DE2716536C2 - Methadon-Antigene und Verfahren zur Herstellung dieser - Google Patents
Methadon-Antigene und Verfahren zur Herstellung dieserInfo
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Description
worin π 2 oder 3 ist
weiche über die Carboxylgruppe an ein immunogenes Trägermaterial kovalent gebunden ist
2. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immunogene Trägermaterial Rinderserumalbumin
ist
20 3. Antigen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß π 2 ist.
20 3. Antigen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß π 2 ist.
4. Verfahren zur Herstellung eines Antigens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel
CH3 CH3
C2H5-C-C-CH2-CH-N O (D
30 J\ CH2CH2-O —C—(CH2Jn-COOH
35 worin η 2 oder 3 ist,
in Gegenwart eines Kupplungsmittels mit einem immunogenen Trägermaterial umsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsmittel ein Carbodiimid ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsmittel ein Carbodiimid ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Methoden-Antigene und deren Herstellung, welche bei Immunverfahren
zur Bestimmung von Methoden Verwendung finden.
Immun verfahren zur Bestimmung von Methadon sind bereits bekannt. So wird z. B. in der US-Patenschrift
45 38 43 696 ein Enzym-Immunverfahren zur Bestimmung von Methadon beschrieben. In diesem Immunverfahren
wird ein Antikörper, welcher mittels eines Antigens enthaltend die folgende haptenische Gruppe
T Ii
CH3-CH-CH2-C-C-R-CO-
55 N(CH3),
erzeugt wurde, verwendet. In diesem Fall erfolgt die Bindung des Haptens an den immunogenen Träger an dem
60 Ketonende des Moleküls. Der entsprechende Antikörper ergibt leichte Kreuzreaktionen mit dem Methadonme=
tabolit 2-Äthyliden-1 ,S-dimethyl-S.S-diphenylpyrrolidin.
Dieser Nachteil wird mit Hilfe der vorliegenden Erfindung betreffend neue Methadon-Antigene bestehend
aus einer Verbindung der allgemeinen Formel
CH3 CH3
C2H5-C-C-CH2-CH-N O (D
\ Il
J\ CH2CH2-O-C-(CHj)n-COOH
worin π 2 oder 3 ist,
welche über die Carboxylgruppe an ein immunogenes Trägermaterial !covalent gebunden ist, ausgeräumt
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Methadonderivat der allgemeinen Formel
O X/ CH3 CH3
C2H5-C-C-CH2-CH-N
(ID
/\ CH2CH2OH
zur Herstellung von neuen Haptenen der Formel
CH3 CH3
C2H5-C-C-CH2-CH-N O (D
6CH2CH2-O-C-(CHj)n-COOH
40
worin η 2 oder 3 ist,
verwendet.
verwendet.
Die Umsetzung der Verbindungen der Formel II in die Haptene der Formel I erfolgt auf eine zur Herstellung
von Halbestern bekannte Art durch Reaktion eines nieder-Alkandicarbonsäureanhydrids mit der Verbindung
der Formel II. Geeignete nieder-Alkandicarbonsäureanhydride sind das Bernsteinsäureanhydrid (unter Bildung
einer Verbindung der Formel I, worin π 2 ist) und das Glutarsäureanhydrid (unter Bildung einer Verbindung der
Formel I, worin η 3 ist). Die Reaktion erfolgt in einem polaren organischen Lösungsmittel wie beispielsweise
Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Pyridin. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 50 und 12O0C, vorzugsweise
zwischen 100—1100C. In der Regel enthält das Reaktionsgemisch eine Base. Geeignete Basen sind
Triniederalkylamine oder ein Alkoxydsalz enthaltend ein Alkal-metallatom wie beispielsweise Kalium-t-butoxid.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antigens wird das Hapten der Formel I über die Carboxylgruppe
kovalent an ein übliches immunogenes Trägermaterial gebunden.
Der hier verwendete Ausdruck »immunogenes Trägermaterial« umfaßt solche Materialien, die bei ihrer
Injizierung in Wirtstiere selbständig eine immunogene Reaktion im Wirtstier hervorrufen und die mittels einer
kovalenten Bildung an das obige Hapten gekuppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien sind z. B.
Proteine; natürliche oder synthetische polymere Stoffe, wie Polypeptide, z. B. Polylysin und Copolymere von
Aminosäuren; Polysaccharide; und dergleichen. Bevorzugte Trägermaterialien sind Proteine und Polypeptide,
wobei Proteine besonders bevorzugt sind.
Die Art des zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antigens verwendeten Proteins spielt keine besondere
Rolle. Beispiele für bevorzugte Proteine sind Säugetier-Serumproteine, wie menschliches ^-Globulin, menschliches
Serumalbumin, Rinderserumalbumin, methyliertes Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin oder
Rinder-^-Globulin. Es liegt im Vermögen des Fachmannes, weitere geeignete Proteine zu verwenden. Obwohl es
nicht unbedingt notwendig ist, werden im allgemeinen bevorzugt solche Proteine verwendet, die für das mit dem
Antigen zu behandelnde Wirtstier artfremd sind.
Die kovalente Bindung des Haptens an den immunogenen Träger kann auf bekannte Art erfolgen. So kann
z. B. das Hapten vor der Kupplung in eine isolierbare aktivierte Form übergeführt werden. Geeignete aktivierte
Formen sind der N-Hydroxysuccinimidester, der p-Nitrophenylester oder Acylimidazole und dergleichen.
Es können auch Verfahren benützt werden, in welchen es nicht notwendig ist, die aktivierten Zwischenprodukte
zu isolieren. Dies kann z. B. durch Gebrauch des Mischanhydrid-Verfahrens unter Verwendung von EEDQ
(N-Äthoxycarbony!-2-äthoxy-1^-dihydrochinolin) als Kupplungsmittel und dergleichen erreicht werden.
Die Kupplung eines Haptens — als freie Säure oder als aktiviertes Derivat — an ein immunogenes Trägermaterial kann nach den zur Bildung von Amidbindungen bekannten Methoden durchgeführt werden. So kennen z. B. in einer dieser Ausführungsformen das immunogene Trägermaterial und das Kupplungsmittel in einem geeigneten inerten organischen Lösungsmittel gelöst und anschließend das Hapten zugesetzt werden. Die iReaktion wird bei einer Temperatur zwischen ungefähr 0° C und ungefähr 50° C, vorzugsweise bei Raumtempeiratur durchgeführt, obwohl je nach Reagenzien auch niedere oder höhere Temperaturen verwendet werden können.
Die Kupplung eines Haptens — als freie Säure oder als aktiviertes Derivat — an ein immunogenes Trägermaterial kann nach den zur Bildung von Amidbindungen bekannten Methoden durchgeführt werden. So kennen z. B. in einer dieser Ausführungsformen das immunogene Trägermaterial und das Kupplungsmittel in einem geeigneten inerten organischen Lösungsmittel gelöst und anschließend das Hapten zugesetzt werden. Die iReaktion wird bei einer Temperatur zwischen ungefähr 0° C und ungefähr 50° C, vorzugsweise bei Raumtempeiratur durchgeführt, obwohl je nach Reagenzien auch niedere oder höhere Temperaturen verwendet werden können.
Das bei der vorgenannten Reaktion verwendete Kupplungsmittel wird aus den üblicherweise in der organischen
Chemie zur Bildung von Amidbindungen verwendeten Kupplungsmitteln ausgewählt. Eine besonders
geeignete Gruppe von Kupplungsmittel umfaßt die Carbodiimide, insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid oder
]-Äthyl-3-(3-dimethylaminpropyl)-carbodiimid entweder als freie Base oder als Additionssalz einer anorganischen
Säure wie das Hydrochloric!. Das molare Verhältnis von Hapten und Trägermaterial hängt selbstverständlich
von der Art des für die Reaktion ausgewählten Haptens und Trägermaterials ab.
Die Kupplungsreaktion kann unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden. Bei Verwendung von Carbodiimiden
als Kupplungsmittel ist es wünschenswert, die Reaktion in einem leicht sauren Reaktionsmedium, d. h.
in einem Medium mit einem pH-Wert zwischen ungefähr 3 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis >ß, durchzuführen.
Nachdem die Reaktion beendet ist, wird der Oberschuß an Haptenmoieküien durch Dialyse emfemt.
Wie bereits erwähnt wird in einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Antigens erst ein aktiviertes Derivat hergestellt und isoliert, und anschließend diese Verbindung mit dem
Trägermaterial zur Reaktion gebracht. Solche aktivierten Derivate werden mit Vorteil erhalten, wenn man das
Hapten mit einem gewünschten Aktivierungsmittel wie beispielsweise N-Hydroxysuccinimid und einem Kupplungsmittel,
wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, in einem inerten Lösungsmittel umsetzt Die Reaktion wird
üblicherweise bei niedrigen Temperaturen (0—5°C) während 16 bis 30 Stunden fortgesetzt. Das aktivierte
Derivat wird dann nach Filtration des Nebenproduktes Dicyclohexylharnstoff und Abdampfen des Lösungsmittels
isoliert.
Das erhaltene Hapten kann anschließend kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden werden,
indem das aktivierte Derivat und das gewählte Trägermaterial in Kontakt gebracht werden. Besteht z. B. das
aktivierte Hapten aus einem N-Hydroxysuccinimidester und das immunogene Trägermaterial aus Rinderseriumalbumin,
so wird das aktivierte Hapten in einem wasserlöslichen Lösungsmittel gelöst und zu einer wäßrigen
Lösung des Trägermaterials, enthaltend eine Base wie Natriumbicarbonat, gegeben
In einer weiteren Ausführungsform zur Kupplung eines Proteins als immunogenes Trägermaterial an ein
Hapten der Formel I wird die Carboxylgruppe des Haptens ohne Isolierung eines Zwischenproduktes aktiviert,
und das aktivierte Hapten mit dem immunogenen Trägermaterial in Kontakt gebracht. Als Beispiel für ein
derartiges Verfahren gilt die Umsetzung eines Haptens mit Chlorameisensäureisobutylester unter Bildung eines
Mischanhydrids. Das Hapten wird in einem wasserfreien, wasserlöslichen organischen Lösungsmittel wie z. B.
Dioxan oder 1 -Methyl-pyrrolidon gelöst, und die Lösung mit einer äquimolaren Menge an Triäthylamin neutralisiert.
Nach Rühren bei Raumtemperatur wird die Temperatur der Mischung auf zwischen 0° bis 8°C reduziert.
Anschließend wird ein leichter (10%) molarer Überschuß an Isobutylchloroformat zugegeben und das Rühren
fortgesetzt.
In der Zwischenzeit, wird das Protein, z. B. Rinderserumalbumin, in Wasser gelöst und der pH-Wert mit
NaOH auf 9,0 eingestellt. Die Menge an verwendetem Trägermaterial entspricht ungefährt der molaren Menge
an Hapten geteilt durch die theoretische Anzahl an reaktiven Gruppen am Träger. Der Trägermaterial enthaltenden
Lösung wird ein organisches Lösungsmittel zugesetzt und die Mischung wird dann auf 0° bis 8°C
abgekühlt. Schließlich wird diese Lösung dem aktivierten Hapten zugegeben und die Kupplungsreaktion während
einer Zeitdauer, welche zwischen 30 Minuten und einer ganzen Nacht liegt, fortgesetzt.
Die Mischung wird dann dialysiert und das Antigen gewonnen.
Die Mischung wird dann dialysiert und das Antigen gewonnen.
Die Antigene der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Bildung von gegenüber Methoden
und verwandten Verbindungen spezifischen Antikörpern in Wirtstieren tu induzieren, indem man das
Antigen, vorzugsweise unter Zusatz eines Hiifsstoffes, dieun Wirtstieren injiziert. Erhöhte Antikörpertiter
können durch wiederholtes Injizieren über einen gewissen Zeitraum erreicht werden. Geeignete Wirtstiere sind
z. B. Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweine, Ratten, Binder oder Schafe. Die erhaltenen
Antisera enthalten Antikörper, welche selektiv mit Methadon oder mit einem Antigen, welches wie oben
beschrieben aus einem Methadon-Derivat erzeugt wurde, unter Komplexbildung reagieren.
Die so gewonnenen spezifischen Antikörper dienen als Reagenz zur Bestimmung von Methadon. In einem
solchen Nachweisverfahren wird eine bestimmte Menge eines radioaktiv markierten Methadonderivats wie
N-Methyl-N-[l-methyl-3,3-diphenyl]-4-Qxohexyl-aminoäthanolester von Il25-N-3-(4-hydroxyphenyl)-äthylbernsteinsäuremonoamid
oder I125-6-Dimethylamino-4-phenyl-4-(hydroxyphenyl)heptan-3-on mit dem oben erwähnten
Antikörper vermischt, und eine Probe, welche eine gewisse Menge Methadon enthält, wird zugegeben.
Die Menge des in der Probe vorhandenen Methadons kann bestimmt werden, indem man das Ausmaß der
konkurrierenden Inhibierung beobachtet, die zwischen der Bindung des ma-kierten Methadonderivats und des
Methadons aus Jer Probe mit dem spezifischen Antikörper stattfindet und anschließend den erhaltenen Wert
mit einer im voraus aufgestellten Standardkurve vergleicht.
Die Standardkurvt· wird unter Verwendung von bekannten Mengen an Methadon und Bestimmung für jede
dieser Mengen der Inhibierung des Bindens, welche in einer Mischung auftritt, die den spezifischen Antikörper
und das markierte Antigen enthält, aufgestellt. Ein derartiges Nachweisverfahren wird mehr im Detail in der
US-Patentschrift 37 09 868 beschrieben. Die Reagenzien können in beliebiger Reihenfolge zugegeben werden.
Ein besonders bevorzugtes markiertes Methadonderivats ist ll25-6-Dimethylamino-4-phenyl-4-(4-hydroxyphenyl)heptan-3-oin,
weil es selbst bei längerer Lagerung bei Raumtemperatur stabil bleibt.
Die neuen Antigene der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit üblichen Zusatzstoffen, Puffern,
Stabilisatoren, Verdünnungsmitteln oder in Verbindung mit anderen physiologisch aktiven Stoffen, verwendet
werden. Die Herstellung und Verwendung von Gemischen, die Antigene in Verbindung mit pharmakologisch
verträglichen Hilfsstoffen enthalten, sind bekannt.
Die Verbindungen und Zwischenprodukte der vorliegenden Erfindung können als freie Basen oder als
Säureadditionssalze verwendet werden. Geeignete Säureadditionssalze sind Hydrochloride, Hydrobromide,
Sulfate, Nitrate, Phosphate,Trifluoracetate. Oxalate und dergleichen.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele veranschaulicht. Alle Temperaturen sind in Grad
Celsius angegeben.
0,55 g 6-Dimethylamino-4-(4-methoxyphenyl)-4-phenylheptan-3-on, 40 ml Methylenchlorid und 12,1 ml einer
I fttiino vnn RoririhirnmiH Mpthvlpnrhlnrirt /lOQ/niup hanHpUühlirhfi 1 Jtaunr) werden unter Stickstoffatmosnhäre
in einen mit einem Rührer versehenen 100 ml Reaktionskolben eingebracht. Die Mischung wird über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden 30 ml Methanol unter Abkühlen zugegeben. Das nach
Abdampfen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck erhaltene zurückbleibende öl wird mit 7 ml Wasser
behandelt, wobei da:s Rohprodukt auskristallisiert. Nach Filtration und Waschen mit Wasser wird der Feststoff in
Wasser umkristallisiert. Man erhält 0,137 g von 6-Dimethylamino-4-(4-hydroxyphenyl)-4-phenyl-heptan-3-onhydrobromid.
Durch Konzentrierung des wässerigen Filtrats erhält man eine zweite kleine Menge an Produkt
von 20 mg.
In einem Dreihalskolben mit Rührer, Stickstoffzufuhr, Thermometer und Tropftrichter werden 45,5 ml 3N
Äthylmagnesiumchlorid (0.136 Mol) und 54 ml wasserfreier Äther vermischt. Eine Lösung von 10,1 g 4-(N-methyl-N-[2-hydroxyäthyl)amino-2,2-diphenylpentannitril
(0,0328 ml) in 81 ml wasserfreiem Toluol werden langsam zugegeben. Die Reaktion ist leicht exothermisch. Die Reaktionsmischung wird anschließend erhitzt und der
Äther abdestüliert. Wenn die Reaktienstemperatur 100° erreicht hat, wird das Reaktionsgemisch während 8
Stunden unter Rückfluß gerührt.
Anschließend wird tropfenweise eine Menge von 95,5 ml 2N HCl zugegeben. Die Reaktion ist stark exotherm.
Das Reaktionsgemisch wird dann während 1 Stunde unter Rückfluß gerührt. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemisch
in einen Scheidetrichter übergeführt und die wässerigen Schichten entfernt. Die organische Schicht
wird mit 70 ml 2N HCI gewaschen. Die kombinierten wässerigen Schichten werden mit 70 ml Toluol gewaschen.
Der pH-Wert der wässerigen Schicht wird mit konzentriertem NH4OH auf 8 eingestellt und es wird zweimal mit
100 ml Chloroform extrahiert. Der organische Extrakt wird über CaSÜ4 getrocknet, filtriert und konzentriert.
Nach zusätzlicher Konzentrierung unter Hochvakuum wird der Rückstand in absolutes Äthanol aufgenommen
und mit verdünntem wässerigen HBr behandelt. Die Lösung wird bis zu einem braunen öl konzentriert, welches
in absolutem Äthanol aufgenommen wird. Die erhaltene Lösung wird bis zur Hälfte konzentriert und mit
wasserfreiem Äther behandelt bis sie trübe ist. Die Mischung wird in einem Eisschrank aufbewahrt, filtriert und
der Feststoff mit einer Mischung von absolutem Äthanol/wasserfreiem Äther gewaschen. Das erhaltene N-methyl-N-(l-methyI-3,3-diphenyl-4-oxohexyr)aminoäthanol
hydrobromid weist nach dem Trocknen im Hochvakuum über P2O5 einen Schmelzpunkt von 148° auf.
Weitere Mengen an Produkt können aus den Äthanol/Äther-Mutterlaugen durch Mischung mit zusätzlichem
wasserfreiem Äther erhalten werden.
Zu einer Lösung von 210 mg N-methyl-N-(l-methyl-33-diphenyf-4-oxohexyl)aminoäthanol hydrobromid in
5 ml wasserfreiem Pyridin werden 56 mg Kalium-t-butoxid gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur während
15 Minuten werden 200 mg Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt Die Mischung wird auf 100° erhitzt, und bei
dieser Temperatur während 1 Stunde und 45 Minuten gerührt Es wird dann unter reduziertem Druck abgedampft
und der Rückstand an Silicagel chromatographiert Nach Chromatographie an der Kolonne mit Äther,
Äthylacetat und Aceton werden Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthalten mit Aceton/Methanol
(4:1) eluiert Nach Abdampfen erhält man 207 mg von N-methyl-N-(l-methyI-3r3-diphenyl-4-oxohexyl)aminoäthanolmonoester
der Bernsteinsäure als einen farblosen hygroskopischen Feststoff.
Zu einer Lösung von 440 mg N-Methyl-N-(l-methy!-33-diphenyI-4-oxohexyI)aminoäthanoImonoester der
Bernsteinsäure in 5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran werden 162 mg Carbonyldiimidazol zugesetzt Das Reaktionsgemisch
wird während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Anschließend werden 137 mg Tyramin
zugesetzt Nach Rühren während 16 Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung unter reduziertem Druck
abgedampft, und der Rückstand einer Chromatographie an Silicagel unterworfen. Die Kolonne wird mit Äther
und Äther/Äthylacetat (1 :1) eluiert. Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthalten, werden unter
Vakuum abgedampft. Man erhält 379 mg des N-Methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxohexyl)aminoäthanolesters
von N-3-(4-Hydroxyphenyl)äthylbernsteinsäuremonoamid in Form eines farblosen amorphen Feststoffes.
Herstellung des N-Methyl-N-{1 -methyl-3,3-diphenyl-4-oxophenyl)aminoäthanolesters
des Il2S-N-3-(4-hydroxyphenyl)-äthylbemsteinsäuremonoamids
des Il2S-N-3-(4-hydroxyphenyl)-äthylbemsteinsäuremonoamids
ίο 50 μΙ einer Lösung von 1 mg des N-Methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxophenyl)aminoäthanolesters des
N-3-(4-Hydroxyphenyl)äthylbernsteinsäuremonoamids in 1 ml Dimethylsulfoxid werden in einem Fläschchen
enthaltend 5 μό NaI125 mit einer spezifischen Aktivität von 11 — 17 μΟ/π^ zugesetzt. Dieser Mischung werden
dann 40 μΐ einer Chloramin T-Lösung (5 mg/ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird während 5 Minuten in
einem Homogenisator gemischt. Nach gründlichem Mischen werden 40 μΙ einer 10 mg/ml Lösung von Natrium-
!5 metabisulfit dem Reaktionsfläschchen zugesetzt. Schließlich wird das Fläschchen während 2 Minuten in dem
Homogenisator gemischt und die Reaktion gestoppt.
Die Mischung wird aus dem Fläschchen entfernt und in eine kleine Flasche enthaltend 1% menschliches
Albumin in 2 ml Trispuffer vom pH-Wert 6,5 übergeführt. Die Mischung wird dann über die Oberfläche einer
100—220-dioGei-P-2-'Koionne (2,6 χ 4ö cm) gegossen, bis sie völlig νυιϊ dem Material der Kolonne absorbiert
ist. Insgesamt werden 2 ml Trispuffer enthaltend 1% menschliches Albumin auf die Kolonne gegeben und die
Kolonne wird anschließend mit Trispuffer enthaltend 1 % Albumin eluiert. 60 χ 5 ml Fraktionen werden bei einer
Durchflußgeschwindigkeit von 25 ml/Stunde gesammelt. Die Fraktionen 12—18 werden kombiniert und die
erhaltenen kombinierten Eluate enthalten das oben erwähnte Antigen mit einer Radioaktivität von 6,7 μΟ/πιΙ.
Herstellung von Il25-6-Dimethylamino-4-phenyi-4-(4-hydroxyphenyl)heptan-3-on
Das Verfahren gemäß Beispiel 5 wird wiederholt unter Verwendung des Methadonderivats 6-Methylamino-4-phenyl-4-(4-hydroxyphenyl)heptan-3-on
jedoch mit den folgenden Änderungen. Anstatt das Na I125 enthaltende
Reaktionsgemisch in einem Homogenisator zu mischen, wird die Mischung während 90 Sekunden sachte
geschüttelt. Auch nach dem Zusatz von Bisulfit wird die Mischung während 30 Sekunden sachte geschüttelt.
Schließlich werden vor der Säulenchromatographie 2,0 ml O1IM Trispuffer vom pH-Wert 7,0 zugegeben. Das
erhaltene oben erwähnte markierte Antigen wird in den Fraktionen 22—27 erhalten und weist eine Radioaktivitat
von 10,5 μο/ΐη! auf.
Beispiel 7
Herstellung des Immunogens und dessen Anwendung
Herstellung des Immunogens und dessen Anwendung
Zu 40 ml Acetatpuffer (0,05 M, pH 5,5) enthaltend 200 mg Rinderserumalbumin (kristallin) werden 150 mg des
gemäß Beispiel 3 erhaltenen Hemisuccinats zugegeben. 150 mg des wasserlöslichen Äthyi-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorids
werden der Lösung zugesetzt. Anschließend wird bei Raumtemperatur während 24 Stunden kontinuierlich gerührt. Der pH-Wert wird von Zeit zu Zeit überprüft und auf 5,5 gehalten. Die
schließlich erhaltene Lösung wird bei niedriger Temperatur gegen destilliertes Wasser während 3 Tagen
dialysiert Das gemischte Antigen wird aus dem Dialysator gewonnen und auf eine Konzentration von 5—10 mg/
ml an Protein verdünnt Anschließend wird das Antigen mit einem gleichen Volumen von »vollständigem
Freund's Hilfsstoff« emulgiert und während drei Wochen bei Ziegen subkutan injiziert Anschließend wird das
Antigen, emulgiert in einem gleichen Volumen von »unvollständigem Freund's Hilfsstoff«, monatlich injiziert
so Die Injektionen erfolgen an zwei Stellen in einem Volumen von 0,5 ml pro Stelle. Den Tieren wird eine Woche
nach jeder Immunisierung Blut entnommen und die erhaltenen Antisera werden in einem Radioimmunverfahren
zur Bestimmung von Methadon eingesetzt
Anwendungsbeispiel 8
Testprocedere für das I1 M-Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Methadon
Harnproben bedürfen keiner speziellen Behandlung. Die pipettierten Proben müssen frei von großen Partikeln
sein.
Alle Reagenzien werden vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht
Die Pipettierung muß mit Genauigkeit durchgeführt werden.
Die Pipettierung muß mit Genauigkeit durchgeführt werden.
' Qualitativer Test
■ 1) Es wird eine Menge an Teströhrchen, vorzugsweise 10x75 mm Teströhrchen aus Glas, vorbereitet und mit
d! einer Etikette versehen, die für die positive Kontrolle und für die Bestimmung von Methadon in den
unbekannten Harnproben ausreichen. Wegen der Wichtigkeit der Kontrollwerte ist es empfehlenswert, die
positive Kontrolle dreifach durchzuführen.
2) 0,1 ml einer hinsichtlich Methadon positiven Harnkontrollprobe (100 ng/ml) werden jedem der drei Test-
: röhrchen zugegeben.
: ; J) 0,1 ml einer unbekannten Harnprobe wird den restlichen numerierten Teströhrchen zugegeben.
; 4) 0,2 ml Antigen-Testreagenz in Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2, welches 54,000 Impulse/Min ergibt, wer-
den zugesetzt; anschließend wird in einem Homogenisator gründlich gemischt.
5) 0,2 ml Antikörper-Testreagenz in Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Titer von 1/40 enthaltend
50% normales Ziegenserum werden jedem Teströhrchen zugegeben; anschließend wird in einem Homogei'-i
nisator gründlich gemischt.
■', 6) Die Teströhrchen werden bei Raumtemperatur während 1 Stunde inkubiert. ,5
j; 7) 0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung werden jedem Teströhrchen
zum Ausfällen von Globulinen zugegeben; anschließend wird in einem Homogenisator gründlich gemischt.
V 8) Die Teströhrchen werden bis zur vollständigen Ausfällung während mindestens 10 Minuten bei Raumtem-
r: peratur stehengelassen.
\i 9) Es wipd während 10 Minuten unter Verwendung eines Rotors mit beweglich angebrachten Behältern bei
i; ungefähr 1200 bis 2500 χ g oder unter Verwendung eines Rotors mit im fixen Winkel angebrachten Behäl-
r tern bei ungefähr 3500 bis 4000 χ g zentrifugiert. Eine Probe mit beweglich angebrachten Behältern wird
',; bevorzugt.
Ί 10) Aus jedem Teströhrchen werden 0,5 ml an überstehender Flüssigkeit ohne Zerstörung des Niederschlages
v entlang den Wänden und dem Boden dieser Teströhrchen genommen, und in ein Zählfiäschchen zum Zählen
der Gammaszintillation übergeführt (als Alternative wird die Flüssigkeit entfernt und die Impulse des
j, Niederschlags gezählt).
% 11) Für jedes Teströhrchen werden während 1 Minute die Impulse in einem Szintillationszähler gezählt. Das
f Resultat wird in Impulse/Minute (CPM) ausgedrückt.
%
r! Quantitativer Test
-j Das bereits beschriebene Radioimmunverfahren (RIA) zur Bestimmung von Methadon stellt einen qualitati-
\ ven Test dar. Falls ein quantitativer Test gewünscht wird, kann das obige Prozedere so geändert werden, daß an
Ij Stelle der positiven Kontrollen eine Standardkurve tritt.
I Die Standardkurve wird wie folgt erstellt:
I Eine Kontroiiprobe einnähend normalen Harn (0 ng/ml) wird als 0 Punkt der Siar.dardkurve und als Verdün-
^ nungsmittel zur Herstellung der anderen Standardlösungen verwendet. Die hinsichtlich Methadon positive
I Harnprobe enthält 100 ng/ml Methadon und wird als Standard verwendet. Eine 1 : 2 Verdünnung des Standards
I (100 ng/ml) mit der Kontrollprobe enthaltend normalen Harn ergibt eine 50 ng/ml Standardlösung. Eine
i: \ : 4-Verdünnung des Standards (100 ng/ml) mit dem normalen Harn ergibt eine 25 ng/ml Standardlösung.
I 15 Teströhrchen (10 χ 75 mm) aus Glas werden vorbereitet und mit einer Etikette versehen. Zu den Teströhr-
t. chen 1,2 und 3 werden jeweils Kontrollproben mit normalem Harn zugegeben; zu den Teströhrchen 4,5 und 6
werden jeweils 0,1 ml eines Standards enthaltend 25 ng/ml Methadon zugegeben; zu den Teströhrchen 7,8 und 9
werden jeweils 0,1 ml eines Standars enthaltend 50 ng/ml Methadon zugegeben; und zu den Teströhrchen 10,11
und 12 werden jeweils 0,1 ml eines Standards enthaltend 100 ng/ml zugegeben.
Die oben beschriebenen Verfahrensschritte 4 bis 11 werden durchgeführt.
Die Standardkurve wird wie folgt erstellt:
Die K-Achse (senkrecht) entspricht CPM (Impulse/Minute) und die .Y-Achse entspricht ng/ml Methandon. Es
werden Punkte aufgetragen, welche die durchschnittlichen Werte der Impulse pro Minute (CPM) für die drei
Teströhrchen enthaltend normalen menschlichen Harn, für die drei Teströhrchen enthaltend den 25 ng/ml
Standard, für die drei Teströhrchen enthaltend den 50 ng/ml Standard und für die drei Teströhrchen enthaltend
den 100 ng/ml Standard, wiedergegeben. Die Kurve wird so genau wie möglich aufgezeichnet
Zur quantitativen Bestimmung von Methadon werden für jede der untersuchten Testproben die Impulse/Minute
(CPM) gemessen.
Die Menge an Methadon (ng/ml), weiche in der Harnprobe vorhanden ist, kann direkt aus der Standardkurve
abgelesen werden.
Wenn die für die Harnprobe gemessene Menge höher ist als 100 ng/ml, wird die Harnprobe auf 1 :10 und
1 :100 mit normaler Kochsalzlösung verdünnt und der Test wiederholt Wenn die erhaltenen Werte nun in den
Bereich der Standardkurve fallen, muß die Menge in ng/ml mit den entsprechenden Verdünnungsfaktoren
multipliziert werden, um die Konzentration an Methadon im unverdünnten Harn zu ergeben. In manchen Fällen
müssen Harnproben sogar auf 1 :1000 verdünnt werden ehe die erhaltenen CPM-Werte in den Bereich der
Standardkurve fallen.
Auswertung .
Die Impulse pro Minute, welche mit jeder unbekannten Probe oder jedem Standard erhalten werden, sind mit
den durchschnittlichen Werten, die mit den Methadon-positiven Kontrollen gemessen werden, zu vergleichen.
Negative Ergebnisse
Der Test ist negativ in bezug auf die Anwesenheit von Methadon, wenn der CPM-Wert für die unbekannte
Probe kleiner ist als der durchschnittliche CPM Wert für die Methadon-positive Kontrolle.
Positive Ergebnisse
Der Test ist positiv, wenn der CPM-Wert für die unbekannte Probe gleich oder größer ist als der durchschnittliche
CPM-Wert für die Methadon-positive Kontrolle.
Anwendungsbeispiel 9
Das im Anwendungsbeispiel 8 beschriebene Immunverfahren wird zur Bestimmung von Harnproben einer
Anzah! von »normalen Personen« und einer Anzahl von personen, die Methadon erhalten haben, benützt.
15 Tabelle I gibt die Ergebnisse des Methadon-Tests für 100 »normale« Harnproben wieder.
cna'i im Harn von ! 00 »normalen« Personen
20 "
Nr.der Personen Methadon-Aqu'valente, ng/ml
90 0-10
9 10-40
25 1 40-60
Aufgrund dieser Ergebnisse wird ein Signa!, an Methadonäquivalente von 100 ng/ml ausgewählt, um zwischen
einer negativen und einer positiven Harnprobe zu unterscheiden.
In Tabelle 11 sind Ergebnisse des Methadon-Tests mit Personen wiedergegeben die einer klinischen Behand-3Γ
lung mit Methadon unterworfen wurden, und bei welchen eine chemische Analyse die Anwesenheit von Methadon
im Harn bewiesen hat.
35 Methadon-Gehalt im Harn von 118 mit Methadon klinisch
behandelten Personen
Nr.der Personen Methadon-Äquivalente
40 46 > 500
58 200-500
11 100-200
1 50-100
2 < 50
45
45
Bei Auswahl von 100 ng Methadon-Äquivalente pro ml als Grenzpunkt, sind 97% der untersuchten Harnproben
positiv.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Nachweisquote an Methadon-Verbraucher mit dem beschriebenen
Radioimmunverfahren hoch ist.
Claims (1)
- Patentansprüche:
1. Antigen bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen FormelO \/ CH3 CH3ι Τ ι /C2H5-C-C—CH2—CH-N O (DJ CH2CH2-O—C—(CH2Jn-COOH
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