DE4329952C1 - Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Pyrethroiden sowie Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die eine hohe Spezifität bzw. Affinität zu einem insektiziden oder pestiziden Wirkstoff aus der Gruppe solcher Pyrethrine und Pyrethroide sowie deren Derivate besitzen, welche in ihrer Funktion als Pestizide einen Phenoxybenzyl- und/oder Cyclopropananteil enthalten. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, in denen als Immunogen ein Konjugat aus einem Hapten und einem immunogenen Carrier verwendet wird, sowie einen Testkit zur Durchführung eines Immunonassays unter Benutzung der monoklonalen Antikörper.

Die Intensivierung und Spezialisierung der Landwirtschaft ist ohne den Einsatz von pflanzenschutzmitteln (Pestizide, d. h.: Herbizide, Insektizide, Fungizide) nicht mehr vorstellbar. Untersuchungen zeigen aber auch, daß Pflanzenschutzmittel und deren Abbauprodukte (Metabolite) nach ihrer Applikation nicht nur in den oberen Bodenschichten festgehalten werden, sondern auch in Grundwasser und Oberflächenwasser gelangen. Die hiermit im Zusammenhang stehenden Umweltbelastungen sind in jüngster Zeit immer häufiger Mittelpunkt der öffentlichen Diskussion. Pestizide müssen biologisch aktive Wirkstoffe enthalten, um die beabsichtigten Effekte (Insektizid, Fraßhemmung) zu erzielen. Mit ihrer Anwendung können Gefährdungen für die Gesundheit des Menschen und die Umwelt verbunden sein. Aus diesem Grund hat der Gesetzgeber für Pestizide, einschließlich toxischer Hauptabbauprodukte, Grenzwerte z. B. für Trinkwasser, Lebensmittel oder am Arbeitsplatz (MAK = Maximale Arbeitsplatz-Konzentration) festgelegt.

Pyrethrum ist das älteste, aus Pflanzen gewonnene bekannte Insektizid und eigentlich ein Gemisch verschiedener insektizider Stoffe, den sog. Pyrethrinen. Hinsichtlich toxikologischer und ökologischer Bedenken gegen z. B. insektizide Phosphorsäureester, Chlorkohlenwasserstoffe (Lindan, PCP, DDT, Toxaphen) oder Carbamate weisen Pyrethrine ein äußerst interessantes Bündel von hochwertigen erwünschten Eigenschaften für den Einsatz als Insektizide auf (Naumann, 1981), was sich auch an ständig steigenden Marktanteilen pyrethrinhaltiger Mittel widerspiegelt. Es gilt vielfach als naturverträgliches und ungiftiges Mittel, jedoch keineswegs als unproblematisch. Pyrethrum wird in der Literatur als für Säuger leicht bis mäßig toxisch eingestuft. Menschen mit regelmäßigem Pyrethrumkontakt können krankhafte Hautreaktionen entwickeln. Durch Zusätze von Stabilisatoren und Synergisten wird der Abbau und der Metabolismus von Pyrethrum verzögert, was zu einem längeren Verbleib der Substanz in der Natur führt. Wirtschaftlich genutzte Insekten, Fische und andere exponierte Lebewesen werden länger belastet. Die schnellere Penetrierbarkeit sowie die langsamere Metabolisierung im Körper von Säugern erhöhen die Toxizität und erzeugen somit ein höheres Gefährdungspotential.

In Anlehnung an natürliche Pyrethrine werden die Pyrethroide synthetisch hergestellt, um für Insekten toxischer, persistenter ("rückstandsaktiver") und damit als Insektizid wirksamer zu sein (Naumann, 1981; Leahey, 1985;). Mehr als 100 Pyrethroide sind heute bekannt. Zum Teil hat ihre Struktur und/oder ihre Wirkungsweise nur noch wenig Ähnlichkeit mit dem natürlichen Muster. Pyrethroide weisen aber auch gegenüber dem Menschen und anderen Lebewesen unerwünschte Wirkungen auf. Ferner besitzen sie ein Bioakkumulationspotential: die Akkumulation im Fettgewebe, in aquatischen Organismen und in Pflanzen deuten auf eine Anreicherung in der Nahrungskette hin. Im menschlichen Gehirn kann dieses chronische Giftwirkungen zur Folge haben. Die Halbwertzeit von Pyrethroiden z. B. im Boden in Abhängigkeit von Wirkstoffart, Formulierung und Bodenart liegt zwischen einer und 60 Wochen. Ferner sind Pyrethroide wie auch Pyrethrine für Insekten unselektiv (bienengiftig) und hochtoxisch für Fische.

Aus den oben aufgeführten Gründen muß es daher als eine vordringliche Aufgabe angesehen werden, bestehende Nachweisverfahren für Pyrethrine bzw. synthetische Pyrethroide sowie für deren Abbauprodukte (Metabolite) zu verbessern. Besonders wünschenswert ist die Entwicklung kostengünstiger, effizienter und leicht handhabbarer Verfahren, die auch außerhalb des Labors unter Feldbedingungen oder im häuslichen Bereich angewendet werden können und die z. B. dem Landwirt, Analytiker, Ökologen, Allergiker, Arzt oder anderen Anwendern schnell und zuverlässig Informationen darüber liefert, ob und in welchem Konzentrationsbereich ein bestimmter Wirkstoff oder Metabolit z. B. in der Nahrung, Luft, im Boden oder Wasser vorkommt. Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Nachweissystem für Insektizide oder Pestizide zur Verfügung zu stellen, welches reproduzierbar, kostengünstig, einfach in der Bedienung, vor Ort anwendbar und schnell in der Auswertung ist.

Derzeit übliche physikalisch-chemisch Analysemethoden (TLC: thin layer chromatography, HPLC: high performance liquid chromatography, GC: gas chromatography, GC-MS: GC-mass spectrometry) für Pyrethrine und Pyrethroide erfordern aufwendige Anreicherungsverfahren, sind kostspielig, zeitaufwendig und nur von spezialisierten Fachkräften in besonders apparativ ausgestatteten Labors durchzuführen. So müssen beispielsweise für die Bestimmung von Pyrethroiden in Bodenproben mittels HPLC vor der Durchführung der eigentlichen chromatographischen Analyse aufwendige Reinigungs- und Konzentrierungsschritte zwischengeschaltet werden. Die GC-MS-Analyse ist aufgrund des geringen Dampfdrucks dieser Verbindungen nur mit erheblichem Aufwand durchführbar. Um diese Nachteile zu vermeiden, werden in jüngster Zeit Verfahren (Immunoassays) entwickelt, wie sie in der klinischen Diagnostik zum Nachweis der verschiedensten Substanzen routinemäßig eingesetzt werden, insbesondere für die quantitative und qualitative Bestimmung von Schadstoffen in Lebensmittel-, BpfdruckWasser- oder Luftproben. So hat man mittlerweile begonnen, immunologische Verfahren für den Nachweis bestimmter Herbizide und Pestizide zu entwickeln (Zusammenfassung bei: Van Emon & Mumma, 1990). Auch für den immunologischen Nachweis von Pyrethroiden sind bereits Verfahren beschrieben (Wing et al., 1978), die jedoch, wie auch die meisten anderen Pestizid-Immunoassays, auf der Verwendung polyklonaler Antiseren beruhen.

Hier setzt die vorliegende Erfindung ein, der die weitere Aufgabe zugrunde liegt, monoklonale Antikörper und diese produzierende Maus-Hybridomazellinien bereitzustellen, die samt immunologischem Verfahren und Testeinheit für den einfachen, spezifischen und empfindlichen Nachweis von Pyrethroiden und/oder Pyrethrinen und deren Metaboliten geeignet sind. Dabei soll der Nachweis standardisierbar und reproduzierbar sein, geringen technischen und materiellen Aufwand erfordern und eine schnelle und qualitative/quantitative Pestizid-Bestimmung ermöglichen.

Immunoassays sind hochempfindliche und selektive serologische Analyseverfahren zur qualitativen/quantitativen Bestimmung von Substanzen auf der Grundlage der immunologischen Antikörper-Antigen Reaktion. Bei den Immunoassays (IA′s) wird eine Komponente der Immunreaktion, entweder das Antigen (Hapten) oder der Antikörper, mit einer leicht nachweisbaren Markierungssubstanz gekoppelt. Bewährt haben sich der Radioimmunoassay (RIA), der Fluoreszenzimmunoassay (FIA) und der Enzymimmunoassay (EIA). In der EP-A 0235000 wird die Möglichkeit der radioaktiven Markierung von Pyrethroiden als Analyt bzw. Tracer für RIA′s beschrieben. Weitere Pyrethroid-RIA-Systeme sind von Wing (1978) beschrieben.

Antikörper werden durch Immunisierung von Labortieren induziert und anschließend mittels herkömmlicher Verfahren isoliert (Harlow & Lane, 1988). Substanzen (Moleküle), die eine spezifische Immunantwort zu induzieren und mit den Produkten dieser Immunatwort zu reagieren vermögen, werden im weitesten Sinne des Wortes als Antigene bezeichnet. Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton sind normalerweise schwache Immunogene. Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 2.000 Dalton können alleine kaum eine Immunantwort auslösen. Sie werden Haptene genannt. Nach dem Stand der Technik werden Substanzen, die nicht antigen sind (Haptene) und gegen die Antikörper erzeugt werden sollen, an ein hochmolekulares, meist lösliches immunogenes Molekül ("Carrier") gebunden und sogenannte Konjugate erzeugt, um damit dann Tiere, z. B. Kaninchen oder Mäuse, zu immunisieren. Bei der Immunisierung mit Hapten-Carrier-Konjugaten werden neben den Hapten-spezifischen Antikörpern auch solche induziert und gebildet, die gegen den Carrier oder das Bindeglied zwischen Carrier und Hapten, oder die nur gegen den Komplex aus Hapten-(Bindeglied)-Carrier gerichtet sind. Über die Methoden der Kopplung von Haptenen an Carrier gibt es eine Reihe etablierter Techniken (Tÿssen, 1985). Die spezifischen Anti-Hapten-Antikörper sind im Regelfall gegen denjenigen Teil das Moleküls gerichtet, der vom Carrier am weitesten entfernt ist.

In der PCT WO 90/10 450 als nächstliegendem Stand der Technik wird eine aufwendige Synthese benutzt, da Pyrethroide wie beispielsweise Permethrin bzw. Phenothrin keine funktionelle Gruppe enthalten, die eine direkte kovalente Kopplung an ein Carrier-Protein ermöglicht. Aus diesem Grund wird in der PCT WO 90/10450 erst das Pyrethroid Phenothrin und davon ausgehend der Phenothrin-Cyclopropandicarbonsäure-monoester synthesiert. Letzteres wird anschließend über die freie Carboxylgruppe des Chrysanthemumsäureanteils des Pyrethroidmoleküls mit einer primären Aminogruppe auf dem Carrier-Protein zur kovalenten Hapten-Carrier-Bindung eingesetzt. Folglich findet eine Bindung von Antikörpern an einem solcherart erzeugten Hapten-Carrier-Konjugat bevorzugt an dem ihm entferntesten Molekülteil, nämlich dem Phenoxybenzyl-Anteil statt. Daher binden Antikörper, die aufgrund des bekannten Antigens isoliert werden, bevorzugt solche Pyrethroide bzw. deren Derivate, die eine Phenoxybenzylgruppe als Epitop (antigengleiche Strukturkomponente) besitzen. Pyrethroide ohne ein solches Epitop werden nicht oder nur lose gebunden.

Um die Anzahl der nachweisbaren Pyrethroide zu erhöhen und gleichzeitig eine höhere Spezifität auch gegen solche Pyrethroide zu erreichen, die in ihrer Struktur dem Hapten unähnlich sind, wobei auch Metabolite der Pyrethroide nachweisbar sein sollen, wird erfindungsgemäß als Hapten ein Metabolit der Pyrethrine und/oder Pyrethroide an den immunogenen Carrier gebunden. Unter einem Metabolit werden in diesem Zusammenhang Strukturmoleküle bzw. -komponenten verstanden, die zur Synthese von Pyrethroiden gebraucht werden, oder während deren Metabolisierung entstehen. Metabolite in diesem Sinne können sich chemisch und/oder toxikologisch von den Pyrethroiden unterscheiden. Man ist nunmehr nicht nur auf die Verwendung von Pyrethroiden oder Pyrethrum als Immunisierungshaptene angewiesen, sondern es können die beiden Grundstrukturkomponenten der Pyrethroide bzw. Pyrethrine (Alkohol- und Säurekomponente), getrennt voneinander für die Hapten-Carrier-Kopplung und für die anschließende Immunisierung bzw. das Screening und die Charakterisierung der induzierten/isolierten Antikörper verwendet werden. Die Anwendung eröffnet die Möglichkeit, Antikörper mit hoher Spezifität auch gegen solche Pyrethroide oder Pyrethrine zu gewinnen, die in ihrer Grundstruktur nur eine der Komponenten zu enthalten brauchen, sowie Antikörper mit hoher Spezifität gegen z. B. Pestizid-Metaboliten zu erhalten, die zumindest eine dieser Komponenten noch als Strukturmerkmale enthalten.

Es hat sich gezeigt, daß eine Bindung der Grundstrukturkomponenten an ein Enzym oder an das Biotin/Streptavidinsystem als Carrier hervorragend als Tracer in den unterschiedlichsten Immunoassays zum Nachweis von Pyrethroiden geeignet sind.

Die Verwendung einzelner Strukturkomponenten zur Erzeugung monoklonaler Antikörper eröffnet die Möglichkeit zur Isolierung eines "Satzes" unterschiedlicher monoklonaler Antikörper, die sich bezüglich ihrer immunologischen Bindung gegenüber den Pyrethroiden/Pyrethrinen unterscheiden, unter Umständen ergänzen. Auf diese Weise ließe sich ein definierter "Cocktail monoklonaler Antikörper" (analog einem polyklonalen Serum) herstellen, mit dem für polyklonale Antikörperseren charakteristischen hohen Empfindlichkeiten (d. h. sehr niedrigen Nachweisgrenzen) und breiteren Selektivität. Das Mischen zu in aufwendigen Verfahren isolierten monoklonalen Antikörpern scheint im ersten Augenblick widersprüchlich. Dennoch können monoklonale Antikörper als sog. "standardisierte Reagenzien" betrachtet werden, wogegen polyklonale Antikörperseren eine in vorliegendem Zusammenhang unerwünschte Variationsbreite besitzen, wie weiter unten erläutert wird. Die hergestellten Antikörper-Cocktails lassen sich somit, durch das Wissen über den Beitrag eines jeden einzelnen Antikörpers in dieser künstlichen Mischung, genau definieren (Burrin & Newman, 1992).

Durch die Kombination ("pooling") hoch-affiner monoklonaler Antikörper gelingt es in einigen Fällen, Testsysteme bzw. Immunoassays mit erweiterten Nachweisgrenzen herzustellen. In Fällen, in denen keine hoch-affinen monoklonalen Antikörper isoliert werden können, kann der Weg über die Kombination einzelner schwach- bis mittel-affiner Antikörper zu einem definierten "polyspezifischen Antikörpergemisch" mit bevorzugter (höherer) Affinität gegenüber einer bestimmten Antigendeterminate führen (Campbell, 1991). Auf diese Weise lassen sich die EIA-Eigenschaften je nach Anforderung individuell über die Konzentration der einzelnen monoklonalen Antikörper steuern.

Antikörper erkennen die dreidimensionale Struktur/Konformation eines Analyten und sind dadurch in der Lage, zwischen optischen Isomeren zu unterscheiden. Diesbezüglich bietet ein Immunoassay oder eine Immun-Affinitätschromatographie die Möglichkeit, selektiv Struktur-Isomere spezifisch anzureichern, zu identifizieren oder zu trennen, was mit klassischen physiko-chemischen Analyseverfahren fast unmöglich ist. Um Antikörper mit den genannten Eigenschaften zu isolieren, wurden die Isomere der Pestizid-Säurekomponente: cis-Permethrinsäure, trans-Permethrinsäure und Phenoxybenzoesäure zur individuellen Hapten-Carrier-Kopplung verwendet und die so gebildeten Hapten-Antigene zur Immunisierung eingesetzt.

Ein weiterer Vorteil in der Verwendung von einzelnen Strukturkomponenten als Haptene (Säure- bzw. Alkoholkomponente) zur Bildung antigener Konjugate besteht in der günstigen Eigenschaft, daß die mit diesen Haptenen erzeugten Antikörper in den sog. Immunoassays eingesetzt werden können, die nach dem Verdrängungsprinzip arbeiten, da bei gleichbleibend hoher Spezifität eine unterschiedliche Affinität gegenüber dem Tracer einerseits und den Analyten andererseits erreicht werden muß.

Die nach bekannten Immunisierungsverfahren gewonnenen Antikörper sind in ihrer Spezifität bzw. Selektivität gegenüber den Strukturkomponenten und den Pestizidmolekülen oder davon abgeleiteten Metaboliten gleichbleibend hoch, jedoch mit unterschiedlicher Affinität. Dadurch kann während der Reaktion der Analyt (Pyrethroid, Pyrethrum oder deren Metabolite) einen markierten Tracer (z. B. einzelne derivatisierte Strukturkomponenten) aus seiner Bindung mit den spezifischen Antikörpern verdrängen. Beim Verwenden von Strukturkomponenten (Säure- bzw. Alkoholanteil) während der Immunisierung der Tiere, bei der experimentellen Durchführung von Tests und bei dem Anwendung des Nachweiskits wird der Umgang und der Verbrauch von Pestiziden erheblich reduziert. Aus diesem und allen anderen vorab genannten Gründen werden bevorzugt die Grundstrukturkomponenten der Pyrethroide bzw. Pyrethrum: cis- bzw. trans-Permethrinsäure und Phenoxybenzoesäure als Hapten zur Immunisierung von Versuchstieren und zur anschließenden Erzeugung polyklonaler bzw. monoklonaler anti-Pestizid-Antikörper eingesetzt. Diese besitzen dadurch eine hohe Spezifität und mittlere bis hohe Affinität gegenüber Pestiziden-/Insektizidenwirkstoffen (z. B. Pyrethrum, Bioallethrin, Allethrin, Phenothrin, Fenfluthrin) d. h. insbesondere Pyrethrum und deren Derivate/Metabolite, hierbei insbesondere die Säurekomponente (Cyclopropancarbonsäure, Permethrinsäure), sowie gegenüber einigen Pyrethroiden, welche diese Strukturkomponenten aufweisen. Man gewinnt Antikörper, die im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit der Alkoholkomponente (Phenoxybenzyl-Alkohol) einiger Pyrethroide bzw. mit diesem Metaboliten selber, und mit solchen Pyrethroiden, die kein Cyclopropancarbonsäure-Derivat als Strukturkomponente enthalten, aufweisen. Besondere Merkmale bei der Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hilfe der erfindungsgemäßen Hapten-Konjugate sind darin zu sehen, daß die mittels dieser gewonnenen Hybridomazellinien, oder Klone bzw. Subklone davon, die entsprechenden Antikörper produzieren bzw. synthetisieren und vorzugsweise in das umgebende Medium sezernieren.

Monoklonale Antikörper (mAk), die mittlerweile gegen eine Vielzahl von Antigenen hergestellt wurden, sind in erster Linie in der medizinischen Diagnostik gut etabliert. Die Vorteile monoklonaler Antikörper gegenüber denjenigen, die man aus Antiseren konventionell immunisierter Tiere erhält, sind zahlreich: a) monoklonale Antikörper können in großer Menge und in hohem Reinheitsgrad erhalten werden; b) die Herstellung monoklonaler Antikörper ist homogen im Hinblick auf die Antigen-Reaktivität und ändert sich auch nicht im Verlauf der Zeit; c) mAk produzierende Hybridoma-Zellen können über Jahre und Jahrzehnte hinweg aufbewahrt werden, ohne dabei ihre spezifischen Eigenschaften zu verlieren; d) mAk sind für die Verwendung als Standardreagenzien besser geeignet als polyklonale Antiseren, da letztere negativ beeinflußt werden durch eine große Variationsbreite z. B. im Hinblick auf die Blutentnahme immunisierter Tiere, eine ständige Verfügbarkeit von Material für zusätzliche Immunisierungen und die begrenzte Lebenszeit der Donanten. Die in vitro-Kultivierung der erfindungsgemäßen Hybridoma-Zellen erfolgt in geeigneten Kultivierungsmedien, insbesondere in den üblicherweise verwendeten, standardisierten Kulturmedien wie z. B. Dulbecco′s Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI 1640 oder CG-Medium, die gegebenenfalls durch Zugabe von Säuger-Seren wie z. B. Foetales Kälberserum (FCS) oder durch wachstumsfördernde Zusätze und Spurenelemente ergänzt werden können.

Die Isolierung der monoklonalen Antikörper beinhaltet verschiedene Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und die beispielsweise die Verwendung chromatographischer Methoden wie z. B. Protein-A/Protein-G-Chromatographie beinhalten. Unter dem Begriff "Derivate" monoklonaler Antikörper sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung z. B. Antikörperfragmente zu verstehen, die noch die Spezifität und Affinität für die infrage kommenden Tracer und Analyten besitzen, desweiteren Antikörper, die mit unterschiedlichen Markierungen, exemplarisch in der EP-A 365818 zusammengefaßt, versehen sind. Ebenfalls inbegriffen sind rekombinante Antikörper bzw. Antikörperfragmente, die z. B. mittels DNA-Rekombinationsverfahren in heterologen Organismen kloniert, gentechnisch manipuliert bzw. exprimiert werden.

Besonders gut geeignet sind die derart gewonnenen Antikörper bei ihrer Verwendung in einem der gebräuchlichen Immunoassays zum Nachweis von Pyrethroiden bzw. Pyrethrinen und/oder deren Metabolite/Derivate, sowie zur Differenzierung von einzelnen Pyrethroiden bzw. Pyrethrinen und/oder deren Metabolite/Derivate in Boden-, Luft-, Wasser- und Lebensmittelproben, auf Oberflächen und in Hausstaub sowie in anderem biologischen Material, z. B. in der medizinischen Diagnostik. Die monoklonalen Antikörper können somit in allen bekannten Immunoassays verwendet werden, die auf der spezifischen Bindung zwischen Antigen und dem entsprechenden monoklonalen Antikörper aufbauen. Bevorzugt kommen sie jedoch in kompetitiven- bzw. nichtkompetitiven-EIA-Test z. B.: Fließ-Injektionsverfahren (FIA) und/oder Immunchromatographie (MIDA, vgl. deutsche Patentanmeldung P 42 29 591.2), zum Einsatz.

Die bekannten Testverfahren werden in Form von Test-Kits bereitgestellt für die qualitative und quantitative Bestimmung von Pyrethrinen und/oder Pyrethroiden bzw. deren Metabolite oder ihre Strukturkomponenten enthaltenden Abbauprodukte. Neben den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern und/oder deren Derivate, können die Test-Kits auch noch andere monoklonale bzw. polyklonale Antikörper bzw. deren Derivate sowie weitere Zusätze enthalten. Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind Test-Kits, die auf einem der üblicherweise verwendeten Immunoassays basieren, insbesondere aber auf einem Fluoreszenzimmunoassay (FIA) bzw. Enzymimmunoassay (EIA) beruhen.

Testkits für den immunologischen Nachweis von Pyrethrinen/Pyrethroiden, die auf einem Immunoassay (z. B.: ELISA-Test) basieren, enthalten beispielsweise die folgenden Bestandteile:

• a) ein geeignetes Trägermaterial, welches unbeschichtet oder aber mit einem der erfindungsgemäßen Immunkonjugaten, Tracer bzw. Antikörper oder einem Antikörper-Konjugat beschichtet sind,
• b) gefriergetrocknete bzw. konzentrierte Lösungen eines der erfindungsgemäßen Antikörper/Antikörper-Konjugate und/oder eines zweiten Enzym-markierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, der gegen das zu bestimmende Antigen-oder einen das Antigen erkennenden Antikörper gerichtet ist,
• c) Enzymsubstrat in fester oder gelöster Form,
• d) das Antigen (Tracer bzw. Enzym-Konjugat) in fester oder gelöster Form,
• e) Puffer- bzw. Waschlösungen,
• f) Zusätze, die beispielsweise eine unspezifische Adsorption und Aggregation verhindern,
• g) Pipetten, Reaktionsgefäße, Referenzstandards, Eichkurven, Farbtafel.

Trägermaterialien, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, umfassen in erster Linie unlösliche, polymere Materialien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polypropylen, Polyester, Polyacrylnitril, Polyvinylchlorid, Polyacrylamid, Zellulosenitrat, quervernetzte Dextrane, fluorierte Harze, Agarose, quervernetzte Agarose, Polysaccharide. Daneben sind aber auch andere Materialien denkbar, wie z. B. Glas, Glasfasern, Metall, Netzgewebe bzw. Membranen auf Nylonbasis. Die genannten Trägermaterialien dienen der Illustration der vorliegenden Erfindung und sind nicht limitierend. Die zuvor im einzelnen genannten Trägermaterialien können unterschiedlich gestaltet sein und dem Verwendungszweck entsprechend sehr unterschiedliche Formen aufweisen. Diese Formen umfassen z. B. Schalen, Kugeln, Platten, Stäbchen, Streifen, Zellen, Fläschchen, Röhrchen, Säulen, Fasern, Netze, Vliese. Häufige Verwendung bei der Herstellung von Test-Kits finden beispielsweise sog. Mikrotiterplatten oder Reagenzgefäße aus durchsichtigen Plastikmaterial, die unbeschichtet oder aber mit einem der erfindungsgemäßen Antikörper, mit freiem Antigen oder mit einem Antigenkonjugat beschichtet sein können. Weiterhin sind Bestandteil des Testkits Farb- bzw. Signal-erzeugende/gebende Marker oder Indikatoren, mit deren Hilfe es möglich ist, das Vorliegen einer Komplexbildungsreaktion, insbesondere einer Immunreaktion, nachzuweisen, welche bevorzugt zu einem Antigen-Antikörper-Komplex oder aber zu einem Liganden-Rezeptor-Komplex führt, wodurch neben qualitativen möglicherweise auch quantitative Aussagen über das nachzuweisende Antigen möglich sind. Als Marker oder Indikatoren kommen sowohl einzelne Atome als auch Moleküle in Betracht, die entweder direkt oder aber indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt sind und exemplarisch in der EP-A 0365818 beschrieben sind.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert und in den zugehörigen Figuren dargestellt.

Kapitel 1: Konjugatsynthese 1.1 Immunkonjugate: Permethrinsäure- bzw. Phenoxybenzoesäure-Carrier-Konjugate

Mit den Haptenen cis- bzw. trans-Permethrinsäure und Phenoxybenzoesäure wurden wie folgt Immunkonjugate synthetisiert:

1.1.1: Kopplungsreaktion für die cis- bzw. trans-Permethrinsäure als Haften (Tÿssen 1985)

3 × 10^-6 mol (200 mg) "Bovine Serum Albumin" (BSA) in 10 ml H₂O dest. lösen und den pH auf 5,5 einstellen,
anschließend 10^-4 mol (47 mg) N-cyclohexyl-N′-(2 morpholinoethyl)-carbodiimid (CMC) zufügen, 1,5 × 10^-4 mol (31,5 mg) Hapten (cis- bzw. trans-Permethrinsäure) in Dimethylformamid (DMF) lösen und tropfenweise der obigen Lösung zugeben. Dabei den pH-Wert überprüfen und gegebenenfalls neu einstellen,
15 Minuten nach Beendigung der Haptenzugabe 5 × 10^-5 mol (21 mg) CMC zusetzen und die Lösung ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur rühren,
anschließend wird die Lösung 48 Stunden gegen H₂O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-BSA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20°C gelagert.

1.1.2: Kopplungsreaktion für die Phenoxybenzoesäure als Haften (Goodfriend et al., 1964)

3 × 10^-6 mol (200 mg) BSA in 10 ml H₂O dest. lösen und den pH auf 5,5 einstellen,
anschließend 2 × 10^-4 mol (93 mg) N-cyclohexyl-N′(2 morpholinoethyl)-carbodiimid (CMC) zufügen,
3 × 10⁻⁴ mol (64 mg) Hapten (Phenoxybenzoesäure) in Dimethylformamid (DMF) lösen und tropfenweise der obigen Lösung unter Rühren zugeben. Dabei den pH-Wert überprüfen und gegebenenfalls neu einstellen,
15 Minuten nach Beendigung der Haptenzugabe 5 × 10⁻⁴ mol (42 mg) CMC zusetzen und die Lösung ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur rühren,
anschließend wird die Lösung 48 Stunden gegen H₂O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-BSA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20°C gelagert.

Um prüfen zu können, ob die Immunkonjugate in der Lage sind, Antikörper gegen cis-/trans Permethrinsäure-Konjugat induziert zu haben, sind Testkonjugate erforderlich, die sich im Typ des Carriers unterscheiden, und die auch unterschiedliche Kopplungsmoleküle benutzen. Wenn im Immunkonjugat als Carrier BSA und als Kopplungsmolekül CMC verwendet wurde, ist für das Testkonjugat ein anderes Albumin, beispielsweise Ovalbumin (OVA), und als Kopplungsmolekül DCC und NHS zu wählen. Dadurch wird ausgeschlossen, daß bei einem Test auf Antikörper positive Resultate infolge der Bildung von Antikörpern gegen den Carrier oder das Bindungsmolekül erzielt werden.

1.2: Testkonjugate: Permethrinsäure- bzw. Phenoxybenzoesäure-Carrier Konjugate (Märtlbauer und Terplan, 1987)

In getrennten Ansätzen werden je 3 × 10⁻⁴ mol Hapten (cis- bzw. trans-Permethrinsäure = je 62 mg, und Phenoxybenzoesäure = 64 mg) eingewogen, anschließend zusammen mit 3 × 10⁻³ mol (620 mg) N,N′-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 1,5 × 10⁻³ mol (173 mg) N′-hydroxysuccinimid (NHS) in wasserfreiem DMF lösen und 18 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren,
3 × 10⁻⁶ mol (132 mg) OVA in 7 ml 130 mM NaHCO₃ lösen,
obiges Reaktionsgemisch und die OVA-Lösung langsam vermischen,
anschließend weitere 3 Stunden unter Rühren inkubieren,
danach wird die Lösung 48 Stunden gegen H₂O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-OVA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20° gelagert.

Die Bestimmung der Haptendichte (Tab.: 1.1) je Molekül Träger- bzw. Carrier-Protein erfolgte bei den Permethrinsäure-Konjugaten mit Hilfe der Chlor-Elementaranalyse (Fa. Ilse Beetz, Kronach, B.R.D.) Die Phenoxybenzoesäure-Konjugate der CMC-Kopplung wurden spektralphotometrisch untersucht.

Tabelle 1.1

Haptendichten:

1.3 Biotin-gekoppelte Konjugate (Tÿssen, 1985)

Es hat sich gezeigt, daß für die Anwendung von Immunoassays geeignete Enzym-markierte Tracer durch eine Biotinylierung der Haptene cis-/trans-Permethrinsäure und Phenoxybenzoesäure gewonnen werden können: Über das bekannte (Strept-)Avidin-Biotin Markierungssystem kann das derivatisierte Hapten mit einem oder mehreren Markierungen oder Indikatoren verbunden werden. So wird das Hapten-Enzym-Konjugat hergestellt, indem über einen Spacer ein reaktiver Biotinester an das Hapten gekoppelt wird. Nach Aktivierung d. h. Veresterung der Haptene mit NHS bzw. DCC (Fig. 3, 4) erfolgt die Umsetzung mit z. B. N-Biotinyl-1,8-diamino-3,6-dioxactan (Biotin-DADOO) zum biotinylierten Hapten (Fig. 5, 6).

Kapitel 2: Die Immunisierung

Die Immunisierung weiblicher, 4 bis 6 Wochen alter BALB/c Mäuse erfolgte nach dem in Tab. 2 angegebenem Immunisierungsschema. Dabei wurde das Konjugat intraperitoneal injiziert. Nach der Erstapplikation wurde das komplette Freund′s Adjuvans durch inkomplettes ersetzt.

Tabelle 2

Immunisierungsprotokoll:

An den Tagen 3, 2 und 1 vor der Milzentnahme erfolgten weitere intraperitoneale Boost-Injektionen mit jeweils 400 Mikrogramm Immunkonjugat in 200 Mikroliter Kochsalzlösung (0,9%). Anschließend wurden die Mäuse getötet und die aus diesen isolierten Milzen portioniert und kryokonserviert bzw. die isolierten Milzzellen mit den Myelomazellen PAI-B3Ag81 (Stocker et al, 1982) fusioniert.

Die Fusion von Milzzellen mit Myelom-Zellen zur Bildung von Hybridomas wird im nachfolgenden Protokoll festgehalten.

Kapitel 3: Fusionsprotokoll

Die Anzucht der Myelom-Zellinie PAI-B3Ag81, bei der es sich um eine Myelom-Zellinie handelt, die selbst keine Antikörper sezerniert und die bei Stocker et al. (1982) beschrieben ist, erfolgte nach bekannten Zellkulturverfahren, wie sie exemplarisch von Lindl & Bauer (1989) bzw. Peters & Baumgarten (1990) beschrieben werden. Die Entnahme der Milz aus den gemäß Kapitel 2 immunisierten BALB/c Mäusen, die Gewinnung der Milzzellsuspension für die Zellfusion und die über Polyethylenglycol vermittelte Fusion der Milzzellen mit den Myelomzellen wurden ebenfalls in Anlehnung an bzw. nach vorgeschriebenen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt (Harlow & Lane, 1988). Nach erfolgter Anzucht der Myelom-Zellinien werden die gewünschten Hybridzellen selektiert.

Kapitel 4: Kultivierung der Hybridzellen

Die Kultivierung und Selektion der gewünschten Hybridomzellen mit Hilfe der HAT- und HT-Selektion erfolgt nach Peters & Baumgarten (1990). Dabei wird am 1. Tag nach der Zellfusion frisches HAT-Medium zu den Zell-Kulturen zugegeben. 3 bis 5 Tage nach der Zellfusion erfolgt eine mikroskopische Kontrolle der fusionierten Zellen. Gleichzeitig erfolgt ein erster Mediumwechsel. Nach weiteren 3 Tagen erfolgt ein erneuter Wechsel des Kulturmediums. Ab dem 7. bzw. 10. Tag nach der Zellfusion werden die Vertiefungen der Zellkulturgefäße nach Hybriden abgesucht und 2 bis 3 mal wöchentlich das Medium erneuert. Nach ca. 2 Wochen kann das HAT-Medium durch HT-Medium ersetzt werden. Der Überstand von gewachsenen Hybridkulturen wird dekantiert und auf das Vorhandensein von Antikörpern getestet (siehe Kapitel 5). Monoklonale Antikörper sezernierende Zellkolonien werden anschließend mit der dem Fachmann bekannten, limitierten Verdünnungsmethode kloniert (Klone).

Es ist zu prüfen, ob die so gewonnen Hybridomklone die gewünschten Antikörper produzieren.

Kapitel 5: Hybridoma-Screening

Hierzu werden die in Kapitel 1.2 beschriebenen Screeningkonjugate eingesetzt. Ferner werden Mikrotiterplatten: "Maxisorp" (Fa. Nunc) verwendet. Das Immunscreening-Verfahren, ein indirekter kompetitiver Immunoassay mit freien Antikörpern, ist schematisch in Fig. 7 dargestellt. Zunächst werden die Mikrotiterplattenvertiefungen jeweils mit 300 Mikroliter Hapten-OVA-Konjugat (10 Mikrogramm/ml Carbonatpuffer) beschichtet (coating). Dieses erfolgt für 15-18 Stunden bei 4°C. Anschließend werden die Vertiefungen dreimal mit z. B. PBS-Tween-20-Puffer gewaschen. Zur Blockierung der unbesetzten Bindungsstellen auf der Mikrotiterplatte werden ca. 300 Mikroliter 0,1%ige OVA-Lösung in jede Vertiefung gegeben. Dieser Ansatz wird für weitere 1 bis 2 Stunden inkubiert, anschließend wie beschrieben wiederum gewaschen. Zur gesicherten Aussage werden zwei getrennte Screening-Verfahren angewendet (Fig. 7):
5.1 Direkter Nachweis von solchen monoklonalen Antikörpern aus den Kulturüberständen gemäß Kapitel 4., die an das Hapten-OVA-Konjugat (Kapitel 1.2) binden.
5.2 Kompetitiver Immunoassay zwischen den in der Festphase gebundenen Hapten-OVA-Konjugaten (Kapitel 1.2) und freiem Antigen in Form einer Lösung aus einem Pyrethroid-Gemisch.

Für den direkten Nachweis (5.1) werden je Mikrotiterplattenvertiefung 100 Mikroliter PBS-Puffer und 100 Mikroliter Zellkulturüberstand (Kapitel 4) eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend erfolgt ein Waschschritt mit PBS-Tween-20-Puffer. Es folgt die dem Fachmann bekannte Inkubation mit Peroxidase-(POD)-konjugierten anti-Maus-Antikörpern mit anschließender Enzym-Substratzugabe und Farbentwicklung. Die Reaktion wird nach 30 min. mit 2N H₂SO₄ gestoppt und spektralphotometrisch ausgewertet. Positive Hybridom-Zellen, die einen spezifischen Antikörper sezernieren, geben ein starkes Farbsignal.

Der direkte Nachweis gibt bei positivem Signal die Gewißheit, daß die Antikörper aus den Kulturüberständen gemäß Kapitel 4 überhaupt in der Lage sind, auf das Testkonjugat, welches einen Strukturanteil der Pyrethroide/Pyrethrum enthält, zu reagieren. Es ist somit gelungen, monoklonale Antikörper herzustellen, welche auf eine Pyrethroid-spezifische Gruppe bzw. auf einen Strukturanteil reagieren. Der direkte Nachweis erlaubt jedoch lediglich die Aussage, ob Antikörper gebildet wurden oder nicht. Es ist keine Unterscheidung bezüglich der Affinität der Antikörper zu einem spezifischen Pyrethroid oder einer Pyrethroid-Gruppe möglich. Hierzu dient der kompetitive Immunoassay nach Kapitel 5.2:
Als Analyt dient eine Lösung eines Gemisches aus Pyrethroid-Substanzen im Überschuß. Für Antikörper, die mit dem Permethrinsäure-Konjugat (Kapitel 1.2) reagieren, besteht das Gemisch aus äquimolaren Mengen beispielsweise an Allethrin, Pyrethrum, Fenfluthrin, Permethrin, Cypermethrin (Fig. 8, MIX-I), und für Antikörper, die spezifisch an das Phenoxybenzoesäure-Konjugat (Kapitel 1.2) binden, besteht das Pyrethroid-Gemisch aus äquimolaren Mengen beispielsweise an Permethrin, Cypermethrin, Cyfluthrin, Deltamethrin und Fenvalerat (Fig. 8, MIX-II).

Es werden hierzu 100 Mikroliter Analyt-Lösung (10 Milligramm/Liter Pyrethroid-Substanz im Gemisch MIX I/II in PBS Puffer) und 100 Mikroliter Kulturüberstand (Kapitel 4) je Mikrotiterplattenvertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Enthält der Zellkulturüberstand für mindestens eine Substanz aus dem jeweiligen Gemisch MIX I/II hochaffine spezifische Antikörper, binden diese an das im Überschuß vorhandene freie Hapten (Pyrethrine/Pyrethroide) und nicht an das in der Festphase gebundene Hapten-Konjugat. Die monoklonalen, an dem Hapten gebundenen Antikörper werden dann im nachfolgenden Waschschritt entfernt. Es folgt die dem Fachmann bekannte Inkubation mit Peroxidase-(POD)-konjugierten anti-Maus-Antikörpern mit anschließender Enzym-Substrat-Zugabe und Farbentwicklung. Nach einer festgelegten Inkubationszeit erfolgt die spektralphotometrische Mikrotiterplatten-Auswertung. Positive Hybridom-Zellen, die einen für das im MIX I/II selektiven Antikörper sezernieren, geben ein schwächeres bzw. kein Farbsignal. Hybridom-Zellen, die Antikörper sezernieren, welche unspezifisch an das Hapten-Konjugat binden, lassen sich durch den Pyrethroid-Überschuß nicht verdrängen und geben ein entsprechendes Farbsignal ab. Sind im Kulturüberstand keine Antikörper vorhanden, kommt es in keinem der beiden Fälle zu einer Farbreaktion.

Für das EIA-Substrat und das EIA-Chromogen wurde folgende Zusammenstellung gewählt:

Substrat: (pH 5,5)

1,25 g/l Na₂HPO₄ × 2H₂O (7 mM)
18,20 g/l NaH₂PO₄ × H₂O (132 mM)
282 mg/l Ureahydrogenperoxide (Aldrich Kat.-Nr. 28,913-2)

Chromogen: (pH 2,6)

288 mg 3,3′, 5,5′Tetramethylbenzidine (Sigma T-2885) in 100 ml DMSO lösen. Auf einen Liter mit H₂O dest. auffüllen. Danach 500 ml Phosphorsäure und 12 mg Penicillin-G zufügen.

Eine Gebrauchsmischung besteht aus 1 Teil Chromogen und 2 Teilen Substrat. Je Vertiefung in der Mikrotiterplatte werden 200 Mikroliter verwendet.

Bei einem doppelt positiven Signal sowohl aus dem direkten Nachweis (Kapitel 5.1) als auch aus dem kompetitiven Immunoassay (Kapitel 5.2) hat man die Gewißheit, daß die im Kulturüberstand (Kapitel 4) erhaltenen Antikörper selektiv auf mindestens eine Substanz aus dem jeweiligen MIX I/II von Pyrethroiden ansprechen. Weiteren Aufschluß über eine spezifische Selektivität/Affinität zu einem einzelnen Pyrethroid erhält man durch entsprechende Untersuchungen zur Kreuzreaktivität (siehe Kapitel 7).

Die bisher geschilderten Verfahrensschritte zur Herstellung und zum Nachweis monoklonaler Antikörper, die auf Pyrethroide empfindlich sind, welche als funktionellen Strukturanteil ein Cyclopropansäure-Derivat und/oder Phenoxybenzoesäure besitzen, kann wie folgt zusammengefaßt werden:

• 1. Synthese von Immunkonjugaten mit cis-/trans-Permethrinsäure, bzw. Phenoxybenzoesäure, an BSA gebunden über CMC, Synthese von Testkonjugaten mit cis-/trans-Permethrinsäure bzw. mit Phenoxybenzoesäure, an OVA gebunden über DCC/NHS,
• 2. Immunisierung einer BALB/c-Maus,
• 3. Die Milzzellen werden mit Myelom-Zellen fusioniert (Hybridome),
• 4. Die Hybridomzellen werden kultiviert und von den übrigen Zellen abgetrennt, indem sie in ein spezifisches Medium gebracht werden, in welchem nur Hybridome überleben können,
• 5. Die auf Pyrethroide spezifisch reagierenden Hybridome werden in mehreren Screening-Testreihen von den übrigen Hybridom-Zellen isoliert.

Die nach Schritt 5. erhaltenen Hybridomzellen werden in Zellkulturen weitervermehrt, und so der monoklonale Antikörper ständig gewonnen.

Die monoklonalen Antikörper können nunmehr eingesetzt werden, um Pestizide/Insektizide nachzuweisen, welche Pyrethroide mit einer funktionalen Gruppe aus Permethrinsäure und/oder Phenoxybenzoesäure enthalten:

Kapitel 6. Pestizid/Insektizid-Nachweis

Der Nachweis von Pyrethrum, Pyrethroiden bzw. deren Derivaten und/oder Metaboliten erfolgt mit Hilfe der in Kapitel 1 beschriebenen Hapten-Screening-Konjugate bzw. Biotin-Tracern, und in Anwendung des in Kapitel 5 beschriebenen kompetitiven Immunoassay (ELISA).

Zunächst soll allgemein der Testablauf an Hand eines kompetitiven Tests beschrieben werden (ELISA = Enzyme linked immuno sorbent assay).

Beim kompetitiven Test findet ein Wettbewerb um Antikörperbindeplätze zwischen einem unmarkierten Analyten unbekannter Menge (hier: Pyrethroid) und einem Tracer (markiertes Hapten) bekannter Menge statt. Der Antikörper ist auf einer festen Phase immobilisiert. Je nach Anteil von Tracer und unmarkierten Analyten in der Probe werden die Antikörperbindestellen mehr oder weniger von Tracer und Analyten belegt. Der Tracer wird durch eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen, so daß das Detektionssignal an der festen Phase umgekehrt proportional zur nachgewiesenen Menge an Analyt ist.

Beim direkt-kompetitiven Test für niedermolekulare Substanzen wie Pyrethroide findet ein Wettbewerb um eine konstante Zahl von Antikörperbindeplätzen zwischen einem unmarkierten Analyten unbekannter Menge (hier: Pyrethroid) und einem Tracer (markiertes Hapten) bekannter Menge statt. Der Antikörper ist auf einer Festphase immobilisiert. Je nach Anteil an unmarkiertem Analyten in der Probe werden die Antikörperbindeplätze mehr oder weniger von Tracer oder Analyten belegt. Der Tracer wird durch eine Farbreaktion nachgewiesen, so daß das Detektionssignal an der festen Phase umgekehrt proportional zur nachgewiesenen Menge an Analyt ist. Die Farbentwicklung wird spektrophotometrisch bei einer festgelegten Wellenlänge erfaßt. Die zu benutzende Wellenlänge hängt vom Substrat und dem Chromogen ab. Bei der hier verwendeten Zusammenstellung (vgl. Kapitel 5.2) beträgt sie 450 nm. Mehrere zu untersuchende Proben werden unterschiedlich verdünnt. Die Verdünnungen der einzelnen Proben werden so gewählt, daß man ohne Zugabe eines Analyten (d. h. ohne Inhibitor = Bo) Absorptionswerte in einem Bereich beispielsweise zwischen 0,7 und 1,0 erhält. Für die Kontrolle (beispielsweise ohne Antikörper oder ohne Enzyme) ergeben sich Absorptionswerte kleiner 0,005. Die Proben werden in dreifacher Ausfertigung bestimmt. Zur Ermittlung der in einer Probe enthaltenen Menge an Pyrethrinen/Pyrethroiden (Analyt) wird zunächst eine Eichkurve erstellt, wobei B/Bo × 100 gegen die Konzentration an Inhibitor aufgetragen wird (B/Bo: Enzymtracerbindung in Gegenwart eines Analyten (B) bekannter Menge im Verhältnis zur Enzymtracerbindung in Abwesenheit eines Analyten (Bo)). Im hier gewählten indirekten kompetitiven Test gibt der Testmittelpunkt (50%B/Bo) diejenige Konzentration des Analyten an, bei der die Antikörperbindung an der Festphase zu 50% (B/Bo-Wert) gehemmt wird. Trägt man B/Bo auf der Y-Achse gegen den Logarithmus der Analytkonzentration auf, ergibt sich ein sigmoider Kuvenverlauf. Der 50% B/Bo-Wert wird anhand Transformation der Werte nach dem logit-log-Verfahren oder dem Vier-Parameter-Verfahren berechnet (Rodbard, 1978; Rodgers, 1984).

Für die Durchführung eines kompetitiven Immunoassays (ELISA) kann ein Testkit zusammengestellt werden, wie er beispielsweise in der älteren, auf den Namen der Anmelderin vorliegender Patentanmeldung beim deutschen Patentamt eingereichten Anmeldung mit dem Aktenzeichen: P 42 29 591.2, angemeldet am 4. Sept. 1992, beschrieben ist.

Der schematische Ablauf eines Immunoassay mit Hilfe eines solchen Testkits ist in Fig. 9 dargestellt. Bei dem beispielhaft beschriebenen Test handelt es sich um einen Verdrängungstest.

Dieser Form des Immunoassays liegt eine Verdrängung eines immobilisierten enzymmarkierten Haptens (Tracer) in der Festphase durch ein nicht markiertes Antigen oder Hapten in der freien Phase (Lösung) zugrunde. Die Verdrängung wird durch die unterschiedlich großen Affinitätskonstanten des enzymmarkierten und des freien Antigens ermöglicht. Bei Messung der Enzymaktivität ähnlich dem o.g. kompetitiven Assay an der festen Phase steht auch hier das Detektionssignal in umgekehrt proportionalem Verhältnis zur Menge des Analyten in der Probe.

Die Antikörper werden als gepufferte Lösung (geeigneterweise 1 mg/ml) strichförmig auf die zu verwendende Membran aufgetragen. Hierfür geeignet ist z. B. der Linomat IV (Fa. Camag). Dies ergibt typischerweise 0.5 Mikrogramm Protein pro Membranteststreifen. Anschließend wird die Membran an der Luft bei Raumtemperatur (ca. 22-25°C) getrocknet. Die von den Antikörpern nicht besetzten noch freien Bindeplätze auf dem Teststreifen werden durch Inkubation der Membran in Absättigungsreagenzen blockiert.

Bekannte Absättigungsreagenzien sind z. B.: 3 bis 5% (v/v) Pferdeserum (HSA) in Phosphat gepufferter Lösung (PBS); 0.25% (w/v) Casein (Fa. Merck) + 0.1% (v/v) Triton X-100 (Fa. Rohm & Haas) in PBS.

Nach dem Absättigungsschritt folgt ein Waschschritt mit 0.1% (v/v) Tween 20 (Fa. Merck) in PBS Lösung, um überschüssiges Absättigungsreagenz zu entfernen. Es folgt die Inkubation mit dem nach Kapitel 1.3 hergestellten Tracer, der im Verhältnis zu den immobilisierten Antikörpern im Überschuß dazu gegeben wird, um alle möglichen Antikörper-Bindeplätze abzusättigen. Anschließend erfolgt wie vorher b%schrieben ein weiterer Waschschritt in Tween/PBvon den AnDanach kann der Teststreifen getrocknet, oder wie in der P 4229591.2 beschrieben unmittelbar für einen Pyrethroid- bzw. Pyrethrin-MIDA-Test eingesetzt werden (Fig. 9). Dazu wird der vorbereitete Teststreifen in einer Halterung eingesetzt. Teststreifen und Halterung werden dann z. B. im Deckel der als Glasbehälter ausgebildeten Testeinheit plaziert. Anschließend wird die Lösung mit dem Analyten (die das Insektizid enthaltende Probe) in das Probengefäß überführt. Im Probengefäß befindet sich zusätzlich eine definierte Menge z. B. an Avidin-, bevorzugt Streptavidin-Enzym-Konjugat. Der Teststreifen wird nun so in das Probengefäß eingesetzt, daß der untere Rand des Streifens in die Probe eintaucht. Durch den stattfindenden kapillaren Flüssigkeitstransport werden die Substanzen im Probengefäß über bzw. durch die Membrane geleitet. Dabei kommt es an der vorgesehenen Stelle zur Verdrängungsreaktion zwischen Tracer und Analyt. Nach einer vorgegebenen Zeit, oder wenn die gesamte Probenflüssigkeit aufgesogen ist, wird der Membranstreifen aus dem Probengefäß entnommen und z. B. unter einem Wasserhahn oder mit einer Laborspritzflasche abgespült. Anschließend wird der Teststreifen in ein zweites Gefäß (Substratgefäß) überführt, welches den Substratpuffer in wäßriger Lösung oder die entsprechenden Substanzen in lyophilisierter Form enthält. Im Falle von lyophilisierten Substanzen werden diese zuvor mit einer vorgeschriebenen Menge z. B. Wasser rehydratisiert. Die Substratpuffer sind dabei immer auf das entsprechende Enzym-Konjugat abgestimmt. Beispielhaft ist hier die Zusammensetzung für die alkalische Phosphatase aufgeführt:

Substratpuffer

0.1 mol/l NaHCO₃
0.001 mol/l MgCl₂
0.70 mmol/l NBT
0.30 mmol/l BCIP:
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat­ dinatriumsalz;
(Stammlösung in Dimethylformamid = DMF)
NBT: 2,2′-di-p-nitrophenyl-5,5′ diphenyl-3,3′-(3,3′-dimethoxy-4, 4′-diphenyl)-ditetrazoliumchlorid.

Nach einer festgelegten Reaktionszeit (z. B. 1 bis 2 Minuten) wird die Reaktion durch Spülen des Teststreifens mit Wasser gestoppt und die erzielte Verfärbung mit einer Farbskala zwecks Auswertung verglichen. Eine intensive Färbung zeigt an, daß in der Probe kein Pestizid bzw. für diesen Test unterhalb der Nachweisgrenze, vorhanden ist, folglich keine nachweisbare Tracer-Verdrängung stattgefunden hat. Keine Farbentwicklung zeigt eine vollständige Verdrängung des Tracers und somit einen hohen Gehalt an Pestizid in der Probenlösung an. Mögliche Zwischenstufen der Verfärbung sind ein Maß für die Analytkonzentration in der Probe. In diesem Beispiel ist die Farbintensität umgekehrt proportional zur gemessenen Analytkonzentration. Weitere Ausführungsformen oder Typen des MIDA-Test bzw. Testkits, die für den Nachweis von Pyrethroiden bzw. Pyrethrinen und deren Derivate möglich sind sowie die Beschreibung zum Einsatz als Multianalyteinheit, werden exemplarisch in der P 4229591.2 beschrieben.

Kapitel 7: Kreuzreaktivität

Die Qualität und Spezifität der hergestellten monoklonalen Antikörper soll im folgenden als Ergebnisprotokoll von durchgeführten Untersuchungen dargestellt werden:

Bereits wenige Tage nach der erfolgten Zellfusion zwischen den Myelomazellen und den Milzzellen der Mäuse, die zuvor mit dem in Kapitel 1.1 beschriebenen Hapten-Immunkonjugaten: cis- bzw. trans-Permethrinsäure oder Phenoxybenzoesäure getrennt immunisiert wurden, lassen sich in den Vertiefungen der Kulturgefäße proliferierende Zellkolonien nachweisen. Das Hybridoma-Screening erfolgte wie in Kapitel 5 beschrieben. So wurden beispielsweise nach der Immunisierung mit trans-Permethrinsäure-Konjugat und der Fusion von Milzzellen mit Myelomzellen 15 Aussaatplatten à 96 Vertiefungen untersucht. 30 Zellkolonien produzieren dabei monoklonale Antikörper, wobei letztlich 4 Zellkolonien nach dem beschriebenen Testverfahren monoklonale Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften synthetisieren. Diese Antikörper gehören in die IgGl Subklasse. Die auf diese Art und Weise gewonnenen monoklonalen Antikörper können aufgrund ihrer Kreuzreaktivitäten, die im ELISA-Test bestimmt werden, in 2 Gruppen unterteilt werden. In der ersten Gruppe (vertreten durch mAk der Myelom Zellinie 3/B4-1/F8) ist die Kreuzreaktivität auf natürliche Pyrethrine und synthetische Pyrethroide beschränkt. Ferner ist eine unterschiedliche Selektivität gegenüber den Isomeren-Permethrinsäure-Haptenen unter Anwendung des bekannten Tüpfeltest (dot-immuno-binding-assay) festzustellen. Die isolierten monoklonalen Antikörper besitzen eine deutlich höhere Affinität zu dem trans-PMS-Hapten-Immunokonjugat als zu cis-PMS-Hapten-Konjugaten (PMS = Permethrinsäure). Die zweite Gruppe (vertreten durch mAk der Myelom-Zellinie 1/E2-5/B5) kennzeichnet die Selektivität gegenüber Allethrin, Ben-PermethrinsäuPhenothrin. Die hierbei auftretenden Kreuzreaktivitäten gegenüber anderen Pyrethroiden sind vernachlässigbar gering. Die unteren Nachweisgrenzen für Pyrethrine/Pyretrhoide liegen im Bereich zwischen 10 und 80 ng/ml Puffer. Die entsprechenden 50%B/Bo-Werte liegen zwischen 40 und 400 ng/ml.

In beiden Gruppen tritt keine Kreuzreaktivität mit dem Phenoxybenzoesäure-Hapten-Konjugat (PBZ) oder mit Pyrethroiden auf, welche PBZ als einzige Pestizid-charakteristische Strukturkomponente enthalten. Überraschenderweise zeigen die isolierten monoklonalen Antikörper keine bzw. nur eine geringe Kreuzreaktivität gegenüber der freien cis- bzw. trans-Permethrinsäure.

Bei der Verwendung von cis-Permethrinsäure- bzw. PBZ-Immunkonjugaten konnten bisher keine monoklonalen Antikörper isoliert werden, die etwa ein vergleichbares Ausmaß an Kreuzreaktivität oder Hapten-Stereoisomerenspezifität aufweisen.

Die festgestellten Kreuzreaktivitäten sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt:

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und verwendeten Hybridoma-Zellinien werden bei der als Internationale Hinterlegungsstelle anerkannten "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen GmbH" (DSM) in Braunschweig (F.R.G.), entsprechend den geltenden Anforderungen des Budapester Vertrages für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Zellkulturen zum Zweck der Patentierung hinterlegt. Eine Erklärung zur Lebensfähigkeit (Lebensfähigkeitsbescheinigung) der hinter legten Proben (Eingangsnummer) wurde durch die Hinterlegungsstelle ausgefertigt.

Die im Rahmen der Versuchsreihen, Synthesen und Tests verwandten Medien und Puffer werden in der folgenden Tabelle aufgelistet:

Tabelle Medien und Puffer

A) Normalmedium (RPMI 1640):
500 ml RPMI mit Hepes
55 ml FCS
(FCS: Fetal Calf Serum)
5,5 ml 200 mM Glutamin
5,5 ml 10⁻³ M Mercaptoethanol-Lösung

B) HAT-Medium: Stammlösung
10⁻²M Hypoxanthin
10⁻⁵M Aminopterin
10⁻³M Thymidin
von diesen Stammlösungen je 5,5 ml zu 570 ml Normalmedium dazu mischen.

C) HT-Medium: von den o.a. Stammlösungen für Hypoxanthin und Thymidin je 5,5 ml zu 570 ml Normalmedium dazu mischen.

D) Einfriermedium:
70 ml RPMI-Medium ohne Hepes
20 ml FCS
12 ml DMSO
 1 ml 10⁻³ M Mercaptoethanol

E) PBS-Puffer (pH 7,6):
150 mM NaCl
  2 mM Na₂HPO₄
  8 mM NaH ₂PO₄

F) PBS-Tween-20 (0,05%):
0,5 ml Tween-20 + 1000 ml PBS-Puffer (Tween-20: Polyoxyethylensorbitonmonolaurat)

G) Carbonat-Puffer (pH 9,6):
16 mM Na₂CO₃
34 mM NaHCO₃

Zum Stand der Technik werden folgende Fachliteratur und Patentliteratur angegeben:

Fachliteratur

Goodfriend, T.L., Levine, L. & Fasman, G. D. (1964): Antibodies to bardykinin and Angiotensin: a use of carbodiimides in immunology. Science 144, 1344-1346.

Harlow, E. & Lane, D., Hrsg., (1988): Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, USA.

Burrin, J. & Newman, D. (1992): "Production and assessment of antibodies"; In: Principles and practice of imunoassay, (Price, C.P. & Newman, D. Hrsg.), Stockton press, New York, USA.

Campbell, A.M., (1991): "Monoclonal antibody and immunsensor technology"; Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, 23, (van der Vliet, P.C., Hrsg.), Elsevier science publishers B.V., Amsterdam, NL.

Leahey, J.P. Hrsg., (1985): The Pyrethroid Insecticides, Taylor & Francis Ltd. London UK.

Lindl, T. & Bauer, J., Hrsg., (1989): Zell- und Gewebekultur. Einführung in die Grundlagen sowie ausgewählte Methoden und Anwendungen, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, BRD.

Märtlbauer, E. & Terplan, G. (1987): Ein enzymimmunologischer Nachweis von Chloramphenicol in Milch, Archiv f. Lebensmittelhygiene, 38, 1-7.

Naumann, K., (1981): Chemie der synthetischen Pyrethroid-Insektizide, Band 7: Chemie der Pflanzenschutz- und Schädlingsbekämpfungsmittel, (Wegler, R., Hrsg.), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, BRD.

Peters, J. H. & Baumgarten, H., Hrsg. (1990): Monoklonale Antikörper: Herstellung und Charakterisierung, Springer-Verlag, Berlin, BRD.

Rodbard, D. (1978): Data processing for radioimmunoassay: an overview., in: Clinical Immunoassay: cellular basis and applications in disease. (Natelson, Pesce & Dietz., Hrsg.), Am. Assoc. for Clin. Chem., Washington DC, 477-494.

Rodgers, R. P. C. (1984): Data analysis and quality control fo assays: a practical primer, in: Practical Immunoassay, the state of the art (Butt, W. R. Hrsg.), Dekker-Verlag, New York, 253-308.

Stocker, J. W. et al. (1982): Generation of 2 new mouse myeloma cell lines "PAI" and "PAI-O" for hybridoma production. Hoffmann-La Roche Research Disclosure, 21713, 155-157.

Tÿssen, P. (1985): Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Burdon, R. H. & Knippenberg, P. H., Hrsg.), Elsevier, Oxford, UK.

Van Emon, J. M. & Mumma, R. O. Hrsg., (1990): Immunochemical Methods for Environmental Analysis, ACS Symposium series 442, ACS Washington, USA.

Wing, K.D., Hammock, B.D. & Wustner, D.A. (1978): Development of an SBioallethrin specific antibody, J. Agric. Food chem., 26, 1328-1333.

Patentliteratur

PtT WO 90/10450: "Monoclonal antibodies to synthetic pyrethroids and method for detecting the same".

EP-0 235 000 A1: "Pyr´throides marqu´s à l′iode, leur proc´d´ et interm´diaires de pr´paration et leur application aux dosages radioimmunologiques".

EP-0 365 818 A1: "Immunologischer Nachweis von Atrazin und Atrazinderivaten".

P 42 29 591.2: "Immunologisches Verfahren zur Bestimmung eines Analyten".

Im folgenden werden die Fig. 1 bis 9 erläutert:

Fig. 1 Permethrin

Fig. 2 Haptene für die Konjugatsynthese

Fig. 3 Kopplungsreaktion der Haptene mit Succinimid

Fig. 4 Kopplungsreaktion der Haptene mit Carbodiimid

Fig. 5 Biotinylierung von PBZ

Fig. 6 Biotinylierung von Permethrinsäure

Fig. 7 Schematischer Ablauf des Hybridoma-Screening

Fig. 8 Zusammenstellung der Überschußlösungen MIX/MIX II für das Screening nach Fig. 7

Fig. 9 Schematische Darstellung des Pyrethroid-Nachweises mit Hilfe eines Testkits

Fig. 1 stellt die chemische Strukturformel von Permethrin (IR-cis) und Permethrin (IR-trans) dar, von denen die zur Herstellung der Immunkonjugate verwendeten Haptene gemäß Fig. 2 abgeleitet sind. Durch Trennung der Esterbindung des Permethrin entstehen Permethrinsäure und Phenoxybenzylalkohol. Für die nachfolgend beschriebene Carbodiimidkopplung werden freie Carboxylgruppen benötigt, so daß statt des Phenoxybenzylalkohols die Phenoxybenzylsäure (BPZ) zur Haptenkopplung eingesetzt wird. Die Kopplung von Phenoxybenzoesäure bzw. Permethrinsäure erfolgt in zwei Schritten. Der erste Reaktionsschritt besteht in der sog. "Aktivierung" der Carboxylgruppen der freien Säure mit Hilfe von N-Hydroxysuccinimid (Fig. 3) und Dicyclohexylcarbodiimid (Fig. 4) (siehe Kapitel 1.2: Testkonjugate: Carbodiimide verbinden Carboxyl- mit Aminogruppen). Die so aktivierten Säuren ermöglichen nun eine Reaktion zwischen der primären Aminogruppe des N-Biotinyl-1,8-Diaminodioxacctan (Biotin-DADOO) und der aktivierten Carboxylgruppe. Dabei entstehen die "biotinylierte" Phenoxybenzoesäure (Fig. 5) bzw. Permethrinsäure (Fig. 6); das Dicyclohexylcarbodiimid, ein starkes Kondensationsmittel, wird zum Harnstoffderivat hydratisiert.

In Fig. 7 sind die Verfahrensschritte dargestellt, wie sie zur Durchführung des Hybridoma-Screening gemäß Kapitel 5. verwendet werden. In Schritt A werden die Mikrotiterplatten-Vertiefungen (14) jeweils mit 300 Mikroliter Hapten-OVA-Konjugat (8) in 10 Mikrogramm/ml Carbonatpuffer (9) beschichtet ("coating"). Nach den erforderlichen Wasch- und Absättigungsschritten werden danach parallel zueinander zwei Verfahrenswege beschritten: Einerseits wird eine sogenannte "Nullprobe" mit den Schritten B, C, D, durchgeführt, bei der ein direkter Nachweis von monoklonalen Antikörpern aus den Kulturüberständen gemäß Kapitel 4., die an das Hapten-OVA-Konjugat binden, erfolgt; andererseits wird ein kompetitiver Immuntest durchgeführt (Schritte E, F, G) zwischen dem an einer Festphase (Mikrotiterplattenvertiefung (14)) gebundenen Hapten-OVA-Konjugat und freiem Antigen in einer Pyrethroid-Lösung.

Für die Nullprobe werden in Schritt B die Pyrethroid-Konjugat-spezifischen Monoklonalen Antikörper (10) an das Konjugat gebunden und anschließend mit einem enzymmarkierten Anti-Maus-Antikörper (11) inkubiert (Schritt C). Das Enzym ist in diesem Falle Peroxidase (POD). Es folgt die Zugabe eines Enzym-Substrates (12), wodurch unter Farbentwicklung eine Anzeige erfolgt, durch die die Menge der spezifisch am Hapten-Konjugat gebundenen mAK erfaßt werden. Die Auswertung erfolgt durch eine spektralphotometrische Untersuchung der Mikrotiterplatten-Vertiefungen (14). Für den Immuntest (Schritte E, F, G) werden aus dem Kulturüberstand gemäß Kapitel 4. in jede Mikrotiterplatten-Vertiefung (14) eine Menge von 100 Mikroliter, in 100 Mikroliter PBS-Pufferlösung gegeben, wobei der Kulturüberstand monoklonale Antikörper (10) enthält.

Ein Pyrethroid-Gemisch (13) in Lösung wird in Überschuß dazugegeben (Schritt E). Das Gemisch (13) besteht für Antikörper (10), die mit den Permethrinsäure-Konjugaten gemäß Kapitel 1.2 reagieren, aus äquimolaren Mengen Allethrin, Pyrethrin, Fenfluthrin, Permethrin und Cypermethrin (MIX I aus Fig. 8). Das Gemisch (13) besteht für monoklonale Antikörper (10), die mit den Phenoxybenzoesäure-Konjugat gemäß Kapitel 1.2 reagieren, aus äquimolaren Mengen Permethrin, Cypermethrin, Cyfluthrin, Deltamethrin und Fenvalverat (MIX II, Fig. 8). Enthält der Kulturüberstand spezifische Antikörper (10) gegen die im Überschuß vorliegenden freien Antigene, binden die Antikörper an diese, und nicht an das an die Festphase gebundene Hapten-Konjugat (8). Die monoklonalen Antikörper (10) werden dann in einem nachfolgenden Waschschritt entfernt. Anschließend erfolgt die Zugabe und Inkubation mit einem Enzym-markierten Anti-Maus-Antikörper (11), der mit dem Enzym Peroxidase (POD) markiert ist. Wenn alle spezifischen Antikörper (10) einen Bindungspartner in Form eines freien Antigens (13) gefunden hatten, können die Anti-Maus-Antikörper (11) ihrerseits keinen Bindungspartner finden (Schritt F). Eine nachfolgende Enzym-Substrat-Zugabe und daraus folgende Farbentwicklung findet also nicht statt (Schritt G). Würden jedoch nicht alle Maus-Antikörper (10) einen freien Antigen-Bindungspartner (13) finden, bzw. nicht-freies Antigen nur an das Hapten-Konjugat (8) binden, würde die nachfolgende Zugabe an Enzym-markierten Anti-Maus-Antikörper (11) sowie die Substrat-Zugabe zu einer Farbentwicklung führen und ein auswertbares Farbsignal ergeben, wie es schon bei der Nullprobe gemäß den dort durchgeführten Schritten C und D erzielt wurde.

In Fig. 9 ist schematisch ein Immunoassay nach dem Verdrängungsprinzip (ELISA) (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay) zum Nachweis von Pestiziden dargestellt. Die Antikörper werden als gepufferte Lösung in Form eines Streifens (20) auf eine Trägermembran (21) aufgetragen (Schritt K). Die bandförmig ausgebildete Membran (21) besitzt an einem Ende einen Saugkörper (22) in Form eines Schwammes. Nach erfolgter Präparation wird die Membran (21) mit ihrem anderen Ende in eine Lösung (23) mit den zu untersuchenden Pyrethroiden getaucht (Schritt L). In der Lösung befindet sich zusätzlich eine definierte Menge an Avidin- (Streptavidin-) Enzym-Konjugat. Bei in die Lösung (23) eingetauchter Membran (21) findet ein kapillarer Flüssigkeitstransport längs des Richtungspfeiles (24) auf der Membran (21) statt. Im Bereich des Streifens (20) erfolgt eine Verdrängungsreaktion am Antikörper zwischen Tracer und Analyt. Ist die gesamte Flüssigkeit der Lösung (23) aufgesogen, erfolgt ein Waschschritt unter einem Wasserhahn oder mit einer Spritzflasche. Anschließend wird die Membran (21) in eine nicht dargestellte weitere Lösung mit Substratpuffer, abgestimmt auf das Enzymkonjugat, eingetaucht, wo es zu einer Farbreaktion zwischen Enzym und Substrat kommt. Eine intensive Färbung des Streifens (20) (Schritt N) zeigt an, daß in der Probe (Lösung (23)) kein Pyrethroid (Analyt) vorhanden war, und eine schwächere Verfärbung des Streifens (20) (Schritte O, P) zeigen entsprechende Anwesenheit eines Analyten in der Probe (23) an. Ein Maß für die in der Probe (23) vorhandenen Menge an Analyt kann durch Vergleich des verfärbten Streifens (20) mit einer Farbskala (31) (Schritt Q) angegeben werden, welche sechs verschiedene abgestufte Farbbereiche (25, 26, 27, 28, 29, 30) mit einer zugehörigen Mengenangabe enthält.

Claims (8)

1. Monoklonaler Antikörper mit hoher Spezifität bzw. Affinität zu einem insektiziden oder pestiziden Wirkstoff aus der Gruppe solcher Pyrethroide und Pyrethrine, welche in ihrer Funktion als Pestizide einen Phenoxybenzyl- und/oder Cyclopropananteil enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung ein Immunogen verwendet wird, bei welchem als Hapten ein Metabolit der Pyrethrine bzw. Pyrethroide an ein Carriet-Protein gebunden ist.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Metabolit eine (1R-cis)- oder (1R-trans)-Permethrinsäure und/oder 3-Phenoxybenzoesäure bzw. deren Derivate ist.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Metabolit Cyclopropancarbonsäure bzw. deren Derivate ist.

4. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß an einen Protein-Carrier als Hapten ein Metabolit der Pyrethrine bzw. Pyrethroide gebunden und mit dem so synthetisierten Immunkonjugat ein Donor-Tier immunisiert wird, daß aus dem immunisierten Donor-Tier immunkompetente B-Lymphozyten isoliert werden, daß die B-Lymphozyten mit einer Myelom-Zellinie zur Bildung von Hybridomazellen fusioniert, und die fusionierten Zellen kloniert werden, daß mit Hilfe eines Screening-Verfahrens diejenigen Hybridomazellen isoliert werden, die den spezifischen Antikörper sezernieren, und daß die isolierten Hybridomazellen zur Herstellung und anschließenden Isolierung der monoklonalen Antikörper in vivo bzw. in vitro kultiviert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Metabolit eine Permethrinsäure (1R-cis/1R-trans) und/oder eine Phenoxybenzoesäure bzw. deren Derivate verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Pyrethrine Verbindungen der Struktur: verwendet werden, wobei R1 für CH₃ oder CO₂CH₃; R2 für H, CH₃, CH₂CH₃ oder CHCH₂ steht.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomazellinien aus den unter den Hinterlegungsnummern DSM ACC 2135 und DSM ACC 2136 bei der Internationalen Hinterlegungsstelle DSM hinterlegten Zellinien gewählt sind.

8. Monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie zum Nachweis von Pyrethrinen bzw. Pyrethroiden mit Hilfe eines solchen Immunoassays nach dem Verdrängungsprinzip verwendet werden, bei dem die Antikörper (10) als gepufferte Lösung in Form eines Streifens (20) auf eine bandförmige Trägermembran (21) aufgetragen werden, die präparierte und getrocknete Membran (21) in eine Lösung (23) getaucht wird, welche in gelöster Form die zu untersuchenden Pyrethroide in unbekannter Menge und zunächst ein Avidin-(Steptavidin-) Enzym-Konjugat enthält, daß die Lösung (23) infolge Kapillarwirkung entlang der Membran (21) über den Streifen (20) hinweg wandert und eine Verdrängungsreaktion zwischen Antikörper (10) und Analyt (Pyrethroid) aus löst, und daß nach einem Waschschritt mit TWEEN 20 in einer PBS-Lösung die Membran (21) in eine gepufferte, für das Enzym spezifische Substratlösung getaucht wird, welche gegebenenfalls die notwendigen Chromogene enthält, und daß bei Überschreiten des Streifens (20) das Substrat mit dem Enzym und gegebenenfalls mit dem Chromogen zu einer Farbreaktion führt, deren Verfärbung ein Maß für die in der Lösung (23) vorhandenen Analytmenge ist.