CH627188A5

CH627188A5 -

Info

Publication number: CH627188A5
Application number: CH319877A
Authority: CH
Inventors: Magdalena Usategui Gomez; Harvey Gurien; John Edward Heveran; Manfred Weigele
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1976-10-13
Filing date: 1977-03-15
Publication date: 1981-12-31
Also published as: CA1096774A; DE2716536A1; US4104367A; SE447761B; IT1075387B; NL186116B; DE2716536C2; JPS5350144A; NL186116C; GB1574744A; JPS6316709B2; NL7704093A; SE7704325L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Methadon-Antikörpern sowie deren Verwendung zur Bestimmung von Methadon.

Immunverfahren zur Bestimmung von Methadon sind bereits bekannt. So wird z.B. in der US Patentschrift No. 3 843 696 ein Immunverfahren zur Bestimmung von Methadon, welches auf einer Enzymmultiplikation beruht, beschrieben. In c H3—c H—CH2—c

N(CH3)2

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erzeugt wurde, verwendet. In diesem Fall erfolgt die Bindung des Haptens an den immunogenen Träger an dem Ketonende des Moleküls. Der entsprechende Antikörper ergibt leichte Kreuzreaktionen mit dem Methadonmetabolit 2-Äthyliden-45 l,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidin.

Dieser Nachteil wird mit Hilfe der erfindungsgemäss erhältlichen Methadon-Antikörper behoben.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung von Methadon-Antikörpern. Das Verfahren ist so dadurch gekennzeichnet, dass man ein Antigen bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel

CH3

ch2ch2—o o

II

-G-

■(CH2)n COOH I

worin n 2 oder 3 ist,

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welche über die Carboxylgruppe an ein immunogenes Träger-material kovalent gebunden ist, in ein Wirtstier injiziert und die erhaltenen Antiseren gewinnt.

Im weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der so erhaltenen Antikörper zur Bestimmung von Methadon. Diese Bestimmung ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten Methadonderivates und einem solchen Antikörper vermischt, den Bindungsgrad des markierten Methadonderivates misst und die Menge des in der Probe vorhandenen Methadons bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Mengen des Methadonderivates zu einem definierten Gemisch aus dem markierten Methadonderivat und dem erwähnten Antikörper erhalten worden ist und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des Methadonderivates bestimmt.

Bei der Herstellung der Methadon-Antikörper wird vorzugsweise eine Verbindung der Formel I verwendet, worin n 2 ist.

Die Verbindungen der Formel I sind neu und können durch Überführen eines Methadonderivates der Formel

C2H5 C

ÇH3

-C H-

-N

CH3

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CH2CH2OH

in die Verbindungen der Formel I erhalten werden.

Die Überführung der Verbindung der Formel II in ein Hapten der Formel I erfolgt auf eine zur Herstellung von Halbestern bekannte Weise durch Reaktion eines nieder-Alkandicarbonsäureanhydrids mit der Verbindung der Formel II. Geeignete nieder-Alkandicarbonsäureanhydride sind das Bernsteinsäureanhydrid (unter Bildung einer Verbindung der Formel I, worin n 2 ist) und das Glutarsäureanhydrid (unter Bildung einer Verbindung der Formel I, worin n 3 ist). Die Reaktion erfolgt in einem polaren organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Pyridin. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 50 und 120'C, vorzugsweise zwischen 100-1 IOC. In der Regel enthält das Reaktionsgemisch eine Base. Geeignete Basen sind Triniederalkylamine oder ein Alkoxydsalz enthaltend ein Alkalimetallatom wie beispielsweise Kalium-t-butoxid.

Zur Herstellung des Antigens wird das Hapten der Formel I über die Carboxylgruppe kovalent an ein übliches immunogenes Trägermaterial gebunden.

Der hier verwendete Ausdruck «immunogenes Trägermaterial» umfasst solche Materialien, die bei ihrer Injizierung in Wirtstiere selbständig eine immunogene Reaktion im Wirtstier hervorrufen und die mittels einer kovalenten Bindung an das obige Hapten gekuppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien sind z.B. Proteine; natürliche oder synthetische poly-mere Stoffe, wie Polypeptide, z.B. Polylysin und Copolymere von Aminosäuren; Polysaccharide; und dergleichen. Bevorzugte Trägermaterialien sind Proteine und Polypeptide, wobei Proteine besonders bevorzugt sind.

Die Art des zur Herstellung des Antigens verwendeten Proteins spielt keine besondere Rolle. Beispiele für bevorzugte s Proteine sind Säugetier-Serumproteine, wie menschliches 7-Globulin, menschliches Serumalbumin, Rinderserumalbumin, methyliertes Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin oder Rinder-v-Globulin. Es liegt im Vermögen des Fachmannes, weitere geeignete Proteine zu verwenden. Obwohl es nicht 10 unbedingt notwendig ist, werden im allgemeinen bevorzugt solche Proteine verwendet, die für das mit dem Antigen zu behandelnde Wirtstier artfremd sind.

Die kovalente Bindung des Haptens an den immunogenen Träger kann auf bekannte Art erfolgen. So kann z.B. das 15 Hapten vor der Kupplung in eine isolierbare aktivierte Form übergeführt werden. Geeignete aktivierte Formen sind der N-Hydroxysuccinimidester, der p-Nitrophenylester oder Acylimi-dazole und dergleichen.

20 Es können auch Verfahren benützt werden, in welchen es nicht notwendig ist, die aktivierten Zwischenprodukte zu isolieren. Dies kann z.B. durch Gebrauch des Mischanhydrid-Verfahrens unter Verwendung von EEDQ (N-Äthoxycarbo-nyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin) als Kupplungsmittel und 25 dergleichen erreicht werden.

Die Kupplung eines Haptens - als freie Säure oder als aktiviertes Derivat - an ein immunogenes Trägermaterial kann nach den zur Bildung von Amidbindungen bekannten Methoden durchgeführt werden. So können z.B. in einer dieser Ausführungsformen das immunogene Trägermaterial und das Kupplungsmittel in einem geeigneten inerten organischen Lösungsmittel gelöst und anschliessend das Hapten zugesetzt werden. Die Reaktion wird bei einer Temperatur zwischen ungefähr 0°C und ungefähr 50°C, vorzugsweise bei Raumtem-35 peratur durchgeführt, obwohl je nach Reagenzien auch niedere oder höhere Temperaturen verwendet werden können.

Das bei der vorgenannten Reaktion verwendete Kupplungsmittel wird aus den üblicherweise in der organischen Chemie 40 zur Bildung von Amidbindungen verwendeten Kupplungsmitteln ausgewählt. Eine besonders geeignete Gruppe von Kupplungsmitteln umfasst die Carbodiimide, insbesondere Dicyclo-hexylcarbodiimid oder l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid entweder als freie Base oder als Additionssalz 45 einer anorganischen Säure wie das Hydrochlorid. Das molare Verhältnis von Hapten und Trägermaterial hängt selbstverständlich von der Art des für die Reaktion ausgewählten Haptens und Trägermaterials ab.

Die Kupplungsreaktion kann unter üblichen Bedingungen 50 durchgeführt werden. Bei Verwendung von Carbodiimiden als Kupplungsmittel ist es wünschenswert, die Reaktion in einem leicht sauren Reaktionsmedium, d.h. in einem Medium mit einem pH-Wert zwischen ungefähr 3 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 6,5, durchzuführen. Nachdem die Reaktion beendet ist, ss wird der Überschuss an Haptenmolekülen durch Dialyse entfernt.

Wie bereits erwähnt wird in einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung des Antigens erst ein aktiviertes 60 Derivat hergestellt und isoliert, und anschliessend diese Verbindung mit dem Trägermaterial zur Reaktion gebracht. Solche aktivierten Derivate werden mit Vorteil erhalten, wenn man das Hapten mit einem gewünschten Aktivierungsmittel wie beispielsweise N-Hydroxysuccinimid und einem Kupp-65 lungsmittel, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, in einem inerten Lösungsmittel umsetzt. Die Reaktion wird üblicherweise bei niedrigen Temperaturen (0-5°C) während 16 bis 30 Stunden fortgesetzt. Das aktivierte Derivat wird dann nach Filtra-

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tion des Nebenproduktes Dicyclohèxylharnstdff und Abdampfen des Lösungsmittels isoliert.

Das erhaltene Hapten kann anschliessend kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden werden, indem das aktivierte Derivat und das gewählte Trägermaterial in Kontakt gebracht werden. Besteht z.B-. das-aktivierte Hapten aus einem N-Hydroxysuceinimidester und das immunogene Trägermate-rial aus Rinderserumalbumin, so wird das aktivierte Hapten in einem wasserlöslichen Lösungsmittel gelöst und zu einer wäss-rigen Lösung des Trägermaterials, enthaltend eine Base wie Natriumbicarbonat, gegeben.

In einer weiteren Ausführungsform zur Kupplung eines Proteins als immunogenes Trägermaterial an ein Hapten der Formel I wird die Carboxylgruppe des Haptens ohne Isolierung eines Zwischenproduktes aktiviert, und das aktivierte Hapten mit dem immunogenen Trägermaterial in Kontakt gebracht. Als Beispiel für ein derartiges Verfahren gilt die Umsetzung eines Haptens mit Chlorameisensäureisobutylester unter Bildung eines Mischanhydrids. Das Hapten wird in einem wasserfreien, wasserlöslichen organischen Lösungsmittel wie z.B. Dioxan oder l-Methyl-pyrrolidon gelöst, und die Lösung mit einer äquimolaren Menge an Triäthylamin neutralisiert. Nach Rühren bei Raumtemperatur wird die Temperatur der Mischung auf zwischen 0° bis 8°C reduziert. Anschliessend wird ein leichter (10%) molarer Überschuss an Isobutylchloro-format zugegeben und das Rühren fortgesetzt.

In der Zwischenzeit wird das Protein, z.B. Rinderserumal-bumin, in Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 9,0 eingestellt. Die Menge an verwendetem Trägermaterial entspricht ungefähr der molaren Menge an Hapten geteilt durch die theoretische Anzahl an reaktiven Gruppen am Träger. Der Trägermaterial enthaltenden Lösung wird ein organisches Lösungsmittel zugesetzt und die Mischung wird dann auf 0° bis 8°C abgekühlt. Schliesslich wird diese Lösung dem aktivierten Hapten zugegeben und die Kupplungsreaktion während einer Zeitdauer, welche zwischen 30 Minuten und einer ganzen Nacht liegt, fortgesetzt.

Die Mischung wird dann dialysiert und das Antigen gewonnen.

Die Antigene können verwendet werden, um die Bildung von gegenüber Methadon und verwandten Verbindungen spezifischen Antikörpern in Wirtstieren zu induzieren, indem man das Antigen, vorzugsweise unter Zusatz eines Hilfsstoffes, diesen Wirtstieren injiziert. Erhöhte Antikörpertiter können durch wiederholtes Injizieren über einen gewissen Zeitraum erreicht werden. Geeignete Wirtstiere sind z.B. Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweine, Ratten, Rinder oder Schafe. Die erhaltenen Antisera enthalten Antikörper, welche selektiv mit Methadon oder mit einem Antigen, welches wie oben beschrieben aus einem Methadon-Derivat erzeugt wurde, unter Komplexbildung reagieren.

Die erfindungsgemäss erhältlichen spezifischen Antikörper dienen als Reagenz zur Bestimmung von Methadon. In einem solchen Nachweisverfahren wird eine bestimmte Menge eines radioaktiv markierten Methadonderivats wie N -Methyl-N-[ 1 -methyl-3,3 -diphenyl] -4-oxohexyl-amino-äthanolesters von I125-N-3-(4-hydroxyphenyl)-äthylbern-steinsäuremonoamid oder I125-6-Dimethylamino-4-phenyl-4-(hydroxyphenyl)heptan-3-on mit dem oben erwähnten Antikörper vermischt, und eine Probe, welche eine gewisse Menge Methadon enthält, wird zugegeben. Die Menge des in der Probe vorhandenen Methadons kann bestimmt werden, indem man das Ausmass der konkurrierenden Inhibierung beobachtet, die zwischen der Bindung des markierten Methadonderivats und des Methadons aus der Probe mit dem spezifischen Antikörper stattfindet und anschliessend den erhaltenen Wert mit einer im voraus aufgestellten Standardkurve vergleicht.

Die Standardkurve wird unter Verwendung von bekannten Mengen an Methadon und Bestimmung für jede dieser Mengen der Inhibierung des Bindens, welche in einer Mischung auftritt, die den spezifischen Antikörper und das markierte Antigen enthält, aufgestellt. Ein derartiges Nach weis verfahren wird mehr im Detail in der US Patentschrift No.» 3 709 868 besehrieben. Die Reagenzien können in beliebiger Reihenfolge zugegeben werden.

Ein besonders bevorzugtes markiertes Methadonderivat ist I125-6-Dimethylamino-4-phenyI-4-(4-hydroxyphenyl)-heptan-3-on, weil es selbst bei längerer Lagerung bei Raumtemperatur stabil bleibt.

Die neuen Antigene und die erfindungsgemäss erhältlichen Antikörper können in Verbindung mit üblichen Zusatzstoffen, Puffern, Stabilisatoren, Verdünnungsmitteln oder in Verbindung mit anderen physiologisch aktiven Stoffen, verwendet werden. Die Herstellung und Verwendung von Gemischen, die Antigene oder Antikörper in Verbindung mit pharmakologisch verträglichen Hilfsstoffen enthalten, sind bekannt.

Die Verbindungen und Zwischenprodukte der vorliegenden Erfindung können als freie Basen oder als Säureadditionssalze verwendet werden. Geeignete Säureadditionssalze sind Hydro-chloride, Hydrobromide, Sulfate, Nitrate, Phosphate, Trifluor-aeetate, Oxalate und dergleichen.

Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung von radioaktiv markierten Methadonderivaten, die Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, die erfindungsgemässe Herstellung von Antikörpern gegen Methadon sowie eine Methode zur Bestimmung von Methadon unter Verwendung dieser Antikörper.

Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

Herstellung einer Verbindung der Formel I

0,55 g 6-Dimethylamino-4-(4-methoxyphenyl)-4-phenyl-heptan-3-on, 40 ml Methylenchlorid und 12,1 ml einer Lösung von Borfribromid, Methylenchlorid (10%ige handelsübliche Lösung) werden unter Stiekstoffatmosphäre in einen mit einem Rührer versehenen 100 ml Reaktionskolben eingebracht. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend werden 30 ml Methanol unter Abkühlen zugegeben. Das nach Abdampfen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck erhaltene zurückbleibende öl wird mit 7 ml Wasser behandelt, wobei das Rohprodukt auskristallisiert. Nach Filtration und Waschen mit Wasser wird der Feststoff in Wasser umkristallisiert. Man erhält 0,137 g von 6-Dimethyl-amino-4-(4-hydroxy-phenyl)-4-phenyl-heptan-3-on-hydrobro-mid. Durch Konzentrierung des wässerigen Filtrats erhält man eine zweite kleine Menge an Produkt von 20 mg.

In einem Dreihalskolben mit Rührer, Stickstoffzufuhr, Thermometer und Tropftrichter werden 45,5 ml 3N Äthylma-gnesiumehlorid (0,136 Mol) und 54 ml wasserfreier Äther vermischt. Eine Lösung von 10,1 g 4-(N-methyl-N-[2-hydroxy-äthyl)amino-2,2-diphenylpentannitril (0,0328 ml) in 81 ml wasserfreiem Toluol werden langsam zugegeben. Die Reaktion ist leicht exothermisch. Die Reaktionsmischung wird anschliessend erhitzt und der Äther abdestilliert. Wenn die Reaktionstemperatur 100° erreicht hat, wird das Reaktionsgemisch während 8 Stunden unter Rückfluss gerührt. Anschliessend wird tropfenweise eine Menge von 95,5 ml 2N HCl zugegeben. Die Reaktion ist stark exotherm. Das Reaktionsgemisch wird dann während 1 Stunde unter Rückfluss gerührt. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemiseh in einen Scheidetrichter übergeführt und die wässerigen Schichten entfernt. Die organische Schicht wird mit 70 ml 2N HCl gewaschen. Die kombinierten wässerigen Schichten werden mit 70 ml Toluol gewaschen. Der pH-Wert der wässerigen Schicht wird mit konzentriertem NH4OH auf 8 eingestellt und es wird zweimal mit 100 ml Chloroform extrahiert. Der organische Extrakt

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wird über CaSÜ4 getrocknet, filtriert und konzentriert. Nach zusätzlicher Konzentrierung unter Hochvakuum wird der Rückstand in absolutem Äthanol aufgenommen und mit verdünntem wässerigem HBr behandelt. Die Lösung wird bis zu einem braunen öl konzentriert, welches in absolutem Äthanol aufgenommen wird. Die erhaltene Lösung wird bis zur Hälfte konzentriert und mit wasserfreiem Äther behandelt bis sie trübe ist. Die Mischung wird in einem Eisschrank aufbewahrt, filtriert und der Feststoff mit einer Mischung von absolutem Äthanol/wasserfreiem Äther gewaschen. Das erhaltene N-methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxohexyl) aminoäthanol hydrobromid weist nach dem Trocknen im Hochvakuum über P2O5 einen Schmelzpunkt von 148° auf.

Weitere Mengen an Produkt können aus den Äthanol/ Äther-Mutterlaugen durch Mischung mit zusätzlichem wasserfreiem Äther erhalten werden.

Zu einer Lösung von 210 mg N-methyl-N-(l-methyl-3,3-di-phenyl-4-oxohexyl)aminoäthanol hydrobromid in 5 ml wasserfreiem Pyridin werden 56 mg Kalium-t-butoxid gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur während 15 Minuten werden 200 mg Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt. Die Mischung wird auf 100° erhitzt, und bei dieser Temperatur während 1 Stunde und 45 Minuten gerührt. Es wird dann unter reduziertem Druck abgedampft und der Rückstand an Silicagel chromato-graphiert. Nach Chromatographie an der Kolonne mit Äther, Äthylacetat und Aceton werden Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthalten mit Aceton/Methanol (4:1) eluiert. Nach Abdampfen erhält man 207 mg von N-methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxohexyl)amino-äthanolmonoester der Bernsteinsäure als einen farblosen hygroskopischen Feststoff.

Herstellung von markierten Methadonderivaten A) Herstellung des N-Methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxophenyl)aminoäthanolesters des I125-N-3-(4-hydroxy-phenyl)-äthylbernsteinsäuremonoamids

Zu einer Lösung von 440 mg N-Methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxohexyl)aminoäthanolmonoester der Bernsteinsäure in 5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran werden 162 mg Carbonyl-diimidazol zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend werden 137 mg 4-Hydroxy-phenäthylamin zugesetzt. Nach Rühren während 16 Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand einer Chromatographie an Silicagel unterworfen. Die Kolonne wird mit Äther und Äther/Äthylacetat (1:1) eluiert. Fraktionen, welche das gewünschte Produkt enthalten werden unter Vakuum abgedampft. Man erhält 379 mg des N-Methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxohexyl)aminoäthanol-esters von N-3-(4-Hydroxyphenyl)äthylbernsteinsäuremono-amid in Form eines farblosen amorphen Feststoffes.

50 (il einer Lösung von 1 mg des so erhaltenen N-Methyl-N-(l-methyl-3,3-diphenyl-4-oxophenyl)aminoäthanol-esters des N-3-(4-Hydroxyphenyl)äthylbernsteinsäure-monoamids in 1 ml Dimethylsulfoxid werden in einem Fläsch-chen enthaltend 5 [iCi Nal125 mit einer spezifischen Aktivität von 11-17 (iCi/mg zugesetzt. Dieser Mischung werden dann 40 (J.1 einer Chloramin T-Lösung (5 mg/ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird während 5 Minuten in einem Homogenisator gemischt. Nach gründlichem Mischen werden 40 11I einer 10 mg/ml Lösung von Natriummetabisulfit dem Reak-tionsfläschchen zugesetzt. Schliesslich wird das Fläschchen während 2 Minuten in dem Homogenisator gemischt und die Reaktion gestoppt.

Die Mischung wird aus dem Fläschchen entfernt und in eine kleine Flasche enthaltend 1 % menschliches Albumin in 2 ml Trispuffer vom pH-Wert 6,5 übergeführt. Die Mischung wird dann über die Oberfläche einer 100-220 BioGel P-2 Kolonne

(2,6 X 40 cm) gegossen, bis sie völlig von dem Material der Kolonne absorbiert ist. Insgesamt werden 2 ml Trispuffer enthaltend 1% menschliches Albumin auf die Kolonne gegeben und die Kolonne wird anschliessend mit Trispuffer enthaltend 1 % Albumin eluiert. 60 X 5 ml Fraktionen werden bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 25 ml/Stunde gesammelt. Die Fraktionen 12-18 werden kombiniert und die erhaltenen kombinierten Eluate enthalten das oben erwähnte Antigen mit einer Radioaktivität von 6,7 (xCi/ml.

B) Herstellung von I125-6-Dimethylamino-4-phenyl-4-(4-hydroxyphenyl)heptan-3-on

Das Verfahren gemäss A) wird wiederholt unter Verwendung des Methadonderivats 6-Dimethylamino-4-phenyl-4-(4-hydroxyphenyl)heptan-3-on jedoch mit den folgenden Änderungen. Anstatt das Na I125 enthaltende Reaktionsgemisch in einem Homogenisator zu mischen, wird die Mischung während 90 Sekunden sachte geschüttelt. Auch nach dem Zusatz von Bisulfit wird die Mischung während 30 Sekunden sachte geschüttelt. Schliesslich werden vor der Säulenchromatographie 2,0 ml 0,1M Trispuffer vom pH-Wert 7,0 zugegeben. Das erhaltene oben erwähnte markierte Antigen wird in den Fraktionen 22-27 erhalten und weist eine Radioaktivität von 10,5 uCi/ml auf.

Herstellung eines Antikörpers

Zu 40 ml Acetatpuffer (0,05 M, pH 5,5) enthaltend 200 mg Rinderserumalbumin (kristallin) werden 150 mg des gemäss Beispiel 3 erhaltenen Hemisuccinats zugegeben. 150 mg des wasserlöslichen Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorids werden der Lösung zugesetzt. Anschliessend wird bei Raumtemperatur während 24 Stunden kontinuierlich gerührt. Der pH-Wert wird von Zeit zu Zeit überprüft und auf 5,5 gehalten. Die schliesslich erhaltene Lösung wird bei niedriger Temperatur gegen destilliertes Wasser während 3 Tagen dialysiert. Das gemischte Antigen wird aus dem Dialysator gewonnen und auf eine Konzentration von 5-10 mg/ml an Protein verdünnt. Anschliessend wird das Antigen mit einem gleichen Volumen von «vollständigem Freund's Hilfsstoff» emulgiert und während drei Wochen bei Ziegen subkutan injiziert. Anschliessend wird das Antigen, emulgiert in einem gleichen Volumen von «unvollständigem Freund's Hilfsstoff», monatlich injiziert. Die Injektionen erfolgen an zwei Stellen in einem Volumen von 0,5 ml pro Stelle. Den Tieren wird eine Woche nach jeder Immunisierung Blut entnommen und die erhaltenen Antisera werden in einem Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Methadon eingesetzt.

Bestimmung von Methadon

Harnproben bedürfen keiner speziellen Behandlung. Die pipettierten Proben müssen frei von grossen Partikeln sein.

Alle Reagenzien werden vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht.

Die Pipettierung muss mit Genauigkeit durchgeführt werden.

Qualitativer Test:

1) Es wird eine Menge an Teströhrchen, vorzugsweise 10X75 mm Teströhrchen aus Glas, vorbereitet und mit einer Etikette versehen, die für die positive Kontrolle und für die Bestimmung von Methadon in den unbekannten Harnproben ausreichen. Wegen der Wichtigkeit der Kontrollwerte ist es empfehlenswert, die positive Kontrolle dreifach durchzuführen.

2) 0,1 ml einer hinsichtlich Methadon positiven Harnkontrollprobe (100 ng/ml) werden jedem der drei Teströhrchen zugegeben.

s

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IS

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3) 0,1 ml einer unbekannten Harnprobe wird den restlichen numerierten Teströhrchen zugegeben.

4) 0,2 ml Antigen-Testreagenz in Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2, welches 54,000 Impulse/Min ergibt, werden zugesetzt; anschliessend wird in einem Homogenisator gründlich gemischt.

5) 0,2 ml Antikörper-Testreagenz in Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Titer von 1/40 enthaltend 50% normales Ziegenserum werden jedem Teströhrchen zugegeben; anschliessend wird in einem Homogenisator gründlich gemischt.

6) Die Teströhrchen werden bei Raumtemperatur während 1 Stunde inkubiert.

7) 0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung werden jedem Teströhrchen zum Ausfällen von Globulinen zugegeben; anschliessend wird in einem Homogenisator gründlich gemischt.

8) Die Reströhrchen werden bis zur vollständigen Ausfällung während mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.

9) Es wird während 10 Minuten unter Verwendung eines Rotors mit beweglich angebrachten Behältern bei ungefähr 1200 bis 2500 xg oder unter Verwendung eines Rotors mit im fixen Winkel angebrachten Behältern bei ungefähr 3500 bis 4000 xg zentrifugiert. Eine Probe mit beweglich angebrachten Behältern wird bevorzugt.

10) Aus jedem Teströhrchen werden 0,5 ml an überstehender Flüssigkeit ohne Zerstörung des Niederschlages entlang den Wänden und dem Boden dieser Teströhrchen genommen, und in ein Zahlfläschchen zum Zählen der Gammaszintillation übergeführt (als Alternative wird die Flüssigkeit entfernt und die Impulse des Niederschlags gezählt).

11) Für jedes Teströhrchen werden während 1 Minute die Impulse in einem Szintillationszähler gezählt. Das Resultat wird in Impulse/Minuten (CPM) ausgedrückt.

Quantitativer Test:

Das bereits beschriebene Radioimmunverfahren (RIA) zur Bestimmung von Methadon stellt einen qualitativen Test dar. Falls ein quantitativer Test gewünscht wird, kann das obige Prozedere so geändert werden, dass an Stelle der positiven Kontrollen eine Standardkurve tritt.

Die Standardkurve wird wie folgt erstellt:

Eine Kontrollprobe enthaltend normalen Harn (0 ng/ml) wird als 0 Punkt der Standardkurve und als Verdünnungsmittel zur Herstellung der anderen Standardlösungen verwendet. Die hinsichtlich Methadon positive Harnprobe enthält 100 ng/ml Methadon und wird als Standard verwendet. Eine 1:2 Verdünnung des Standards (100 ng/ml) mit der Kontrollprobe enthaltend normalen Harn ergibt eine 50 ng/ml Standardlösung.

Eine 1:4-Verdünnung des Standards (100 ng/ml) mit dem normalen Harn ergibt eine 25 ng/ml Standardlösung.

15 Teströhrchen (10 X 75 mm) aus Glas werden vorbereitet und mit einer Etikette versehen. Zu den Teströhrchen 1, 2 und 3 werden jeweils Kontrollproben mit normalem Harn zugegeben; zu den Teströhrchen 4, 5 und 6 werden jeweils 0,1 ml eines Standards enthaltend 25 ng/ml Methadon zugegeben; zu den Teströhrchen 7, 8 und 9 werden jeweils 0,1 ml eines Standards enthaltend 50 ng/ml Methadon zugegeben; und zu den

Teströhrchen 10,11 und 12 werden jeweils 0,1 ml eines Standards enthaltend 100 ng/ml zugegeben.

Die oben beschriebenen Verfahrensschritte 4 bis 11 werden durchgeführt.

Die Standardkurve wird wie folgt erstellt:

Die Y-Achse (senkrecht) entspricht CPM (Impulse/Minute) und die X-Achse entspricht ng/ml Methadon. Es werden Punkte aufgetragen, welche die durchschnittlichen Werte der Impulse pro Minute (CPM) für die drei Teströhrchen enthaltend normalen menschlichen Harn, für die drei Teströhrchen enthaltend den 25 ng/ml Standard, für die drei Teströhrchen enthaltend den 50 ng/ml Standard und für die drei Teströhrchen enthaltend den 100 ng/ml Standard, wiedergeben. Die Kurve wird so genau wie möglich aufgezeichnet.

Zur quantitativen Bestimmung von Methadon werden für jede der untersuchten Testproben die Impulse/Minute (CPM) gemessen.

Die Menge an Methadon (ng/ml), welche in der Harnprobe vorhanden ist, kann direkt aus der Standardkurve abgelesen werden.

Wenn die für die Harnprobe gemessene Menge höher ist als 100 ng/ml, wird die Harnprobe auf 1:10 und 1:100 mit normaler Kochsalzlösung verdünnt und der Test wiederholt. Wenn die erhaltenen Werte nun in den Bereich der Standardkurve fallen, muss die Menge in ng/ml mit den entsprechenden Verdünnungsfaktoren multipliziert werden, um die Konzentration an Methadon im unverdünnten Harn zu ergeben. In manchen Fällen müssen Harnproben sogar auf 1:1000 verdünnt werden ehe die erhaltenen CPM-Werte in den Bereich der Standardkurve fallen.

Auswertung:

Die Impulse pro Minute, welche mit jeder unbekannten Probe oder jedem Standard erhalten werden, sind mit den durchschnittlichen Werten, die mit den Methadon-positiven Kontrollen gemessen werden, zu vergleichen.

Negative Ergebnisse:

Der Test ist nagativ in bezug auf die Anwesenheit von Methadon, wenn der CPM-Wert für die unbekannte Probe kleiner ist als der durchschnittliche CPM-Wert für die Metha-don-positive Kontrolle.

Positive Ergebnisse:

Der Test ist positiv, wenn der CPM-Wert für die unbekannte Probe gleich oder grösser ist als der durchschnittliche CPM-Wert für die Methadon-positive Kontrolle.

Praktische Bestimmung von Methadon in Harnproben:

Das beschriebene Immunverfahren wird zur Bestimmung von Harnproben einer Anzahl von «normalen Personen» und einer Anzahl von Personen, die Methadon erhalten haben, benützt.

Tabelle I gibt die Ergebnisse des Methadon-Tests für 100 «normale» Harnproben wieder.

Tabelle I

Methadon-Gehalt im Harn von 100 «normalen» Personen.

No. der Personen

Methadon-Äquivalente ng/ml

90

0-10

9

10-40

1

40-60

Aufgrund dieser Ergebnisse wird ein Spiegel an Methadon-äquivalente von 100 ng/ml ausgewählt, um zwischen einer negativen und einer positiven Harnprobe zu unterscheiden.

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In Tabelle II sind Ergebnisse des Methadon-Tests mit Per- sehe Analyse die Anwesenheit von Methadon im Harn bewiesenen wiedergegeben, die einer klinischen Behandlung mit sen hat.

Methadon unterworfen wurden, und bei welchen eine chemi-

Tabelle II

Methadon-Gehalt im Harn von 118 mit Methadon klinisch behandelten Personen

No. der Personen Methadon-Äquivalente

46 2=500

58 200-500

11 100-200

1 50-100

2 <50

Bei Auswahl von 100 ng Methadon-Äquivalente pro ml als Methadon-Verbraucher mit dem erfindungsgemässen Grenzpunkt, sind 97 % der untersuchten Harnproben positiv. Radioimmunverfahren hoch ist.

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Nachweisquote an

B

Claims

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2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I verwendet, worin n 2 ist.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines Methadon-Antikörpers,

dadurch gekennzeichnet, dass man ein Antigen bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel c—c—ch2-

ch3

■C H-

-N

CH-

O

II

CH2CH2 O C—(CH2)n—COOH I

worin n 2 oder 3 ist,

welche über die Carboxylgruppe an ein immunogenes Trägermaterial kovalent gebunden ist, in ein Wirtstier injiziert und die erhaltenen Antiseren gewinnt,
3. Verwendung eines nach Patentanspruch 1 erhaltenen Antikörpers zur Bestimmung von Methadon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten Methadonderi-vates und einem gemäss Anspruch 1 erhaltenen Antikörper vermischt, den Bindungsgrad des markierten Methadonderiva-tes misst und die Menge des in der Probe vorhandenen Methadons bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Mengen des Methadonderivates zu einem definierten Gemisch aus dem markierten Methadonderivat und dem erwähnten Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des Methadonderivates bestimmt.

diesem Immunverfahren wird ein Antikörper, welcher mittels eines Antigens enthaltend die folgende haptenische Gruppe