DE2310280A1 - Tubocurarin-antigene - Google Patents
Tubocurarin-antigeneInfo
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Description
.„., . . - 1. März 1973
RAN 4050/13
F. Hoifmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Die Erfindung bezieht sich auf neue Tubocurarinantigene,
auf dafür spezifische Antikörper sowie auf ein Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft auch biochemische
Methoden zur Bestimmung der Anwesenheit von Tubocurarinderivate
in biologischen Flüssigkeiten.
Curarebestandteile, hauptsächlich Tubocurarin, dessen Säureadditionssalze und quaternäre Ammoniumsalze, finden verbreitet
Verwendung zum Relaxieren von glatten Muskeln, insbesondere im Zusammenhang mit Operationen, bei denen glatte
Muskeln manipuliert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass viele Curarebestandteile tödliche Gifte sind und bekanntlich
durch Eingeborene in Süd-Amerika als Pfeilgift verwendet werden, müssen sie für medizinische Zwecke mit grosser Sorgfalt
gehandhabt werden, um eine Ueberdosierung, welche eine Lähmung der Atmungsorgane verursacht, zu vermeiden. Gegenwärtige
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Methoden zur Messung des Gehalts an Tubocurarinderivaten bei
einem bestimmten Patient sind nicht sehr empfindlich und selbst im besten Fall ziemlich grob und subjektiv. Das Auffinden
einer empfindlicheren Methode zur Bestimmung von Tubocurarinderivaten in einem biologischen System würde deshalb einen
wichtigen technischen Fortschritt bedeuten.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass verschiedene kleine Moleküle (Haptene), die selbst keine Antigenizität
aufweisen, die Antigeneigenschaften eines Proteins verändern können, wenn das kleine Molekül mit dem Protein durch stabile
kovalente Bindungen verknüpft wird. Gemäss der US-Patentschrift 2 372 066 können Antigene so hergestellt werden, dass Histamin ccei
Histamin-ähnliche Verbindungen durch Verknüpfung des Imidazclrings
über einen Rest, der eine für die Verknüpfung mit dem Protein reaktionsfähige Gruppe enthält, mit dem Protein verknüpft
werden. Diese Antigene werden entweder direkt injiziert, wodurch die Widerstandsfähigkeit, die Widerstandskraft oder
aktive Immunität,des Subjekts entwickelt werden, oder Wirtstieren injiziert, von denen spezifische Antikörper entwickelt
werden, die spezifisch hinsichtlich des Haptenrestes, z.B. des Histamine oder der Histamin-ähnlichen Verbindung, sind.
Eine ähnliche, gleichzeitige Offenbarung wurde von Landsteiner in "Specificity of Serological Reactions", Harvard
University Press, Cambridge, Massachusetts, 1945, gemacht. Hierbei wurde p-Aminophenylarsinsäure mit einem Protein über
dessen Diazoniumsalz zu einer chemisch einfachen, gut definierten Verbindung gekuppelt, die antigene Eigenschaften besass
und die Bildung von Antikörpern stimulierte. Darüber hinaus können die Antikörper für dieses Immunogen (konjugiertes
Protein) mit den kleinen Molekülen, z.B. der Arsinsäure, die mit keinem Protein verbunden ist, kombinieren. Dieser Anti-r
körper ist in der Aktivität sehr spezifisch. Wird z.B. ein Isomeres der Arsanilsäure verwendet, in der sich die
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-AsO^HpGruppe in m-Stellung zur Aminogruppe befindet, so wird
dieses nicht mit dem Antikörper kombinieren, der für einen Protein-Arsanilsäurekomplex gebildet worden ist, in dem sich
die -AsCUH^Gruppe in p-Stellung zur Aminogruppe befindet.
Es sei darauf hingewiesen, dass es beim derzeitigen Stand der Forschung noch nicht möglich ist, diejenigen Eigenschaften
eines Moleküls vorauszusagen oder zu bestimmen, die das Molekül dazu befähigen, als Antigen zu wirken. Man hat einmal
angenommen, dass das Molekulargewicht und die Anwesenheit einer aromatischen Gruppe, die entscheidenden Faktoren sind. Mit der
Zeit hat sich die Forderung nach einem bestimmten Molekulargewicht als Bedingung für die Antigenizität beträchtlich verringert.
Man ist jedoch noch der Auffassung, dass das Molekulargewicht in gewissem Umfang die antigenen Fähigkeiten eines
Moleküls beeinflusst. Auch andere Faktoren, wie die molekulare Gestalt und die chemische Reaktivität, müssen eine Rolle bei
den Antigeneigenschaften spielen. Auf diese Weise wird eine Vorhersage über diese Eigenschaften noch erheblich schwieriger.
Es wurde nun gefunden, dass neue Antigene durch Kupplung von Tubocurarinderivaten an immunogene Trägermaterialien, hergestellt
werden können. Die Kupplung erfolgt mittels einer brückenartigen Gruppierung, welche sich von einer Aminosäure
ableitet, einerseits mittels einer Azobindung an ein Tubocurarinrest und anderseits mittels einer Peptidbindung an
ein immunogenes Trägermaterial gebunden ist.
Genauer gesagt erfolgt die Kupplung durch eine Gruppe der allgemeinen Formel
-N=N'
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-■ 4 -
worin m eine ganze Zahl von O bis 5 bedeutet.
Diese Gruppe leitet sich von einer Aminobenzoesäure
(m = O) oder einer Aminophenyl-nieder-Alkancarbonsäure (m = 1-5)
ab. Vorzugsweise wird das Tubocurarinhapten über eine Gruppe, welche sich von einer p-Aminobenzoesäure ableitet, an ein
Protein gebunden. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die mit gewisser Spezifität mit dem Tubocurarinhapten
einen Komplex bilden. Diese Antikörper werden dadurch hergestellt, dass man Wirtstiere mit dem vorgenannten
Antigen behandelt. Die spezifischen Antikörper lassen sich in einfacher Weise aus den von den Wirtstieren nach der Behandlung
mit dem Antigen gewonnenen Seren isolieren.
Der hier verwendete Ausdruck "Tubocurarin" oder "Tubocurarinderivat"
umfasst die d- und 1-enantiomeren Formen von Tubocurarin und seine Mono- oder Di-O-nieder Alkyl-äther, die
Säureadditionssalze davon, (z.B. Mono- oderDi-Hydrochlorid oder -Hydrobromid und dergleichen); die quaternären Ammoniumsalze
davon (z.B. Mono- oder Di-methochloride, -methobromide,
methiodide und dergleichen) und Mischungen der bereits genannten Verbindungen. Bevorzugte Tubocurarinderivate sind
diejenigen, welche die d-Form besitzen. Ganz besonders bevorzugt ist d-Tubocurarinchlorid.
Der hier verwendete Ausdruck "immunogenes Trägermaterial"
umfasst solche Materialien, die bei ihrer Injizierung in Wirtstiere selbständig eine immunogene Reaktion im Wirtstier hervorrufen
und die mittels einer Peptidbindung an ein Molekül mit einer freien oder aktivierten Carboxylgruppe gekuppelt werden
können. Geeignete Trägermaterialien sind z.B. Proteine, natürliche oder synthetische polymere Stoffe, wie Polypeptide,
z.B. Polylysin und dergleichen. Bei der Anwendung der Erfindung in der Praxis werden als Trägermaterial vorzugsweise
Proteine verwendet.
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Die Art des zur Herstellung eines "bevorzugten Antigens verwendeten Proteins spielt keine besondere Rolle. Beispiele
für bevorzugte Proteine sind Säugetiere-Serumproteine, wie menschliches γ-Globulin, menschliches Serumalbumin, Rinderserumalbumin,
Kaninchenserumalbumin oder Rinder-y-Globulin. Es
liegt im Vermögen des Fachmannes, weitere geeignete Proteine zu verwenden. Im allgemeinen wird es bevorzugt, solche Proteine
zu verwenden, die für das mit dem Antigen zu behandelnde Wirtstier artfremd sind.
Ein Tubocurarinhapten wird an das immunogene Trägermaterial,
z.B. ein Protein, mittels einer von einer Aminosäure der allgemeinen Formel
(CH2)m-C00H
worin m die obige Bedeutung besitzt,
sich ableitenden Gruppe, gekuppelt. Die Kupplung an das Tubocurarin erfolgt mittels einer Azobindung.
Diese Bindung wird durch Diazotierung der Aminogruppe der Aminosäure und Kupplung an den aromatischen Ring des Tubocurarinhaptens
gebildet.
Die Diazotierung kann durch irgendeine, zur Durchführung solcher Reaktionen bekannte Methode erfolgen. So kann z.B.
die Aminosäure durch Reaktion mit einem Metallnitrit wie z.B. Natriumnitrit, in Anwesenheit einer Mineralsäure wie z.B.
Chlorwasserstoffsäure diazotiert werden. Das auf diese Weise gebildete Diazoniumsalz kann anschliessend an das aromatische
Substrat, d.h. an das Tubocurarinhapten, durch in Kontakt bringen des Diazoniumsalzes mit dem Tubocurarin gekuppelt werden.
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Die Kupplung erfolgt vorzugsweise bei einem alkalischen pH-Wert wie z.B. bei einem pH-V/ert zwischen 8 und 12. Nach
Ablauf der Reaktion wird der Ueberschuss an Aminosäure durch Säureextraktion entfernt.
Das Tubocurarin, welches , wie vorstehend beschrieben,
mittels einer Azobindung auf den Aminosäurerest gebunden ist (nachstehend als "Azotubocurarin" bezeichnet), kann anschliessend
zur Herstellung des erfindungsgenässen Antigens an das immunogene Trägermaterial, z.B. ein Protein, gekuppelt
werden. Diese Herstellung kann nach irgendwelchen bekannten Verfahren der Protein- und Peptidchemie zur Ausbildung von
Peptidbindungen, durchgeführt werden.
Nach einem Verfahren werden z.B. das Protein und ein Dehydratisierungsmittel nach dem Lösen in einem geeigneten
Lösungsmittel mit einem grossen molaren Ueberschuss an Azotubocurarin versetzt. Die Reaktion kann bei Temperaturen im
Bereich von etwa O bis etwa 500C durchgeführt werden. Nach
Massgabe der Art der Reaktanten und der Denaturierungstemperatur des Proteins können jedoch auch höhere oder niedrigere
Temperaturen angewendet werden. Ein besonders bevorzugter Temperaturbereich erstreckt sich von etwa O0C bis etwa Raumtemperatur.
Es ist von Vorteil, ein schwach saures Reaktionsmedium, z.B. mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis 6,5»
insbesondere im Bereich von etwa 4 bis 6,5» zu verwenden. Nach Vervollständigung der Reaktion können die überschüssigen
Azotubocurarinmoleküle und das Dehydratisierungsmittel durch Dialyse entfernt werden. Der Fortschritt der Dialyse kann so
kontrolliert werden, dass man das Dialysat auf die Anwesenheit von Azotubocurarin oder Dehydratisierungsmittel prüft. Die
Dialyse kann jedoch auch einfach eine bestimmte Zeit, z.B. 3 Tage, durchgeführt werden. Das gereinigte Antigen wird al
Rückstand im Dialysesack gewonnen.
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Das bei der vorgenannten Reaktion verwendete Dehydratisierungsmittel
wird aus den üblicherweise in der Peptidchemie zur Bildung von Peptidbindungen verwendeten Dehydratisierungsmitteln
ausgewählt. Eine besonders geeignete Gruppe von Dehydratisierungsmitteln
umfasst die Carbodiimide, insbesondere Dicyclohexy!carbodiimide oder l-Aethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.
Die Menge des molaren Ueberschusses des Haptens über das Protein in der vorgenannten Reaktion hängt selbstverständlich
von der Art des für die Reaktion ausgewählten Haptens und Proteins ab. Im allgemeinen wird ein molarer Ueberschuss
im Bereich von etwa 100 bis 1000, insbesondere im Bereich von etwa 500 bis 1000, angewendet. Es wird allgemein beobachtet,
dass sich etwa 2 bis etwa 3 Tubocurarinreste an
1 Molekül des Proteins nach Massgabe des molaren Ueberschusses des verwendeten Tubocurarins anlagern.
Einanderes nützliches Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen
Antigene besteht darin, dass man zunächst ein aktiviertes Derivat der Carboxylgruppe des Azotubocurarinrestes
herstellt und dann dieses aktivierte Derivat mit dem Protein unter Bildung des gewünschten Antigens umsetzt. Geeignete
aktivierte Derivate sind z.B. aktivierte Ester, wie p-Nitrophenylester, oder Acylimidazole. Die aktivierten Esterderivate
werden zweckmässig durch Umsetzung der freien Säure mit dem gewünschten Alkohol in Gegenwart eines geeigneten
Dehydratisierungsmittels, wie eines Carbodiimids, unter den vorgenannten Reaktionsbedingungen ähnlichen Bedingungen hergestellt.
Die Acylimidazole können durch Umsetzung der freien Carboxylgruppe mit z.B. Carbonyldiimidazol hergestellt werden.
Zur Herstellung des Antigens kann das aktivierte Derivat mit dem gewünschten Protein in Berührung gebracht werden. Wie
bereits erwähnt, wird das Antigen im allgemeinen durch Dialyse gereinigt.
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Die Antigene der Erfindung können auch so hergestellt werden, dass man zuerst die Aminosäure mittels einer Amidbindung
an das immunogene Trägermaterial, z.B. ein Protein, kuppelt und anschliessend dieses Proteinderivat, welches einen
Aminophenylrest besitzt, an das Tubocurarin durch Diazotierung
der Aminogruppe und Kupplung wie vorstehend beschrieben, bindet. In der Regel wird es bevorzugt, zuerst die Bindungsgruppe,
welche sich von einer Aminosäure ableitet mittels einer Azo- bindung an das Tubocurarin zu kuppeln und anschliessend dieses
Azotubocurarin mittels einer Peptidbindung an das Protein zu kuppeln.
Die Antigene der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Bildung von gegenüber Tubocurarinderivaten
spezifischen Antikörpern.im Serum von Wirtstieren zu induzieren, indem man das Antigen diesen Wirtstieren über einen gewissen
Zeitraum wiederholt injiziert, das Serum sammelt, den Antikörper mit einer neutralen Salzlösung ausfällt und anschliessend
durch Dialyse und Säulenchromatographie reinigt. Geeignete Wirtstiere sind z.B. Säugetiere, wie Kaninchen, Pferde, Ziegen,
Guinea-Schweine, Ratten, Rinder oder Schafe. Die erhaltenen Antikörper besitzen eine Vielzahl aktiver Zentren, die selektiv
mit den Tubocurarinderivaten und den hiermit hergestellten Antigenen unter Komplexbildung reagieren.
Die Bildung Tubocurarin-spezifischer Antikörper in den Wirtstieren lässt sich durch Blutprobenentnahmen und Versetzen
dieser Blutproben mit dem Tubocurarin-Protein-Antigen, welches
zur Injizierung verwendet wurde, kontrollieren. Die Ausbildung eines Niederschlags zeigt die Antikörperaktivität an. Die
Antigenbehandlung des Tieres kann so lange fortgeführt werden, bis der Antikörpertiter die gewünschte Aktivitätshöhe erreicht.
Für die Zwecke dieser Erfindung stellt der Antikörpertiter die
Maximalkonzentration an ausgefälltem Protein dar, die sich auf-
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grund der Zugabe verschiedener bekannter Konzentrationen von Antigen zu bestimmten Volumina von Serum, ergibt.
Die Tubocurarin-spezifischen Antikörper können aus den Seren der behandelten Wirtstiere unter Verwendung von in der
Biochemie bekannten Verfahren isoliert werden. Zum Beispiel können die gewünschten Tubocurarin-spezifischen Antikörper
aus den Seren mittels neutraler Salze ausgefällt werden. Für dies.en Zweck geeignete neutrale Salze sind z.B. Natriumsulfat,
Magnesiumsulfat, Natriumhydrogenphosphatgemische oder Ammoniumsulfat. Ammoniumsulfat wird bevorzugt. Gegebenenfalls
können sich der Ausfällung Reinigungsverfahren, wie Dialyse oder Säulenchromatographie, anschliessen. Bei den so erhaltenen
Antikörpern handelt es sich um γ-Globuline mit einem Molekulargewicht
von etwa 160 000. Diese Antikörper reagieren in vorgenannter Weise mit Tubocurarin und Tubocurarin-Antigenen unter
Komplexbildung.
Die spezifischen Antikörper der Erfindung stellen wertvolle Reagentien zum biochemischen Nachweis von Tubocurarinderivaten
in biologischen Flüssigkeiten dar. Ein besonders bevorzugtes Nachweisverfahren besteht in einem Immuno-Ausfällungsverfahren,
das zum Nachweis von Nanogrammengen Tubocurarinderivaten im Serum oder im Urin verwendet werden kann. Bei
diesem Verfahren wird eine bestimmte Menge markiertes Tubocurarinderivat mit dem Tubocurarin-spezifischen Antikörper
und einer Probe, die die unbekannte Menge an Tubocurarinderivat
enthält, vermischt. Die Menge des in der Probe vorhandenen Tubocuarinderivats kann bestimmt werden, indem man das Ausmass
der konkurrierenden Inhibierung beobachtet, die zwischen der Bindung des markierten Tubocurarinderivats und des Tubocurarinderivats
aus der Probe mit dem Tubocurarin-spezifischen Antikörper stattfindet und anschliessend die Menge des Tubocurarinderivats
in der Probe aus einer Standardkurve berechnet.
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Für diesen Zweck geeignete Tubocurarinderivate sind Isotopen-markierte Tubocurarinderivate,«insbesondere Tritium-
und C-markierte, sowie mit einer El< gruppe markierte Tubocurarinderivate.
und C-markierte, sowie mit einer Elektronenspinresonanz-
Beispiele für die Verwendung verschiedener Elektronenspinresonanz-markierter
Moleküle in biochemischen Analysenverfahren sind in den US-Patentschriften 3 453 288, 3 481 952 und
3 507 876 beschrieben.
Die neuen Antigene und Antikörper der Erfindung können in Verbindung mit üblichen Zusatzstoffen, Puffern, Stabilisatoren,
Verdünnungsmitteln oder in Verbindung mit anderen physiologisch aktiven Stoffen verwendet werden. Die Herstellu^
und Verwendung von Gemischen, die Antigene oder Antikörper in Verbindung mit pharmakologisch verträglichen Hilfsstoffen
enthalten, ist bekannt.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele veranschaulicht. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
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Herstellung des Antigens
p-Aminobenzoesäure wird bei 4° in 10 ml IN HCl gelöst.
Eine Lösung von 100 mg Natriumnitrit in 0,5 ml Wasser wird zugefügt. Der Ueberschuss an Natriumnitrit wird durch Zugabe
von 600 mg Ammoniumsulfamat in 1 ml Wasser entfernt. Die Lösung
von diazotierter p-Aminobenzoesäure wird einer Lösung von 50 mg d-Tubocurarinchlorid in 5 ml 90-prozentigem wässrigen
Methanol zugegeben. Der pH-Wert wird auf 10 eingestellt und man lässt das Gemisch während zwei Stunden bei 0 bis 5° reagieren.
Der pH-Wert des Gemisches wird mit O,1N HCl auf 1,5 eingestellt, um den Ueberschuss an p-Aminobenzoesäure zu entfernen.
Das ausgefällte Azo-d-Tubocurarin wird in O,1N Natriumhydroxid
gelöst und die Mischung wird zentrifugiert, um den ueberschuss an d-Tubocurarin zu entfernen. Das Azo-d-Tubocurarin
wir'd mittels einer 4:1 Mischung von Benzol und Methanol extrahiert und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wird
einer Lösung enthaltend 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 100 mg Rinderserumalbumin in 10 ml 0.9-prozentiger Natriumchloridlösung
zugegeben. Die Mischung wird über Nacht bei 4° stehen gelassen und anschliessend gegen eine 0,9-prozentige
Natriumchloridlösung während 3 Tagen dialysiert. Der Rückstand im Dialysator ist Azo-d-Tubocurarin-Rinderserumalbumin-Antigen.
Herstellung des Antikörpers
Neuseeland-Albinokaninchen werden mit 1 ml gemäss Beispiel
1 hergestelltem Azo-d-Tubocurarin-Rinderserumalbuminantigen
immunisiert. Das Antigen wird in eine phosphatgepufferte Salzlösung vom pH-Wert 7,4 gelöst, mit einem gleichen Volumen
von "vollständigem Freund's Hilfsstoff" emulgiert und in die
Fussballen injiziert. Eine zusätzliche Injektion von 100 mg des Antigens im Hilfsstoff wird alle 6 bis 8 Wochen in die
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Fussballen und die Seiten verabreicht.
5 bis 7 Tage nach den zusätzlichen Injektionen wird das Antiserum abgenommen. Das durch Herzpunktierung abgenommene
Blut wird während einer Stunde bei 37° inkubiert und anschliessend über Nacht bei 4° stehen gelassen. Nach 30 Minuten
Zentrifugierung bei 5OOO Upm und 4°, wird das Serum vom
Sediment abgetrennt.
Radioimmunoanalyse
Die Radioimmunoanalyse wird so durchgeführt, dass man
0,1 ml von verschiedenen Verdünnungen von gemäss Beispiel 2 hergestellten Antiseren in Gegenwart von 0,1 ml normalem
Serum von der selben Tierart, 0,18 ml einer Ο,ΟΙΝ phosphatgepufferten
Salzlösung vom pH-Wert 7,2 und 0,025 ml einer Lösung von d-Tubocurarin dimethyl-C -äther iodid (Amershan-Searle,
112 μο/mg), 4500 Impulse/Min, bei 4° über Nacht inkubiert.
Nach der Inkubation werden alle Gläser mit einer neutralen gesättigten Ammoniumsulfatlösung (gleiches Volumen wie das
Brütmedium) versetzt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugierung (5000 Upm) während 15 Minuten bei 4° sedimentiert
und zweimal mit einer 50-prozentigen Ammoniumsixl fat lösung
gewaschen. Der gewaschene Niederschlag, welcher Antikörpergebundenes markiertes d-Tubocurarin enthält, wird in 0,5 ml
eines handelsüblichen lösungsvermittelnden Netzmittels, wie beispielsweise "NCS-solubilizer" gelöst und quantitativ
in ein Flüssigkeits-Szintillationsspektrophotometer (Packard Tri-Carb) überführt und nach Zugabe von 12 ml einer Bray
Szintillationslösung gezählt. Dasjenige Glas, das kein unmarkiertes d-Tubocurarinchlorid enthält, dient als Mass für die
maximale Antikörper-gebundene Radioaktivität. Die Zugabe steigender Mengen von unmarkiertem d-Tuboeurarinchlorid zu
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einer bestimmten Menge an markiertem Material und Antiserum
resultiert in einer konkurrenzierenden Inhibierung des markierten Materials für die Bildung des Antikörper-Hapten-Komplexes.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
nicht-radioaktives, zugesetztes Tubocurarin (Nanogramm) |
Inhibierung der Bindung von d-Tubocurarin dimethyl C^-äther-iodid {%) |
0,25 | 10 |
0,5 | 30 |
1,0 | 36 |
5,0 | 70 |
10,0 | 80 |
Die gleichen Ergebnisse können erhalten werden, wenn man die Radioaktivität der überstehenden Flüssigkeit anstatt
die Radioaktivität, welche im Niederschlag durch den markierten Antikörper verursacht wird, misst.
Die vorgenannten Ergebnisse zeigen deutlich die Empfindlichkeit des Verfahrens.
Es wurden Vergleichsversuche mit anderen Verbindungen
durchgeführt. Dimethyl-d-tubocurarin wird fest an den Antikörper
gebunden. Andererseits werden Verbindungen wie z.B. Acetylcholin, Succinylcholin und Neostigmln, deren Strukturen
derjenigen von Tubocurarin nicht extrem nahe verwand sind, nicht an den Antikörper gebunden.
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Claims (23)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung eines Tubocurarinantigens, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Tubocurarinderivat an den Azorest einer brückenartigen Gruppe der allgemeinen Formel-N=N(CH2)m-Cworin m eine ganze Zahl von O bis 5 ist,kuppelt, wobei die brückenartige Gruppe ihrerseits über eine Peptidbindung an ein immunogenes Trägermaterial, welches bei Injizierung in ein Wirtstier selbständig eine immunogene Reaktion hervorruft, gebunden ist.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die brückenartige Gruppe eine p-Azo-benzoylgruppe ist.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Tubocurarinderivat die d-enantiomere Form besitzt.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass das Tubocurarinderivat d-Tubocurarinchlorid ist.
- 5; Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Material ein Protein ist.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Rinderserumalbumin ist.309837/1157- .15 -
- 7. Verfahren zur Herstellung eines für Tubocurarinspezifischen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, dass ein gemäss Anspruch 1 hergestelltes Tubocurarinantigen in ein Wirtstier über einen gewissen Zeitraum wiederholt injiziert wird, bis ein für das Tubocurarin spezifischer Antikörper in dem Blut vorhanden ist, das Serum gesammelt , der Antikörper aus dem Serum mittels einer neutralen Salzlösung ausfällt und der Antikörper gereinigt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das neutrale Salz Ammoniumsulfat ist.
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung durch Dialyse und Säulenchromatographie erfolgt.
- 10. Verfahren zur Bestimmung eines Tubocurarinderivats in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe zu einer Lösung gibt, die eine bekannte Menge eines markierten Tubocurarinderivats und einen Antikörper enthält, der spezifisch für Tubocurarin ist und aus einem Protein einer γ-Globulin-Fraktion besteht, das eine Vielzahl von Zentren aufweist, die selektiv mit dem Tubocurarinderivat unter Komplexbildung reagieren, die prozentuale Inhibierung der Bindung des markierten Tubocurarinderivats misst und die Menge an in der Probe vorhandenem Tubocurarinderivat bestimmt, indem man den prozentualen Inhibierungswert mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Menge des Tubocurarinderivats zu einem bestimmten Gemisch aus dem markierten Tubocurarinderivat und dem Antikörper erhalten worden ist, und die prozentuale Inhibierung der Bindung für jede bekannte Menge des Tubocurarinderivats bestimmt.309837/1157- 3.6 -
- 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Tubocurarinderivat d-Tubocurarin dimethyl C14-äther-iodid ist.
- 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Tubocurarinderivat d-Tubocurarinchlorid ist.
- 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Messung der prozentualen Inhibierung der Bindung des markierten Tubocurarins mittels Flüsaigkeits-Szintillationszählung vornimmt.
- 14. Antigen bestehend aus einem Tubocurarinderivat, welches an den Azorest einer brückenartigen Gruppe der allgemeinen Formel-N=N ·— - 2 mworin m eine ganze Zahl von 0 bis 5 bedeutet, gekuppelt ist, wobei die brückenartige Gruppe ihrerseits über eine Peptidbindung an ein immunogenes Trägermaterial, welches bei Injizierung in ein Wirtstier selbständig eine immunogene Reaktion hervorruft, gebunden ist.
- 15. Antigen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die brückenartige Gruppe eine p-Azo-benzoylgruppe ist.
- 16. Antigen nach einem der Ansprüche 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Tubocurarinderivat die d-enantiomere Form besitzt.309837/1157
- 17. Antigen nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Tubocurarinderivat d-Tubocurarinchlorid ist.
- 18. Antigen nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Material ein Protein ist.
- 19. Antigen nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Rinderserumalbumin ist.
- 20. Für Tubocurarin spezifischer Antikörper bestehend aus dem Protein einer γ-Globulin-Fraktion, das eine Vielzahl von Zentren aufweist, die selektiv mit einem Tubocurarinderivat und einem Antigen gemäss Anspruch 14 unter Komplexbildung reagieren.
- 21. Antikörper nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein der γ-Globulin-Praktion ein Molekulargewicht von etwa 160 000 aufweist.
- 22. Antikörper nach einem der Ansprüche 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Tubocurarinderivat d-Tubocurarinchlorid und die brückenartige Gruppe eine p-Azo-benzoylgruppe ist.
- 23. Verwendung eines für Tubocurarin spezifischen AntikörpexB gemäss einem der Ansprüche 20 bis 22 in einem Bestimmungsverfahren gemäss einem der Ansprüche 10 bis 13.309837/1157
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0094844A2 (de) * | 1982-05-18 | 1983-11-23 | The Regents Of The University Of California | Arzneimittel-Träger-Konjugate |
EP0094844A3 (de) * | 1982-05-18 | 1984-11-21 | The Regents Of The University Of California | Arzneimittel-Träger-Konjugate |
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