lösung von 419 mg 5-Cholesten-7ß-chlor-3ß-ol und 400 mg Bernsteinsäure-monotetramethylammoniumsalz in 25 ml wasserfreiem Aceton wird 4 bis 6 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, das Aceton wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird chromatographiert, das Produkt, 5-Cholesten-3ß-ol-7-bernsteinsäure-halbester, wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

B' e i" s" ρ" 1 e" 1 " " 7

Eine Lösung von 150 mg Bernsteinsäureanhydrid in 5 ml wasserfreiem Pyridin wird erwärmt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 288 mg I,3i5(10)-östratrien-3,6a-17ß-triol versetzt.

309848/1227

Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, dann langsam in eine gerührte Lösung von 2,5 ml Schwefelsäure in Eiswasser eingetropft. Der Niederschlag wird gesammelt, das Produkt, l,3,5(10)-östratrien-3,6,17ß-triol-6-bernsteinsäure-halbester,wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

Beispiel8

Eine Methanollösung, die 5 Prozent Salzsäure, 286 mg 1,3»5(1O)-östratrien-3,17ß-diol-6-on und 150 mg p-Carboxyphenylhydrazin enthält, wird auf dem Wasserbad auf 60 bis 85°C 1 bis 3 Stunden lang erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, der Niederschlag wird filtriert. Das Produkt, l,3,5(10)-Östratrien-3,17ß-diol-6-on-6-[pcarboxyphenylhydrazon], wird durch DünnschichtChromatographie gereinigt.

Beispiel 9

Eine Lösung von 298 mg l,3,5(10)-östratrien-6ß-chlor-3»15ß-diol und 4oo mg Bernsteinsäure-monotetramethylammoniumsalz in 25 ml wasserfreiem Aceton wird 4 bis 6 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, das Aceton wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird chromatographiert, das Produkt, l,3,5(10)-östratrien-3,17ß-diol-6-bernsteinsäure-halbester, wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

309848/1227

B- eis pi e 1 10

Eine Lösung von 150 mg Bernsteinsäureanhydrid in 5 nil wasserfreiem Pyridin wird erwärmt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 304 mg 6-Hydroxydihydrotestos'teron versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, dann langsam in eine gerührte Lösung von 2,5 ml Schwefelsäure in Eiswasser eingetropft. Der Niederschlag wird gesammelt, das Produkt, DihydrotestDsteron-6-bernsteinsäure"-halbester, wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

Beispiel 11

Eine Methanollösung, die 5 Prozent Salzsäure, 304 mg 6-Ketodihydrotestosteron und 122 mg p-Carboxyphenylhydrazin enthält, wird auf dem Wasserbad auf 60 bis 85⁰C 1 bis 3 Stunden lang erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, der Niederschlag wird filtriert. Das Produkt, Dihydrotestosteron-6-[p-carboxyphenylhydrazon], wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

Beispiel 12

Eine Lösung von 325 mg 6-Chlor-dihydrotestosteron und 400 mg Bernsteinsäure-monotetramethylammoniumsaiz in 25 ml wasserfreiem Aceton wird 4 bis 6 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, das Aceton wird unter vermindertem Druck abdestilliert. ,Der Rückstand wird chromatographiert, das Produkt,

3 098/»8/1227

Dihydrotestosteron-6--bernsteinsäure-halbester_swird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

Beispiel 13

Eine Lösung von 448 mg 10-Brom-Prostaglandin und 400 mg Bernsteinsäure-monotetramethylammoniumsalz in wasserfreiem Aceton wird 1 bis 8 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, das Aceton wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Das Produkt, Prostaglandin__raethylester-10-bernsteinsäurehalbester, wird nach Standardchromatographie-Verfahren gereinigt.

B e i s ρ i e 1 14

Eine Methanollösung, die eine Spur p-Toluolsulfonsäure, 314 mg Morphin-2-amino-3-methyläther und 166 mg 4-Carboxybenzaldehyd enthält, wird auf dem Wasserbad auf 60 bis 85°C 1 bis 3 Stunden lang erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Das Produkt der Formel

309848/ 1227

wird durch DünnschichtChromatographie gereinigt.

Beispiel 15

Eine Lösung von 314 mg ⁱl-Pregnen-6ß-ol-3_s20-dion und ΐβθ mg 1,^-Phenyldiisocyanat in wasserfreiem Aceton wird erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert, das Produkt der Formel

wird umkristallisiert.

Beispiel 16

Eine Lösung von 314 mg 4-Pregnen-6ß-ol-3,20-dion und 192 mg 1,4-Phenyldiisothiocyanat in wasserfreiem Aceton wird auf dem Wasserbad erwärmt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert, das Produkt der Formel

309848/1227

wird umkristallisiert.

Beispiel 17

Eine Lösung von 314 mg 4-Pregnen-6ß-ol-3»20-dion und 203 mg Terephthalsauredichlorid in wasserfreiem Aceton wird im Wasserbad erwärmt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert, man erhält ein Produkt der Formel

das durch DünnschichtChromatographie gereinigt wird.

3098A 8/122 7

destilliert. Der feste Rückstand wird extrahiert, das Produkt der

Formel

WO

wird durch Kolonnenchromatographie gereinigt. Der Äthylester wird dann in In Natronlauge gelöst und 24 Stunden bei Raumtemperatur
stehengelassen. Der pH-Wert der Lösung wird dann auf 7 eingestellt, das Wasser wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird extrahiert, das Produkt der Formel

wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

Beispiel 20

Eine Methanollösung, die eine Spur p-Toluolsulfonsäure, 296 mg
einer Verbindung der Formel

309848/1227

Beispiel l8

Eine Methanollösung, die eine Spur p-Toluolsulfonsäure, 260 mg einer Verbindung der Formel

und 108 mg p-Phenylendiamin enthält, wird im Wasserbad auf 70 bis 85 C 1 bis 3 Stunden lang erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt, das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Das Produkt der Formel

wird durch Dünnschichtchromatographie gereinigt.

Beispiel 19

285 mg Morphin werden in verdünnter Natronlauge gelöst, der pH-Wert wird auf 8 eingestellt. Im Verlauf von 1 Stunde wird die kalte alkalische Morphinlösung tropfenweise mit 212 mg von p-Aniino-

abgeleitetem Diazoniumsalz benzoesäure-äthylester/inkaltem wäßrigen Methanol versetzt. Die Lösung wird 1 Stunde bei 5°C gerührt, dann weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur. Der pH-Wert der Lösung wird dann auf 7 eingestellt, das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck ab-

3 0 3 8 i> 8/122?

und 108 mg p-Phenylendiamin enthält, wird im Wasserbad auf 70 bis 85 C 1 bis 3 Stunden lang erhitzt. Die Lösung wird dann abgekühlt, das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert-. Man erhält ein Produkt der Formel

das durch DünnschichtChromatographie gereinigt wird.

Wie ersichtlich, ist die Anzahl der möglichen Bindungsgruppen L nur durch die Zahl der bekannten organofunktionellen Gruppen und durch die zur Verfügung stehenden Bindungsstellen am Hapten R begrenzt. Zusätzlich zu den in den Beispielen angeführten Kupplungsmitteln kann man noch andere verwenden: sie müssen zwei funktioneile Gruppen, eine für die kovalente Bindung an R und eine andere für die kovalente Bindung an den Träger Z,haben. Beispiele derartiger Gruppen sind Carbonyl-, Carboxy-, Isocyano-, Diazo-, Isothiocyano-, Nitroso-, .Sulfhydryl- und Halogencarbonyl-

309848/1227

7324544

gruppen -

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen synthetischen Antigene der Formel (H-L-)· Z bevorzugten Eindungstypen zwischen R und Z über die Bindungsgruppe L sind in Tabelle II zusammengestellt.

TABELLE II: Bindungstypen

Eoεκ tive Gruppen

Bindungstyp Struktur der

Bindung

(1) Amid ........-C-NH-

S u

(2 ) Thioharnstoff... -N-C-NII

(3) Azo-Bindung»..-N=N-Äther RL-O-Z

(5) Ester -C-O-Z

(6) Disulfid .... RL-S-S-Z

R-L-

-COOH

-NH,

-NH₂	» ■* r\ -COOH S H
-NH₂	-NK₂+ClCCl
Tyrosin Histidin Lysin -C-ONa	-N₂ ⁺-Cl" Z-X
-COOH	Z-OH
R-SH	Z-SH

Für das Kuppeln von Protein an die erfindungsgemäße Zwischenverbindung der Formel R-L wird die Amidbindung bevorzugt.

Die erfindungsgemäße Zwischenverbindung RL kann leicht an den immunogenen Träger Z nach herkömmlichen Kupplungsverfahren gebunden werden. So kann man bei Vorhandensein von Carboxylgruppen an dem

3 0 9 8 A 8 / 1 2 2 7

einen Molekül und Aminogruppen an dem anderen die Bindung durch herkömmliche Carbödiimid-Kondensation durchführen (siehe z.B. die Anmeldung P 21 28 517.6,dort Beispiele 5 bis 8)/

B ei s pi el 21

100 mg (O₃I Mol) l-Cyclohexyl-3-(2-mor'pholinoäthyl)-carbodiimidp-tolüolsulfonsäure-methylester in lprozentiger Natriumchloridlösung werden zu 25 mg des gereinigten kristallinen 'Produkts des Beispiels 19 gegeben. Es bildet sich e⁴ne Pseudoharnstoff-Zwischenverbindung« Das Gemisch wird mit Schnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin) versetzt und so lange gerührt, bis der Pseudoharnstoff an das Schnecken-Hämocyanin gebunden ist. Das Gemisch wird 2 bis 3 Tage bei 3°C gegen 0,5 m Natriumcarbonat, pH

r
8,2, dialysiertjund zwar so lange bis die Dialysierlösung farblos ist.Dann wird noch einmal gegen 0,9 Prozent Natriumchlorid 24 Stunden lang dialysiert. Das unlösliche Protein wird abzentrifugiert.Im gefärbten überstand, der das Konjugat der Formel

enthält, wird das Protein bestimmt. Der überstand wird nach der Dialyse gegen dreifach destilliertes Wasser gefriergetrocknet.

Beispiel 21 wird wiederholt,mit dem Unterschied, daß eine ent-

3 0 3 8 4 8/1227

sprechende Menge Gainmaglobulin oder Rinderserumalbumin anstelle des Schnecken-Hämocyanins verwendet wird. Man erhält das entsprechende Proteinkonjugat, wobei die Reaktion über "den entsprechenden Protein-Pseudoharnstoff verläuft.

Beispiel 22

Herstellung von ^-

hydrazon])-Sehnecken-Hämocyanin

100 mg (0,1 Mol) l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimidp-toluolsulfonsäure-methy!ester in Iprozentiger Natriumchloridlösung werden zu 25 mg gereinigten kristallinen 4-Andrdsten-17ßol-3,6-dion-6-[p-carboxyphenylhydrazon] gegeben. Dieses Gemisch wird mit Schnecken-Hämocyanin versetzt und so lange gerührt, bis der gebildete Azopseudoharnstoff an das Schnecken-Hämocyanin gebunden ist. Das Gemisch wird 2 bis 3 Tage lang bei 3°C gegen 0,5 m Natroncarbonat, pH 8,2, dialysiert, und zwar so lange, bis die Dialysierlösung farblos ist. Eine letzte Dialyse wird 2¹J Stunden lang gegen 0,9 Prozent Natriumchlorid durchgeführt. Durch die Dialyse werden nicht umgesetztes Steroid und dessen Derivate entfernt. Das unlösliche Protein wird abzentrifugiert. Im gefärbten überstand, der 4-Androsten-17ß-ol-3,6-dion-6-[p-earboxyphenylhydrazon]-hämocyanin-Konjugat enthält, wird das Protein bestimmt. Dieser überstand wird nach der Dialyse gegen dreifach destilliertes Wasser gefriergetrocknet.

309848/1227

Beispiel 22 wird wiederholt, mit dem Unterschied, daß eine entsprechende Menge Immuno-Gammaglobulin oder Rinderserumalbumin anstelle des Schnecken-Hämocyanins verwendet wird. Man erhält die entsprechenden Proteinkonjugate, wobei die Reaktion über den entsprechenden Protein-Pseudoharnstoff verläuft.

Man kann die Zwischenverbindung RL an das Protein auch dadurch binden, daß man ein O-Carboxymethyloxim-Derivat (RL) herstellt und dessen Carboxylgruppe an die primären Amingruppen des Proteins kuppelt (vgl. "Steroids", Bd. 18, Nr. 5, S. 593 - 603).

Beispiel 23

Ein Gemisch von 200 mg Δ -Tetrahydrocannabinolazobenzoesäure und 0,22 ml Tributylamiri wird in Dioxan gelöst und mit Eis gekühlt. Dieses Gemisch wird mit 60 μΐ Chlorkohlensäure-isobutylester versetzt und bei 5 C 45 Minuten stehengelassen. Eine Lösung von 580 mg Rinderserumalbumin in einem Gemisch aus 15,5 ml Wasser, 10,3 ml Dioxan und 0,58 ml m. Natronlauge wird zugegeben, das Reaktiongemisch wird 12 Stunden bei 5 bis 10⁰C stehengelassen, wobei der pH-Wert mit In Natronlauge auf 8 eingestellt wird. Das Konjugat wird gegen 0,1 m Phosphat gepufferte Natriumchloridlösung bei pH 8 dialysiert, anschließend durch Zentrifugieren und Chromatographie gereinigt. Wird das gereinigte Konjugat gelagert, so wird es gegen dreifach destilliertes V/asser dialysiert und gefriergetrocknet.

309848/1227

7324544

Weitere Beispiele der er-findungs gemäßen synthetischen Antigene der Formel (R-L)- ^z sind solche, in denen ein Ringatom des Haptens R kovalent an den immunoqenen Träqer Z über eine Bindungsgruppe der folgenden Struktur gebunden ist:

-(N=N-R¹	>a^L~	-(CH=Ni-	a ^J
-(N=N)- L- Ά	a^L"
-(CO-R" )■	L- oder
-(CH=CHi-	L-,
a

in denen L eine Bindung ist, die durch die Reaktion der funktioneilen Gruppen X und Y (siehe Tabelle I) gebildet wurde, R^f eine die Bildung eines Diazoniumions ermöglichende Gruppe ist (z.B. Ortho-, Meta- oder Para-phenylene^, Ortho-, Meta- oder Paranieder-alkylenphenylene, Ortho-, Meta- oder Para-(-CHpCHNHp)

"i niedere Alky !gruppe mit 1 bis 4 C-Ätoiaennjedeu.tet

"] i i

Ji--^g y gpp

phenylene)/und a den Viert 0 oder 1 hat"] R ist somit an deniramunogenen Träger Z entweder über eine der Bindungsgruppen oder direkt über die Bindung L gebunden. Bevorzugt sind erfindungsgemäße synthetische Antigene, in denen ein Ringkohlenstoffatom oder ein Ringstickstoffatom des Haptens R kovalent über eine-N=N-Phenylen-

(nieder-alkyl) -Bindungsgruppe an den Träger Z gebunden ist. a

Herstellung der erfindungsgemäßeη synthetischen Antigene der Formel (R-L)^_nZ, in denen L ein an ein Ringkohlenstoff atom des

3098A8/1227

Restes R gebundender Azorest ist, z.B. R-N=N-R'-L-Z, kann über zwei Diazotierungsverfahren erfolgen (siehe Reaktionsfolgen I und II).

In beiden Reaktionsfolgen verläuft die Diazotierung nach herkömmlichen Diazotierungsverfahren, man erhält das Diazoniumsalz (II) bzw. (IV). In der Reaktionsfolge I wird das Diazoniumsalz zuerst mit dem Hapton R umgesetzt, dann an den inuminogenen Träger Z gekuppelt (siehe Kupplungsreaktionen der Tabelle I). In der Reaktionsfolge II wird zuerst der immunogene Träger Z an das Diazoniumsalz (II) gekuppelt (siehe Tabelle I). Das entstandene Produkt (III) wird diazotiert und an das Hapten R gebunden, man erhält das Produkt (V).

Die Reaktionsfolge II wird in Beispiel ?Λ näher erläutert.

Reaktionsfolge I

YR¹NH₂ (I)

1 Diazotierung YR¹N₂ ⁺ (II)

R-NsN-R'-Y (III)

Z-X (Kupplungsreaktion)

(R-N=N-R'-L)-Z (IV)

0 9843/1227

Reaktionr,folge II

Z-X (I)

232A5U

Y-R'-NH₂ (II) (Kupplungsreaktion)

Z-L-R'-NK₂ (III)

Diazotierung

Z-(L-R' -N₂ ⁺ )_n (IV)

Ζ—(L-R'-N=N-R) (V)

B ei s ρ i e _ 1 2jJ

Eine Lösung von 100 mg Polylysin-p-aminobenzoesäure in 5 ml destilliertem V/asser wird mit In- Salzsäure auf pH 1,0 bis 1,5 eingestellt und auf 0 bis 5°C abgekühlt. Eine kalte Lösung von 100 mg Natriumnitrit in 0,5 ml destilliertem Wasser wird zugegeben, bis zum Umschlag von Kalium-jod-Stärkepapier. Die Lösung wird bei 0 bis 5 C 30 Minuten lang gerührt. Die überschüssige salpetrige Säure vrird mit Sulfaminsäure zersetzt (Kontrolle mit Kalium-jod-Stärkepapier).

100 mg dieser diazotierten Polylysin-p-aminobenzoesäure werden zu

309848/122 7

einer auf O bis 5°C abgekühlten Lösung von 300 mg Morphinsulfat in 10 ml destilliertem Wasser, die vorher auf pH 10,5 mit 6n Natronlauge eingestellt worden ist, zugegeben. Der pH-Wert wird während der Zugabe mit In Natronlauge auf etwa 10,5 gehalten. Das Reaktionsgemisch wird 9 Stunden bei 0 bis 5°C stehengelassen, der pH-Wert wird in der ersten Stunde auf 10 bis 10,5 mit; In Natronlauge eingestellt. Das Konjugat wird gegen 6 1 0,1 rn Natriumcarbonat 10.Tage lang d-ialysiert, wobei die Natriumcarbonatlösung zweimal täglich gewechselt wird. Anschließend wird das Konjugat zwei Tage lang gegen 6 1 destilliertes Wasser dialysiert, wobei das destillierte V/asser zweimal täglich gewechselt wird. Die Konjugatlösung wird gefriergetrocknet, man erhält 130 mg Polylysiri-morphin.

309848/122 7

Claims

Pate η t a η s ρ r _ü_ c he

!.,Synthetische Antigene der Formel

(R-L> Z

in der R ein Hapten bedeutet, bei dem ein Ring atom !covalent über eine Bindung oder Bindungsgruppe L an einen immunogenen Träger Z gebunden ist, wobei die Bindungsgruppe L eine der nachstehenden Strukturen hat:

a) -N=N-R'-Y-

b) -N=N-Y-

c) -N=CH-Y-

d) -CII=N-Y-

e) -CO-R"-Y-

f) -CR"=CR"-Y-

in welchen Strukturen R¹ eine die Bildung eines Diazoniumions ermöglichende Gruppe, R" ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest und Y eine funktioneile Gruppe ist, die mit einer funktionellen Gruppe X des immunogenen Trägers Z reagiert, und η eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist.
2. Synthetische Antigene nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das kovalent über L an den immunogenen Träger Z gebundene Ringatom des Haptens R ein Kohlenstoffatom ist.
3. Synthetische Antigene nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsgruppe L die Struktur

3 0 9 8 4 8/1227
4. Synthetische Antigene nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung die Struktur

-CONH- .
5. Synthetische Antigene nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ ein 1,4-, 1,3- oder 1,2-Ph.enylen, ein 1,4-, 1,3- oder 1,2-Alkylenphenylen oder ein 1,4-, 1,3- oder 1,2-P<"oder ß-Aminoalkylen)-phcnylen ist.
6. Synthetische Antigene nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß R' ein 1,4-(Λ-Aminoäthylen)-phenylen, 1,4-(ß-Aminoäthylen)-phenylen oder 1,4-Phenylen ist.
7. Synthetische Antigene nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß R ein östrogen, Opiuirtalkaloid, Tetrahydrocannabinol, Amphetamin, Barbiturat, Dijodthyronin, Trijodthyronin, Thyroxin, Progesteron, Kokain oder ein Stereoisomeres, Glucuronid oder Sulfat dieser Verbindungen ist.
8. Synthetische Antigene nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Z ein Schnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin), Rinderserumalbumin oder Immunogammaglobulin ist und η einen Wert von etwa 10 bis etwa 30 hat.

309848/1227
9. Vervrendung der synthetischen Antigene noch Anspruch 1 bis 8 zur Herstellung von Jvntikörpern für iiranunochemis ehe Analysen.

3 0 9 8 <* 3 / 12 2 7