DE69727009T2

DE69727009T2 - Reagenzien für einen Lysergsäurediethylamid-Immunoassay

Info

Publication number: DE69727009T2
Application number: DE69727009T
Authority: DE
Inventors: Salvatore Joseph Stockton Salamone; Stephen S. Piscataway Vitone; Robert Sundoro West Orange Wu
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1996-07-02
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2017-07-01
Also published as: ES2212015T3; EP0816364B1; US6476199B1; DE69727009D1; ATE257155T1; US6063908A; EP0816364A1; CA2209217A1; JPH1087662A

Description

Diese Erfindung betrifft neue Lysergsäurediethylamid-Derivate und die Verwendung dieser Derivate bei der Herstellung von anti-Lysergsäurediethylamid-Antikörpern und die Verwendung dieser Antikörper als Reagenzien bei verbesserten Immunoassays für Lysergsäurediethylamid und dessen Metaboliten in biologischen Flüssigproben.
Das als LSD bekannte (+)-Lysergsäurediethylamid, 9,10-Didehydro-N,N-diethyl-6-methylergolin-8β-carboxamid, ist ein Halluzinogen, welches am zentralen Nervensystem wirkt und die sensorische Reizwahrnehmung verändert. Eine Stoffaufnahme von 20 bis 80 μg LSD ist ausreichend, um eine Halluzination hervorzurufen (Nelson, C. und Foltz, R., Anal. Chem., 64, 1578 bis 1585, 1992). Die Verwendung von LSD war und bleibt überall auf der Welt ein Problem für Arzneimittel- und Gesetzesinstitutionen. Momentane Verfahren, welche zur Bestimmung der Level von LSD und dessen Metabolite, zum Beispiel von N-Desmethyl-LSD (nor-LSD), in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum und Urin, verwendet werden, schließen Fluoreszenzspektroskopie, GC/Tandem-MS, HPLC und Radioimmunoassay (RIA) ein. Jedoch zeigt Fluoreszenzspektroskopie nicht-spezifische gegenseitige Beeinflussung und unterscheidet nicht zwischen LSD, dessen Metaboliten und anderen Ergot-Alkaloiden. HPLC führt zu niedrigerer nicht-spezifischer gegenseitiger Beeinflussung mit Antikörper-Bindung. Jedoch ist dieses Verfahren zeitaufwändig und nicht für ein Routine-Screening von einer großen Anzahl an Proben geeignet. Immunoassays bieten gegenüber den vorstehend erwähnten analytischen Verfahren viele Vorteile, einschließlich ein schnelles Arzneistoff-Screening und am Wichtigsten, hohe Empfindlichkeit.
In Immunoassays für Arzneistoffe, wie LSD, werden eine biologische Flüssigprobe, von welcher man vermutet, dass sie den Arzneistoff oder dessen Metabolite enthält, in der Gegenwart eines mit Marker versehenen LSD-Derivats (Marker) mit Antikörpern in Kontakt gebracht. In dem Ausmaß, in dem der Arzneistoff oder dessen Metabolite in der Probe vorhanden sind, kommt es zu einer Konkurrenz bei der Bindung an die Antikörper und die Menge des mit Marker versehenen Derivats, welche gebunden bleibt, wird im Verhältnis zum Ausmaß der Konkurrenz mit dem Arzneistoff oder dessen Metaboliten in der Probe verringert.
Ein Fluoreszenz-Immunoassay für LSD wurde beschrieben (B. Law et al., Anal. Proc., 20, 606, 1983). Das Immunkonjugat, welches zur Erzeugung von Antikörpern verwendet wird, wird aus dem Carboxyl-Rest von Lysergsäure hergestellt (siehe z. B. H. Van Vunakis, Proc. Nat. Acad. Sci., 68, 1483 bis 1487, 1971) und es wird erwartet, dass davon abgeleitete Antikörper eine hohe Kreuzreaktivität mit einer Anzahl an Ergot-Alkaloiden aufweisen. Der in diesem Verfahren verwendete Tracer wird über Konjugieren von Fluoresceinamin an den Säurerest des Moleküls hergestellt. Die Empfindlichkeit des Assaysystems liegt im Bereich von 5 bis 40 ng/ml LSD. Obwohl dieses Verfahren den Vorteil aufweist, schnell zu sein, hat es eine schlechtere Nachweisgrenze als der RIA.
Es wird ein Radioimmunoassay für LSD beschrieben, wobei aus dem Carboxy-Rest von Lysergsäure (siehe z. B. H. Van Vunakis, Proc. Nat. Acad. Sci., 68, 1483 bis 1487, 1971) ein LSD-Immunkonjugat hergestellt wird. Jedoch sind die aus dem Immunkonjugat abgeleiteten Antikörper nicht hoch spezifisch für LSD. Es zeigte sich, dass mehrere Ergot-Alkaloide, wie Ergosin, Ergonovin, Ergotamin und Methysergid (auch als Methylergonovin bekannt), bei der Bindung an die LSD-Antikörper konkurrieren, was zu nicht wünschenswerten, falsch positiven Ergebnissen führt.
WO 97/19100, welches ein nicht veröffentlichtes Dokument ist, und Chem. Abs. 80: 78869m beschreiben Konjugate von LSD oder dessen Derivaten mit BSA als die immunogene Trägersubstanz, welche über den Indolstickstoff von LSD gebunden ist. US 4,375,414 beschreibt Konjugate von LSD-Derivaten mit Menschenserumalbumin (HSA, engl. „human serum albumin"), welches über den Indolstickstoff gebunden ist.
WO 92/03163 und FR 2 282 115 beschreiben Konjugate von anderen Haptenen und Arzneistoffen mit BSA über eine Bindungsgruppe. In WO 96/10179 und WO 93/20070 werden Konjugate von anderen Nicht-LSD-Arzneistoffen und Träger- oder Detektormolekülen verschieden von BSA offenbart.
Der Stand der Technik geht nicht darauf ein, wie die Bindung zwischen LSD oder dessen Derivaten und einem Trägermolekül in einer chemisch stabilen Weise hergestellt werden kann.
Ein anderer Radioimmunoassay für LSD in Serum- und Urinproben wird beschrieben (siehe W. A. Ratcliffe, Clin. Chem., 23(2), 169 bis 174, 1977), wobei das Immunkonjugat über eine Reaktion vom Mannich-Typ (J. March, Advanced Org. Chem., 4. Ausgabe, 900, 1992) über Kondensation von LSD und Rinderserumalbumin (BSA, engl. „bovine serum albumin") in der Gegenwart von Formaldehyd (Tauton-Rigby, Science, 181, 165, 1973) hergestellt wird. Das hergestellte Immunkonjugat erzeugt LSD-Antikörper mit einer niedrigen Kreuzreaktivität in Bezug auf eine Anzahl von Ergot-Alkaloiden. Die bei der Kondensation gebildete Verknüpfung leitet sich über die Indolgruppe des LSD-Moleküls ab.
Diese Verknüpfung ist ähnlich zu einem Acetal und Imidazolin (hier als ein „Aminoketal" bezeichnet), welche als die Stickstoff-Schutzgruppen für Indol dienen. Da diese Gruppen in einem sauren Medium jeweils für Hydrolyse anfällig sind, kann diese Verknüpfung auch in einfacher Weise über Hydrolyse in einem sauren Medium gespalten werden (siehe z. B. A. J. Stern et al., J. Org: Chem., 54, 2953 (1989); D. A. Evans et al., J. Am. Chem. Soc., 103, 5813 (1981); und A. Giannis et al., Tetrahedron, 44, 7177 (1988)). N,N'-Diisopropylidenphenylalanylleucin, welches die „Aminoketal"-Verknüpfung trägt, wird einfach durch Erwärmen des Materials in 10%iger wässriger Lösung bei 60°C bei neutralem pH-Wert gespalten (siehe P. M. Hardy et al., Chem. Soc., Perkin I, 1954 (1977)). Deshalb ist ein Verfahren, welches zu dieser instabilen Verknüpfung führt, nicht zur Herstellung von LSD-Derivaten geeignet, welche zur Herstellung von Haptenen und Reagenzien, die eine stabile Verknüpfung tragen, für einen Immunoassay verwendet werden sollen.
Deshalb ist ein Immunoassay-Verfahren ohne Radioisotope zur schnellen Detektion von LSD und dessen Metaboliten, insbesondere in Urinproben, sehr wünschenswert. Es ist auch wünschenswert, ein LSD-Derivat vorliegen zu haben, welches eine stabile nicht spaltbare Verknüpfung trägt, aus welchem stabile Haptene und Immunogene erzeugt werden können. Außerdem sollten Antikörper, welche zur Detektion von LSD und dessen Metaboliten verwendet werden, hoch spezifisch sein und sollten keinen Kreuzreaktionen mit anderen Ergot-Alkaloiden unterliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt Hapten-Derivate bereit, welche zur Herstellung von Antigen-Reagenzien, Antikörper-Reagenzien und Tracer-Reagenzien mit überlegenen Leistungscharakteristiken zur Verwendung in Immunoassays für die Detektion von Lysergsäurediethylamid (LSD) und dessen Metaboliten nützlich sind. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der LSD-Kern über den Indolstickstoff derivatisiert, wobei ein Hapten-Aminoalkyl-Derivat gebildet wird. In einer anderen Ausführungsform werden die Derivate über den Piperidinstickstoff des nor-LSD-Moleküls hergestellt. Die bevorzugte Derivatisierung verläuft über Alkylierung, wobei eine funktionelle Gruppe gebildet wird, welche weiter zur Bindung an eine geeignete Bindungs-, Antigen- oder Markergruppe modifiziert werden kann, um stabile Reagenzien für den Immunoassay bereitzustellen.
Die Verbindungen der Erfindung sind von LSD abgeleitet und haben die Formel
wobei

(a) R¹ ein Rest -A-R³ ist; A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist und R³ ein Rest NHR⁴ ist und R² CH₃ ist; oder
(b) R¹ H ist und R² ein Rest -A-R³ ist; A eine Bindung oder ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest COR⁴ ist, oder A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest NHR⁴ ist;

⁴

Die Stabilität dieser Verbindungen wird durch die Einführung von geeigneten Verknüpfungen zwischen der Arzneistoffeinheit und einer Bindungsgruppe, Trägerproteinen oder Detektormolekülen bereitgestellt.
Bindungsgruppen sind im Stand der Technik bekannt. Sie werden zur Aktivierung, d. h. zur Bereitstellung einer verfügbaren Stelle an, eines/einem Arzneistoff-Derivats) zur Synthese eines Haptens verwendet. Die Verwendung einer Bindungsgruppe kann vorteilhaft oder notwendig sein oder nicht, abhängig vom speziellen Hapten und den Trägerpaaren. Die Auswahl einer geeigneten Bindungsgruppe liegt im Bereich des Wissens eines Fachmanns. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,144,030 und U.S. Patent Nr. 5,237,057. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Bindungsgruppe nur Kombinationen von Atomen, welche chemisch verträglich sind, umfassen kann, z. B. welche ein kovalentes Binden zwischen einem Träger und einem Hapten erlauben, was zur Bildung einer Amid-, Thiocarbamid- oder Thioether-Verknüpfung führt, abhängig von der Natur der verwendeten Bindungsgruppen.
Herkömmliche Bindungsgruppen, welche homobifunktionelle und heterobifunktionelle Linker einschließen, sind zum Koppeln an die LSD-Amin-Derivate der vorliegenden Erfindung geeignet, um das Derivat für eine weitere Synthese der neuen LSD-Haptene und -Immunogene der vorliegenden Erfindung zu aktivieren. Beispiele von geeigneten bifunktionellen Linkern L schließen Dimethylsuberimidat (DMS), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), Diisothiocyanatobenzol, 4-Isothiocyanatobenzoylchlorid und m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) (Pierce, Rockford, IL, USA), [4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonylchlorid und 5-(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy-5-oxopentanoylchlorid ein. Geeignete Verbindungen nach Formel I mit solchen bifunktionellen Linkem sind zum Beispiel 1-[[[(4-Isothiocyanatophenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid, 1-[3-[[[4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]amino]propyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid, 1-[[5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]-1,5-dioxopentyl]oxy]-2,5-pyrrolidindion und 1-[[[4'-[[[3-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]propyl]amino]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-y1]carbonyl]oxy]-2,5-pyrrolidindion.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff „Trägermolekül" jene Materialien ein, welche die Eigenschaft aufweisen, unabhängig in einem Wirtstier eine Immunantwort hervorzurufen, und welche kovalent an die hier beschriebenen Hapten-Derivate gekoppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien schließen zum Beispiel Proteine, natürliche oder synthetische Polymerverbindungen, wie Polypeptide, ein. Besonders bevorzugte Trägermaterialien sind Proteine.
Die Identität der Proteinmaterialien, welche bei der Herstellung eines Immunogens der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist nicht kritisch. Beispiele von geeigneten Proteinen, welche in der Praxis dieser Erfindung nützlich sind, schließen Rindergammaglobulin, Rinderthyroglobulin (BTG, engl. „bovine thyroglobulin") und Rinderserumalbumin (BSA) ein, wobei die letzten beiden Proteine bevorzugt sind. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, aber nicht notwendig, dass Proteine verwendet werden, die für die Wirtstiere, in welchen die Antikörper gegen LSD oder dessen Metabolite und Derivate hervorgerufen werden sollen, fremdartig sind.
Durch Anfügen des Hapten-Derivats der vorliegenden Erfindung an einen Rest, welcher aus einem immunogenen Trägermaterial besteht, können sowohl Antiseren und polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper hergestellt und isoliert werden, welche nützliche Reagenzien für Immunoassays für die Detektion von LSD und dessen Metabolite sind. Träger werden typischerweise verwendet, da Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht (hier das Hapten) im Allgemeinen nicht immunogen sind, wenn sie selbst verabreicht werden. Wenn ein Träger an ein Hapten konjugiert wird und das Konjugat als ein Immunogen verwendet wird, können Antikörper gegen das Hapten erzeugt werden, welche über eine Immunisierung mit dem Hapten alleine nicht hergestellt worden wären.
Die Derivate, wie die Haptene, können auch über auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren an eine Vielfalt von Tracer-, Detektions- oder Trägermolekülen gekoppelt werden, um eine Vielfalt an Reagenzien bereitzustellen, welche in verschiedenen Formaten von Immunoassays nützlich sind. Für Detektion können Detektormoleküle angefügt werden, wie Fluorophore, zum Beispiel Fluorescein, um Tracer herzustellen, oder radiomarkierte oder chemolumineszente Reste. Das Hapten kann an Mikroteilchen gebunden werden, einschließlich gefärbtes Latex, zur Verwendung bei Formaten von Spektrophotometrie oder optischer Direktdetektion, wie Latex-Agglutination oder chromatographischen Streifentests. Der angefügte Rest kann auch ein indirektes Detektionsmolekül sein, wie ein Energieübertragungspartner, Enzym oder anderer Rest, welcher/welches über eine weitere chemische Umsetzung detektiert wird.
In der vorliegenden Erfindung werden die LSD-Hapten-Derivate aktiviert und an Proteine gekoppelt, zum Beispiel an Trägerproteine, wie BSA oder BTG, um Immunogene zu bilden.
Außerdem werden diese Trägerreste zur Bildung von Reagenzien für einen Immunoassay verwendet, d. h. Verbindungsstücke zum Anfügen der Haptene an Festmatrizes oder Markerreste, wie Mikroteilchen, radioaktive Marker, welche Markerkonjugate bilden. Die Markerkonjugate werden als Reagenzien in Immunoassays oder in ELISA-Mikrotiterplatten-Tests als Konkurrenz für den Arzneistoff beim Binden an Antikörper verwendet. Die Markerkonjugate können zum Beispiel in bestimmten Testformaten zum Beschichten von Mikrotiter-Testplatten verwendet werden. Beispiele von geeigneten Markerkonjugaten sind 1-[[[(4-Thiocarbamidphenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid-BTG, 1-[[[3-Carbonyl(1,1'-biphenyl)-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-D-lysergsäureamid-BSA, 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BTG und 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BSA.
Die Erfindung betrifft auch ein Reagenz für Immunquantifizierung (d. h. Quantifizierung über einen Immunoassay) von Lysergsäurediethylamid und dessen Metaboliten in biologischen Flüssigproben, welches ein Markerkonjugat umfasst, das eine Verbindung nach Formel I darstellt, wobei X ein Trägermolekül ist, welches aus Rinderserumalbumin (BSA) oder Rinderthyroglobulin (BTG) besteht. Geeignete Markerkonjugate sind 1-[[[(4-Thiocarbamidphenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid-BTG und 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BTG, und insbesondere 1-[[[3-Carbonyl(1,1'-biphenyl)-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-D-lysergsäureamid-BSA und 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BSA.
Die Erfindung betrifft auch einen Immunoassay, bei welchem ein solches Reagenz verwendet wird.
Unerwarteterweise fanden wir, dass in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die neuen Derivate nach Formel I hergestellt werden können, indem ein Spacerarm über den Indolstickstoff der LSD-Einheit eingebracht wird, wobei LSD-Derivate mit der folgenden Formel hergestellt werden:
wobei R¹ ein Rest -A-R³ ist; A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist und R³ ein Rest NHR⁴ ist und R² CH₃ ist; R⁵ LX ist, wobei L eine homobifunktionelle oder heterobifunktionelle Bindungsgruppe ist, ausgewählt aus Dimethylsuberimidat, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, Diisothiocyanatobenzol, 4-Isothiocyanatobenzoylchlorid, m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, [4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonylchlorid und 5-(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy-5-oxopentanoylchlorid, und X ein Detektor- oder Trägermolekül, zum Beispiel BSA oder BTG, ist.
Die Erfindung betrifft auch eine Verbindung mit der Formel
wobei

(a) R¹ ein Rest -A-R³ ist; A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist und R³ ein Rest NHR^4' ist und R² CH₃ ist; oder
(b) R¹ H ist und R² ein Rest -A-R³ ist; A eine Bindung oder ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest COR⁴ ist, oder A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest NHR^4' ist;

^4'

Das bevorzugte Verfahren zum Einbringen eines Spacerarms oder eines Spacers am LSD-Molekül erfolgt durch Alkylierung. Spacer sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden im Allgemeinen zur Bereitstellung von zusätzlichem Abstand zwischen einem Hapten und dem Trägermolekül verwendet. Typische Spacer weisen 1 bis 20 Kohlenstoffatome auf und können 0 bis 10 Heteroatome oder Heteroatom enthaltende Reste, zum Beispiel N, O, COOH oder S, umfassen und können gerad- oder verzweigtkettig sein. In der vorliegenden Erfindung wurde der Spacer an dem LSD-Molekül über ein geeignetes Alkylierungsmittel, ausgewählt aus zum Beispiel 4-Bromethylbutyrat, Iodethylacetat, 4-Brommethylbenzoesäure, Acrylsäure und Acryloin, eingebracht. Eine Alkylierung des Indolstickstoffs wird beschrieben unter Verwendung von Alkylierungsmitteln, wie Methyliodid oder n-Butylbromid (siehe E. Santaniello, Synthesis, 617 (1979)); Benzylierung mit Benzyliodid (siehe Y. Kiguawa, Synthesis, 421 (1981); N-Alkylierung von 3-Acetylindol mit Allylbromid (siehe T. Kurihara, Synthesis-Stuttgart, 4: 396 (1987); N-Alkylierung von Dihydrolysergsäure am Indolstickstoff mit Cyclopentyltosylat unter Verwendung von KOH-Pulver in DMSO (siehe G. Marzoni et al., Synthesis-Stuttgart, 7: 651 (1987); Herstellung eines N-Methyl-Derivats von Ergolin (siehe U.S. Patent Nr. 4,754,037). Unter Verwendung von solchen Bedingungen (z. B. G. Marzoni et al., Synthesis-Stuttgart, 7: 651 (1987)), welche eine Alkylierung mit N-(4-Iodbutyl)phthalimid am Indolstickstoff-Zentrum einschlossen, wurde kein alkyliertes LSD-Derivat erhalten. Keines der bekannten Verfahren beschreibt die erfolgreiche Derivatisierung von LSD am Indolstickstoff, über dessen Stellung die stabilen LSD-Derivate der vorliegenden Erfindung erzeugt werden.
In der vorliegenden Erfindung können bekannte Alkylierungsmittel, wie 4-(Brommethyl)-t-butylbenzoat, Halogenalkylnitril, Bromacetonitril und Brom-t-butylacetat, verwendet werden, um die gewünschte stabile Verknüpfung herzustellen. Wir fanden, dass es notwendig ist, zuerst ein Anion am Indolstickstoff zu erzeugen, um den Indolstickstoff zu alkylieren. Das Anion wurde dann mit einem geeigneten Alkylierungsmittel abgefangen, wobei ein Amin gebildet wurde.
Die 1 bis 4 zeigen geeignete Schemata I bis IV zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung. Interessante Intermediate in jenen Schemata sind z. B. 1-(3-Aminobutyl)-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid (Derivat 5), 1-(3-Aminopropyl)-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid (Derivat 10) und 8β-6-(3-Aminopropyl)-9,10-didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid (Derivat 23).
In einem bevorzugten Verfahren zur Erzeugung der LSD-Derivate, welches in Schema I von 1 gezeigt ist, wurde das Indolstickstoff-Anion mit n-Butyllithium in der Gegenwart von Hexamethylphosphoramid (HMPA) oder bevorzugt N,N'-Dimethylpropylenharnstoff (DMPU) anstatt des stärker toxischen HMPA, erzeugt. Das so erhaltene Anion wurde dann mit N-(4-Iodbutyl)phthalimid abgefangen, wobei Verbindung 4 erhalten wurde. Entschützung des Phthalimids in wasserfreiem Hydrazin stellte das Funktion tragende LSD-Derivat 5 bereit, welches zur Erzeugung des entsprechenden Haptens und Immunogens verwendet wurde.
Wir wählten den bifunktionellen Linker 4-Isothiocyanatobenzoylchlorid, Verbindung 6, (siehe K. Ziegler et al., Biochem. Biophys. Acta, 773: 11 bis 12 (1984)), um das Amin zum Hapten 7 umzuwandeln. Dieses Hapten wurde weiter zum entsprechenden LSD-Immunogen 8, 1-[[[(4-Thiocarbamidphenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid-BTG, umgewandelt, wie in Schema I von 1 aufgezeigt ist. Das Immunogen 8 wurde dann zur Erzeugung von anti-LSD-Antikörpern, welche als G648 und G651 bezeichnet werden, gemäß dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren verwendet.
In einer alternativen Synthese wurden die LSD-Derviate aktiviert, um stabile Haptenmarker und Markerkonjugate zur Verwendung in einem Immunoassay zur Detektion von LSD und dessen Metaboliten zu bilden. LSD ist empfindlich gegenüber Licht und alkalischem pH-Wert. Bei einem pH-Wert von über 7 unterliegt das Molekül einer Epimerisierung an der Position C-8, was zur teilweisen Bildung von iso-LSD führt. Unter langanhaltender Bestrahlung mit Licht wird LSD an der Position C-9 oxidiert, was zum Verlust des Olefinrests führt. Deshalb ist es wünschenswert, aktivierte Derivate herzustellen, die stabile Haptenmarker und Markerkonjugate erzeugen, welche einer Langzeitlagerung standhalten, welches eine höherstehende Betrachtung bei der Formulierung von Reagenzien zur einfachen Verwendung in einer Herstellungsumgebung darstellt.
Die Synthese des neuen Haptens 13 ist in Schema II von 2 veranschaulicht. Für die Synthese der Haptene wurde der Indolstickstoff mit N-(3-Iodpropyl)phthalimid abgefangen und mit wasserfreiem Hydrazin behandelt, wobei Amin 10 erhalten wurde, an welches eine Bindungsgruppe angefügt wurde. Herkömmliche Bindungsgruppen, wie Isothiocyanatobenzoylchlorid, DSS und SPDP, sind für die Synthese der Haptene geeignet. Die am stärksten bevorzugte Bindungsgruppe jedoch war ein heterobifunktioneller Linker 12, wobei gefunden wurde, dass dieser den Verbindungen eine gute Gesamtstabilität verleiht. Koppeln der Bindungsgruppe 12 mit dem LSD-Amin 10 in einem wasserfreien Zustand führte zum Hapten 13. Das neue Hapten 13 wurde wie in Beispiel 14 beschrieben an BSA gekoppelt, wobei das nachstehend gezeigte Markerkonjugat 14, 1-[[[3-Carbonyl(1,1'-biphenyl)-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-D-lysergsäureamid-BSA, bereitgestellt wurde.
Die neuen Reagenzien wurden wie in Beispiel 27 beschrieben in einem ELISA-Immunoassay getestet. Das von N-Indol abgeleitete LSD-BSA-Markerkonjugat 14, welches den Biphenyl-Linker enthält, wurde in Konkurrenz gegenüber bekannten Konzentrationen an LSD zum Binden an die anti-LSD-Antikörper G648 und G651, welche gegen das LSD-Immunogen 8 auftreten, verwendet. Die in Beispiel 27 gezeigten Daten führten zur Dosis-Wirkungs-Kurve, die in 4 gezeigt ist.
Die Kurve in 5 zeigt, dass die anti-LSD-Antikörper, welche gegen das LSD-Immunogen 8 auftreten, an das LSD-Markerkonjugat 14 binden. Freies LSD konkurriert mit dem BSA-Markerkonjugat 14 beim Binden an die anti-LSD-Antikörper, so dass die Gegenwart von LSD zu einer Abnahme oder Hemmung der Antikörper-Antigen-Bindung führt. Die Ergebnisse zeigen, dass das neue LSD-Markerkonjugat 14 als ein Reagenz im ELISA zur Bestimmung von LSD in Kombination mit LSD-Derivaten mit verschiedenen Bindungsgruppen verwendet werden kann.
Es wurde gezeigt, dass die zwei Antikörper G648 und G651, welche gegen das LSD-Immunogen 8 auftreten, auch an einen Hauptmetaboliten von LSD, nor-LSD, binden. 6 stellt eine Kurve bereit, welche über einen ELISA-Mikrotiterplatten-Test, wie in Beispiel 27 beschrieben, unter Verwendung von nor-LSD als der Standard erzeugt wurde.
Die Hemmungskurve von 6, welche aus den in Beispiel 27 bereitgestellten Daten erzeugt wurde, zeigt, dass das LSD-Derivat 14, welches über den Indolstickstoff des LSD-Moleküls hergestellt wurde, in einer dosisabhängigen Weise mit nor-LSD beim Binden an die Antikörper, welche über das LSD-Immunogen 8 erzeugt werden, konkurriert und deshalb in einem Immunoassay zur Detektion von nor-LSD nützlich ist.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen neuen LSD-Derivaten, welche sich über den Indolstickstoff des LSD ableiten, haben wir auch eine andere Klasse von LSD-Derivaten über den Piperidinstickstoff des LSD-Moleküls synthetisiert, um ein LSD-Derivat mit der folgenden Formel herzustellen:
wobei R¹ H ist und R² ein Rest -A-R³ ist; A eine Bindung oder ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, wenn R³ ein Rest COR⁴ ist, oder A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, wenn R³ NHR⁴ ist; R⁴ LX ist, wobei L eine homobifunktionelle oder heterobifunktionelle Bindungsgruppe ist, ausgewählt aus Dimethylsuberimidat, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, Diisothiocyanatobenzol, 4-Isothiocyanatobenzoylchlorid, m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, [4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonylchlorid und 5-(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy-5-oxopentanoylchlorid, zum Beispiel BSA oder BTG. Diese Derivate wurden zur Synthese von zusätzlichen Haptenen und Immunogenen verwendet, welche als Reagenzien bei einer Vielfalt von LSD-Immunoassay-Formaten nützlich sind, einschließlich einem Mikrotiterplatten-Format.
Die Synthese der Derivate über den Piperidinstickstoff erfordert die Bildung von nor-LSD vor der Derivatisierung. Schema III von 3 veranschaulicht die Synthese von nor-LSD 16 und LSD-Hapten 19, LSD-Immunogen 20 und Markerkonjugat 21, welche über den Piperidinstickstoff gebildet wurden. Für diese Synthese wurde LSD mit BrCN behandelt, wobei das Cyano-Derivat 15 erhalten wurde, welches über weitere Behandlung mit Zn in Essigsäure (HOAc) nor-LSD 16 bereitstellte. Nor-LSD wurde in der Gegenwart von Triethylamin (TEA) an den bifunktionellen Linker 18 gekoppelt, wobei das von Piperidin-N abgeleitete LSD-Hapten 19 erhalten wurde, welches weiter an BSA gekoppelt wurde, um das am stärksten bevorzugte Markerkonjugat 21, 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BSA, bereitzustellen. Siehe 3. Es stellte sich heraus, dass dieses Konjugat als ein anderes Reagenz im LSD-Immunoassay nützlich ist, wenn es zusammen mit den Antikörpern, welche gegen das Immunogen 8 auftreten, verwendet wird. Im in Beispiel 27 beschriebenen ELISA wurde unter Verwendung von LSD als der Standard eine Dosis-Wirkungs-Kurve erzeugt. 7 veranschaulicht die Hemmungskurve von LSD durch das BSA-Markerkonjugat 21, welche aus den in Beispiel 27 gezeigten Daten erzeugt wurde.
Die Ergebnisse in 7 weisen daraufhin, dass freies LSD mit dem BSA-Markerkonjugat 21 beim Binden an die anti-LSD-Antikörper konkurriert, so dass die Gegenwart von LSD zu einer Abnahme (oder Hemmung) der Antikörper-Antigen-Bindung führt. Folglich ist das LSD-Markerkonjugat als ein Regenz im ELISA-Test zur Bestimmung von LSD nützlich.
Auch ein anderes LSD-Hapten, welches sich über den Piperidinstickstoff ableitet und einen Biphenyl-Linker enthält, wurde synthetisiert. Die Synthese dieses Haptens ist nachstehend in Schema IV von 4 gezeigt. Nor-LSD 16 wurde mit 3-Iodphthalimid 2 in K₂CO₃ umgesetzt, wobei Verbindung 22 erhalten wurde. Eine Hydrazinolyse stellte das Amin 23 bereit, welches weiter mit dem Linker 12 behandelt wurde, wobei das LSD-Hapten 24, 1-[[[4'-[[[3-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]propyl]amino]carbonyl] [1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]oxy]-2,5-pyrrolidindion, bereitgestellt wurde. Die Biphenyl-Bindungsgruppe, welche in Bezug auf Licht stärker tolerierbar ist als aliphatische Monophenyl-Bindungsgruppen, stellt ein stabileres LSD-Derivat bereit.
Zusätzlich zur Herstellung von N-Aminopropyl-nor-LSD 23 wurde auch ein Carboxyalkyl, welches die Funktion am nor-LSD-Stickstoffatom trägt, synthetisiert. Die Herstellung der so erhaltenen Buttersäure-Derivate ist in den Beispielen 24 und 25 beschrieben.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sollen dazu dienen, die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weiter zu veranschaulichen. Die folgende Beschreibung kann unter Bezug auf die folgenden 1 bis 7 besser verstanden werden.
Die 1 bis 4 zeigen geeignete Schemata I bis IV zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung, welche in den Beispielen verwendet werden.
5 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve für die Konkurrenz zwischen LSD und 1-[[[3-Carbonyl(1,1'-biphenyl-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-D-lysergsäureamid-BSA beim Binden an anti-LSD-Antikörper.
6 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve für die Konkurrenz zwischen nor-LSD und 1-[[[3-Carbonyl(1,1'-biphenyl-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-D-lysergsäureamid-BSA beim Binden an einen anti-LSD-Antikörper.
7 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve für die Konkurrenz zwischen LSD und 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BSA beim Binden an anti-LSD-Antikörper.
Die numerischen Bezeichnungen der Verbindungen in den Überschriften der Beispiele 1 bis 25 in den Beispielen und in den 5 bis 7 beziehen sich auf die in den 1 bis 4 (Schemata I bis IV) gezeigten Strukturformeln.
Beispiel 1
Synthese von D-Lysergsäurediethylamid 1
Ein Gemisch von 4,0 g (0,015 mol) D-Lysergsäure und 200 ml trockenem DMF wurde unter Argon mit 3,6 g (0,022 mol) Carbonyldiimidazol (CDI) behandelt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Umsetzung wurde mit 15,2 ml (0,15 mol) Diethylamin behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 250 ml CH₂Cl₂ aufgenommen und mit 250 ml H₂O gewaschen. Unlösliches Material wurde über Filtration entfernt, und die Schichten wurden getrennt. Der organische Anteil wurde mit 250 ml gesättigter Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 500 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 3% CH₃OH in CH₂Cl₂ als Eluent chromatographiert, wobei 3,65 g (75,7%) D-LSD mit [α]_D = +50,4° (Konzentration = 1%; CHCl₃) als ein hell-brauner Feststoff erhalten wurden. Das 8α-Epimer (auch als iso-LSD bekannt) wies [α]_D = +226° (Konzentration = 1%; CHCl₃) auf.
Beispiel 2
Synthese von N-(3-Iodpropyl)phthalimid 2
Eine Lösung von 10,0 g (0,04 mol) N-(3-Brompropyl)phthalimid in 240 ml Aceton wurde mit 41,7 g (0,25 mol) Kaliumiodid behandelt und bei Raumtemperatur für 4 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde mit 800 ml Ether verdünnt und erneut durch Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde dann unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der so erhaltene gelbe Feststoff wurde in 550 ml Hexan umkristallisiert (heiß filtriert und auf 300 ml eingekocht), wobei 10,71 g (91,1%) von 2 als gebrochen-weiße Nadeln erhalten wurden.
Beispiel 3
Synthese von N-(4-Iodbutyl)phthalimid 3
Eine Lösung von 5,0 g (0,018 mol) N-(4-Brombutyl)phthalimid in 116 ml Aceton wurde mit 20,7 g (0,125 mol) Kaliumiodid behandelt und bei Raumtemperatur für 5 Tage gerührt. Die Umsetzung wurde filtriert und das Filtrat wurde mit 400 ml Ether verdünnt und dann erneut durch Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der so erhaltene Feststoff wurde in 300 ml Hexan umkristallisiert (heiß filtriert und auf 150 ml eingekocht), wobei 4,0 g (68,6%) von 3 als weiße Nadeln erhalten wurden.
Beispiel 4
Synthese von 1-[3-(1,3-Dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)butyl]-N,N-diethyl]-D-lysersäureamid 4
Eine Lösung von 2,0 g (6,18 mmol) D-LSD in 40 ml trockenem THF wurde unter Argon auf –78°C in einem Trockeneis-Aceton-Bad gekühlt. Die Lösung wurde mit 6,0 ml 1,6 M n-Butyllithium, gefolgt von 20 ml Dimethylpropylharnstoff behandelt und bei –78°C für 15 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer Lösung von 3,0 g (9,1 mmol) N-(4-Iodbutyl)phthalimid 3 in 6 ml N,N'-Dimethylpropylenharnstoff (DMPU) behandelt und bei –78°C für 2 Stunden, dann bei Raumtemperatur für 90 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck zu einem Öl aufkonzentriert. Das Öl wurde mit 100 ml Ethylacetat verdünnt und mit 5 × 50 ml H₂O gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 400 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 3% Methanol in Methylenchlorid als Eluent chromatographiert, wobei 900 mg von 4 als gelber amorpher Feststoff und 800 mg eines geringfügig weniger reinen Materials erhalten wurden, wodurch eine kombinierte Ausbeute von 52% erhalten wurde.
Beispiel 5
Synthese von 1-(3-Aminobutyl)-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid 5
Eine Lösung von 900 mg (1,7 mmol) von 4 in 25 ml Methanol wurde mit 0,385 ml (12,3 mmol) wasserfreiem Hydrazin behandelt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit 25 ml eines 9 : 1 Gemisches von Methylenchlorid : Methanol behandelt und die unlöslichen Feststoffe wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde an 200 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 25% Methanol in Methylenchlorid als Eluent, wobei an der Front laufende Verunreinigungen eluiert wurden, dann 2% Triethylamin, 25% Methanol in Methylenchlorid als Eluent, wobei das Produkt eluiert wurde, chromatographiert, wobei 563 mg (83%) von 5 als ein gelber amorpher Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 6
Synthese von 4-Isothiocyanatobenzoylchlorid 6
Ein Gemisch von 500 mg (2,79 mmol) 4-Carboxyphenylisothiocyanat und 5 ml Thionylchlorid wurde für 6 Stunden am Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert und der so erhaltene gelb-braune Feststoff wurde über Nacht unter hohem Vakuum an der Pumpe belassen. Der Feststoff wurde in einer kleinen Menge Hexan zerstoßen und durch Saugfiltration gesammelt, wobei 516 mg (93%) von 6 als ein gebrochen-weißer Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 7
Synthese von 1-[[[(4-Isothiocyanatophenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid 7
Eine Lösung von 370 mg (0,94 mmol) von 5 in 15 ml trockenem THF wurde auf 0°C gekühlt und mit einer Lösung von 190 mg (0,96 mmol) von 6 in 5 ml trockenem THF behandelt, bei 0°C für 30 Minuten gerührt und dann bei Raumtemperatur über Nacht. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,14 ml (1,0 mmol) Triethylamin behandelt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst, mit H₂O gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 200 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 3% Methanol in Methylenchlorid als Eluent chromatographiert, wobei 325 mg (62%) von 7 als ein gelb-brauner amorpher Feststoff mit [α]_D = +47,5° (Konzentration = 0,91%; CHCl₃) erhalten wurden.
Beispiel 8
Synthese von 1-[[[(4-Thiocarbamidphenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid-BTG 8
Eine Lösung von 698 mg BTG in 20 ml 50 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 7,5 wurde auf 0°C gekühlt und mit 58 ml DMSO behandelt, welches tropfenweise sehr langsam über einen Zeitraum von 2 Stunden zugegeben wurde. Das Gemisch wurde mit einer Lösung von 90 mg (0,16 mmol) von 7 in 2 ml DMSO, welches tropfenweise sehr langsam zugegeben wurde, behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt, in einen Dialysebehälter mit einem Rückhaltevermögen von 50 K gegossen und wie folgt dialysiert: 2 Liter 75% DMSO in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (KPi), pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; 2 Liter 50% DMSO in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; 2 Liter 30% DMSO in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; 2 Liter 15% DMSO in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; und 4 × 4 Liter 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für jeweils 6 Stunden bei 4°C. Das so erhaltene Konjugat wurde durch einen 0,22 μm Sterilfilter filtriert, wobei 116 ml des LSD-BTG-Konjugats 8 erhalten wurden. Die Proteinkonzentration betrug 5,3 mg/ml, wie über einen Coomasieblau-Proteintest bestimmt wurde. Ein TNBS-Test zeigte eine Modifizierung von 63,8% von verfügbaren Lysinen an BTG.
Beispiel 9
Synthese von 1-[3-(1 3-Dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)propyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid 9
Eine Lösung von 3,57 g (0,011 mol) D-LSD in 70 ml trockenem THF unter Argon wurde auf –78°C in einem Trockeneis-Aceton-Bad gekühlt. Die Lösung wurde mit 6,7 ml 2,5 M n-Butyllithium, gefolgt von 35 ml N,N'-Dimethylpropylenharnstoff (DMPU) behandelt und bei –78°C für 15 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer Lösung von 5,4 g (0,017 mol) N-(3-Iodpropyl)phthalimid 2 (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) in 10 ml DMPU behandelt und bei –78°C für 90 Minuten, dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das THF wurde unter verringertem Druck entfernt. Das Öl wurde mit 200 ml Ethylacetat verdünnt, mit 5 × 100 ml H₂O gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 500 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 3% Methanol in Methylenchlorid als Eluent chromatographiert, wobei 1,5 g des Produkts als ein amorpher Feststoff erhalten wurden. Gemischte Fraktionen wurden kombiniert und zweimal erneut an 250 g Kieselsäuregel chromatographiert, wobei zusätzliche 0,6 g an Produkt erhalten wurden, wodurch eine kombinierte Ausbeute von 2,1 g (37,5%) an 9 erhalten wurde.
Beispiel 10
Synthese von 1-(3-Aminopropyl)-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid 10
Eine Lösung von 2,1 g (4,1 mmol) von 9 in 35 ml Methanol wurde mit 0,92 ml (29,3 mmol) wasserfreiem Hydrazin behandelt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Umsetzung wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit 25 ml Methylenchlorid verdünnt, nicht gelöste Feststoffe wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde an 300 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 15% Methanol in Methylenchlorid als Eluent, wobei an der Front laufende Verunreinigungen entfernt wurden, dann 2% Triethylamin und 15% Methanol in Methylenchlorid als Eluent, wobei das Produkt eluiert wurde, chromatographiert, wobei 1,24 g (79,5%) von 10 als ein gelber amorpher Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 11
Synthese von 1,1'-Biphenyl-4,4'-dicarbonyldichlorid 11
Ein Gemisch von 2,0 g (8,2 mmol) 4,4'-Biphenyldicarbonsäure in 40 ml trockenem THF wurde mit 5,0 ml (55,0 mmol) Oxalylchlorid, gefolgt von 0,02 ml trockenem DMF behandelt. Die Umsetzung wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, dann für 90 Minuten zum Rückfluss erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck zu einem gelben Öl aufkonzentriert. Dieses wurde in einem Gemisch von THF und Ether umkristallisiert, wobei 1,67 g (73%) von 11 als gelbe Nadeln erhalten wurden.
Beispiel 112
Synthese von 4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-carbonylchlorid 12
Eine Lösung von 1,67 g (6,0 mmol) von 11 in 65 ml trockenem THF wurde mit 710 mg (6,17 mmol) N-Hydroxysuccinimid, gefolgt von 0,835 ml (6,0 mmol) Triethylamin behandelt. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, wobei nach dieser Zeit filtriert wurde, um Triethylamin Hydrochlorid zu entfernen. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert, wobei 2,0 g (93%) von 12 als ein blass-gelber Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 13
Synthese von 1-[3-[[[4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]amino]propyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid 13
Eine Lösung von 850 mg (2,375 mmol) von 12 in 65 ml trockenem THF unter Argon wurde in einem Eisbad auf 0°C gekühlt und dann mit einer Lösung von 900 mg (2,365 mmol) von 10 in 50 ml trockenem THF und 0,6 ml (4,3 mmol) Triethylamin, welches tropfenweise über einen Zeitraum von 20 Minuten zugegeben wurde, behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C für 1 Stunde gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt, wobei für 1 Stunde gerührt wurde. Das Gemisch wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert und der Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde mit 100 ml H₂O, 100 ml gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung, 100 ml gesättigter Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck zu einem braunen Rückstand aufkonzentriert. Dieser wurde an einer kurzen Säule mit 100 g Kieselsäuregel unter Verwendung von zuerst Methylenchlorid als Eluent, dann 9 : 1 Methylenchlorid : Ether als Eluent, wobei an der Front laufende Verunreinigungen eluiert wurden, dann 14 : 1 Methylenchlorid : Isopropylalkohol als Eluent, wobei das Produkt eluiert wurde, chromatographiert, wobei 650 mg (39%) von 13 als cremefarbener Feststoff mit [α]_D = +34,3° (Konzentration = 0,45%; CHCl₃) erhalten wurden.
Beispiel 14
Synthese von 1-[[[3-(4'-Carbonyl)(1,1'-biphenyl)-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid-BSA 14
Das LSD-Hapten von Beispiel 13 wurde in 100% DMF in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und wurde zu einer BSA-Lösung in einer Endkonzentration von 200 μg LSD-Derivat/ml, 20 mg BSA/ml und 20% DMF in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 gegeben. Dieses Konjugat wurde dann in Dialyseschläuchen mit einem MW-Rückhaltevermögen von 25.000 Dalton unter zwei Bedingungen dialysiert, (1) 20% DMF/50 mM KPi, pH-Wert 7,5, 10-fach Dialyse, gefolgt von 10% DMF/50 mM KPi, pH-Wert 7,5, 10-fach Dialyse und 0% DMF/50 mM KPi, pH-Wert 7,5, 10³-fach Dialyse. (2) 20% DMF/50 mM KPi, pH-Wert 7,5, 10²-fach Dialyse, gefolgt von 10% DMF/50 mM KPi, pH-Wert 7,5, 10²-fach Dialyse und 0% DMF/50 mM KPi, pH-Wert 7,5, 10³-fach Dialyse. Die Anzahl an LSD-Molekülen pro BSA in dem LSD-BSA-Konjugat wurde über Messen der Fluoreszenz des LSD-Biphenyl-BSA-Konjugats 14 bestimmt. Die Fluoreszenz des Nicht-Arzneistoff-BSA bei der gleichen BSA-Konzentration wie beim LSD-Biphenyl-BSA-Konjugat 14 wurde auch aufgezeichnet. Das LSD-Biphenyl-Derivat 13 wurde als ein Fluoreszenz-Standard verwendet. Die Konzentration an BSA wurde mit ROCHE Gesamtprotein (Produkt-Bestellnummer 44903/44026) unter Verwendung von 50 mg/ml natives BSA als Standard bestimmt.
Beispiel 15
Synthese von 8β-6-Cyano-9,10-didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid 15
Eine unter Rückfluss stehende Lösung von 3,0 g (28,3 mmol) Cyanbromid in 200 ml trockenem Chloroform unter Argon wurde mit einer Lösung von 2,0 g (6,2 mmol) von 1 (D-LSD) in 100 ml trockenem Chloroform, welches tropfenweise über einen Zeitraum von 20 Minuten zugegeben wurde, behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde für 1 Stunde am Rückfluss gehalten, dann auf Raumtemperatur gekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit 100 ml 1%iger wässriger Weinsäure-Lösung gewaschen. Die kombinierten wässrigen Waschphasen wurden einmal mit 50 ml Chloroform extrahiert. Beide organischen Anteile wurden kombiniert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck zu einem schwarzen Rückstand aufkonzentriert. Dieser wurde an 250 g Kieselsäuregel unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent chromatographiert, wobei 1,5 g (73%) von 15 als ein blass-gelber amorpher Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 16
Synthese von 8β-9,10-Didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid 16 und 8α-9,10-Didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid 17
Ein Gemisch von 1,2 g (3,6 mmol) von 15, 2,1 g (32,1 mmol) Zinkstaub, 11 ml Essigsäure (HOAc) und 2,1 ml H₂O wurde unter Argon für 4 Stunden zum Rückfluss erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und vom Zink-Rückstand abdekantiert, dann unter verringertem Druck auf ein kleines Volumen aufkonzentriert. Unter Kühlen in einem Eisbad wurde das Konzentrat mit 10 ml H₂O verdünnt und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid basisch auf einen pH-Wert von 9 eingestellt. Der so erhaltene gummiartige Niederschlag wurde mit 4 × 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Nach der ersten Extraktion wurde eine zusätzliche Menge an konzentriertem Ammoniumhydroxid zugegeben, um den pH-Wert wieder auf 9 anzupassen. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 150 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 10% Methanol in Aceton als Eluent chromatographiert, wobei 500 mg (45%) von 16 (nor-LSD) als ein hell-brauner amorpher Feststoff und 200 mg (18%) von 17 (nor-iso-LSD) als ein hell-brauner amorpher Feststoff erhalten wurden. Auch wurden 400 mg eines Gemisches aus beiden Epimeren erhalten. 16: [α]_D = +34,3° (Konzentration = 0,455%; CHCl₃); 17: [α]_D = +208,9° (Konzentration = 1,37%; CHCl₃).
Beispiel 17
Synthese von 5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-5-oxopentanoylchlorid 18
Eine Lösung von 10,0 g (0,088 mol) Glutarsäureanhydrid in 50 ml trockenem THF unter Argon wurde mit 10,0 g (0,087 mol) N-Hydroxysuccinimid behandelt und unter Rückfluss für 3,5 Stunden erwärmt. Die Umsetzung wurde unter verringertem Druck zu einem Öl aufkonzentriert. Das Öl wurde in 50 ml Ethylacetat kristallisiert, wobei 9,2 g (46%) 5-[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-5-oxopentansäure erhalten wurden, welche mit 16 ml Thionylchlorid behandelt und bei 45°C für 3 Stunden unter Argon erwärmt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck zu einem weißen Feststoff aufkonzentriert, welcher in einer kleinen Menge an Ether zerstoßen und über Saugfiltration gesammelt wurde. Das Produkt wurde bei hohem Vakuum über Nacht getrocknet, wobei 8,7 g (88%) von 18 als ein weißer Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 18
Synthese von 1-[[5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]-1,5-dioxopentyl]oxy]-2,5-pyrrolidindion 19
Eine Lösung von 200 mg (0,65 mmol) von 16 in 10 ml trockenem THF unter Argon wurde mit 161 mg (0,65 mmol) von 18 behandelt, gefolgt von 0,2 ml (1,4 mmol) an trockenem Triethylamin. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt, dann unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst, mit H₂O und gesättigter wässriger Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert, wobei 330 mg (98%) von 19 als ein gelber amorpher Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 19
Synthese von 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]-1,5-dioxopentyl-BTG 20
Eine Lösung von 700 mg BTG in 13 ml 50 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 7,5 wurde auf 0°C gekühlt und mit 13 ml DMSO, welches tropfenweise sehr langsam zugegeben wurde, behandelt. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde eine Lösung von 84 mg (0,16 mmol) von 19 in 1 ml DMSO tropfenweise sehr langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt, in einen Dialysebehälter mit einem Rückhaltevermögen von 50 kDa gegossen und wie folgt dialysiert: 2 Liter 50% DMSO in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; 2 Liter 25% DMSO in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; 2 Liter 100% 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; und 7 × 4 Liter 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für jeweils 6 Stunden bei 4°C. Das so erhaltene Konjugat wurde durch einen 0,22 μm Sterilfilter filtriert, wobei das LSD-BTG-Konjugat 20 erhalten wurde. Die Proteinkonzentration betrug 12,1 mg/ml, wie über einen Coomasieblau-Proteintest bestimmt wurde. Ein TNBS-Test zeigte eine Modifizierung von 45% von verfügbaren Lysinen an BTG.
Beispiel 20
Synthese von 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]-1,5-dioxopentyl-BSA 21
Eine Lösung von 1,1 g BSA in 22 ml 50 mM Phosphat-Puffer, pH-Wert 7,5 wurde auf 0°C gekühlt und mit 22 ml DMSO, welches tropfenweise sehr langsam zugegeben wurde, behandelt. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurden 4 ml entfernt und als eine Referenz aufbewahrt. Zu den verbleibenden 40 ml (1 g BSA) wurde tropfenweise eine Lösung von 12 mg (0,02 mmol) von 19 in 0,5 ml DMSO gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt, in einen Dialysebehälter mit einem Rückhaltevermögen von 50 kDa gegossen und wie folgt dialysiert: 2 Liter 50% DMSO in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; 2 Liter 25% DMSO in 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; 2 Liter 100% 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur; und 7 × 4 Liter 50 mM KPi, pH-Wert 7,5 für jeweils 6 Stunden bei 4°C. Das so erhaltene Konjugat wurde durch einen 0,22 μm Sterilfilter filtriert, wobei das LSD-BSA-Konjugat 21 erhalten wurde. Die Proteinkonzentration betrug 14,6 mg/ml, wie über einen Coomasieblau-Proteintest bestimmt wurde. Das Verhältnis von Hapten/BSA betrug 0,8.
Beispiel 21
Synthese von 8β-9,10-Didehydro-6-[3-(1,3-dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)propyl]-N,N-diethylergolin-8-carboxamid 22
Eine Lösung von 568 mg (1,84 mmol) von 16 in 17 ml trockenem DMF wurde mit 413 mg (4,2 mmol) wasserfreiem Kaliumcarbonat, gefolgt von 653 mg (2,1 mmol) N-(3-Iodpropyl)phthalimid 2 behandelt und über Nacht bei 40°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert, der Rückstand wurde mit Methylenchlorid verdünnt, mit H₂O gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Das Produkt wurde dann an 150 g Kieselsäuregel unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent chromatographiert, wobei 833 mg (91%) von 22 als ein gelber amorpher Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 22
Synthese von 8β-6-(3-Aminopropyl)-9,10-didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid 23
Eine Lösung von 820 mg (1,65 mmol) von 22 in 30 ml Methanol wurde mit 0,4 ml (12,7 mmol) wasserfreiem Hydrazin behandelt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 100 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 2% Triethylamin, 15% Methanol in Methylenchlorid als Eluent chromatographiert. Fraktionen, die Produkt enthielten, wurden kombiniert und erneut an 150 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 2% Triethylamin, 15% Methanol in Chlorofrom als Eluent chromatographiert, wobei 560 mg (93%) von 23 als ein gelber amorpher Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 23
Synthese von 1-[[[4'-[[[3-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]propyl]amino]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]oxy]-2,5-pyrrolidindion 24
Eine Lösung von 1,32 g (3,7 mmol) von 12 in 50 ml trockenem Methylenchlorid unter Argon wurde auf 0°C gekühlt und mit einer Lösung von 535 mg (1,46 mmol) von 23 in 50 ml trockenem Methylenchlorid, welches tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten zugegeben wurde, behandelt. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde das Reaktionsgemisch mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 100 g Kieselsäuregel unter Verwendung von 5% Isopropylalkohol als Eluent chromatographiert. Fraktionen, die Produkt enthielten, wurden kombiniert und unter verringertem Druck zu einem gelben Feststoff aufkonzentriert. Der Feststoff wurde fünfmal in Ether aufgenommen und aufkonzentriert, um restlichen Isopropylalkohol zu entfernen, wobei 280 mg (28%) von 24 als ein gelber Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 24
Synthese von 8β-6-Buttersäureethylester-9,10-didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid 25
Eine Lösung von 1,1 g (3,5 mmol) von 16 in 35 ml trockenem DMF unter Argon wurde mit 800 mg wasserfreiem Kaliumcarbonat, gefolgt von 2 ml Ethylbrombutyrat behandelt und für 6 Stunden bei 40°C gerührt, dann bei Raumtemperatur über Nacht. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit Methylenchlorid verdünnt, mit H₂O gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde an 200 g Kieselsäuregel unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent chromatographiert, wobei 780 mg (52%) von 25, dem 8β-Epimer, als ein gelber amorpher Feststoff erhalten wurden. Auch wurden 84 mg des 8α-Epimers und 395 mg eines Gemisches von 8α- und 8β-Epimeren erhalten.
Beispiel 25
Synthese von 8β-6-Buttersäure-9,10-didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid 26
Eine Lösung von 400 mg (0,94 mmol) von 25 in 16 ml Methanol und 8 ml H₂O wurde mit 1,6 g Kaliumcarbonat behandelt und bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Scheidetrichter gegossen und mit 50 ml Methylenchlorid und 50 ml H₂O verdünnt. Die wässrige Schicht wurde mit 6 N HCl auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert. Das Gemisch wurde im Scheidetrichter kräftig geschüttelt. Die Schichten wurden getrennt und der wässrige Anteil wurde zweimal zusätzlich mit Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck aufkonzentriert, wobei 330 mg (88%) von 26 als ein gelb-brauner Feststoff erhalten wurden.
Beispiel 26
Tierimmunisierungs-Protokoll
Das Immunogen wurde 1 : 1 mit Freund-Adjuvans gemischt. Jeweils fünf Ziegen erhielten wie folgt an mehreren Stellen über den Rücken verteilt Injektionen:
Sechs Monate nachdem die Tiere das geeignete Immunogen erhalten hatten, wurde Testblut erhalten und die Antiseren wurden in dem ELISA-Mikrotiterplatten-Test unter Verwendung des geeigneten LSD-BSA-Konjugats als das Plattenbeschichtungsmaterial, wie im Folgenden in Beispiel 27 beschrieben, bewertet.
Beispiel 27
ELISA-Mikrotiterplatten-Test für LSD unter Verwendung von anti-LSD-Antikörpern und LSD-BSA-Markerkonjugaten
Wells von hochbindenden Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Wells (Costar, MA) wurden jeweils mit 50 μl eines LSD-BSA-Konjugats (verdünnt in PBS-Azid-Puffer, pH-Wert 7,2) beschichtet und man ließ für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 2°C bis 8°C inkubieren. Die Platten wurden dreimal mit dem PBS-Puffer gewaschen. 100 μl von 1% BSA in PBS-Azid-Puffer wurden in jedes Well gegeben und die Platte wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit dem PBS, welches 0,05% TWEEN^®-20 (Sigma) enthielt, gewaschen. 50 μl LSD oder nor-LSD, verdünnt in BSA-PBS-Azid-Puffer, oder 50 μl 1%iger BSA-PBS-Azid-Puffer ohne den Arzneistoff als eine Kontrolle wurden zugegeben. 50 μl der geeigneten Antiseren in 1%igem BSA-PBS-Azid-Puffer wurden zu jedem Well gegeben. Die Platten wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, dann dreimal mit PBS-TWEEN^®-20 gewaschen. 50 μl von anti-Ziegen-Konjugat mit alkalischer Phosphatase (Fisher Scientific) wurden zu jedem Well gegeben und die Platte wurde für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit PBS-TWEEN^®-20-Puffer gewaschen und in jedes Well wurden 50 μl p-Nitrophenylphosphat (Sigma) gegeben. Die Platten wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde über die Zugabe von 50 μl 3 N NaOH abgestoppt und die so erhaltene optische Dichte wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt. Die in den Tests erzeugten Daten sind nachstehend aufgeführt. Die so erhaltenen Hemmungs- oder Verdrängungskurven von LSD sind in den 5 bis 7 gezeigt.
Die Daten, welche zur Hemmungskurve von 5 führen:
Die Daten, welche zur Hemmungskurve von 6 führen:

Nor-LSD (ng/ml) G651 (OD)

0 1,38

1 1,2

5 0,88

5 (LSD) 0,63
Die Daten, welche zur Hemmungskurve von 7 führen:

Claims

Verbindung der Formel
wobei (a) R¹ ein Rest -A-R³ ist; A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist und R³ ein Rest NHR⁴ ist und R² CH₃ ist; oder (b) R¹ H ist und R² ein Rest -A-R³ ist; A eine Bindung oder ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest COR⁴ ist, oder A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest NHR⁴ ist; R⁴ LX ist, wobei L eine homobifunktionelle oder heterobifunktionelle Bindungsgruppe ist, ausgewählt aus Dimethylsuberimidat, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, Diisothiocyanatobenzol, 4-Isothiocyanatobenzoylchlorid, m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, [4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonylchlorid und 5-(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy-5-oxopentanoylchlorid, und X ein Detektor- oder Trägerprotein ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei X ein aus Rinderserumalbumin (BSA) oder Rinderthyroglobulin (BTG) bestehendes Trägerprotein ist.
Verbindung gemäß Anspruch 2, welche aus 1-[[[(4-Thiocarbamidphenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid-BTG, 1-[[[3-(4'-Carbonyl)(1,1'-bi-phenyl)-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-D-lysergsäureamid-BSA, 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BTG und 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BSA ausgewählt ist.
Reagenz zur Immunquantifizierung von Lysergsäurediethylamid und seinen Metaboliten in biologischen Flüssigproben, welches ein Markerkonjugat, das eine Verbindung gemäß Anspruch 2 oder 3 ist, umfasst.
Reagenz gemäß Anspruch 4, wobei das Markerkonjugat aus 1-[[[3-(4'-Carbonyl)(1,1'-biphenyl)-4-yl]carbonyl]aminopropyl]-D-lysergsäureamid-BSA und 5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl-1,5-dioxopentyl-BSA ausgewählt ist.
Immunoassay zur Quantifizierung von Lysergsäurediethylamid und seinen Metaboliten in biologischen Flüssigproben, welches die Verwendung eines Markerkonjugats, das eine Verbindung gemäß Anspruch 2 oder 3 ist, umfasst.
Verbindung der Formel
wobei (a) R¹ ein Rest -A-R³ ist; A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist und R³ ein Rest NHR^4' ist und R² CH₃ ist; oder (b) R¹ H ist und R² ein Rest -A-R³ ist; A eine Bindung oder ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest COR^4' ist, oder A ein gesättigter gerad- oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, falls R³ ein Rest NHR^4' ist; R^4' aus H oder LH ausgewählt ist; L eine homobifunktionelle oder heterobifunktionelle Bindungsgruppe ist, ausgewählt aus Dimethylsuberimidat, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, Diisothiocyanatobenzol, 4-Isothiocyanatobenzoylchlorid, m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, (4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonylchlorid und 5-(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy-5-oxopentanoylchlorid.
Verbindung gemäß Anspruch 7, welche aus 1-[[[(4-Isothiocyanatophenyl)carbonyl]amino]butyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid, 1-[3-[[[4'-[[(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]amino]propyl]-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid, 1-[[5-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]-1,5-dioxopentyl]oxy]-2,5-pyrrolidindion und 1-[[[4'-[[[3-[8β-9,10-Didehydro-8-[(diethylamino)carbonyl]ergolin-6-yl]propyl]amino]carbonyl][1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]oxy]-2,5-pyrrolidindion ausgewählt ist.
Verbindung gemäß Anspruch 7, welche aus 1-(3-Aminobutyl)-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid, 1-(3-Aminopropyl)-N,N-diethyl-D-lysergsäureamid und 8β-6-(3-Aminopropyl)-9,10-didehydro-N,N-diethylergolin-8-carboxamid ausgewählt ist.