DE4329952C1 - Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Pyrethroiden sowie Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents
Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Pyrethroiden sowie Verfahren zu deren HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die eine
hohe Spezifität bzw. Affinität zu einem insektiziden
oder pestiziden Wirkstoff aus der Gruppe solcher
Pyrethrine und Pyrethroide sowie deren Derivate
besitzen, welche in ihrer Funktion als Pestizide einen
Phenoxybenzyl- und/oder Cyclopropananteil enthalten.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur
Herstellung monoklonaler Antikörper, in denen als
Immunogen ein Konjugat aus einem Hapten und einem
immunogenen Carrier verwendet wird, sowie einen Testkit
zur Durchführung eines Immunonassays unter Benutzung
der monoklonalen Antikörper.
Die Intensivierung und Spezialisierung der
Landwirtschaft ist ohne den Einsatz von
pflanzenschutzmitteln (Pestizide, d. h.: Herbizide,
Insektizide, Fungizide) nicht mehr vorstellbar.
Untersuchungen zeigen aber auch, daß
Pflanzenschutzmittel und deren Abbauprodukte
(Metabolite) nach ihrer Applikation nicht nur in den
oberen Bodenschichten festgehalten werden, sondern auch
in Grundwasser und Oberflächenwasser gelangen. Die
hiermit im Zusammenhang stehenden Umweltbelastungen
sind in jüngster Zeit immer häufiger Mittelpunkt der
öffentlichen Diskussion. Pestizide müssen biologisch
aktive Wirkstoffe enthalten, um die beabsichtigten
Effekte (Insektizid, Fraßhemmung) zu erzielen. Mit
ihrer Anwendung können Gefährdungen für die Gesundheit
des Menschen und die Umwelt verbunden sein. Aus diesem
Grund hat der Gesetzgeber für Pestizide, einschließlich
toxischer Hauptabbauprodukte, Grenzwerte z. B. für
Trinkwasser, Lebensmittel oder am Arbeitsplatz (MAK =
Maximale Arbeitsplatz-Konzentration) festgelegt.
Pyrethrum ist das älteste, aus Pflanzen gewonnene
bekannte Insektizid und eigentlich ein Gemisch
verschiedener insektizider Stoffe, den sog.
Pyrethrinen. Hinsichtlich toxikologischer und
ökologischer Bedenken gegen z. B. insektizide
Phosphorsäureester, Chlorkohlenwasserstoffe (Lindan,
PCP, DDT, Toxaphen) oder Carbamate weisen Pyrethrine
ein äußerst interessantes Bündel von hochwertigen
erwünschten Eigenschaften für den Einsatz als
Insektizide auf (Naumann, 1981), was sich auch an
ständig steigenden Marktanteilen pyrethrinhaltiger
Mittel widerspiegelt. Es gilt vielfach als
naturverträgliches und ungiftiges Mittel, jedoch
keineswegs als unproblematisch. Pyrethrum wird in der
Literatur als für Säuger leicht bis mäßig toxisch
eingestuft. Menschen mit regelmäßigem Pyrethrumkontakt
können krankhafte Hautreaktionen entwickeln. Durch
Zusätze von Stabilisatoren und Synergisten wird der
Abbau und der Metabolismus von Pyrethrum verzögert, was
zu einem längeren Verbleib der Substanz in der Natur
führt. Wirtschaftlich genutzte Insekten, Fische und
andere exponierte Lebewesen werden länger belastet. Die
schnellere Penetrierbarkeit sowie die langsamere
Metabolisierung im Körper von Säugern erhöhen die
Toxizität und erzeugen somit ein höheres
Gefährdungspotential.
In Anlehnung an natürliche Pyrethrine werden die
Pyrethroide synthetisch hergestellt, um für Insekten
toxischer, persistenter ("rückstandsaktiver") und damit
als Insektizid wirksamer zu sein (Naumann, 1981;
Leahey, 1985;). Mehr als 100 Pyrethroide sind heute
bekannt. Zum Teil hat ihre Struktur und/oder ihre
Wirkungsweise nur noch wenig Ähnlichkeit mit dem
natürlichen Muster. Pyrethroide weisen aber auch
gegenüber dem Menschen und anderen Lebewesen
unerwünschte Wirkungen auf. Ferner besitzen sie ein
Bioakkumulationspotential: die Akkumulation im
Fettgewebe, in aquatischen Organismen und in Pflanzen
deuten auf eine Anreicherung in der Nahrungskette hin.
Im menschlichen Gehirn kann dieses chronische
Giftwirkungen zur Folge haben. Die Halbwertzeit von
Pyrethroiden z. B. im Boden in Abhängigkeit von
Wirkstoffart, Formulierung und Bodenart liegt zwischen
einer und 60 Wochen. Ferner sind Pyrethroide wie auch
Pyrethrine für Insekten unselektiv (bienengiftig) und
hochtoxisch für Fische.
Aus den oben aufgeführten Gründen muß es daher als eine
vordringliche Aufgabe angesehen werden, bestehende
Nachweisverfahren für Pyrethrine bzw. synthetische
Pyrethroide sowie für deren Abbauprodukte (Metabolite)
zu verbessern. Besonders wünschenswert ist die
Entwicklung kostengünstiger, effizienter und leicht
handhabbarer Verfahren, die auch außerhalb des Labors
unter Feldbedingungen oder im häuslichen Bereich
angewendet werden können und die z. B. dem Landwirt,
Analytiker, Ökologen, Allergiker, Arzt oder anderen
Anwendern schnell und zuverlässig Informationen darüber
liefert, ob und in welchem Konzentrationsbereich ein
bestimmter Wirkstoff oder Metabolit z. B. in der
Nahrung, Luft, im Boden oder Wasser vorkommt. Es war
daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein
Nachweissystem für Insektizide oder Pestizide zur
Verfügung zu stellen, welches reproduzierbar,
kostengünstig, einfach in der Bedienung, vor Ort
anwendbar und schnell in der Auswertung ist.
Derzeit übliche physikalisch-chemisch Analysemethoden
(TLC: thin layer chromatography, HPLC: high performance
liquid chromatography, GC: gas chromatography, GC-MS:
GC-mass spectrometry) für Pyrethrine und Pyrethroide
erfordern aufwendige Anreicherungsverfahren, sind
kostspielig, zeitaufwendig und nur von spezialisierten
Fachkräften in besonders apparativ ausgestatteten
Labors durchzuführen. So müssen beispielsweise für die
Bestimmung von Pyrethroiden in Bodenproben mittels HPLC
vor der Durchführung der eigentlichen
chromatographischen Analyse aufwendige Reinigungs- und
Konzentrierungsschritte zwischengeschaltet werden. Die
GC-MS-Analyse ist aufgrund des geringen Dampfdrucks
dieser Verbindungen nur mit erheblichem Aufwand
durchführbar. Um diese Nachteile zu vermeiden, werden
in jüngster Zeit Verfahren (Immunoassays) entwickelt,
wie sie in der klinischen Diagnostik zum Nachweis der
verschiedensten Substanzen routinemäßig eingesetzt
werden, insbesondere für die quantitative und
qualitative Bestimmung von Schadstoffen in
Lebensmittel-, BpfdruckWasser- oder Luftproben. So hat
man mittlerweile begonnen, immunologische Verfahren für
den Nachweis bestimmter Herbizide und Pestizide zu
entwickeln (Zusammenfassung bei: Van Emon & Mumma,
1990). Auch für den immunologischen Nachweis von
Pyrethroiden sind bereits Verfahren beschrieben (Wing
et al., 1978), die jedoch, wie auch die meisten anderen
Pestizid-Immunoassays, auf der Verwendung polyklonaler
Antiseren beruhen.
Hier setzt die vorliegende Erfindung
ein, der die weitere Aufgabe zugrunde liegt,
monoklonale Antikörper und diese produzierende
Maus-Hybridomazellinien bereitzustellen, die samt
immunologischem Verfahren und Testeinheit für den
einfachen, spezifischen und empfindlichen Nachweis von
Pyrethroiden und/oder Pyrethrinen und deren Metaboliten
geeignet sind. Dabei soll der Nachweis standardisierbar
und reproduzierbar sein, geringen technischen und
materiellen Aufwand erfordern und eine schnelle und
qualitative/quantitative Pestizid-Bestimmung
ermöglichen.
Immunoassays sind hochempfindliche und selektive
serologische Analyseverfahren zur
qualitativen/quantitativen Bestimmung von Substanzen
auf der Grundlage der immunologischen
Antikörper-Antigen Reaktion. Bei den Immunoassays
(IA′s) wird eine Komponente der Immunreaktion, entweder
das Antigen (Hapten) oder der Antikörper, mit einer
leicht nachweisbaren Markierungssubstanz gekoppelt.
Bewährt haben sich der Radioimmunoassay (RIA), der
Fluoreszenzimmunoassay (FIA) und der Enzymimmunoassay
(EIA). In der EP-A 0235000 wird die Möglichkeit der
radioaktiven Markierung von Pyrethroiden als Analyt
bzw. Tracer für RIA′s beschrieben. Weitere
Pyrethroid-RIA-Systeme sind von Wing (1978)
beschrieben.
Antikörper werden durch Immunisierung von Labortieren
induziert und anschließend mittels herkömmlicher
Verfahren isoliert (Harlow & Lane, 1988). Substanzen
(Moleküle), die eine spezifische Immunantwort zu
induzieren und mit den Produkten dieser Immunatwort zu
reagieren vermögen, werden im weitesten Sinne des
Wortes als Antigene bezeichnet. Moleküle mit einem
Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton sind
normalerweise schwache Immunogene. Moleküle mit einem
Molekulargewicht von weniger als 2.000 Dalton können
alleine kaum eine Immunantwort auslösen. Sie werden
Haptene genannt. Nach dem Stand der Technik werden
Substanzen, die nicht antigen sind (Haptene) und gegen
die Antikörper erzeugt werden sollen, an ein
hochmolekulares, meist lösliches immunogenes Molekül
("Carrier") gebunden und sogenannte Konjugate erzeugt,
um damit dann Tiere, z. B. Kaninchen oder Mäuse, zu
immunisieren. Bei der Immunisierung mit
Hapten-Carrier-Konjugaten werden neben den
Hapten-spezifischen Antikörpern auch solche induziert
und gebildet, die gegen den Carrier oder das Bindeglied
zwischen Carrier und Hapten, oder die nur gegen den
Komplex aus Hapten-(Bindeglied)-Carrier gerichtet sind.
Über die Methoden der Kopplung von Haptenen an Carrier
gibt es eine Reihe etablierter Techniken (Tÿssen,
1985). Die spezifischen Anti-Hapten-Antikörper sind im
Regelfall gegen denjenigen Teil das Moleküls gerichtet,
der vom Carrier am weitesten entfernt ist.
In der PCT WO 90/10 450 als nächstliegendem Stand der
Technik wird eine aufwendige Synthese benutzt, da
Pyrethroide wie beispielsweise Permethrin bzw.
Phenothrin keine funktionelle Gruppe enthalten, die
eine direkte kovalente Kopplung an ein Carrier-Protein
ermöglicht. Aus diesem Grund wird in der
PCT WO 90/10450 erst das Pyrethroid Phenothrin und
davon ausgehend der
Phenothrin-Cyclopropandicarbonsäure-monoester
synthesiert. Letzteres wird anschließend über die freie
Carboxylgruppe des Chrysanthemumsäureanteils des
Pyrethroidmoleküls mit einer primären Aminogruppe auf
dem Carrier-Protein zur kovalenten
Hapten-Carrier-Bindung eingesetzt. Folglich findet eine
Bindung von Antikörpern an einem solcherart erzeugten
Hapten-Carrier-Konjugat bevorzugt an dem ihm
entferntesten Molekülteil, nämlich dem
Phenoxybenzyl-Anteil statt. Daher binden Antikörper,
die aufgrund des bekannten Antigens isoliert werden,
bevorzugt solche Pyrethroide bzw. deren Derivate, die
eine Phenoxybenzylgruppe als Epitop (antigengleiche
Strukturkomponente) besitzen. Pyrethroide ohne ein
solches Epitop werden nicht oder nur lose gebunden.
Um die Anzahl der nachweisbaren Pyrethroide zu erhöhen
und gleichzeitig eine höhere Spezifität auch gegen
solche Pyrethroide zu erreichen, die in ihrer Struktur
dem Hapten unähnlich sind, wobei auch Metabolite der
Pyrethroide nachweisbar sein sollen, wird
erfindungsgemäß als Hapten ein Metabolit der Pyrethrine
und/oder Pyrethroide an den immunogenen Carrier
gebunden. Unter einem Metabolit werden in diesem
Zusammenhang Strukturmoleküle bzw. -komponenten
verstanden, die zur Synthese von Pyrethroiden gebraucht
werden, oder während deren Metabolisierung entstehen.
Metabolite in diesem Sinne können sich chemisch
und/oder toxikologisch von den Pyrethroiden
unterscheiden. Man ist nunmehr nicht nur auf die
Verwendung von Pyrethroiden oder Pyrethrum als
Immunisierungshaptene angewiesen, sondern es können
die beiden Grundstrukturkomponenten der Pyrethroide
bzw. Pyrethrine (Alkohol- und Säurekomponente),
getrennt voneinander für die Hapten-Carrier-Kopplung
und für die anschließende Immunisierung bzw. das
Screening und die Charakterisierung der
induzierten/isolierten Antikörper verwendet werden. Die
Anwendung eröffnet die Möglichkeit, Antikörper mit
hoher Spezifität auch gegen solche Pyrethroide oder
Pyrethrine zu gewinnen, die in ihrer Grundstruktur nur
eine der Komponenten zu enthalten brauchen, sowie
Antikörper mit hoher Spezifität gegen z. B.
Pestizid-Metaboliten zu erhalten, die zumindest eine
dieser Komponenten noch als Strukturmerkmale enthalten.
Es hat sich gezeigt, daß eine Bindung der
Grundstrukturkomponenten an ein Enzym oder an das
Biotin/Streptavidinsystem als Carrier hervorragend als
Tracer in den unterschiedlichsten Immunoassays zum
Nachweis von Pyrethroiden geeignet sind.
Die Verwendung einzelner Strukturkomponenten zur
Erzeugung monoklonaler Antikörper eröffnet die
Möglichkeit zur Isolierung eines "Satzes"
unterschiedlicher monoklonaler Antikörper, die sich
bezüglich ihrer immunologischen Bindung gegenüber den
Pyrethroiden/Pyrethrinen unterscheiden, unter Umständen
ergänzen. Auf diese Weise ließe sich ein definierter
"Cocktail monoklonaler Antikörper" (analog einem
polyklonalen Serum) herstellen, mit dem für polyklonale
Antikörperseren charakteristischen hohen
Empfindlichkeiten (d. h. sehr niedrigen Nachweisgrenzen)
und breiteren Selektivität. Das Mischen zu in
aufwendigen Verfahren isolierten monoklonalen
Antikörpern scheint im ersten Augenblick
widersprüchlich. Dennoch können monoklonale Antikörper
als sog. "standardisierte Reagenzien" betrachtet
werden, wogegen polyklonale Antikörperseren eine in
vorliegendem Zusammenhang unerwünschte Variationsbreite
besitzen, wie weiter unten erläutert wird. Die
hergestellten Antikörper-Cocktails lassen sich somit,
durch das Wissen über den Beitrag eines jeden einzelnen
Antikörpers in dieser künstlichen Mischung, genau
definieren (Burrin & Newman, 1992).
Durch die Kombination ("pooling") hoch-affiner
monoklonaler Antikörper gelingt es in einigen Fällen,
Testsysteme bzw. Immunoassays mit erweiterten
Nachweisgrenzen herzustellen. In Fällen, in denen keine
hoch-affinen monoklonalen Antikörper isoliert werden
können, kann der Weg über die Kombination einzelner
schwach- bis mittel-affiner Antikörper zu einem
definierten "polyspezifischen Antikörpergemisch" mit
bevorzugter (höherer) Affinität gegenüber einer
bestimmten Antigendeterminate führen (Campbell, 1991).
Auf diese Weise lassen sich die EIA-Eigenschaften je
nach Anforderung individuell über die Konzentration der
einzelnen monoklonalen Antikörper steuern.
Antikörper erkennen die dreidimensionale
Struktur/Konformation eines Analyten und sind dadurch
in der Lage, zwischen optischen Isomeren zu
unterscheiden. Diesbezüglich bietet ein Immunoassay
oder eine Immun-Affinitätschromatographie die
Möglichkeit, selektiv Struktur-Isomere spezifisch
anzureichern, zu identifizieren oder zu trennen, was
mit klassischen physiko-chemischen Analyseverfahren
fast unmöglich ist. Um Antikörper mit den genannten
Eigenschaften zu isolieren, wurden die Isomere der
Pestizid-Säurekomponente: cis-Permethrinsäure,
trans-Permethrinsäure und Phenoxybenzoesäure zur
individuellen Hapten-Carrier-Kopplung verwendet und die
so gebildeten Hapten-Antigene zur Immunisierung
eingesetzt.
Ein weiterer Vorteil in der Verwendung von einzelnen
Strukturkomponenten als Haptene (Säure- bzw.
Alkoholkomponente) zur Bildung antigener Konjugate
besteht in der günstigen Eigenschaft, daß die mit
diesen Haptenen erzeugten Antikörper in den sog.
Immunoassays eingesetzt werden können, die nach dem
Verdrängungsprinzip arbeiten, da bei gleichbleibend
hoher Spezifität eine unterschiedliche Affinität
gegenüber dem Tracer einerseits und den Analyten
andererseits erreicht werden muß.
Die nach bekannten Immunisierungsverfahren gewonnenen
Antikörper sind in ihrer Spezifität bzw. Selektivität
gegenüber den Strukturkomponenten und den
Pestizidmolekülen oder davon abgeleiteten Metaboliten
gleichbleibend hoch, jedoch mit unterschiedlicher
Affinität. Dadurch kann während der Reaktion der Analyt
(Pyrethroid, Pyrethrum oder deren Metabolite) einen
markierten Tracer (z. B. einzelne derivatisierte
Strukturkomponenten) aus seiner Bindung mit den
spezifischen Antikörpern verdrängen. Beim Verwenden von
Strukturkomponenten (Säure- bzw. Alkoholanteil) während
der Immunisierung der Tiere, bei der experimentellen
Durchführung von Tests und bei dem Anwendung des
Nachweiskits wird der Umgang und der Verbrauch von
Pestiziden erheblich reduziert. Aus diesem und allen
anderen vorab genannten Gründen werden bevorzugt die
Grundstrukturkomponenten der Pyrethroide bzw.
Pyrethrum: cis- bzw. trans-Permethrinsäure und
Phenoxybenzoesäure als Hapten zur Immunisierung von
Versuchstieren und zur anschließenden Erzeugung
polyklonaler bzw. monoklonaler anti-Pestizid-Antikörper
eingesetzt. Diese besitzen dadurch eine hohe Spezifität
und mittlere bis hohe Affinität gegenüber
Pestiziden-/Insektizidenwirkstoffen (z. B. Pyrethrum,
Bioallethrin, Allethrin, Phenothrin, Fenfluthrin) d. h.
insbesondere Pyrethrum und deren Derivate/Metabolite,
hierbei insbesondere die Säurekomponente
(Cyclopropancarbonsäure, Permethrinsäure), sowie
gegenüber einigen Pyrethroiden, welche diese
Strukturkomponenten aufweisen. Man gewinnt Antikörper,
die im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit der
Alkoholkomponente (Phenoxybenzyl-Alkohol) einiger
Pyrethroide bzw. mit diesem Metaboliten selber, und mit
solchen Pyrethroiden, die kein
Cyclopropancarbonsäure-Derivat als Strukturkomponente
enthalten, aufweisen. Besondere Merkmale bei der
Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hilfe der
erfindungsgemäßen Hapten-Konjugate sind darin zu sehen,
daß die mittels dieser gewonnenen Hybridomazellinien,
oder Klone bzw. Subklone davon, die entsprechenden
Antikörper produzieren bzw. synthetisieren und
vorzugsweise in das umgebende Medium sezernieren.
Monoklonale Antikörper (mAk), die mittlerweile gegen
eine Vielzahl von Antigenen hergestellt wurden, sind in
erster Linie in der medizinischen Diagnostik gut
etabliert. Die Vorteile monoklonaler Antikörper
gegenüber denjenigen, die man aus Antiseren
konventionell immunisierter Tiere erhält, sind
zahlreich: a) monoklonale Antikörper können in großer
Menge und in hohem Reinheitsgrad erhalten werden; b)
die Herstellung monoklonaler Antikörper ist homogen im
Hinblick auf die Antigen-Reaktivität und ändert sich
auch nicht im Verlauf der Zeit; c) mAk produzierende
Hybridoma-Zellen können über Jahre und Jahrzehnte
hinweg aufbewahrt werden, ohne dabei ihre spezifischen
Eigenschaften zu verlieren; d) mAk sind für die
Verwendung als Standardreagenzien besser geeignet als
polyklonale Antiseren, da letztere negativ beeinflußt
werden durch eine große Variationsbreite z. B. im
Hinblick auf die Blutentnahme immunisierter Tiere, eine
ständige Verfügbarkeit von Material für zusätzliche
Immunisierungen und die begrenzte Lebenszeit der
Donanten. Die in vitro-Kultivierung der
erfindungsgemäßen Hybridoma-Zellen erfolgt in
geeigneten Kultivierungsmedien, insbesondere in den
üblicherweise verwendeten, standardisierten
Kulturmedien wie z. B. Dulbecco′s Modified Eagle Medium
(DMEM), RPMI 1640 oder CG-Medium, die gegebenenfalls
durch Zugabe von Säuger-Seren wie z. B. Foetales
Kälberserum (FCS) oder durch wachstumsfördernde Zusätze
und Spurenelemente ergänzt werden können.
Die Isolierung der monoklonalen Antikörper beinhaltet
verschiedene Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte, die
dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und die
beispielsweise die Verwendung chromatographischer
Methoden wie z. B. Protein-A/Protein-G-Chromatographie
beinhalten. Unter dem Begriff "Derivate" monoklonaler
Antikörper sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung
z. B. Antikörperfragmente zu verstehen, die noch die
Spezifität und Affinität für die infrage kommenden
Tracer und Analyten besitzen, desweiteren Antikörper,
die mit unterschiedlichen Markierungen, exemplarisch in
der EP-A 365818 zusammengefaßt, versehen sind.
Ebenfalls inbegriffen sind rekombinante Antikörper bzw.
Antikörperfragmente, die z. B. mittels
DNA-Rekombinationsverfahren in heterologen Organismen
kloniert, gentechnisch manipuliert bzw. exprimiert
werden.
Besonders gut geeignet sind die derart gewonnenen
Antikörper bei ihrer Verwendung in einem der
gebräuchlichen Immunoassays zum Nachweis von
Pyrethroiden bzw. Pyrethrinen und/oder deren
Metabolite/Derivate, sowie zur Differenzierung von
einzelnen Pyrethroiden bzw. Pyrethrinen und/oder deren
Metabolite/Derivate in Boden-, Luft-, Wasser- und
Lebensmittelproben, auf Oberflächen und in Hausstaub
sowie in anderem biologischen Material, z. B. in der
medizinischen Diagnostik. Die monoklonalen Antikörper
können somit in allen bekannten Immunoassays verwendet
werden, die auf der spezifischen Bindung zwischen
Antigen und dem entsprechenden monoklonalen Antikörper
aufbauen. Bevorzugt kommen sie jedoch in kompetitiven-
bzw. nichtkompetitiven-EIA-Test z. B.:
Fließ-Injektionsverfahren (FIA) und/oder
Immunchromatographie (MIDA, vgl. deutsche
Patentanmeldung P 42 29 591.2), zum Einsatz.
Die bekannten Testverfahren werden in Form von
Test-Kits bereitgestellt für die qualitative und
quantitative Bestimmung von Pyrethrinen und/oder
Pyrethroiden bzw. deren Metabolite oder ihre
Strukturkomponenten enthaltenden Abbauprodukte. Neben
den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern und/oder
deren Derivate, können die Test-Kits auch noch andere
monoklonale bzw. polyklonale Antikörper bzw. deren
Derivate sowie weitere Zusätze enthalten. Besonders
bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind Test-Kits,
die auf einem der üblicherweise verwendeten
Immunoassays basieren, insbesondere aber auf einem
Fluoreszenzimmunoassay (FIA) bzw. Enzymimmunoassay
(EIA) beruhen.
Testkits für den immunologischen Nachweis von
Pyrethrinen/Pyrethroiden, die auf einem Immunoassay
(z. B.: ELISA-Test) basieren, enthalten beispielsweise
die folgenden Bestandteile:
- a) ein geeignetes Trägermaterial, welches unbeschichtet oder aber mit einem der erfindungsgemäßen Immunkonjugaten, Tracer bzw. Antikörper oder einem Antikörper-Konjugat beschichtet sind,
- b) gefriergetrocknete bzw. konzentrierte Lösungen eines der erfindungsgemäßen Antikörper/Antikörper-Konjugate und/oder eines zweiten Enzym-markierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, der gegen das zu bestimmende Antigen-oder einen das Antigen erkennenden Antikörper gerichtet ist,
- c) Enzymsubstrat in fester oder gelöster Form,
- d) das Antigen (Tracer bzw. Enzym-Konjugat) in fester oder gelöster Form,
- e) Puffer- bzw. Waschlösungen,
- f) Zusätze, die beispielsweise eine unspezifische Adsorption und Aggregation verhindern,
- g) Pipetten, Reaktionsgefäße, Referenzstandards, Eichkurven, Farbtafel.
Trägermaterialien, die im Rahmen der vorliegenden
Erfindung Verwendung finden können, umfassen in erster
Linie unlösliche, polymere Materialien, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polypropylen,
Polyester, Polyacrylnitril, Polyvinylchlorid,
Polyacrylamid, Zellulosenitrat, quervernetzte Dextrane,
fluorierte Harze, Agarose, quervernetzte Agarose,
Polysaccharide. Daneben sind aber auch andere
Materialien denkbar, wie z. B. Glas, Glasfasern, Metall,
Netzgewebe bzw. Membranen auf Nylonbasis. Die genannten
Trägermaterialien dienen der Illustration der
vorliegenden Erfindung und sind nicht limitierend. Die
zuvor im einzelnen genannten Trägermaterialien können
unterschiedlich gestaltet sein und dem Verwendungszweck
entsprechend sehr unterschiedliche Formen aufweisen.
Diese Formen umfassen z. B. Schalen, Kugeln, Platten,
Stäbchen, Streifen, Zellen, Fläschchen, Röhrchen,
Säulen, Fasern, Netze, Vliese. Häufige Verwendung bei
der Herstellung von Test-Kits finden beispielsweise
sog. Mikrotiterplatten oder Reagenzgefäße aus
durchsichtigen Plastikmaterial, die unbeschichtet oder
aber mit einem der erfindungsgemäßen Antikörper, mit
freiem Antigen oder mit einem Antigenkonjugat
beschichtet sein können. Weiterhin sind Bestandteil des
Testkits Farb- bzw. Signal-erzeugende/gebende Marker
oder Indikatoren, mit deren Hilfe es möglich ist, das
Vorliegen einer Komplexbildungsreaktion, insbesondere
einer Immunreaktion, nachzuweisen, welche bevorzugt zu
einem Antigen-Antikörper-Komplex oder aber zu einem
Liganden-Rezeptor-Komplex führt, wodurch neben
qualitativen möglicherweise auch quantitative Aussagen
über das nachzuweisende Antigen möglich sind. Als
Marker oder Indikatoren kommen sowohl einzelne Atome
als auch Moleküle in Betracht, die entweder direkt oder
aber indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren
Signals beteiligt sind und exemplarisch in der
EP-A 0365818 beschrieben sind.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert und in den
zugehörigen Figuren dargestellt.
Mit den Haptenen cis- bzw. trans-Permethrinsäure und
Phenoxybenzoesäure wurden wie folgt Immunkonjugate
synthetisiert:
3 × 10-6 mol (200 mg) "Bovine Serum Albumin"
(BSA) in 10 ml H2O dest. lösen und den pH auf 5,5
einstellen,
anschließend 10-4 mol (47 mg) N-cyclohexyl-N′-(2 morpholinoethyl)-carbodiimid (CMC) zufügen, 1,5 × 10-4 mol (31,5 mg) Hapten (cis- bzw. trans-Permethrinsäure) in Dimethylformamid (DMF) lösen und tropfenweise der obigen Lösung zugeben. Dabei den pH-Wert überprüfen und gegebenenfalls neu einstellen,
15 Minuten nach Beendigung der Haptenzugabe 5 × 10-5 mol (21 mg) CMC zusetzen und die Lösung ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur rühren,
anschließend wird die Lösung 48 Stunden gegen H2O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-BSA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20°C gelagert.
anschließend 10-4 mol (47 mg) N-cyclohexyl-N′-(2 morpholinoethyl)-carbodiimid (CMC) zufügen, 1,5 × 10-4 mol (31,5 mg) Hapten (cis- bzw. trans-Permethrinsäure) in Dimethylformamid (DMF) lösen und tropfenweise der obigen Lösung zugeben. Dabei den pH-Wert überprüfen und gegebenenfalls neu einstellen,
15 Minuten nach Beendigung der Haptenzugabe 5 × 10-5 mol (21 mg) CMC zusetzen und die Lösung ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur rühren,
anschließend wird die Lösung 48 Stunden gegen H2O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-BSA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20°C gelagert.
3 × 10-6 mol (200 mg) BSA in 10 ml H2O dest.
lösen und den pH auf 5,5 einstellen,
anschließend 2 × 10-4 mol (93 mg) N-cyclohexyl-N′(2 morpholinoethyl)-carbodiimid (CMC) zufügen,
3 × 10⁻4 mol (64 mg) Hapten (Phenoxybenzoesäure) in Dimethylformamid (DMF) lösen und tropfenweise der obigen Lösung unter Rühren zugeben. Dabei den pH-Wert überprüfen und gegebenenfalls neu einstellen,
15 Minuten nach Beendigung der Haptenzugabe 5 × 10⁻4 mol (42 mg) CMC zusetzen und die Lösung ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur rühren,
anschließend wird die Lösung 48 Stunden gegen H2O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-BSA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20°C gelagert.
anschließend 2 × 10-4 mol (93 mg) N-cyclohexyl-N′(2 morpholinoethyl)-carbodiimid (CMC) zufügen,
3 × 10⁻4 mol (64 mg) Hapten (Phenoxybenzoesäure) in Dimethylformamid (DMF) lösen und tropfenweise der obigen Lösung unter Rühren zugeben. Dabei den pH-Wert überprüfen und gegebenenfalls neu einstellen,
15 Minuten nach Beendigung der Haptenzugabe 5 × 10⁻4 mol (42 mg) CMC zusetzen und die Lösung ca. 12 Stunden bei Raumtemperatur rühren,
anschließend wird die Lösung 48 Stunden gegen H2O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-BSA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20°C gelagert.
Um prüfen zu können, ob die Immunkonjugate in der Lage
sind, Antikörper gegen cis-/trans
Permethrinsäure-Konjugat induziert zu haben, sind
Testkonjugate erforderlich, die sich im Typ des
Carriers unterscheiden, und die auch unterschiedliche
Kopplungsmoleküle benutzen. Wenn im Immunkonjugat als
Carrier BSA und als Kopplungsmolekül CMC verwendet
wurde, ist für das Testkonjugat ein anderes Albumin,
beispielsweise Ovalbumin (OVA), und als
Kopplungsmolekül DCC und NHS zu wählen. Dadurch wird
ausgeschlossen, daß bei einem Test auf Antikörper
positive Resultate infolge der Bildung von Antikörpern
gegen den Carrier oder das Bindungsmolekül erzielt
werden.
In getrennten Ansätzen werden je 3 × 10⁻4 mol
Hapten (cis- bzw. trans-Permethrinsäure = je 62 mg,
und Phenoxybenzoesäure = 64 mg) eingewogen,
anschließend zusammen mit 3 × 10⁻3 mol (620 mg)
N,N′-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 1,5 × 10⁻3
mol (173 mg) N′-hydroxysuccinimid (NHS) in
wasserfreiem DMF lösen und 18 Stunden bei
Raumtemperatur unter Rühren inkubieren,
3 × 10⁻6 mol (132 mg) OVA in 7 ml 130 mM NaHCO3 lösen,
obiges Reaktionsgemisch und die OVA-Lösung langsam vermischen,
anschließend weitere 3 Stunden unter Rühren inkubieren,
danach wird die Lösung 48 Stunden gegen H2O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-OVA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20° gelagert.
3 × 10⁻6 mol (132 mg) OVA in 7 ml 130 mM NaHCO3 lösen,
obiges Reaktionsgemisch und die OVA-Lösung langsam vermischen,
anschließend weitere 3 Stunden unter Rühren inkubieren,
danach wird die Lösung 48 Stunden gegen H2O dest. bei 4°C dialysiert und das Wasser dabei mindestens 4 mal gewechselt,
das entstandene Hapten-OVA-Konjugat wird danach lyophilisiert und bei -20° gelagert.
Die Bestimmung der Haptendichte (Tab.: 1.1) je Molekül
Träger- bzw. Carrier-Protein erfolgte bei den
Permethrinsäure-Konjugaten mit Hilfe der
Chlor-Elementaranalyse (Fa. Ilse Beetz, Kronach,
B.R.D.) Die Phenoxybenzoesäure-Konjugate der
CMC-Kopplung wurden spektralphotometrisch untersucht.
Es hat sich gezeigt, daß für die Anwendung von
Immunoassays geeignete Enzym-markierte Tracer durch
eine Biotinylierung der Haptene
cis-/trans-Permethrinsäure und Phenoxybenzoesäure
gewonnen werden können: Über das bekannte
(Strept-)Avidin-Biotin Markierungssystem kann das
derivatisierte Hapten mit einem oder mehreren
Markierungen oder Indikatoren verbunden werden. So wird
das Hapten-Enzym-Konjugat hergestellt, indem über einen
Spacer ein reaktiver Biotinester an das Hapten
gekoppelt wird. Nach Aktivierung d. h. Veresterung der
Haptene mit NHS bzw. DCC (Fig. 3, 4) erfolgt die
Umsetzung mit z. B. N-Biotinyl-1,8-diamino-3,6-dioxactan
(Biotin-DADOO) zum biotinylierten Hapten (Fig. 5, 6).
Die Immunisierung weiblicher, 4 bis 6 Wochen alter
BALB/c Mäuse erfolgte nach dem in Tab. 2 angegebenem
Immunisierungsschema. Dabei wurde das Konjugat
intraperitoneal injiziert. Nach der Erstapplikation
wurde das komplette Freund′s Adjuvans durch
inkomplettes ersetzt.
An den Tagen 3, 2 und 1 vor der Milzentnahme erfolgten
weitere intraperitoneale Boost-Injektionen mit jeweils
400 Mikrogramm Immunkonjugat in 200 Mikroliter
Kochsalzlösung (0,9%). Anschließend wurden die Mäuse
getötet und die aus diesen isolierten Milzen
portioniert und kryokonserviert bzw. die isolierten
Milzzellen mit den Myelomazellen PAI-B3Ag81 (Stocker et
al, 1982) fusioniert.
Die Fusion von Milzzellen mit Myelom-Zellen zur Bildung
von Hybridomas wird im nachfolgenden Protokoll
festgehalten.
Die Anzucht der Myelom-Zellinie PAI-B3Ag81, bei der es
sich um eine Myelom-Zellinie handelt, die selbst keine
Antikörper sezerniert und die bei Stocker et al. (1982)
beschrieben ist, erfolgte nach bekannten
Zellkulturverfahren, wie sie exemplarisch von Lindl &
Bauer (1989) bzw. Peters & Baumgarten (1990)
beschrieben werden. Die Entnahme der Milz aus den gemäß
Kapitel 2 immunisierten BALB/c Mäusen, die Gewinnung
der Milzzellsuspension für die Zellfusion und die über
Polyethylenglycol vermittelte Fusion der Milzzellen mit
den Myelomzellen wurden ebenfalls in Anlehnung an bzw.
nach vorgeschriebenen, dem Fachmann bekannten Verfahren
durchgeführt (Harlow & Lane, 1988). Nach erfolgter
Anzucht der Myelom-Zellinien werden die gewünschten
Hybridzellen selektiert.
Die Kultivierung und Selektion der gewünschten
Hybridomzellen mit Hilfe der HAT- und HT-Selektion
erfolgt nach Peters & Baumgarten (1990). Dabei wird am
1. Tag nach der Zellfusion frisches HAT-Medium zu den
Zell-Kulturen zugegeben. 3 bis 5 Tage nach der
Zellfusion erfolgt eine mikroskopische Kontrolle der
fusionierten Zellen. Gleichzeitig erfolgt ein erster
Mediumwechsel. Nach weiteren 3 Tagen erfolgt ein
erneuter Wechsel des Kulturmediums. Ab dem 7. bzw. 10.
Tag nach der Zellfusion werden die Vertiefungen der
Zellkulturgefäße nach Hybriden abgesucht und 2 bis 3
mal wöchentlich das Medium erneuert. Nach ca. 2 Wochen
kann das HAT-Medium durch HT-Medium ersetzt werden. Der
Überstand von gewachsenen Hybridkulturen wird
dekantiert und auf das Vorhandensein von Antikörpern
getestet (siehe Kapitel 5). Monoklonale Antikörper
sezernierende Zellkolonien werden anschließend mit der
dem Fachmann bekannten, limitierten Verdünnungsmethode
kloniert (Klone).
Es ist zu prüfen, ob die so gewonnen Hybridomklone die
gewünschten Antikörper produzieren.
Hierzu werden die in Kapitel 1.2 beschriebenen
Screeningkonjugate eingesetzt. Ferner werden
Mikrotiterplatten: "Maxisorp" (Fa. Nunc) verwendet. Das
Immunscreening-Verfahren, ein indirekter kompetitiver
Immunoassay mit freien Antikörpern, ist schematisch in
Fig. 7 dargestellt. Zunächst werden die
Mikrotiterplattenvertiefungen jeweils mit 300 Mikroliter
Hapten-OVA-Konjugat (10 Mikrogramm/ml Carbonatpuffer)
beschichtet (coating). Dieses erfolgt für 15-18
Stunden bei 4°C. Anschließend werden die Vertiefungen
dreimal mit z. B. PBS-Tween-20-Puffer gewaschen. Zur
Blockierung der unbesetzten Bindungsstellen auf der
Mikrotiterplatte werden ca.
300 Mikroliter 0,1%ige OVA-Lösung in jede Vertiefung
gegeben. Dieser Ansatz wird für weitere 1 bis 2 Stunden
inkubiert, anschließend wie beschrieben wiederum
gewaschen. Zur gesicherten Aussage werden zwei
getrennte Screening-Verfahren angewendet (Fig. 7):
5.1 Direkter Nachweis von solchen monoklonalen Antikörpern aus den Kulturüberständen gemäß Kapitel 4., die an das Hapten-OVA-Konjugat (Kapitel 1.2) binden.
5.2 Kompetitiver Immunoassay zwischen den in der Festphase gebundenen Hapten-OVA-Konjugaten (Kapitel 1.2) und freiem Antigen in Form einer Lösung aus einem Pyrethroid-Gemisch.
5.1 Direkter Nachweis von solchen monoklonalen Antikörpern aus den Kulturüberständen gemäß Kapitel 4., die an das Hapten-OVA-Konjugat (Kapitel 1.2) binden.
5.2 Kompetitiver Immunoassay zwischen den in der Festphase gebundenen Hapten-OVA-Konjugaten (Kapitel 1.2) und freiem Antigen in Form einer Lösung aus einem Pyrethroid-Gemisch.
Für den direkten Nachweis (5.1) werden je
Mikrotiterplattenvertiefung 100 Mikroliter PBS-Puffer
und 100 Mikroliter Zellkulturüberstand (Kapitel 4) eine
Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln
inkubiert. Anschließend erfolgt ein Waschschritt mit
PBS-Tween-20-Puffer. Es folgt die dem Fachmann bekannte
Inkubation mit Peroxidase-(POD)-konjugierten
anti-Maus-Antikörpern mit anschließender
Enzym-Substratzugabe und Farbentwicklung. Die Reaktion
wird nach 30 min. mit 2N H2SO4 gestoppt und
spektralphotometrisch ausgewertet. Positive
Hybridom-Zellen, die einen spezifischen Antikörper
sezernieren, geben ein starkes Farbsignal.
Der direkte Nachweis gibt bei positivem Signal die
Gewißheit, daß die Antikörper aus den Kulturüberständen
gemäß Kapitel 4 überhaupt in der Lage sind, auf das
Testkonjugat, welches einen Strukturanteil der
Pyrethroide/Pyrethrum enthält, zu reagieren. Es ist
somit gelungen, monoklonale Antikörper herzustellen,
welche auf eine Pyrethroid-spezifische Gruppe bzw. auf
einen Strukturanteil reagieren. Der direkte Nachweis
erlaubt jedoch lediglich die Aussage, ob Antikörper
gebildet wurden oder nicht. Es ist keine Unterscheidung
bezüglich der Affinität der Antikörper zu einem
spezifischen Pyrethroid oder einer Pyrethroid-Gruppe
möglich. Hierzu dient der kompetitive Immunoassay nach
Kapitel 5.2:
Als Analyt dient eine Lösung eines Gemisches aus Pyrethroid-Substanzen im Überschuß. Für Antikörper, die mit dem Permethrinsäure-Konjugat (Kapitel 1.2) reagieren, besteht das Gemisch aus äquimolaren Mengen beispielsweise an Allethrin, Pyrethrum, Fenfluthrin, Permethrin, Cypermethrin (Fig. 8, MIX-I), und für Antikörper, die spezifisch an das Phenoxybenzoesäure-Konjugat (Kapitel 1.2) binden, besteht das Pyrethroid-Gemisch aus äquimolaren Mengen beispielsweise an Permethrin, Cypermethrin, Cyfluthrin, Deltamethrin und Fenvalerat (Fig. 8, MIX-II).
Als Analyt dient eine Lösung eines Gemisches aus Pyrethroid-Substanzen im Überschuß. Für Antikörper, die mit dem Permethrinsäure-Konjugat (Kapitel 1.2) reagieren, besteht das Gemisch aus äquimolaren Mengen beispielsweise an Allethrin, Pyrethrum, Fenfluthrin, Permethrin, Cypermethrin (Fig. 8, MIX-I), und für Antikörper, die spezifisch an das Phenoxybenzoesäure-Konjugat (Kapitel 1.2) binden, besteht das Pyrethroid-Gemisch aus äquimolaren Mengen beispielsweise an Permethrin, Cypermethrin, Cyfluthrin, Deltamethrin und Fenvalerat (Fig. 8, MIX-II).
Es werden hierzu 100 Mikroliter Analyt-Lösung
(10 Milligramm/Liter Pyrethroid-Substanz im Gemisch MIX
I/II in PBS Puffer) und 100 Mikroliter Kulturüberstand
(Kapitel 4) je Mikrotiterplattenvertiefung für eine
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Enthält der Zellkulturüberstand für mindestens eine
Substanz aus dem jeweiligen Gemisch MIX I/II hochaffine
spezifische Antikörper, binden diese an das im
Überschuß vorhandene freie Hapten
(Pyrethrine/Pyrethroide) und nicht an das in der
Festphase gebundene Hapten-Konjugat. Die monoklonalen,
an dem Hapten gebundenen Antikörper werden dann im
nachfolgenden Waschschritt entfernt. Es folgt die dem
Fachmann bekannte Inkubation mit
Peroxidase-(POD)-konjugierten anti-Maus-Antikörpern mit
anschließender Enzym-Substrat-Zugabe und
Farbentwicklung. Nach einer festgelegten
Inkubationszeit erfolgt die spektralphotometrische
Mikrotiterplatten-Auswertung. Positive Hybridom-Zellen,
die einen für das im MIX I/II selektiven Antikörper
sezernieren, geben ein schwächeres bzw. kein
Farbsignal. Hybridom-Zellen, die Antikörper
sezernieren, welche unspezifisch an das Hapten-Konjugat
binden, lassen sich durch den Pyrethroid-Überschuß
nicht verdrängen und geben ein entsprechendes
Farbsignal ab. Sind im Kulturüberstand keine Antikörper
vorhanden, kommt es in keinem der beiden Fälle zu einer
Farbreaktion.
Für das EIA-Substrat und das EIA-Chromogen wurde
folgende Zusammenstellung gewählt:
1,25 g/l Na2HPO4 × 2H2O (7 mM)
18,20 g/l NaH2PO4 × H2O (132 mM)
282 mg/l Ureahydrogenperoxide (Aldrich Kat.-Nr. 28,913-2)
18,20 g/l NaH2PO4 × H2O (132 mM)
282 mg/l Ureahydrogenperoxide (Aldrich Kat.-Nr. 28,913-2)
288 mg 3,3′, 5,5′Tetramethylbenzidine (Sigma T-2885) in
100 ml DMSO lösen. Auf einen Liter mit H2O dest.
auffüllen. Danach 500 ml Phosphorsäure und 12 mg
Penicillin-G zufügen.
Eine Gebrauchsmischung besteht aus 1 Teil Chromogen und
2 Teilen Substrat. Je Vertiefung in der
Mikrotiterplatte werden 200 Mikroliter verwendet.
Bei einem doppelt positiven Signal sowohl aus dem
direkten Nachweis (Kapitel 5.1) als auch aus dem
kompetitiven Immunoassay (Kapitel 5.2) hat man die
Gewißheit, daß die im Kulturüberstand (Kapitel 4)
erhaltenen Antikörper selektiv auf mindestens eine
Substanz aus dem jeweiligen MIX I/II von Pyrethroiden
ansprechen. Weiteren Aufschluß über eine spezifische
Selektivität/Affinität zu einem einzelnen Pyrethroid
erhält man durch entsprechende Untersuchungen zur
Kreuzreaktivität (siehe Kapitel 7).
Die bisher geschilderten Verfahrensschritte zur
Herstellung und zum Nachweis monoklonaler Antikörper,
die auf Pyrethroide empfindlich sind, welche als
funktionellen Strukturanteil ein
Cyclopropansäure-Derivat und/oder Phenoxybenzoesäure
besitzen, kann wie folgt zusammengefaßt werden:
- 1. Synthese von Immunkonjugaten mit cis-/trans-Permethrinsäure, bzw. Phenoxybenzoesäure, an BSA gebunden über CMC, Synthese von Testkonjugaten mit cis-/trans-Permethrinsäure bzw. mit Phenoxybenzoesäure, an OVA gebunden über DCC/NHS,
- 2. Immunisierung einer BALB/c-Maus,
- 3. Die Milzzellen werden mit Myelom-Zellen fusioniert (Hybridome),
- 4. Die Hybridomzellen werden kultiviert und von den übrigen Zellen abgetrennt, indem sie in ein spezifisches Medium gebracht werden, in welchem nur Hybridome überleben können,
- 5. Die auf Pyrethroide spezifisch reagierenden Hybridome werden in mehreren Screening-Testreihen von den übrigen Hybridom-Zellen isoliert.
Die nach Schritt 5. erhaltenen Hybridomzellen werden in
Zellkulturen weitervermehrt, und so der monoklonale
Antikörper ständig gewonnen.
Die monoklonalen Antikörper können nunmehr eingesetzt
werden, um Pestizide/Insektizide nachzuweisen, welche
Pyrethroide mit einer funktionalen Gruppe aus
Permethrinsäure und/oder Phenoxybenzoesäure enthalten:
Der Nachweis von Pyrethrum, Pyrethroiden bzw. deren
Derivaten und/oder Metaboliten erfolgt mit Hilfe der in
Kapitel 1 beschriebenen Hapten-Screening-Konjugate bzw.
Biotin-Tracern, und in Anwendung des in Kapitel 5
beschriebenen kompetitiven Immunoassay (ELISA).
Zunächst soll allgemein der Testablauf an Hand eines
kompetitiven Tests beschrieben werden (ELISA = Enzyme
linked immuno sorbent assay).
Beim kompetitiven Test findet ein Wettbewerb um
Antikörperbindeplätze zwischen einem unmarkierten
Analyten unbekannter Menge (hier: Pyrethroid) und einem
Tracer (markiertes Hapten) bekannter Menge statt. Der
Antikörper ist auf einer festen Phase immobilisiert. Je
nach Anteil von Tracer und unmarkierten Analyten in der
Probe werden die Antikörperbindestellen mehr oder
weniger von Tracer und Analyten belegt. Der Tracer wird
durch eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen, so
daß das Detektionssignal an der festen Phase umgekehrt
proportional zur nachgewiesenen Menge an Analyt ist.
Beim direkt-kompetitiven Test für niedermolekulare
Substanzen wie Pyrethroide findet ein Wettbewerb um
eine konstante Zahl von Antikörperbindeplätzen zwischen
einem unmarkierten Analyten unbekannter Menge (hier:
Pyrethroid) und einem Tracer (markiertes Hapten)
bekannter Menge statt. Der Antikörper ist auf einer
Festphase immobilisiert. Je nach Anteil an unmarkiertem
Analyten in der Probe werden die Antikörperbindeplätze
mehr oder weniger von Tracer oder Analyten belegt. Der
Tracer wird durch eine Farbreaktion nachgewiesen, so
daß das Detektionssignal an der festen Phase umgekehrt
proportional zur nachgewiesenen Menge an Analyt ist.
Die Farbentwicklung wird spektrophotometrisch bei einer
festgelegten Wellenlänge erfaßt. Die zu benutzende
Wellenlänge hängt vom Substrat und dem Chromogen ab.
Bei der hier verwendeten Zusammenstellung (vgl. Kapitel
5.2) beträgt sie 450 nm. Mehrere zu untersuchende
Proben werden unterschiedlich verdünnt. Die
Verdünnungen der einzelnen Proben werden so gewählt,
daß man ohne Zugabe eines Analyten (d. h. ohne Inhibitor
= Bo) Absorptionswerte in einem Bereich beispielsweise
zwischen 0,7 und 1,0 erhält. Für die Kontrolle
(beispielsweise ohne Antikörper oder ohne Enzyme)
ergeben sich Absorptionswerte kleiner 0,005. Die Proben
werden in dreifacher Ausfertigung bestimmt. Zur
Ermittlung der in einer Probe enthaltenen Menge an
Pyrethrinen/Pyrethroiden (Analyt) wird zunächst eine
Eichkurve erstellt, wobei B/Bo × 100 gegen die
Konzentration an Inhibitor aufgetragen wird (B/Bo:
Enzymtracerbindung in Gegenwart eines Analyten (B)
bekannter Menge im Verhältnis zur Enzymtracerbindung in
Abwesenheit eines Analyten (Bo)). Im hier gewählten
indirekten kompetitiven Test gibt der Testmittelpunkt
(50%B/Bo) diejenige Konzentration des Analyten an, bei
der die Antikörperbindung an der Festphase zu 50%
(B/Bo-Wert) gehemmt wird. Trägt man B/Bo auf der
Y-Achse gegen den Logarithmus der Analytkonzentration
auf, ergibt sich ein sigmoider Kuvenverlauf. Der 50%
B/Bo-Wert wird anhand Transformation der Werte nach dem
logit-log-Verfahren oder dem Vier-Parameter-Verfahren
berechnet (Rodbard, 1978; Rodgers, 1984).
Für die Durchführung eines kompetitiven Immunoassays
(ELISA) kann ein Testkit zusammengestellt werden, wie
er beispielsweise in der älteren, auf den Namen der
Anmelderin vorliegender Patentanmeldung beim deutschen
Patentamt eingereichten Anmeldung mit dem Aktenzeichen:
P 42 29 591.2, angemeldet am 4. Sept. 1992, beschrieben
ist.
Der schematische Ablauf eines Immunoassay mit Hilfe
eines solchen Testkits ist in Fig. 9 dargestellt. Bei
dem beispielhaft beschriebenen Test handelt es sich um
einen Verdrängungstest.
Dieser Form des Immunoassays liegt eine Verdrängung
eines immobilisierten enzymmarkierten Haptens (Tracer)
in der Festphase durch ein nicht markiertes Antigen
oder Hapten in der freien Phase (Lösung) zugrunde. Die
Verdrängung wird durch die unterschiedlich großen
Affinitätskonstanten des enzymmarkierten und des freien
Antigens ermöglicht. Bei Messung der Enzymaktivität
ähnlich dem o.g. kompetitiven Assay an der festen Phase
steht auch hier das Detektionssignal in umgekehrt
proportionalem Verhältnis zur Menge des Analyten in der
Probe.
Die Antikörper werden als gepufferte Lösung
(geeigneterweise 1 mg/ml) strichförmig auf die zu
verwendende Membran aufgetragen. Hierfür geeignet ist
z. B. der Linomat IV (Fa. Camag). Dies ergibt
typischerweise 0.5 Mikrogramm Protein pro
Membranteststreifen. Anschließend wird die Membran an
der Luft bei Raumtemperatur (ca. 22-25°C) getrocknet.
Die von den Antikörpern nicht besetzten noch freien
Bindeplätze auf dem Teststreifen werden durch
Inkubation der Membran in Absättigungsreagenzen
blockiert.
Bekannte Absättigungsreagenzien sind z. B.: 3 bis 5%
(v/v) Pferdeserum (HSA) in Phosphat gepufferter Lösung
(PBS); 0.25% (w/v) Casein (Fa. Merck) + 0.1% (v/v)
Triton X-100 (Fa. Rohm & Haas) in PBS.
Nach dem Absättigungsschritt folgt ein Waschschritt mit
0.1% (v/v) Tween 20 (Fa. Merck) in PBS Lösung, um
überschüssiges Absättigungsreagenz zu entfernen. Es
folgt die Inkubation mit dem nach Kapitel 1.3
hergestellten Tracer, der im Verhältnis zu den
immobilisierten Antikörpern im Überschuß dazu gegeben
wird, um alle möglichen Antikörper-Bindeplätze
abzusättigen. Anschließend erfolgt wie vorher
b%schrieben ein weiterer Waschschritt in
Tween/PBvon den AnDanach kann der Teststreifen
getrocknet, oder wie in der P 4229591.2 beschrieben
unmittelbar für einen Pyrethroid- bzw.
Pyrethrin-MIDA-Test eingesetzt werden (Fig. 9). Dazu
wird der vorbereitete Teststreifen in einer Halterung
eingesetzt. Teststreifen und Halterung werden dann z. B.
im Deckel der als Glasbehälter ausgebildeten
Testeinheit plaziert. Anschließend wird die Lösung mit
dem Analyten (die das Insektizid enthaltende Probe) in
das Probengefäß überführt. Im Probengefäß befindet sich
zusätzlich eine definierte Menge z. B. an Avidin-,
bevorzugt Streptavidin-Enzym-Konjugat. Der Teststreifen
wird nun so in das Probengefäß eingesetzt, daß der
untere Rand des Streifens in die Probe eintaucht. Durch
den stattfindenden kapillaren Flüssigkeitstransport
werden die Substanzen im Probengefäß über bzw. durch
die Membrane geleitet. Dabei kommt es an der
vorgesehenen Stelle zur Verdrängungsreaktion zwischen
Tracer und Analyt. Nach einer vorgegebenen Zeit, oder
wenn die gesamte Probenflüssigkeit aufgesogen ist, wird
der Membranstreifen aus dem Probengefäß entnommen und
z. B. unter einem Wasserhahn oder mit einer
Laborspritzflasche abgespült. Anschließend wird der
Teststreifen in ein zweites Gefäß (Substratgefäß)
überführt, welches den Substratpuffer in wäßriger
Lösung oder die entsprechenden Substanzen in
lyophilisierter Form enthält. Im Falle von
lyophilisierten Substanzen werden diese zuvor mit einer
vorgeschriebenen Menge z. B. Wasser rehydratisiert. Die
Substratpuffer sind dabei immer auf das entsprechende
Enzym-Konjugat abgestimmt. Beispielhaft ist hier die
Zusammensetzung für die alkalische Phosphatase
aufgeführt:
0.1 mol/l NaHCO3
0.001 mol/l MgCl2
0.70 mmol/l NBT
0.30 mmol/l BCIP:
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat dinatriumsalz;
(Stammlösung in Dimethylformamid = DMF)
NBT: 2,2′-di-p-nitrophenyl-5,5′ diphenyl-3,3′-(3,3′-dimethoxy-4, 4′-diphenyl)-ditetrazoliumchlorid.
0.001 mol/l MgCl2
0.70 mmol/l NBT
0.30 mmol/l BCIP:
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat dinatriumsalz;
(Stammlösung in Dimethylformamid = DMF)
NBT: 2,2′-di-p-nitrophenyl-5,5′ diphenyl-3,3′-(3,3′-dimethoxy-4, 4′-diphenyl)-ditetrazoliumchlorid.
Nach einer festgelegten Reaktionszeit (z. B. 1 bis 2
Minuten) wird die Reaktion durch Spülen des
Teststreifens mit Wasser gestoppt und die erzielte
Verfärbung mit einer Farbskala zwecks Auswertung
verglichen. Eine intensive Färbung zeigt an, daß in der
Probe kein Pestizid bzw. für diesen Test unterhalb der
Nachweisgrenze, vorhanden ist, folglich keine
nachweisbare Tracer-Verdrängung stattgefunden hat.
Keine Farbentwicklung zeigt eine vollständige
Verdrängung des
Tracers und somit einen hohen Gehalt an Pestizid in der
Probenlösung an. Mögliche Zwischenstufen der Verfärbung
sind ein Maß für die Analytkonzentration in der Probe.
In diesem Beispiel ist die Farbintensität umgekehrt
proportional zur gemessenen Analytkonzentration.
Weitere Ausführungsformen oder Typen des MIDA-Test bzw.
Testkits, die für den Nachweis von Pyrethroiden bzw.
Pyrethrinen und deren Derivate möglich sind sowie die
Beschreibung zum Einsatz als Multianalyteinheit, werden
exemplarisch in der P 4229591.2 beschrieben.
Die Qualität und Spezifität der hergestellten
monoklonalen Antikörper soll im folgenden als
Ergebnisprotokoll von durchgeführten Untersuchungen
dargestellt werden:
Bereits wenige Tage nach der erfolgten Zellfusion
zwischen den Myelomazellen und den Milzzellen der
Mäuse, die zuvor mit dem in Kapitel 1.1 beschriebenen
Hapten-Immunkonjugaten: cis- bzw. trans-Permethrinsäure
oder Phenoxybenzoesäure getrennt immunisiert wurden,
lassen sich in den Vertiefungen der Kulturgefäße
proliferierende Zellkolonien nachweisen. Das
Hybridoma-Screening erfolgte wie in Kapitel 5
beschrieben. So wurden beispielsweise nach der
Immunisierung mit trans-Permethrinsäure-Konjugat und
der Fusion von Milzzellen mit Myelomzellen 15
Aussaatplatten à 96 Vertiefungen untersucht. 30
Zellkolonien produzieren dabei monoklonale Antikörper,
wobei letztlich 4 Zellkolonien nach dem beschriebenen
Testverfahren monoklonale Antikörper mit den
gewünschten Eigenschaften synthetisieren. Diese
Antikörper gehören in die IgGl Subklasse. Die auf diese
Art und Weise gewonnenen monoklonalen Antikörper können
aufgrund ihrer Kreuzreaktivitäten, die im ELISA-Test
bestimmt werden, in 2 Gruppen unterteilt werden. In der
ersten Gruppe (vertreten durch mAk der Myelom Zellinie
3/B4-1/F8) ist die Kreuzreaktivität auf natürliche
Pyrethrine und synthetische Pyrethroide beschränkt.
Ferner ist eine unterschiedliche Selektivität gegenüber
den Isomeren-Permethrinsäure-Haptenen unter Anwendung
des bekannten Tüpfeltest (dot-immuno-binding-assay)
festzustellen. Die isolierten monoklonalen Antikörper
besitzen eine deutlich höhere Affinität zu dem
trans-PMS-Hapten-Immunokonjugat als zu
cis-PMS-Hapten-Konjugaten (PMS = Permethrinsäure). Die
zweite Gruppe (vertreten durch mAk der Myelom-Zellinie
1/E2-5/B5) kennzeichnet die Selektivität gegenüber
Allethrin, Ben-PermethrinsäuPhenothrin. Die hierbei
auftretenden Kreuzreaktivitäten gegenüber anderen
Pyrethroiden sind vernachlässigbar gering.
Die unteren Nachweisgrenzen für Pyrethrine/Pyretrhoide
liegen im Bereich zwischen 10 und 80 ng/ml Puffer. Die
entsprechenden 50%B/Bo-Werte liegen zwischen 40 und
400 ng/ml.
In beiden Gruppen tritt keine Kreuzreaktivität mit dem
Phenoxybenzoesäure-Hapten-Konjugat (PBZ) oder mit
Pyrethroiden auf, welche PBZ als einzige
Pestizid-charakteristische Strukturkomponente
enthalten. Überraschenderweise zeigen die isolierten
monoklonalen Antikörper keine bzw. nur eine geringe
Kreuzreaktivität gegenüber der freien cis- bzw.
trans-Permethrinsäure.
Bei der Verwendung von cis-Permethrinsäure- bzw.
PBZ-Immunkonjugaten konnten bisher keine monoklonalen
Antikörper isoliert werden, die etwa ein vergleichbares
Ausmaß an Kreuzreaktivität oder
Hapten-Stereoisomerenspezifität aufweisen.
Die festgestellten Kreuzreaktivitäten sind in der
folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt:
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten
und verwendeten Hybridoma-Zellinien werden bei der als
Internationale Hinterlegungsstelle anerkannten
"Deutsche Sammlung von Mikroorganismen GmbH" (DSM) in
Braunschweig (F.R.G.), entsprechend den geltenden
Anforderungen des Budapester Vertrages für die
Internationale Anerkennung der Hinterlegung von
Zellkulturen zum Zweck der Patentierung hinterlegt.
Eine Erklärung zur Lebensfähigkeit
(Lebensfähigkeitsbescheinigung) der hinter legten Proben
(Eingangsnummer) wurde durch die Hinterlegungsstelle
ausgefertigt.
Die im Rahmen der Versuchsreihen, Synthesen und Tests
verwandten Medien und Puffer werden in der folgenden
Tabelle aufgelistet:
A) Normalmedium (RPMI 1640):
500 ml RPMI mit Hepes
55 ml FCS
(FCS: Fetal Calf Serum)
5,5 ml 200 mM Glutamin
5,5 ml 10⁻3 M Mercaptoethanol-Lösung
500 ml RPMI mit Hepes
55 ml FCS
(FCS: Fetal Calf Serum)
5,5 ml 200 mM Glutamin
5,5 ml 10⁻3 M Mercaptoethanol-Lösung
B) HAT-Medium: Stammlösung
10⁻2M Hypoxanthin
10⁻5M Aminopterin
10⁻3M Thymidin
von diesen Stammlösungen je 5,5 ml zu 570 ml Normalmedium dazu mischen.
10⁻2M Hypoxanthin
10⁻5M Aminopterin
10⁻3M Thymidin
von diesen Stammlösungen je 5,5 ml zu 570 ml Normalmedium dazu mischen.
C) HT-Medium: von den o.a. Stammlösungen für Hypoxanthin und
Thymidin je 5,5 ml zu 570 ml Normalmedium dazu mischen.
D) Einfriermedium:
70 ml RPMI-Medium ohne Hepes
20 ml FCS
12 ml DMSO
1 ml 10⁻3 M Mercaptoethanol
70 ml RPMI-Medium ohne Hepes
20 ml FCS
12 ml DMSO
1 ml 10⁻3 M Mercaptoethanol
E) PBS-Puffer (pH 7,6):
150 mM NaCl
2 mM Na2HPO4
8 mM NaH 2PO4
150 mM NaCl
2 mM Na2HPO4
8 mM NaH 2PO4
F) PBS-Tween-20 (0,05%):
0,5 ml Tween-20 + 1000 ml PBS-Puffer (Tween-20: Polyoxyethylensorbitonmonolaurat)
0,5 ml Tween-20 + 1000 ml PBS-Puffer (Tween-20: Polyoxyethylensorbitonmonolaurat)
G) Carbonat-Puffer (pH 9,6):
16 mM Na2CO3
34 mM NaHCO3
16 mM Na2CO3
34 mM NaHCO3
Zum Stand der Technik werden folgende Fachliteratur und
Patentliteratur angegeben:
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application aux dosages radioimmunologiques".
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und Atrazinderivaten".
P 42 29 591.2: "Immunologisches Verfahren zur
Bestimmung eines Analyten".
Im folgenden werden die Fig. 1 bis 9 erläutert:
Fig. 1 Permethrin
Fig. 2 Haptene für die Konjugatsynthese
Fig. 3 Kopplungsreaktion der Haptene mit
Succinimid
Fig. 4 Kopplungsreaktion der Haptene mit
Carbodiimid
Fig. 5 Biotinylierung von PBZ
Fig. 6 Biotinylierung von Permethrinsäure
Fig. 7 Schematischer Ablauf des
Hybridoma-Screening
Fig. 8 Zusammenstellung der Überschußlösungen
MIX/MIX II für das Screening nach Fig. 7
Fig. 9 Schematische Darstellung des
Pyrethroid-Nachweises mit Hilfe eines
Testkits
Fig. 1 stellt die chemische Strukturformel von
Permethrin (IR-cis) und Permethrin (IR-trans) dar, von
denen die zur Herstellung der Immunkonjugate
verwendeten Haptene gemäß Fig. 2 abgeleitet sind.
Durch Trennung der Esterbindung des Permethrin
entstehen Permethrinsäure und Phenoxybenzylalkohol. Für
die nachfolgend beschriebene Carbodiimidkopplung werden
freie Carboxylgruppen benötigt, so daß statt des
Phenoxybenzylalkohols die Phenoxybenzylsäure (BPZ) zur
Haptenkopplung eingesetzt wird. Die Kopplung von
Phenoxybenzoesäure bzw. Permethrinsäure erfolgt in zwei
Schritten. Der erste Reaktionsschritt besteht in der
sog. "Aktivierung" der Carboxylgruppen der freien Säure
mit Hilfe von N-Hydroxysuccinimid (Fig. 3) und
Dicyclohexylcarbodiimid (Fig. 4) (siehe Kapitel 1.2:
Testkonjugate: Carbodiimide verbinden Carboxyl- mit
Aminogruppen). Die so aktivierten Säuren ermöglichen
nun eine Reaktion zwischen der primären Aminogruppe des
N-Biotinyl-1,8-Diaminodioxacctan (Biotin-DADOO) und der
aktivierten Carboxylgruppe. Dabei entstehen die
"biotinylierte" Phenoxybenzoesäure (Fig. 5) bzw.
Permethrinsäure (Fig. 6); das Dicyclohexylcarbodiimid,
ein starkes Kondensationsmittel, wird zum
Harnstoffderivat hydratisiert.
In Fig. 7 sind die Verfahrensschritte dargestellt, wie
sie zur Durchführung des Hybridoma-Screening gemäß
Kapitel 5. verwendet werden. In Schritt A werden die
Mikrotiterplatten-Vertiefungen (14) jeweils mit
300 Mikroliter Hapten-OVA-Konjugat (8) in
10 Mikrogramm/ml Carbonatpuffer (9) beschichtet
("coating"). Nach den erforderlichen Wasch- und
Absättigungsschritten werden danach parallel
zueinander zwei Verfahrenswege beschritten: Einerseits
wird eine sogenannte "Nullprobe" mit den Schritten B,
C, D, durchgeführt, bei der ein direkter Nachweis von
monoklonalen Antikörpern aus den Kulturüberständen
gemäß Kapitel 4., die an das Hapten-OVA-Konjugat
binden, erfolgt; andererseits wird ein kompetitiver
Immuntest durchgeführt (Schritte E, F, G) zwischen dem
an einer Festphase (Mikrotiterplattenvertiefung (14))
gebundenen Hapten-OVA-Konjugat und freiem Antigen in
einer Pyrethroid-Lösung.
Für die Nullprobe werden in Schritt B die
Pyrethroid-Konjugat-spezifischen Monoklonalen
Antikörper (10) an das Konjugat gebunden und
anschließend mit einem enzymmarkierten
Anti-Maus-Antikörper (11) inkubiert (Schritt C). Das
Enzym ist in diesem Falle Peroxidase (POD). Es folgt
die Zugabe eines Enzym-Substrates (12), wodurch unter
Farbentwicklung eine Anzeige erfolgt, durch die die
Menge der spezifisch am Hapten-Konjugat gebundenen mAK
erfaßt werden. Die Auswertung erfolgt durch eine
spektralphotometrische Untersuchung der
Mikrotiterplatten-Vertiefungen (14). Für den Immuntest
(Schritte E, F, G) werden aus dem Kulturüberstand gemäß
Kapitel 4. in jede Mikrotiterplatten-Vertiefung (14)
eine Menge von 100 Mikroliter, in 100 Mikroliter
PBS-Pufferlösung gegeben, wobei der Kulturüberstand
monoklonale Antikörper (10) enthält.
Ein Pyrethroid-Gemisch (13) in Lösung wird in Überschuß
dazugegeben (Schritt E). Das Gemisch (13) besteht für
Antikörper (10), die mit den Permethrinsäure-Konjugaten
gemäß Kapitel 1.2 reagieren, aus äquimolaren Mengen
Allethrin, Pyrethrin, Fenfluthrin, Permethrin und
Cypermethrin (MIX I aus Fig. 8). Das Gemisch (13)
besteht für monoklonale Antikörper (10), die mit den
Phenoxybenzoesäure-Konjugat gemäß Kapitel 1.2
reagieren, aus äquimolaren Mengen Permethrin,
Cypermethrin, Cyfluthrin, Deltamethrin und Fenvalverat
(MIX II, Fig. 8). Enthält der Kulturüberstand
spezifische Antikörper (10) gegen die im Überschuß
vorliegenden freien Antigene, binden die Antikörper an
diese, und nicht an das an die Festphase gebundene
Hapten-Konjugat (8). Die monoklonalen Antikörper (10)
werden dann in einem nachfolgenden Waschschritt
entfernt. Anschließend erfolgt die Zugabe und
Inkubation mit einem Enzym-markierten
Anti-Maus-Antikörper (11), der mit dem Enzym Peroxidase
(POD) markiert ist. Wenn alle spezifischen Antikörper
(10) einen Bindungspartner in Form eines freien
Antigens (13) gefunden hatten, können die
Anti-Maus-Antikörper (11) ihrerseits keinen
Bindungspartner finden (Schritt F). Eine nachfolgende
Enzym-Substrat-Zugabe und daraus folgende
Farbentwicklung findet also nicht statt (Schritt G).
Würden jedoch nicht alle Maus-Antikörper (10) einen
freien Antigen-Bindungspartner (13) finden, bzw.
nicht-freies Antigen nur an das Hapten-Konjugat (8)
binden, würde die nachfolgende Zugabe an
Enzym-markierten Anti-Maus-Antikörper (11) sowie die
Substrat-Zugabe zu einer Farbentwicklung führen und ein
auswertbares Farbsignal ergeben, wie es schon bei der
Nullprobe gemäß den dort durchgeführten Schritten C und
D erzielt wurde.
In Fig. 9 ist schematisch ein Immunoassay nach dem
Verdrängungsprinzip (ELISA)
(Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay) zum Nachweis von
Pestiziden dargestellt. Die Antikörper werden als
gepufferte Lösung in Form eines Streifens (20) auf eine
Trägermembran (21) aufgetragen (Schritt K). Die
bandförmig ausgebildete Membran (21) besitzt an einem
Ende einen Saugkörper (22) in Form eines Schwammes.
Nach erfolgter Präparation wird die Membran (21) mit
ihrem anderen Ende in eine Lösung (23) mit den zu
untersuchenden Pyrethroiden getaucht (Schritt L). In
der Lösung befindet sich zusätzlich eine definierte
Menge an Avidin- (Streptavidin-) Enzym-Konjugat. Bei in
die Lösung (23) eingetauchter Membran (21) findet ein
kapillarer Flüssigkeitstransport längs des
Richtungspfeiles (24) auf der Membran (21) statt. Im
Bereich des Streifens (20) erfolgt eine
Verdrängungsreaktion am Antikörper zwischen Tracer und
Analyt. Ist die gesamte Flüssigkeit der Lösung (23)
aufgesogen, erfolgt ein Waschschritt unter einem
Wasserhahn oder mit einer Spritzflasche. Anschließend
wird die Membran (21) in eine nicht dargestellte
weitere Lösung mit Substratpuffer, abgestimmt auf das
Enzymkonjugat, eingetaucht, wo es zu einer Farbreaktion
zwischen Enzym und Substrat kommt. Eine intensive
Färbung des Streifens (20) (Schritt N) zeigt an, daß in
der Probe (Lösung (23)) kein Pyrethroid (Analyt)
vorhanden war, und eine schwächere Verfärbung des
Streifens (20) (Schritte O, P) zeigen entsprechende
Anwesenheit eines Analyten in der Probe (23) an. Ein
Maß für die in der Probe (23) vorhandenen Menge an
Analyt kann durch Vergleich des verfärbten Streifens
(20) mit einer Farbskala (31) (Schritt Q) angegeben
werden, welche sechs verschiedene abgestufte
Farbbereiche (25, 26, 27, 28, 29, 30) mit einer
zugehörigen Mengenangabe enthält.
Claims (8)
1. Monoklonaler Antikörper mit hoher Spezifität bzw.
Affinität zu einem insektiziden oder pestiziden
Wirkstoff aus der Gruppe solcher Pyrethroide und
Pyrethrine, welche in ihrer Funktion als Pestizide
einen Phenoxybenzyl- und/oder Cyclopropananteil
enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Immunisierung ein Immunogen verwendet wird, bei
welchem als Hapten ein Metabolit der Pyrethrine
bzw. Pyrethroide an ein Carriet-Protein gebunden
ist.
2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Metabolit eine (1R-cis)-
oder (1R-trans)-Permethrinsäure und/oder
3-Phenoxybenzoesäure bzw. deren Derivate ist.
3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Metabolit
Cyclopropancarbonsäure bzw. deren Derivate ist.
4. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper
nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß an einen Protein-Carrier als
Hapten ein Metabolit der Pyrethrine bzw.
Pyrethroide gebunden und mit dem so
synthetisierten Immunkonjugat ein Donor-Tier
immunisiert wird, daß aus dem immunisierten
Donor-Tier immunkompetente B-Lymphozyten isoliert
werden, daß die B-Lymphozyten mit einer
Myelom-Zellinie zur Bildung von Hybridomazellen
fusioniert, und die fusionierten Zellen kloniert
werden, daß mit Hilfe eines Screening-Verfahrens
diejenigen Hybridomazellen isoliert werden, die
den spezifischen Antikörper sezernieren, und daß
die isolierten Hybridomazellen zur Herstellung und
anschließenden Isolierung der monoklonalen
Antikörper in vivo bzw. in vitro kultiviert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß als Metabolit eine Permethrinsäure
(1R-cis/1R-trans) und/oder eine Phenoxybenzoesäure
bzw. deren Derivate verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß als Pyrethrine Verbindungen der
Struktur:
verwendet werden, wobei R1 für CH3 oder
CO2CH3; R2 für H, CH3, CH2CH3 oder
CHCH2 steht.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomazellinien
aus den unter den Hinterlegungsnummern
DSM ACC 2135 und DSM ACC 2136 bei der
Internationalen Hinterlegungsstelle DSM
hinterlegten Zellinien gewählt sind.
8. Monoklonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1
bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie zum
Nachweis von Pyrethrinen bzw. Pyrethroiden mit
Hilfe eines solchen Immunoassays nach dem
Verdrängungsprinzip verwendet werden, bei dem die
Antikörper (10) als gepufferte Lösung in Form
eines Streifens (20) auf eine bandförmige
Trägermembran (21) aufgetragen werden, die
präparierte und getrocknete Membran (21) in eine
Lösung (23) getaucht wird, welche in gelöster Form
die zu untersuchenden Pyrethroide in unbekannter
Menge und zunächst ein Avidin-(Steptavidin-)
Enzym-Konjugat enthält, daß die Lösung (23)
infolge Kapillarwirkung entlang der Membran (21)
über den Streifen (20) hinweg wandert und eine
Verdrängungsreaktion zwischen Antikörper (10) und
Analyt (Pyrethroid) aus löst, und daß nach einem
Waschschritt mit TWEEN 20 in einer PBS-Lösung die
Membran (21) in eine gepufferte, für das Enzym
spezifische Substratlösung getaucht wird, welche
gegebenenfalls die notwendigen Chromogene enthält,
und daß bei Überschreiten des Streifens (20) das
Substrat mit dem Enzym und gegebenenfalls mit dem
Chromogen zu einer Farbreaktion führt, deren
Verfärbung ein Maß für die in der Lösung (23)
vorhandenen Analytmenge ist.
Priority Applications (2)
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