DE3224837A1 - Traegergebundenes immunosorptionsmittel - Google Patents
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Description
"Trägergebundenes Immunosorptj&qsnrltte"! "
ΑΛ.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein trägergebundenes Immunosorptionsmittel mit einem Trägerkörper, der einen
immobilisierten ImmunoreaktionsteiInehmer trägt.
Immobiliserte Antikörper, die über kovalente Bindungen
z.B. mittels eines Vernetzungsmittels wie Glutäraldehyd mit einem kohlehydratartigen Träger, z.B. Zellulose
oder Agarose vernetzt sind, gehören zum Stand der Technik (R. Kowal et alia, anal. Biochem. JO^, 72-76 (1980) ).
Die Trägerkapazität dieser Kohlehydrate ist verhältnismSssig
gering und die Produkte sind verhältnismässig unstabil.
T.T. Ngo (Int. ü. Biochem Vol. 11, Seiten 459-465)
beschreibt verschiedene immobilisierte Enzymsysteme allerdings
nicht im Zusammenhang mit Immunoreagenaen in denen die Enzyme immobilisiert sind durch
(a) Adsorption (wobei die Enzyme sehr leicht wieder desorbiert werden);
(b) kovalente Bindung ihrer nicht-essentiellen Amino-
säurerester an "chemisch aktiviert? Trgger" wie Zellulose,
Glas oder synthetisierte Polymere über Azide, Isocyanate, Carbodiimide und sonstige Derivate des Trägermittels,
(c) Polykondensation durch Vernetzung der Enzyme selbst, wobei zweiseitig reaktionsfähige Vernetzungsmittel wie
Di isothiocyanate,Bisimidate, Alkyliermittel und
Dialdehyde zur Bildung der Aggregate verwendet werden. Dabei verlieren die Enzyme zum überwiegenden Teil ihre
gewünschten Eigenschaften.
-11 -
Enzymgebundene Immunosorbentien für analytische Bestimmungen. (ELISA) für bestimmte Antikörper sind
bekannt (A Voller et alia, proc. soc. exp. biol. med. 163 ,
402-5 (198,0) ). Es ist auch bekannt, Immunoreaktionsteilnehmer
durch Adsorption oder Ionenaustausch mit einer Trägerfläche zu verbinden, doch sind die Bindungen schwach.
Sportsman und Wilson (Anal. Chem. (1980), £2, 2013-2018)
beschreiben Antikörper, die über deren Proteinaminogruppen
(durch Schiffsche Reaktion und anschiiessende Reduktion mit Natriumborhydrid) kovalent an Aldehydgruppen gebunden
werden, wobei letztere durch die Perjodatoxidation von
Glyzidoxypropylsi1angruppen chemisch an die Siliziumatome
silanisierter poröser Glasmikroperlen als ■ Trä'gerkörper
gebunden werden. Dabei haben die porösen Glasperlen einen Durchmesser von nur 10 Mikron und werden durch Eintauchen
in eine Lösung von Glyzidoxypropyltrimethoxysi1 an (GOPS)
silanisiert. Dadurch haken sich die einzelnen Si 1anmoleküle
chemisch an die einzelnen Siliziumatome des Silikas des
Glasses an. Die organischen Glyzidoxypropylgruppen werden
durch Oxidation in Aldehydgruppen umgewandelt, und diese reagieren ihrerseits mit den Antikörpern, die dadurch
immobilisiert werden. Die Immunosorptionseigenschaften der so erhaltenen trägergebundenen Immunosorbentien wurden
durch die Beobachtung des Verhaltens chromatografi scher,
mit den Mikroperlen gefüllter Säulen untersucht. Zu diesem Zweck wurden zwei Antigene (menschliches IgG und Rinderinsulin) zunächst immunosorbiert und dann durch Senkung des
-I2 -
pH's bzw. mittels Acetonitril freigesetzt. Das Immunosorptionsmittel
muss jeweils gesondert hergestellt werden, wobei für jedes Antigen ein entsprechender
anderer Antikörper verwendet werden muss. Weder AntiInsulin, noch Anti-human IgG Antikörper eignen sich für
die Herstellung von Immunosorbentien mit breitem Anwendungsbereich. Das offenbarte Verfahren ist hinsichtlich
der chemischen Gruppen (Amin) des Immunoreaktionstei1-nehmers,
die für die Immobilisationsreaktion in Frage kommen, als auch hinsichtlich der Geometrie der Bindung
und insbesondere der chemischen und physikalischen Beschaffenheit
des Trägerkörpers und dessen Oberfläche beschränkt. Es ist nicht immer vorteilhaft, dass der
Trägerkörper eine £iliziumhaltige Oberfläche hat, oder
die physikalischen Eigenschaften von Silika (SiO2)hzw Glas)
(z.B. falls metallische oder magnetische Eigenschaften gewünscht werden). Ausserdem wird nicht immer gewünscht,
dass der immobilisierte Vertreter des Antikörper/ Antigenpaares für eine Immunosorptionsreaktion unbedingt
der Antikörper sein muss. Die SiIanisierung der Glasteilchen
laut Stand der Technik ergibt normalerweise eine "Bedeckung" der Glasoberflächen von höchstens
monomolekularem oder häufig geringerem Ausmass.'Eine solche
"Bedeckung" verhindert ' in der Regel nicht die unspezifische
und leicht umkehrbare Adsorption von Testsubstanzen. Das stört wiederum die gewünschten Formen spezifischer
und starker Immunosorption. Unbedeckte siliziumhaltige
Adsorptionsstellen und polare Gruppen auf der Glasoberfläche
-13 -
führen leicht zur Denaturierung empfindlicher proteinartiger
Verbindungen. Die Porosität der Mikroperlen laut Stand der Technik ist zwar für manche Zwecke
erwünscht, ist jedoch für die bevorzugten Anwendungsgebiete der vorliegenden Erfindung als ausgesprochener
Nachteil zu betrachten. Die verfügbare Oberflächengrösse
wird unvoraussehbar und in einer Weise, die von einer Perle zur anderen unterschiedlich sein kann, beeinflusst.
Die Porosität hat eine molekularsiebartige Wirkung, wodurch Exklusions- und molekülargrössenabhängige
Retentionswirkungen der gewünschten selektiven und reinen
immunosorptiven Wirkung überlagert werden und diese stören. Die Winzigkeit der Perlen laut Stand der Technik
macht diese ferner für bestimmte Anwendungen der vorliegenden Erfindung ungeeignet.
Den trägergebundenen Immunosorptionsmitteln laut Stand
der Technik fehlt es jeweils ganz oder teilweise an einer oder mehreren der gewünschten Eigenschaften wie:
Stabilität, allgemeine Anwendbarkeit, hohe Kapazität,
leichte Standardisierbarkeit usw.
Die vorliegende Erfindung soll hinsichtlich dieser Nachteile Abhilfe schaffen und bezweckt ein neues
trägergebundenes (immobilisiertes) Immunosorptionsmittel
mit grosser Anpassbarkeit an eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Die Mittel besitzen die gewünschte Stabilität
-I4 -
Ihre Kapazität lasst sich nach Wunsch auf bestimmte Werte einstellen, die leicht standardisierbar sind.
Insbesondere wird die Schaffung eines neuen Typs trägergebundener Immunosorptionsmittel bezweckt, die'
sich leicht einer Vielzahl immunosorptiver Bestimmungsmethoden, z.B. für diagnostische,mikroanalytische,
forensische und pharmakokinetische Untersuchungen einsetzen lassen.
Die vorliegende Erfindung umfasst mehrere eng miteinander verwandte Erfindungsgedanken, die in den bevorzugten
Ausführungsformen miteinander kombiniert werden.
So sieht die Erfindung erstens ein trägergebundenes
Immunosorptionsmateri al der eingangs/genannten Art vor, worin der Immunoreaktionsteilnehmer - entweder ein Antigen
oder ein Antikörper - kovalent an eine den Trägerkörper umhüllende ver/tetzte Schicht in solcher Weise gebunden
ist, dass immunologisch wirksame Teile des Immunoreaktionsteilnehmers an der Oberfläche in einer der Immunosorption
zugänglichen Form vorliegen. Vorzugsweise ragen sie freiliegend aus der Schicht heraus.
In der vorliegenden Beschreibung werden die Begriffe "immunogen" und "antigen" zuweilen synonym verwendet.
Es gelten die folgenden Definitionen:
-15 -
Immunogen : Ein Immunogen ist ein Fremdkörper, z.B.
Protein oder Partikel, z.B. Virus oder Bakterium, und kann von sich aus eine Immunreaktion in einem
Immunsystem hervorgerufen, die sich im allaemeinen durch
das Erscheinen von Anti körpern, 2 .b . im Kreislauf
eines Tieres äussert, dessen Immunsystem beispielsweise durch Injektion mit dem Immunogen
in Kontakt gebracht wurde.
Antigen : Ein Antigen ist eine Substanz oder ein Teilchen,
welches mit dem entsprechenden spezifischen Antikörper eine Antigen-Antikörperkomplexverbindung
bildet, den sogenannten Immunkomplex, führt jedoch nicht unbedingt selbst zu einer
Immunreaktion in einem Immunsystem.
Hapten :
Immunoreakttonsteilnehmer:
Ein Hapten ist ein Stoff, meist geringen Molekulargewichts, der alleine keine Antikörperbildung
stimulieren kann, die aber zur Reaktion mit einem Antikörper fähig ist, und auch nach
Kupplung mit einem Träger immunogenisch wird.
Eine Substanz diein der Lage ist als einer
der Reaktionspartner an einer Antikörper/Antigen
(oder Hapten) -Komplexbildung teilzunehmen.
Vorzugsweise besteht die Schicht ganz oder teilweise aus vernetzten Proteinmolekülen, bzw. deren Peptidteilen.
Vorzugsweise liefert der Immunoreaktionsteilnehmer selbst die Proteinmoleküle bzw. Pepfidteile oder wenigstens einen
-16 -
erheblichen Teil davon. Hierzu sei erwähnt, dass
sämtliche Antikörper und ein grosser Teil der wichtigsten Antigene Proteine sind bzw. weitgehend daraus bestehen.
Was die für die Vernetzung der £chichtbestandteile
verwendbaren Vernetzungsmittel betrifft, sei auf die
weiter unter folgende Beschreibung des erfindungsgemässen Verfahrens hingewiesen.
Gegebenenfalls enthält die Schicht einen zusätzlichen
vernetzten schi chtbil denden Stoff, vorzugsweise ein
Protein oder Peptid, neben dem eigentlichen Immunoreaktionsteilnehmer
. Dies gilt insbesondere für zwei Fälle:
(a) Falls der Immunoreaktionsteilnehmer nicht in ausreichenden
Mengen zur Schaffung des gesamten schichtbildenden Materials vorhanden ist; und
(b) falls der Immunoreaktionsteilnehmer selbst alleine
keine befriedigende Schicht bildet. In dem Fall kann
der Immunoreaktionsteilnehmer !covalent an das echichtbildende
Material gebunden werden, z.B. mittels einer oder mehrerer zweiseitig reaktionsfähiger Reagenzien,
mit mindestens einer Funktionsgruppe, die mit der zusätzlichen schichtbildenden Substanz reaktionsfähig
ist/und mindestens einer Funktionsgruppe, die mit einer
reaktionsfähigen Stelle des Immunoreaktionsteilnehmers reaktionsfähig ist, vorzugsweise einer Stelle, deren
Verlust keinen oder möglichst wenig Einfluss auf die
1-r
immunologischen Eigenschaften des Immunoreaktionstei1-nehmers
hat. Auch hier sei wiederum hinsichtlich einer vollständigeren Beschreibung der zweiseitig reaktionsfähigen
Reagenzien auf die weiter unter folgende Beschreibung des Verfahrens hingewiesen.
Als schichtbildende Verbindung wird Gelatine, und insbesondere
Gelatine aus Knochen besonders bevorzugt. Gelatine aus Tierhäuten, z.B. Schweinehäuten oder aus
Collagen kommt ebenfalls in Frage. Gegebenenfalls kann
die Gelierfähigkeit der Gelatine, z.B. in der in
der US-PS 3 640 809 beschriebenen Weise erhöht werden. Sonstige zusätzliche schichtbildende Verbindungen sind
die Albumine, z.B. Ovalbumin, Serumalbumin (wird nicht
bevorzugt) und ganz allgemein basische Proteine.
Der Immunoreaktionsteilnehmer kann in der Schicht als
statistisches Gemisch mit der·zusatz!ichen schichtbildenden
Verbindung vorliegen. Die zusätzliche schichtbildende Substanz kann jedoch auch für sich alleine
den Trägerkörper umhüllen und den Immunoreaktionsteilnehmer an seine freiliegende Oberfläche(n) gebunden tragen, z.B.
über ein Vernetzungsmittel oder mit Hilfe einer zweiseitig reaktionsfähigen Verbindung der erwähnten Art.
Die Bezeichnung "Schicht" heisst im vorliegenden Sinne nicht unbedingt eine undurchlässige oder dichte Schicht.
Die erste Forderung gilt der Zusammenhängendheit der Schicht zum Zweck der ausreichend starken Umfassung des
-18 -
η JV-:J { - :;X;„:
Trägerkörpers. Dennoch wird in der Regel eine Schicht
bevorzugt, die die Oberfläche des Trägerkörpers auch möglichst vollständig bedeckt.
Auch in dieser Hinsicht unterscheidet sich die Erfindung vom Stand der Technik gemäss Sportsman und Wilson
indem die Erfindung^ was diesen ersten Erfindunqsqedanken betrifft,
sich der mechanischen Umhüllung des Träaerkörpers seitens der Schicht bedient, statt einer chemischen Verbinduna
mit der Oberfläche des Trägerkörpers selbst. Ferner, falls der Trägerkörper entsprechend der bevorzugten Arbeitsweise vollständig
von einer proteinartigen Schicht bedeckt wird, wird dadurch die Gefahr einer unspezifischen Adsorption und
der Schädigung empfindlicher zu immunosorbierender Verbindungen erheblich verringert.
Die Menge des an den Trägerkörper gebundenen Immunoreaktionsteilnehmers^ezogen
auf die Flächengrösse der Trägerkörperoberf1äche;hängt selbstverständlich
zum Teil vom Molekulargewicht des Immunoreaktionsteilnehmers
ab. im Falle typischer proteinartiger Immunoreaktionsteilnehmer
in einem Molekular- bzw. Teilchengewiehts-
6
bereich von 300 bis 8 χ 10 oder mehr (z.B. Bakterien), als Einzel teilchen- bzw. Einzelmolekularschichten, handelt
bereich von 300 bis 8 χ 10 oder mehr (z.B. Bakterien), als Einzel teilchen- bzw. Einzelmolekularschichten, handelt
2 es sich im allgemeinen um Mengen im Bereich von 30 mg/m
(z.B. für Poliovirus mit einem Teilchendurchmesser von 30 χ
-7 2
10 cm (30 nm) und Grippevirus 120 mg/m bei einem
Durchmesser von 120 χ 10~7 (120 nm) ) bis 1 mg/m für
Stoffe wie Insulin mit einem Teilchendurchmesser von der
.Io -
Grössenordnung von 1 χ 10" cm (1 "fim")'.' Einige
Haptene die als Immunoreaktionsteilnehmer in Frage kommen, sind noch kleiner. Im allgemeinen sind die
Mengen jedoch grosser, da in den bevorzugten Ausführungsbeispielen mehrfache Schichten des Antigens auf der
Körperoberfläche vernetzt sind und wegen der aufgerauten
Oberfläche der Körper. Von diesen Mengen, z.B falls zu wenig Immunoreaktions tei 1 nehmermaterial zur Verfugung steht,
oder falls der Immunoraktionsteilnehmer selbst zur Schichtbildung ungeeignet ist, können zwischen 30% und
1000% aber vorzugsweise nicht mehr als 300 Gew.% bezogen
auf den Immunoreaktionstei1 nehmer mittels eines anderen protein- oderpeptidartigen Streckmittels ersetzt oder
ergänzt werden.
Daraus lä'sst sich ableiten, dass die Menge an Antigen oder Antikörpe
als Bestandteil der Schicht im allgemeinen im Bereich
2
von etwa 0,6 bis 500 mg /m liegt, abhängig von der Antigen-oder Antikörpergrösse, und ob ein zusätzliches ffchichtbildend.es Mittel (Streckmittel) verwendet wird.
von etwa 0,6 bis 500 mg /m liegt, abhängig von der Antigen-oder Antikörpergrösse, und ob ein zusätzliches ffchichtbildend.es Mittel (Streckmittel) verwendet wird.
In den Ausführungsbeispielen wird eine dritte Möglichkeit beschrieben,
wonach die Umhüllungsschicht selbst ausschliesslich aus Protein bzw.
Peptid besteht und ihrerseits den kovalent gebundenen Immunoreaktionsteil
nehmer trägt.
Der Trägerkörper besitzt vorzugsweise eine solche Form, dass er leicht von der Schicht in einer
Weise umhüllt werden kann, dass die Schicht sich nicht leicht löst. Der Trägerkörper kann beispielsweise in
Stabform vorliegen, z.B. als Glasstab, der in eine zu analysierende Flüssigkeit eingetaucht wird. Feste
- 20 -
Körper oder Teilchen einer klar definierten und vollständig
eintauchbaren Form werden jedoch bevorzugt, insbesondere massive Perlen abgerundeter und insbesondere sphäroidaler
Form, vorzugsweise Kugelform, z.B. Glasperlen oder magnetischanziehbare
Perlen, z.B. aus rostfreiem Stahl. Solche Perlen haben vorzugsweise eine grössere Dichte als 1, damit sie
in wässriger Flüssigkeit leicht sinken. Im Gegensatz zum Stand der Technik gemäss Sportsman et alia, sind die Perlen
gemäss bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung massiv, d.h. weder porös noch hohl, und haben auch einen um mehrere
Grössenordnungen grösseren Durchmesser.
Gemäss einer besonderen Ausführungsform der Erfindung
ist Protein A bzw. Concanavi11 in A kovalent an die Schicht
gebunden und trägt seinerseits selektiv eingefangene Antikörpermoleküle, wobei diese am Stielende des Moleküls
gehalten werden. Sowohl Protein A als auch Concanavil1 in A
hat die Eigenscha-ft sehr viele" Antikörper in einer
immunosorptionsähnlichen Weise einzufangen und stark zu
binden. Die so eingefangenen Antikörper bieten ihrerseits
nach aussen gerichtete Immunosorptionsstellen für Antigene gegen solche Antikörper an.
Gemäss einer weiteren erfindungsgemässen Lösung der
vorliegenden Erfindungsaufgabe wird ein trägergebundenes Immunosorptionsmi ttel der eingangsjgenannten Art geschaffen,
dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Trägerkörpers
_ 21 -
bzw. eine diese beschichtende Schicht kovalent gebunden einen ersten ImmunoreaktionsteiInehmer trägt - d.h.
einen Vertreter eines Antigen/Antikörperpaares, wobei der
erste Immunoreaktionsteil■ nehmer durch Antigen/Antikörperkomplexbi!dung
den zweiten Vertreter des Paares festhält, und dieser zweite Vertreter aus der Oberfläche mit einem
Molekularbereich herausragt, der selbst eine gewünschte Immunoreaktivität für eine Immunosorptionsreaktion mit
einem dritten ImmunoreaktionsteiInehmer besitzt.
Hier handelt es sich also um eine Art von "Doppel schicht"
der Immunoreaktionsteilnehmer, wobei die "erste Schicht"
im allgemeinen mit derfesten Untergrundfläche orientierungs· los verbunden ist, wobei aber dennoch eine gewisse
Menge des betreffenden Immunoreaktionsteilnehmers so
ausgerichtet ist, dass dieser eine ausreichende Menge des Immunoreaktionsteilnehmers für die "zweite Schicht"
einfängt und festhält. Die Moleküle des Immunoreaktionsteilnehmers der "zweiten Schicht" besitzen jeweils
einen bestimmten Molekularbereich, der die Fähigkeit besitzt, vom immunoreaktiven Gegenstück der ersten
Schicht immunosorbiert zu werden, sowie einen weiteren
Mol ekul. arberei cn mit der Fähigkeit seinerseits den jeweiligen weiteren Immunoreaktionsteilnehmer zu immunosorbieren,
für den das erfindungsgemässe Produkt als
- 22-
Immunosorbenz bestimmt i st. Dieser zweite Molekularbereich
ist stets so orientiert, dass er von der Unterlage weg
und nach aussen hin gerichtet ist, also weg von der "ersten Schicht". Die spezifischen Bindungsbereiche der
zweiten Schicht sind somit exponiert und können ihrerseits mit den entsprechenden Antigenen reagieren. Die zweite
Schicht kann ihrerseits über kovalente Bindungen mittels entsprechender Kupplungsreagentien der obengenannten Art
fixiert sein, was aber nicht bevorzugt wird.
Vorzugsweise dient das als erste erfindungsgemässe
Lösung beschriebene Produkt gleichzeitig als Zwischenprodukt für die Herstellung des Produktes gemäss der
zweiten erf indungsgem'ässen Aufgabenlösung. Ausserdem sind die verschiedensten wesentlichen bzw. bevorzugten Kennzeichen
der Produkte gemäss der ersten erfindungsgemassen Aufgabenlösung,
vorzugsweise auch in^den Produkten gemäss der zweiten
erfindungsgemassen Lösung vertreten.
Der Erfindungsumfang umfasst auch das Verfahren sowie
das Produkt der Umwandlung dieses Zwischenproduktes, wobei letzteres mit einer wässrigen Lösung oder Suspension des
die zweite Schicht bildenden Immunoreaktionsteilnehmers in Berührung gebracht, und dadurch die "zweite Schicht"
durch Immunosorption "eingefangen" wird. Die Verfahrensbedingungen hierfür lassen sich so standardisieren, dass
- 23 -
die "zweite Schicht" eine standardisierte Anzahl der
gewünschten immunoreaktiven Stellen aufweist. Zu diesem Zweck wird eine bekannte Menge des Immunoreaktionstei1 nehmers
für die zweite Schicht aufgetragen, die so bemessen ist, dass sie die verfügbaren Immunosorptionsstellen der
"ersten Schicht" nur teilweise absättigt.
Das soeben umrissene Verfahren lässt sich auch als eine Ausführungsweise eines Anwendungsverfahrens für ein
erfindungsgemässes Inimunosorptionsmittel betrachten,
dadurch gekennzeichnet, dass man das Inimunosorptionsmittel,
welches auf seiner Oberfläche freiliegend einen immobilisierten
Immunoreaktionstei1 nehmer besitzt, der Spezifizitat gegen
immunogenische Determinanten einer ersten Substanz eines
Gemisches aufweist, die nicht bei anderen Substanzen des Gemisches vorliegen, mit dem Gemisch innig in Berührung bringt,
und dadurch die erste Substanz selektiv immunosorbiert ,und man anschl i essend die Berührung 'des Immunosorptionsmi ttel s
mit dem Gemisch unterbricht.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des obenbeschriebenen
Zwischenproduktes (das aber an sich bereits ein wertvolles verkäufliches Erzeugnis darstellt) bestehen
die Immunoreaktionsteilnehmer der ersten Schicht aus
Antikörpern gegen einen besonderen immunogenischen Molekularbereich,
der sich seinerseits leicht ( als passendes Gegenstück zum Eingefangenwerden von der "ersten Schicht") in
- 24-
die Moleküle (im all gemeinen,das eine Ende von entsprechenden
Makromolekülen) einer breiten Pallette verschiedenster Itmnunoreaktionsteilnehmer eingebaut werden kann, die für die
Bildung der "zweiten Schicht" gewünscht werden, z.B. eine breite Pallette höchst spezifischer Antikörper für
die verschiedensten Jmmunobestimmungsmethoden. In der
praktischen Durchführung heisst dies beispielsweise, dass in einer ersten Schicht kovalent gebundene und vernetzte
Antikörper vorliegen, die spezifisch in einer ersten Tierart gegen Antikörper einer zweiten bestimmten Tierart
(z.B. durch entsprechende Immunisierung) hervorgerufen wurden,
- z.B. Säugetiereserums- IgG(Kaninchen, Schaf oder Pferd oder sonstiges geeignetes Tier) angeregt durch Immunisierung gegen
IgY als Antigen,und welches zum Beispiel aus Eidottern von Geflügeleiern gewonnen wurde; oder Säugetierserum IgG
eines Säugetieres, hervorgerufen durch Immunisierung gegen ein anderes Säugetier. Eine solche"erste Schicht" besitzt
nur insofern Spezifizitat, als doren Einfangvermögen auf die
Antikörper aus einer bestimmten Tierart beschränkt ist. (Im spezifischen Beispiel von Antikörpern von IgY heisst dies,
dass spezifische Antikörper solange selektiv eingefangen werden, als sie aus dem Eigelb von Geflügeleiern stammen.)
Dieses "Zwischenprodukt" stellt bereits an sich ein wertvolles Handelserzeugnis dar, nämlich dann, wenn beabsichtigt
wird, dass der Endverbraucher selbst, den Immunoreaktions-
_ 25 _
teilnehmer (z.B. einen monospezifischen Antikörper, z.B.
wionospezifisches TgY) zur Vervollständigung der "Doppelschicht"
für einen bestimmten Test aussuchen und selbst auftragen soll. Solche monospezifische Antikörper können für diesen
Zweck ebenfalls käuflich angeboten werden. Sie können aber auch vom Endverbraucher gemäss Gebrauchsanweisung des
Herstellers angefertigt werden. Da ein bestimmter Antikörper der "ersten Schicht" beiiebige Antikörper für die "zweite
Schicht" bindet, solange sie aus der vorgeschriebenen Quelle stammen, (d.h. in einem Tier,gegen welches die Antikörper
der "ersten Schicht" spezifisch sind, hervorgerufen und gezogen wurden; bzw. anschliessend durch ZeI 1 enkul tür , z.B.
monoklonis'che Zeil enkul tür , reproduziert wurden), ergibt
sich zwangsläufig, dass die mit einer bestimmten Art Antikörper
für die "erste Schicht" überzogenen Glasperlen oder dergleichen für die verschiedensten Bestimmungen (z.B.
verschiedene ELISA oder RIA Bestimmungen ) verwendbar sind, je nach Wahl der Antikörper für die "zweite Schicht".
Für die Züchtung besonderer und hoch spezifischer Antikörper, insbesondere für die "zweite Schicht" stehen dem Fachmann
verschiedene bekannte Methoden zur Verfugung, einschliesslich
derer gemäss der DE-OS 2951412. Als Teil der vorliegenden
Offenbarung sei, insbesondere in diesem Zusammenhang, auch
- 26 -
mm
geändert
auf die Lehre gemäss der gleichzeitig eingereichten
Anmeldung/"entsprechend der südafrikanischen If*
Priorität 81/4898 (Unser Zeichen: 1A-56 226) hingewiesen. Weitere Reinigung der Antikörper
zur Erhöhung ihrer Spezifizität lässt sich gegebenenfalls
mit bekannten Verfahren erreichen, oder dadurch, dass die Immunosorptionsmittel gemäss der vorliegenden Erfindung
als Trennmittel für ein Immunosorptions-Trennverfahren
verwendet werden. Die Anreicherung bzw. Reinigung ist auch durch fraktionierte Fällung in einem bestimmten pH-Bereich,
z.B. mit einem Polyalkylenglykol als Fällungsmittel
z,B. mit Polyäthylenglykol möglich. Diese letztere
Verfahrensweise beruht auf der überraschenden
Feststellung , dass Antikörper gegen Immunogene verschiedenen Molekulargewichtes unterschiedliche
isoelektrische pH-Werte aufweisen. Sie haben deshalb ihre
geringste Löslichkeiten bei unterschiedlichen pH-Werten.
Unter anderem anwendbar für den zuletzt genannten Zweck sieht die Erfindung (auch als eine Ausführungsform der
bereits genannten Anwendungsweise) ein Immunosorptions-Trennverf ahren vor, dadurch gekennzeichnet, dass man das
Immunosorptionsmittel,welches auf seiner Oberfläche freiliegend
einen immobilisierten Immunoreaktionsteilnehmer
besitzt, der Spezifizität gegen immunogene Determinanten einer ersten Substanz eines Gemisches aufweist, die nicht
- 27 -
bei anderen Substanzen des Gemisches vorliegen, mit dem Gemisch innig in Berührung bringt und dadurch
die erste Substanz selektiv immunosorbiert, man anschliessend
die Berührung des Immunosorptionsmittels
mit dem Gemisch unterbricht, und dann die erste Substanz in gereinigter Form durch Desorption vom Immunosorptionsmittei
freisetzt. Geeignete Desorptionsbedingungen für diesen Zweck sind an sich bekannt. Schwache Säuren,
z.B. Propionsäure kommen als Desorbenz in Frage, z.B. bei pH3 bis 4 , insbesondere 3,5 zur Freisetzung mancher
immunosorbierter Stoffe. Andere Beispiele sind Acetonitril und Glycin-HCl Puffer (pH2,6 bis 2,9).
Aus dem Obengesagten ergibt sich als dritte erfindungsgemässe
Lösung der Erfindungsaufgabe-und als eine bevorzugte
Ausführung des zu Grunde liegenden Erfindungsgedankens
ein trägergebundenes Immunosorptionsmittei der eingangs
bezeichneten Art, dadurch gekennzeichnet, dass in einer "ersten Schicht" kovalent gebundene und vernetzte Antikörper
vorliegen, die spezifisch in einer ersten Tierart gegen Antikörper einer zweiten Tierart hervorgerufen wurden, und
dass auf der ersten Schicht eine zweite Schicht immunosorbiert vorliegt, die aus spezifischen Antikörpern besteht,
die in der zweiten Tierart gegen ein spezifisches Antigen hervorgerufen wurde. Für bestimmte Zwecke, z.B. wo die
Bindeeigenschaften von IgY eine besondere Überlegenheit
_ 28 -
zeigen, (höhere Stabilität, höhere Avidität bzw. Affinität, leichtere Beschaffbarkeit, Abwesenheit von proteolytischen
Enzymen) , wählt man als zweite Tierart vorzugsweise einen Vogel, insbesondere eine Geflügelart, vorzugsweise ein
Huhn. Dabei werden die im Vogeltier gezüchteten Antikörper vorzugsweise aus dem Eigelb des Eis bzw. der Eier des
betreffenden Vogels gewonnen, Auch hierzu sei wieder auf die DE-OS 29 51 412 hingewiesen.
Erfindungsgemäss soll auch eine Anwendungsmethode der
oben beschriebenen Immunosorptionsmittel unter Schutz
gestellt werden, dadurch gekennzeichnet, dass man das Immunosorptionsmittel,.welches an seiner Oberfläche
exponiert 'eine genormte Menge eines Immunoreaktionsteilnehmers trägt, in innige Berührung bringt mit einer
Lösung des zweiten Immunoreaktionsteilnehmers und die
Menge des zweiten Immunoreaktionsteilnehmers der Lösung
bestimmt wird, die am Immunosorptionsmittel immunosorbiert
wird.
Gemäss einer Ausführungsweise (die sich besonders für
die Bestimmung verha'l tnismässig grosser Antigene eignet)
wird das mit dem zweiten ImmunoreaktionsteiInehmer der Probe beladene Immunosorptionsmittel in eine Lösung eines
markierten Immunoreagenses eingetaucht, der ein komplementäres Gegenstück zum immunosorbierten Immunoreaktionsteilnehmer
bildet. Das gelöste Immunoreagenz ist.
- 29 -
beispielsweise mit einem Enzym markiert, das mit dem
Substrat des Enzyms eine messbare Farbreaktion ergibt. (Das Substrat ist ein Stoff, dessen Zersetzung oder
chemische Änderung von dem betreffenden Enzym katalytisch beschleunigt wird.) Für die Markierung kommen auch
radioaktive Isotope in Frage. Die Mengenbestimmung der markierten Substanz kann dann unmittelbar an der Glasperle
oder durch Substraktion an der Restlösung des Reagenzes bestimmt werden. Andererseits (z.B. falls die
Konzentration verhältnismässig kleiner Antigene bestimmt
werden soll) kann man die Antigenprobenlösung mit einem
bekannten Volumen einer Standardlösung mischen, die den gleichen Immunoreaktionsteilnehmer in markierter Form
enthält und das Gemisch dann mit dem erfindungsgemässen
Immunosorptionsmittel in innige Berührung bringen, wobei
die markierten und unmarkierten Immunoreaktionstei1nehmermoleküle
miteinander konkurrieren und die Immunosorption des markierten ImmunoreaktionsteiInehmers in einer Menge
stattfindet, die der Menge des unmarkierten Reaktionsteilnehmers der Probe umgekehrt proportional ist.
Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung trägergebundener Immunosorptionsmittel vor, insbesondere
der obenpeschriebenen Art, dadurch gekennzeichnet, dass auf einen festen Trägerkörper eine diesen umhüllende
Schicht aus vernetzbarem Protein oder Peptidmaterial aufge-
-30
tragen wird, wobei in die Schicht oder auf deren Oberfläche
ein gewünschter ImmunoreaktionsteiInehmer eingebaut
wird, die Schicht vernetzt und der Immunoreaktionstei1 nehmer
kovalent, vorzugsweise mittels mindestens eines Vernetzungs- bzw. zweiseitig reaktiven Kupplungsmittels
gebunden wird.
Einige der Lehren,die sich auf das Verfahren beziehen,
insbesondere was die Mengen und einige der zu verwendenden Stoffe betrifft, ergeben sich bereits aus der obigen
Beschreibung des erfindungsgemässen Immunosorptionsmittels
und brauchen somit keine Wiederholung.
Im Gegensatz zu manchen zum Stand der Technik gehörenden Lösungen, bedienen sich Ausführungen der vorliegenden
Erf indung einer physLkalisdaea Umhül lung bzw. Verkrallung der
Schicht mit der Oberfläche des Trägerkörpers statt einer direkten chemischen Reaktion mit dieser Oberfläche.
DiephysikaliscteVerkrailijngwirci vorzugsweise durch Aufrauhung
der Oberflächentextur gefördert. Zum Beispiel werden die
Glasperlenoberflachen vorzugsweise durch Schmirgelwirkung aufgerauht, z.B. mit Siliziumkarbidpulver, bis die Perlen
matt aussehen.
Die beiliegenden Patentansprüche sind als Teil der vorliegenden
Offenbarung zu betrachten. Im folgenden soll die Erfindung und insbesondere das Verfahren anhand der Zeichnungen weiter erläutert werden.
Die Zeichnung stellt diagrammatisch eine bevorzugte Aus-
führungsweise des erfindungsgemässen Verfahrens zur
Herstellung eines erfindungsgemässen Immunosorptionsmittels
dar. Im Diagramm werden auch erfindungsgemässe Produkte schematisch dargestellt, und ebenso bevorzugte Anwendungen
des Produktes.
In der Zeichnung wird der erste Verfahrensschritt mit I
bezeichnet. Glasperlen 1 (von denen nur eine gezeigt wird) mit einem Durchmesser von beispielsweise 0,05 mm bis 15 mm,
im vorliegenden Beispiel z.B. 6 mm, werden gründlich gewaschen und falls erforderlich, entfettet. Die Perlen
können ovaloidal oder ellipsoidal sein, sind aber vorzugsweise spheroidal und insbesondere kugelförmig. In Verfahrensstufe II werden sie mit einem Schmirgelpulver aus Siliziumkarbid
geschüttelt, bis die Oberfläche 2 eine matte und undurchsichtige Textur erlangt hat. Zur Reinigung der
Oberfläche werden die Perlen 5 Minuten in konzentrierter Salzsäure gekocht (andere Reinigungsmethoden z.B. mit heisser
Chromsäure kommen seibstverständlich ebenfalls in Frage).
Nach der Abkühlung werden die Perlen mit destilliertem
Wasser gewaschen. Säurereste werden durch 10 Minuten langes Kochen der Perlen in 10% Natriumcarbonatlösung neutralisiert.
Anschliessend werden die Perlen abgekühlt und
wiederholt mit ■ deionisiertem, durch ein 0,25 Mikronfilter
filtriertes Wasser gewaschen, im Wärmeofen getrocknet, und wieder abgekühlt.
_ 32 _
In Stufe III wird ein erster Immunoreaktionsteilnehmer
als "erste Schicht" aufgetragen. Es sei hier angenommen, dass der Immunoreaktionsteilnehmer selbst ein Protein ist,
oder peptidartigen Charakter besitzt, und somit als schichtbildendes Protein oder Peptidmaterial verwendbar ist.
Es wird auf die Perlen I als wässrige Lösung mit einer
Konzentration von z.B. ι bis 30, vorzugsweise I bis 20 mg/ml
aufgetragen, 0,1 M Kochsalzlösung oder Puffer wird als wässriges Lösungsmittel bevorzugt. Der Immunoreaktionsteilnehmer ist entweder ein bestimmtes Protein oder peptidartiges
Antigen (z.B. ein Virusantigen) oder ein Antikörper, oder aber ein Prote-in oder Peptidmolekül das an sich eine
Affinität für Antikörper oder Antigene für die "zweite Schicht" besitzt (z.B. Protein A oder Concanavil1 in A).
Im vorliegenden Beispiel wird eineSchicht von Antikörpern 3, bestimmter Spezifizität als "erste Schicht" aufgetragen,
z.B. Schaf IgG-Anti-Kaninchen IgG (falls die"zweite Schicht" aus Kaninchen- IgG bestehen soll) oder Schaf fqQ-Anti-"IgY
(falls die "zweite Schicht" aus IgY bestehen soll aus Eidotter gewonnen). 75 Glasperlen 1 werden in eine
Petrischale aus Kunststoff zusammen mit 1 mj der Antikörperlösung
für die "erste Schicht" (in einer,Konzentration von etwa 20 mg/ml - siehe Beispiel 1) gegeben. Die Perlen werden
sanft in der AntikörperTÖsung umgewälzt und dadurch gleichmassig
angefeuchtet und anschliessend nacheinander in ähnlicher Weise in weiteren 5 trockenen Petrischalen aus
Kunststoff umgewälzt, damit überschüssige Antikörperlösung abgetrocknet wird. Wie bereits erwähnt wurde, falls man
- 33 -
die Konzentration der Immunosorptionsstellen auf der
Perlenoberfläche verringern möchte, oder falls die verfügbare
Anti körpermenge gering ist, können auch geringere Antikörperkonzentrationen der Lösung verwendet werden,
und damit genügend Schichtbildungsmaterial vorliegt,
kann der Antikörpergehalt der Lösung mit einem geeigneten Protein oder Peptid gestreckt werden, z.B. in einer Menge
von 30 bis 1000 %, vorzugsweise nicht mehr als 300 Gevi.%,
bezogen auf die Antikörpermenge. Geeignete Schichtbildungsstreckmittel
sind beispielsweise Gelatine, Albumin, Lact-r
albumin und teilweise hydrolisierte Proteine.
In der Stufe IV wird die "erste Schicht" der Antikörper vernetzt, im vorliegenden Beispiel mit Glutaraldehyddämpfen
(gesättigt). Hierzu wird eine 25-prozentige Glutaraldehydlösung
5mm tief in eine flache Glasschale gefüllt, die dicht mit Aluminiumfolie überdeckt und mehrere Stunden
stehengelassen wird, bis die Atmosphäre oberhalb der Lösung gesättigt ist. Die Glasperlen aus Stufe III lasst man dann
in einer Petrischale auf der Glutaraldehydlösung treiben, wobei die Glasschale wieder dicht abgedeckt wird, und die
Glasperlen den Dämpfen etwa eine Stunde oder länger(bei
Zimmertemperatur von 18 bis 25 C) ausgesetzt werden. Diese Zeitveränderliche hängt zum Teil zusammen mit:
(a) der Konzentration der in Stufe VI verwendeten Antikörper für die "zweite Schicht" und
(b) der Länge der Inkubationszeit für die Adsorption (Immunosorption)
der Antikörper der "zweiten Schicht".
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Verschiedene Kombinationen dieser Veränderlichen geben gute Ergebnisse und deshalb seien hier nur einige Hinweise
gegeben, insbesondere da die gewünschte Menge an Antikörpern der "zweiten Schicht" auch von der beabsichtigten Verwendung
des Immunosorptionsmittels abhängt. Zum Beispiel falls das
Immunosorbenz für eine besondere Bestimmungsmethode, z.B.
eine Radioimmunoanalyse (RIA) oder eine Enzym-verknüpfte
Immunosorptionsanalyse (enzyme-linked immunosorbent assay Elisa)
verwendet werden soll, so fällt die bevorzugte Menge an Antikörpern zur Bindung der zu bestimmenden
Substanz (z.B, ein Hormon oder ein Arzneiwirkstoff) binnen gewisse Grenzen, die im allgemeinen bekannt sind
oder ohne weiteres bestimmt werden. Brauchbare Kontaktzeiten liegen im allgemeinen zwischen 20 Minuten und drei
Stunden bei Zimmertemperatur (18 - 250C). Im allgemeinen
ergeben 30 Minuten bis 180 Minuten, insbesondere 60 bis 120 Minuten gute Resultate, insbesondere, falls die übrigen
Veränderlichen (a) und (b) von'der weiter unten beschriebenen
Grössenordnung sind. Berührungszeiten von 60 Minuten bis 2 Stunden in Stufe IV ergeben im allgemeinen ein gutes
"Einzelschicht"—Produkt für allgemeine Verwendungszwecke. Erhöht man die Konzentration der Antikörper für die
"zweite Schicht" ( Veränderliche (a)) in Stufe VI bzw.
erhöht man die Immunosorptionszeit für die "zweite Schicht"
(Veränderliche (b)), so bewirkt dies eine Verlängerung der empfohlenen Optimalzeit für die Berührung mit dem Vernetzungsmittel
oder umgekehrt.
- 35 -
Die Kombination dieser Veränderlichen bestimmt die Anzahl
der verfügbaren Immunosorptionsstellen pro Glasperle,für
die ihrerseits jeweils entsprechend dem beabsichtigten Verwendungszweck der Perle ein Optimalwert gilt. Die
Anzahl der so verfügbaren Immunosorptionsstellen, lässt sich beispielsweise durch Messung der am Produkt
immunosorbierten Menge eines radioaktiv markierten Immunoreaktionsteil
nehm ers bestimmen.
Nach der Vernetzung ist es im allgemeinen (mit Ausnahme der weiter unten beschriebenen Fälle) notwendig - Stufe V den
Überschuss an funktionellen Gruppen des Vernetzungsmittels (diagrammatisch angedeutet als härchenartige
Linien 4a) zu entfernen oder blockieren. Im Falle von Aldehyden wie Glutaraldehyd verwendet man z.B. ein reaktives
Amin wie Ethanolamin. Vorher wäscht man jedoch vorzugsweise etwaiges noch ungebundenes Vernetzungsmittel , z.B. mit
Wasser oder verdünnter Salzlösung, ab. Danach werden die Perlen in einprozentige wässrige Rthanolaminlösung gegeben,
wobei beispielsweise die Alkalinität durch Lösen in einem verdünnten Puffer wie 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,6
gemässigt wird. Im allgemeinen genygt eine Stunde zur Blockierung der überschüssigen Aldehydgruppen. Man verwendet
etwa 100 ml Lösung für 75 Perlen. Unreagiertes Äthanolamin wird durch 3 maliges Waschen mit Phosphatpuffer (50 ml,
0,1 M, pH 7,6) abgewaschen. Statt Ethanolamin kann man auch Glyzin verwenden, doch wird dies weniger bevorzugt.
-36 -
Die so erhaltenen Perlen la stellen eine Ausführungsform
eines erfindungsgemässen Immunosorptionsmitteis dar, und
eignen sich als Zwischenprodukt für die weiter unten beschriebene Weiterverarbeitung. Sie besitzen eine
Schicht 4 ("erste Schicht") aus vernetzten! Protein oder
Peptid, teilweise oder völlig bestehend aus vernetzten Antikörpern 3, wovon die Perle 1 umhüllt wird. Diese
Antikörper 3 sind in der "ersten Schicht" des Filmes 4
ohne richtungsmässige Orientierung angeordnet. Einige der Antikörper 3a sind jedoch so ausgerichtet, dass ihre
Antigeneinfangstellen soweitgehend nach au ssen gelichtet sind
und aus der Schicht hervorstehen, dass sie als Immunosorptionsstellen
auftreten können. Die blockierten Glutaraldehydketten
werden als 4b bezeichnet.
Zweckmässigerweise beträgt die Anzahl der verfügbaren Immunosorptionsstellen in der "ersten" Antikörperschicht
etwa die Hälfte der Anzahl der.davon einzufangenden Antigenmoleküle,
da die stärkste Immunsorption eintritt, falls jeder Antikörper zwei Antigene einfängt.
Das Produkt gemäss Stufe V lässt sich längere Zeit lagern, vorzugsweise kalt, z.B. bei 40C.
In Stufe VI wird das Produkt der Stufe V (entweder nach Lagerung oder sofort) in ein "Doppelschichf'-Produkt der
Erfindung durch Auftragung einer "zweiten Schicht" eines
- 37 -
Immunoreaktionstei1 nehmers umgewandelt. Im vorliegenden
Beispiel handelt es sich bei dem Immunoreaktionstei1 nehmer
für die "zweite Schicht" um eine andere Art Antikörper, die einerseits antigenisch für die Antikörper der
"ersten Schicht" ist, und die andererseits eine spezifische Affinität für ein besonderes Hapten besitzt (z.B. einen
Stoff, der mittels einer Immunosorptionsbestimmungsmethode bestimmt werden soll). Es sei beispielsweise angenommen,
dass das Schilddrüsenhormon T' bestimmt werden soll. Die
Antikörper der "ersten Schicht" seien Schaf-IgG gegen
Kaninchen-IgG und die Antikörper für die "zweite Schicht"
seien Kaninchen-IgG mit einer Spezifizität gegen T3.
Ein weiteres Beispiel für die Antikörper der "ersten Schicht" sind Schaf-IgG gegen IgY (aus Eidotter) und die Antikörper
für die "zweite Schicht" sind "iqY , gewonnen aus den Eidottern
von Eiern von Hühnern, die aktiv gegen T3 immunisiert wurden.
Die Bedingungen für Stufe VI werden (empirisch) so festgelegt, dass die Antikörperkonzentration in der "zweiten
Schicht" für den gewünschten Zweck des Immunosorptionsmittels
geeignet ist. Dafür gelten die folgenden Grundsätze:
1. Für eine Bestimmung wie RIA muss die Antikörpermenge
stets kleiner sein, als die zu bestimmende Antigenrnenge. Sonst gilt die Annahme, dass die gebundene,
radioaktiv markierte Antigenmenge der Menge an unmarkiertem Antigen umgekehrt proportional ist, nicht mehr
- 38 ~
2. Die von der "ersten Schicht" eingefangene Menge an Antikörpern der "zweiten Schicht" hängt von den
Aviditätseigenschaften und der Menge der Antikörper in der "ersten Schicht" ab, sowie der Konzentration
der Antikörperlösung für die"zweite Schicht'! der Berührungszeit damit und der Temperatur.
3. Die Anzahl der Antikörpermoleküle für die "zweite
Schicht", die der "ersten Schicht" zum Immunosorbieren angeboten wird, sollte jedoch mindestens zweimal der
Anzahl der freiliegenden Antikörperstellen der "ersten
Schicht" entsprechen, damit eine starke Immunosorption der Antikörpermoleküle der "zweiten Schicht" stattfindet.
4. Die Anzahl der die "zweite Schicht" bildenden Antikörpermoleküle
sollte ihrerseits jedoch so beschränkt sein, dass mindestens zwei Antigene zum Einfangen für
jedes der Antikörpermoleküle der "zweiten Schicht"
unter den vorgesehenen Verwendungsbedingungen des "Doppelschicht". Immunosorbenten vorliegen.
5. Trotzdem ist die Berührungszeit der "ersten Schicht"
mit der "zweiten Schicht" - Antikörperlösung so zu begrenzen, dass einige der Antikörper der "ersten
Schicht" unbesetzt bleiben. Auf Grund der oben^eschriebenen Grundsätze verwendet man die Antikörper der "zweiten
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Schicht" in einer Menge von 1 bis 20 Mi krogramm pro
Perle, vorzugsweise 2 bis 5 Mikrogramm z.B. 2 Mikrogramm im Falle von Schaf- oder Kaninchen-TgG oder Geflügel-IgY
gegen T . Die Antikörper werden in Phosphatpuffer (O,IM pH 7,6) gelöst, in einem Volumen, das die
Perlen .vol1 ständig bedeckt. Die Tränkung der Perlen
in der Antikörperlösung findet zwischen O0C und der
Denaturierungstemperatur der Antikörper (etwa 560C) statt, mit der Auflage, dass mindestens ein Teil der
Tränkung bei einer niederen Temperatur stattfindet, bei der eine besondere Wirkung eintritt (anscheinend
auf Grund einer Änderung der Molekularform) die zu
einer starken Retention der "zweiten Schicht" durch die "erste Schicht" führt. Die für die Tränkung erforderliche
Gesamtzeit ist temperaturabhängig, wobei höhere Temperaturen die Bildung der "zweiten Schicht"
beschleunigen. Im bevorzugten Beispiel wird die Lösung auf einem Wasserbad lauwarm vorgewärmt, insbesondere
auf zwischen 30 und 40 C, vorzugsweise 370C. Die
Glasperlen la werden dann in die vorgewärmte Lösung eingetaucht und die vorher festgelegte Temperatur
wird für eine im voraus festgelegte erste Tränkungsdauer eingehalten. Diese lässt sich am besten empirisch
bestimmen und beträgt im allgemeinen zwischen 1 und Stunden je nach Temperatur, Konzentration der Antikörperlösung
und Avidität der Antikörper der "ersten Schicht".
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Bei der bevorzugten Temperatur von 370C liegt das
Optimum im allgemeinen zwischen 1,5 und 2 Stunden, insbesondere 1,7 bis 1,8 Stunden. Falls die Tränkungsdauer zu kurz oder zu lang ist, wirkt sich dies ungünstig
auf die mit den Perlen durchgeführten Bestimmungen, z.B. RIA, aus. Man erzielt überlegene Ergebnisse, falls
die Perlen anschliessend in der Antikörperlösung auf
eine niederere Temperatur abgekühlt werden, vorzugsweise zwischen 0 und 1O0C, z.B. 3 bis 50C, inbesondere 40C,
gefolgt von einer zweiten Tränkungsdauer in der Lösung bei der niederen Temperatur. Diese zweite Zeitdauer wird
ebenfalls empirisch optimiert und beträgt im allgemeinen zwischen 10 und 60 Minuten (je höher die Temperatur,
desto kürzer die Zeit), vorzugsweise zwischen 20 und Minuten, z.B. 30 Minuten bei 40C.
Die erhaltenen Perlen Ib werden aus der Lösung entfernt
und dreimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Dieser wird vorzugsweise ein oberflächenaktives
Mittel beigemischt. Zwischen 0,05 und λ% PoIyoxyäthylensorbitolmonooleat
(Handelsprodukt Tween 20 oder Tween 80), vorzugsweise 0,1% des oberflächenaktiven Mittels
wirken sich stabilisierend auf die Antikörper aus, und insbesondere auf'icjY Antikörper. Die Perlen Ib können
dann sofort für eine Bestimmung verwendet werden, oder für späteren Gebrauch gelagert werden, vorzugsweise
bei niederer Temperatur, z.B. 40C. Sie besitzen eine
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"erste Schicht" 4 in Gestalt einer vernetzten Schicht mit Antikörpern 3, von denen einige 3a nach aussen gerichtet
sind und herausragen. Ein grösserer Teil dieser Antikörpermoleküle der "ersten Schicht" hat jeweils zwei Antikörpermoleküle
5 der "zweiten Schicht" eingefangen (die in der Zeichnung in dünneren Linien gezeichnet wurden, zur
besseren Unterscheidung von den in schwereren Linien gezeichneten Antikörpern 3). Die Antikörper haben eine annähernd
Y-artige Form, wobei der Kopfteil des Y die Einfangstelle
darstellt (von denen jede zwei Antigene immunosorbiert).
Das Stielende des Y der Antikörper 5 enthält antigenische Determinanten, für die die Antikörper 3a der "ersten Schicht"
spezifisch sind. Somit halten die Antikörper 3a die eingefangenen Paare der Antikörper 5 der "zweiten Schicht"
jeweils am Stielende fest. Daraus ergibt sich eine vorzugsorientierung der Antikörper 5 mit ihren EinfangsmolekUlteilen
radial nach aussen gerichtet. Das steht im Gegensatz zur fehlenden Orientierung der Antikörper 3, 3a der
"ersten Schicht" .
Die verdünnte Antikörperlösung für die "zweite Schicht" kann wiederholt verwendet werden, muss aber bei niederer
Temperatur (4c) gelagert werden.
Die Perlen Ib können gemeinsam mit den übrigen Chemikalien,
Reagentien und Standardproben für eine gewisse Bestimmungs-
- 42 -
methode als "Kit" in den Handel gebracht werden. Im Falle
einer Radioimmunoanalyse (RIA) beinhaltet ein "Kit" Standardproben der zu bestimmenden Substanz und eine Menge
der gleichen Substanz (oder einer, immunologisch davon nicht unterscheidbaren Substanz), die eine radioaktive
Markierung trägt, (z.B. G oder Tritium oder I).
In der Zeichnung stellt Stufe VII schematisch dar, was
in einem RIA Test für T3 Schilddrüsenhormon stattfindet.
Eine Lösung (die Standardlösung oder die unbekannte Probe) mit 0,06 M Barbitonpuffer auf pH 8,6 gepuffert,
mit einem bekannten oder unbekannten Gehalt an normalem T3 und einem weiteren bekannten Gehalt an mit radioaktivem
125 * *·
I markierten T^, wird auf einem Wasserbad auf eine
bestimmte lauwarme Temperatur erwärmt (z.B. 370C). Eine
" doppelbeschichtete" Perle Ib wird in die Lösung gegeben
und dort bei der festgelegten Temperatur eine bestimmte Zeit lang, z.B. zwei Stunden -lang belassen. Die Lösung
wird dann mit der Perle darin auf eine vorgeschriebene geringere Temperatur abgekühlt, die für eine weitere vorgeschriebene
Zeit eingehalten wird (z.B. 40C , 30 Minuten lang)
Dann wird die Lösung von der Perle entfernt. Die Perle wird z.B. dreimal gewaschen mit z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung,(vorzugsweise
mit 0,1 % Tween 20). Die Perle wird dann in ein Zählrohr gegeben, und seine Radioaktivität
wird eine Minute lang in einem Gammazähler gezählt. Die
Gammazählung ist der Menge des radioaktiv markierten T,
welches von der Perle lein der Stufe VII immunosorbiert
-43 -
wurde,direkt, proportional .' Wie der Zeichnung zu entnehmen
ist, haben diejenigen Antikörper 5 der "zweiten Schicht", die Antigenmoleküle 6 immunosorbiert haben, sowohl "normales"
T3 als auch radioaktivmarkiertes T^ eingefangen, und
zwar in einem Verhältnis von T3*· : T3, welches dem
Verhältnis in der Probe entspricht, vorausgesetzt, dass die Gesamtmenge an Antigen in der Lösung grosser ist
als die maximale Einfangkapazität der Antikörper 5 auf der
Perle Ib. In dem Falle gilt dann dass die gemessene Radioaktivitätszählung der Menge an T- in der Probe umgekehrt
proportional ist.
Wie bereits oben gesagt wurde, kann der Immunoreaktionsteilnehmer selbst, ganz oder teilweise das Material, aus demdie
Schicht gebildet wird, liefern, oder wird dieses mit einem zusätzlichen protein- oder peptidartigen schichtbildenden
Material angereichert oder wird die eigentliche Schicht ausschliesslich vom Schichtbildungsmaterial gebildet,
während der Immunoreaktionsteilnehmer kovalent an den
Film gebunden wird,z.B. mit Hilfe von zwei oder mehr zweiseitig reaktionsfähigen Reagenzen. Zur Durchführung
der letzteren Variante wird Stufe III gemäss der Zeichnung so abgeändert, dass statt der Lösung von Antikörpern 3
zunächst ausschliesslich eine Lösung des schichtbildenden
Proteins oder Peptids, z.B. Gelatine verwendet wird. Dann folgt die Vernetzung wie in Stufe IV, woraus sich ein
Film ergibt, an dem noch tälweise reagierte Ketten des Vernetzungsmittels hängen.Anstelle der Stufe V folgt dann
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eine "Blockierung" der unr.eagierten Verkettungsgruppen
des Vernetzungsmittels durch Reaktion mit den reaktiven Molekülstellen der Antikörper^. Diese Verfahrensweise
ist z.B. vorteilhaft, falls die verfügbare Menge an Antikörpern 3 gering ist, da dann ein grösserer Prozentsatz davon für die Immunosorptionsstellen auf der
Schichtoberfläche erhalten bleibt,
Die Vernetzungs- oder zweiseitig reaktionsfähigen Verkettungsreagentien müssen mindestens zwei funktionelle Gruppen
besitzen, von denen wenigstens eine kovalent zur Bildung einer Bindung mit einer reaktionsfähigen Molekülstelle des
Immunoreaktionsteilnehmers reaktionsfähig ist, während mindestens eine weitere funktionelle Gruppe (der gleichen
oder anderen Art) zur Teilnahme an einer kovalenten Bindungsreaktion mit einer reaktiven Molekülstelle des jeweiligen
Protein- oder Peptidmaterials oder des Materials^das als
schichtbildendes Material dienen soll, reaktionsfähig s*ein muss.
Falls die funktionellen Gruppen des Kupplungsreagenses
verschiedenartig sind, wählt man die eine Gruppe vorzugsweise spezifisch zur Reaktion mit einer spezifischen Art
reaktiver Molekülstelle des Immunoreaktionsteilnehmers,
während die andere spezifisch zur Reaktion mit einer bestimmten Art reaktiver Stelle zur Bindung an das schichtbildende Material gewählt wird. Die Immunoreaktionsteilnehme
- 45- -
verfügen im allgemeinen über mehrere Arten reaktiver
Stellen, von denen einige mit grösserer Wahrscheinlichkeit
als andere zur besonderen und spezifischen Immunoaktivität des betreffenden Immunoreaktionsteilnehmers
beitragen, d.h. eine besondere Rolle für die Immunosorptionsreaktionen
spielen. Man wählt deshalb eine Art von Reaktionsstelle, die sich besonders zur Bindung des
Immunoreaktionsteilnehmers eignetfaber so,dass trotzdem
ein Maximum der spezifischen gewünschten immunologischen
Eigenschaften erhalten bleibt, unter Berücksichtigung der obengenannten Grundsätze, gegebenenfalls durch einfache
Versuche mit verschiedenen Kupplungsreagentjen .
Typische, funktionell e Gruppen der Kuppl ungsreagent'en
sind:
Funktionelle Gruppe
reagiert mit
Al dehyde
Imide
Amino
Cyano (wie in Cyanogenbromid) Halogen (z.B. Brom) Carboxylgruppen
aktivierte Carboxylgruppen (z.B. N Succinimidylester
von Carboxyl säuren)
Anhydride (z.B.Succinanhydrid
und Maleinanhydrid)' Maleimidderivate
primäre Amine
primäre Amine Al dehyde Hydroxyl gruppen
Jhiol-oder Hydroxylgruppen primäre Amine
primäre Amine und Hydroxylgruppen
primäre Amine Thiolgruppen
- 46 -
Geeignete Beispiele solcher Kupplungsmittel sind:
Dialdehyde, insbesondere aliphatisch^ Dialdehyde, vorzugsweise Glutaraldehyd' und dessen höhere Homologe
mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zwischen den Carbonylgruppen;
Carbodiamide, vorzugsweise Verbindungen, worin die Amingruppen
mindestens drei, aber νorzugsweise vier bis zwanzig Kohlenstoffatome auseinander liegen, z.B. Hexamethylendiamin;
Cyanogenbromid, welches in der ersten Reaktionsstufe
mit einer beliebigen OH Gruppe des einen Partners reagiert, und dabei aktivierte Imidoester bildet, die ihrerseits
in der zweiten Stufe mit den Aminogruppen des zweiten Partners, z.B. der Antigene oder Antikörper reagieren.
Einige weitere bevorzugte Kupplungs- bzw. Vernetzungsmittel
werden in den Beispielen beschrieben.
Die obengenannten Kupplungsmittel können in an sich bekannter Weise und insbesondere gemäss der oben/genannten
Tabelle mit den entsprechenden Reaktionsstellen zur Reaktion gebracht werden.
In manchen Ausführungsweisen des Verfahrens wird das
Kupplungsmittel zunächst nur mit einem der beiden zu
verkuppelnden Partner zur Reaktion gebracht und bildet ein reaktionsfähiges Zwischenprodukt, welches dann mit dem
anderen Partner zur Reaktion gebracht wird. Der erste Partner kann entweder der Immunoreaktionsteilnehmer oder
das schichtbildende Naterial sein.
Es können aber auch beide Partner je (z.B. unabhängig
voneinander) mit einer Kupplungsverbindung zur Reaktion gebracht und in reaktive Zwischenprodukte umgewandelt
werden, worauf die Zwischenprodukte ihrerseits durch
Reaktion miteinander verkuppelt werden.
Falls dem Immunoreaktionsteilnehmer eine für die kovalente
Bindungsreaktion mit dem zweiseitig reaktiven Kupplungsmittel
geeignete Gruppe fehlt, wird zunächst ein reaktionsfähiges
Derivat zur Einführung einer solchen reaktiven Gruppe über eine entsprechende Reaktion gebildet, z.B. mittels
einer anderen zweiseitig reaktionsfähigen Verbindung. Das Gleiche gilt auch, falls es unerwünscht erscheint,
eine der bestehenden reaktiven Gruppen des Immunoreaktionsteilnehmers
für die Kupplungsreaktion zu opfern, wenn deren Erlhaltung für eine bestimmte Immunosorptionsreaktion
wichtig erscheint. So ist es z.B. in der oben beschriebenen
Abwandlung des in der Zeichnung abgebildeten Beispieles (wo eine vernetzte Proteinschicht zunächst in den Stufen
III und IV gebildet wird, und anschliessend in Stufe V
ein Antikörper über die unreagierten Kupplungsgruppen an
den Film gebunden wird) manchmal vorteilhaft den Immunoreaktionsteilnehmer,
der in die "erste Schicht" eingeführt werden soll, entweder ein Antikörper 3 oder ein Hapten für
- 48 -
einen Antikörper, der von der "ersten Schicht" immunosorbiert werden soll) so mit einer Kupplungsverbindung
reagieren zu lassen, dass ein Zwischenprodukt gebildet wird, welches besonders leicht mit den noch
nicht abreagierten Kupplungsgruppen des Filmes reagiert.
Aus Gründen der räumlichen Geometrie und verbesserter Immunosorptionseigenschaften kann es vorteilhaft sein,
eine Kupplungsverbindung oder Verbindungen zu wählen, die eine verhältnismässig lange Verbindungskette liefern,
z.B. eine aliphatische Kohlenstoffkette von mindestens 3
und bis beispielsweise 20, vorzugsweise von 4 bis 10
Kohlenstoffatomen zwischen dem Immunoreaktionsteiinehmer
und der Schicht.
In den folgenden Beispielen werden Schi 1 ddrüsenhormonbestimmungen
besonders betont. Ein Grund hierfür ist der verhältnismässig weit fortgeschrittene Entwicklungsstand solcher ♦
Bestimmungen, wodurch das Verständnis der Erfindung für den Fachmann über den Weg von Ausführungsbeispielen
der Erfindung für den gleichen Zweck erleichtert wird. Ausserdem besteht noch stets ein Bedarf für die Entwicklung
noch besserer Analvsenmethoden für Schilddrüsenhormnne, Die vorliegende
Erfindung bietet neue Wege für solche Verbesserungen an.
Für den Fachmann wird es jedoch auch leicht verständlich
sein, wie die Lehren der Beispiele in analoger Weise auf
- 49 -
eine fast unbegrenzte. Viel zahl von Bestimmungen übertragbar sind, die für die klinische Diagnose, die Forensik,
für pharmako - kinetisehe Untersuchungen (z.B. an hochwirksamen Wirkstoffen, für die die Blutkonzentrationen
zur Bestimmung über herkömmliche Methoden nicht ausreichen) eignen, vorausgesetzt, dass Antikörper, die spezifisch sind
für solche zu bestimmenden Stoffe, entweder bereits vorliegen, oder herstellbar sind. Hierzu verwendet man entweder
herkömmliche Verfahren oder die neuen Lehren, auf die in der vorliegenden Beschreibung bereits hingewiesen wurde.
Die Ausführungsbeispiele sollten im Zusammenhang-mit der
Beschreibung als ganzes gelesen werden.
Glasperlen von 6mm ^Durchmesser werden zunächst gemäss der
obenteschriebenen Verfahrensstufe II aufgerauht. Stufe III wird dann mit IgG durchgeführt, welches fölgendermassen
hergestellt wurde: Blut wird aus der Halsschlagader von
Schafen oder der die Ohren von Kaninchen versorgenden Hauptschlagader entzogen. Man lässt das Blut 3 bis 5-Stunden
lang bei Zimmertemperatur koagulieren mit anschliessender
30 Minuten langer Zentrifugierung bei 3000 χ g zur Entfernung
des Fibringerinsels und des Zellenmaterials.
Das so erhaltene Blutserum wird mit dem zweifachen Volumen Boratpuffer (0,01 M, pH 8,6) verdünnt. Polyäthylenglykol
(PEG 6000) wird in einer Menge von 15% m/v hinzugefügt. Die
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Suspension wird bei 12 000 χ g 10 Minuten lang zentrifugiert.
Die Pr'äzipitatpi lie wird entfernt und im gleichen
Volumen Boratpuffer (0,01 M,pH 8,6) wieder suspendiert.
Wieder wird FtG in einer Menge von 15% m/v hinzugefügt, und die Suspension wird 10 Minuten lang bei 12000 χ g
zentrifugiert. Die obenjbl eibende Flüssigkeit wird verworfen
und die Pille wird im halben Volumen Phosphatpuffer
(0,1 M, pH7,6) des ursprünglichen Serumvolumens gelöst.
Die beschriebene Verfahrensstufe III wird mit der IgG-Lösung durchgeführt, die eine Konzentration von 20 mg/ml
besitzt (1 ml für 75 Glasperlen). Die Vernetzung findet in der zu Stufe IV beschriebenen Weise mit Glutaraldehyd statt
(60 Minuten langer Kontakt mit gesättigtenr) Glutaraldehyddampf bei 2O0C durchgeführt/,gefolgt von Athanolamidbehandlung
wie zur Stufe V der Zeichnung beschrieben wurde.
Die Verfahrensweise gemäss Beispiel 1 wird auf die
Beschichtung von Glasperlen mit IgY aus Eigelb angewandt. Das IgY wurde folgendermassen isoliert:
Die Eidotter werden vom Eiweiss getrennt und gründlich
mit fliessendem Wasser zur Entfernung von möglichst viel
Eiweiss gewaschen. Die Dottersäcke bleiben zurück, während das Eigelb in einen Trichter auf einem Messzylinder
geschüttet wird. Das Eigelhvolumen wird gemessen und
das zweifache Volumen von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) wird hinzugegeben und gründlich gemischt. Pulverisiertes
- 51 -
PEG 6000 wird in einer Menge entsprechend einer Endkonzentration von 3,5% m/v hinzugegeben. Das Gemisch
wird gerührt, bis das Polymere gelöst ist und dann 10 Minuten lang bei 14 000 g zentrifugiert, wobei sich im
Zentrifugenrohr drei Phasen bilden: eine gelbe fettige
Schicht auf der Oberfläche, eine klare Oberschicht und eine halbstarre untere Schicht aus kaseinartigem Vitellin,
das etwa ein Drittel des Gesamtvolumens der Substanz im Zentrifugenrohr darstellt. Die Oberflüssigkeit einschliesslich
der fettigen Schicht wird sorgfältig in einen Trichter dekantiert, in dessen Hals sich ein kompakter
Wattebausch zum /Abfi1trieren der Fettschicht befindet.
Das Volumen der klaren Flüssigkeit wird gemessen und weiteres pulverisiertes PEG 6000 wird hinzugefügt, bis
die Konzentration 12% m/v beträgt, wodurch das IgY
vollständig aus der Lösung verdrängt wird. Der Niederschlag wird bei 14 000 χ g 10 Minuten lang abzentrifugiert.
Die Pille wird im ursprünglichen Eigelbvolumen an Phosphatpuffer
gelöst, und das IgY wird wieder mit 12% m/v PEG 6000 gefällt und wie bisher abzentrifugiert. Die Oberflüssigkeit
einschliesslich des PEGs wird abgesaugt. Die
endgültige Pille wird in einem Puffervolamen gelöst,
das einem Sechstel des ursprünglichen Eigelbvolumens
entspricht. Die Proteinkonzentration beträgt nun 20 mg/ml. Zur Haltbarmachung des isol ierten IgY wird dem Puffer 0,01%
Natriumazid zugegeben.
Die Verfahrensweise gemäss Beispiel 1 gilt auch,
falls statt der Antikörper eine"erste Schicht" eines proteinartigen Antigens auf die Glasperlen aufgetragen
werden soll. Beispiele solcher Antigene sind: Bakterien, Bakterienfragmente, die noch ihre
immunogenischen Determinanten tragen, gereinigte Viren Virusantigenmaterial, Proteine, Arzneiwirkstoffe, Hormone
und Toxine. Soweit es sich um nicht-proteinartige Arzneimittel oder Hormone handelt, werden diese zunächstvor
der Beschichtung an ein Trägerprotein, vorzugsweise Gelatine, gekuppelt. Die Beschichtung wird mit einer
Lösung von 1 bis 20 mg/ml des proteinartigen Antigens
durchgeführt.
Kaninchen-ig§ wird durch Immunisierung von Kaninchen
gegen Eigelb IgY in ansonsten herkömmlicher Weise hergestellt. Glasperlen werden mit dem Kaninchen—IgG in der
in Beispiel 1 beschriebenen Weise beschichtet.
Die so beschichteten Glasperlen werden dann in eine gepufferte Lösung (pH 7,6)^ die 1 bis 20 mg/ml (typisch
2 mg/ml) der Eigelbantikörper (IgY) enthält, die eine Spezifizität gegen ein Virusantigen "X" aufweisen.
Nach 30 Minuten langem leichten Umrühren der Glasperlen in der Lösung, werden die Perlen gründlich mit Kochsalz-
. - 53-
lösung einschliesslich 0,1% Tween 20 (einem handelsüblichen
oberflächenaktiven Mittel) oder PBS (phosphatgepufferter
Salzlösung) ebenfalls mit 0,1% Tween 20 oder
einem anderen nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel
zur Entfernung des noch anhaftenden IgY gewaschen. Das so erhaltene "doppe!schichtige" spezifische Antikörperpräparat
kann folgendermassen gelagert werden: Die beschichteten Glasperlen werden im noch feuchten Zustand
in verkorkten Glasbehältern bei 40C aufbewahrt. Es ist auch
möglich, die Perlen in einem Exsikkator oder ähnlichen Gerät über einem Trockenmittel (z.B.PgOg.) bei 40C zu trocknen.
Zur Bestimmung des Gehaltes einer wässrigen Lösung an Virusantigen "X" wird folgendermassen vorgegangen:
Eine Perle wird in ein Mikroti trier rohr gegeben mit 0,3 ml
der zu bestimmenden Lösung. Das Rohr wird 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur sanft geschüttelt. Dadurch wird der
Virus auf dem dafür spezifischen, an die Glasperlen qebundenen Antikörper immobilisiert. Die mit dem eingefangenen
Virus beladene Perle wird mit PBS (einschliesslich 0,1%
Tween 20)(gewaschen und dann in 0,3 ml einer wässrigen Lösung, die 0,01 bis 0,1 mg eines spezifischen Antikörpers
gegen Antigen "X" (z.B. Bromgrasmosaikvirus) markiert mit
enthält einem Enzym (insbesondere alkalischer Phosphatase)/getränkt.
Die Antikörper lagern sich an die eingefangenen Virusteilchen
im Verhältnis zur Anzahl der eingefangenen Virusteilchen
an.
- 54 -
Das Enzym-markierte ?iJY wird folgendermassen hergestellt:
lmg alkalischer Phosphatase wird in 1 ml IgY -Lösung
(2mg/ml)Protein gelöst 0,2ml einer 0,25% Lösung von Glutaraldehyd in Kochsalzlösung werden hinzugefügt man
lässt zwei Stundenlang bei Zimmertemperatur stehen
und dialysiert dann gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung
(PBS) 16 Stunden lang. Es wird auf 0,5% mit PBS verdünnt.
Das zur Markierung des Antikörpers verwendete Enzym ergibt mit Paranitrophenylphosphat, dem Substratum des
Enzyms/eine Farbreaktion, deren Intensität kolorimetrisch messbar ist als Masstab für die vorhandene Enzymmenge» die
ihrerseits im vorliegenden Falle ein Mass für die eingefangene Virusmenge ist. Die Farbreaktion lässt sich entweder
an der aus der Reagenzlösung durch Anlagerung an die Glasperlen entzogenen Enzymmenge durchführen (nachdem man
den nicht-haftenden Überschuss abgewaschen hat),oder an
der Enzymmenge, die nach der Entfernung der Glasperle in der Lösung zurückgeblieben'ist.
In einer bevorzugten Verfahrensweise verwendet man eine Titrationsplatte mit 12 Vertiefungen. 0,1 ml Kochsalzlösung
(mit Tween) wird in jede Vertiefung hineinpipettiert 0,1 ml des IgY- Enzymkomplexes werden zur Kochsalzlösung
der ersten Vertiefung hinzugefügt. Man fertigt dann eine Verdünnungsserie an, indem man jeweils 0,1 ml aus der
ersten Vertiefung in die zweite überträgt, und desgleichen aus der zweiten in die dritte, etc. In jede Vertiefung wird
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dann eine beschichtete Perle gegeben und eine Stunde lang
bei 370C inkubiert. Die Perlen werden entfernt und gründlich
mit PBS gewaschen. Man verdünnt eine p-Nitrophenylphosphatlösung
in Puffer (97ml Diethanolamin, 800 ml Wasser, 0,20 g
NaN3, HCl Einstellung auf pH 9,8, verdünnt auf 1 l)auf
eine Konzentration von 1 mg/ml. 0,1 ml Dieser Lösung werden in jede von 12 sauberen Vertiefungen einer Mikrotitrationsplatte
eingefüllt, und die Perlen werden dann in die Vertiefungen in der richtigen Reihenfolge gelegt. Die Platte
wird bei Zimmertemperatur zwei Stunden lang inkubiert. Die oben beschriebene Bestimmung ist eine Abwandlung der sogenannten
"Elisa" Bestimmung und lässt sich auf sämtliche Antigen/Antikörperreaktionen anwenden, z.B.: Bakterien,
Viren , Proteine, Toxine.
Die gleiche Art Glasperlen, beschichtet mit Kaninchen- IgG
gegen Eier-IgY wird verwendet wie in Beispiel 4. Die Anlagerung des spezifischen Antikörpers gegen ein Antigen
"X" findet ebenfalls wie in Beispiel 4 statt. In der folgenden Abwandlung der "Elisa" Bestimmung wird die Probe mit Antigen
"X'^das bestimmt werden SoII5 sowie mit einem gleichen Volumen
einer Lösung vermischt, die eine entsprechende Konzentration von Antigen "X" enthält, das mit Enzym markiert wurde (man kann
wieder das gleiche Enzym wie in Beispiel 4 verwenden). Normalerweise verwendet man höchstens 0,1 mg/ml des Antigens
"X". Die tatsächlich an die Glasperle angelagerte Flüssigkeit^·
menge ist gering. Deshalb kann man mit einem ml eines der Immunreagentien hunderte der Glasperlen bedecken. In der
- 56 -
vorliegenden Arbeitsweise 'tritt das markierte Antigen
mit dem nicht markierten Antigen der Bestimmungsprobe in Konkurrenz und die Menge an Enzym-markiertem Antigen
"X", welches sich an die spezifischen Antikörper auf der Glasperlenoberfläche anlagertest der Konzentration
des nicht markierten Antigens "X" aus der Probe umgekehrt proportional. Die kolorimetrische Bestimmung entweder
der an die Glasperle angelagerten Enzymmenge oder der in der Lösung übriggebliebenen Enzymmenge findet wie
im vorangegangenen Beispiel statt.
Diese Verfahrensweise eignet sich für Antigene im Molekulargewichtsbereich von 300
mehr, einschliesslich Bakterien.
Molekulargewichtsbereich von 300 bis 8 χ 10 oder noch
6 mm grosse Glasperlen werden mit Schaf-IgGi-Anti-Kaninchen-IqG
als erste Schicht gemäss Beispiel 1 beschichtet. Für die "zweite Schicht" (Stufe VI gemäss
der Zeichnung) wird ein handelsübliches Anti-T«
Kaninchengesamtserum (erhältlich von Henning AG, Berlin, Bundesrepublik Deutschland^ verwendet. Dieses gefriergetrocknete
Produkt wird mit destilliertem Wasser auf das ursprüngliche Volumen rekonstituiert und mit
Phosphatpuffer im Verhältnis 1 : 320 verdünnt.
- 57 -
Es folgt die obenpeschriebene Prozedur gemäss Verfahrensstufe
VI bei 370C, 1,75 Stunden lang gefolgt von 30 Minuten bei 40C. Die Perlen werden aus der
Antikörperlösung entfernt, und wie bisher beschrieben dreimal mit PBS Lösung und 0,1% Tween 20 gewaschen.
RIA-bestimmungen für T, werden folgendermassen durchgeführt:
Für die Bestimmungen verwendet man Pi11enröhrchen aus
Polypropylen mit 10 mm Innendurchmesser und abgerundetem Boden dreifach für jede unmarkierte T^-Konzentration.
Standardlösungen werden im Puffer in folgenden T3-Konzentrationen
angemacht: 0,05 ng/ml, 0,7ng/ml, 2ng/ml
und 5 ng/ml. Jedes Proberöhrchen erhält folgende Reagenzien:
i) Probepufferlösung (lOO/il, 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,6);
ii) IT3 Lösung in Probepuffer (100/fl)·;
iii)Standard T3 Lösung in Probepuffer (100 μ
Der Inhalt der Röhrchen wird durch leichtes Klopfen vermischt. Die Röhrchen werden auf einem Wasserbad auf 370C
vorerwärmt, und die obenpeschriebenen "doppelbeschichteten" Glasperlen werden zur Lösung gegeben, eine Perle pro
-58 -
Röhrchen. Die Röhrchen werden 2 Stunden lang bei 370C
inkubiert und danach noch 30 Minuten lang bei 40C. Der FLüssigkeitsinhalt der Röhrchen wird abgesaugt,
und die Perlen werden dreimal mit PBS Lösung (0,1% Tween 1 ml pro Perle) gewaschen. Die Perlen kommen nun in
Zählrohre und werden je eine Minute lang im Gammazähler
gemessen.
Die T3 RIA Bestimmung an unbekannten Blutserumproben
wird folgendermassen durchgeführt:
Jedes Proberohr erhält folgende Reagenzmengen:
i) Probepuffer (100 ^l,Barbituratpuffer 0,06 M,pH 8,6);
ii) IT3 Lösung in Probepuffer (100 /Ί);
iii) Probepuffer (100 JUi) mit 0,1% Poluol (ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel);
iv) Inhibitor gegenThyroxin-bindendes Globulin in Probepuffer
(lQO/rt);
v) Standardisiertes Serum bzw. unbekanntes Serum (50 Al)
Zur Herstellung der T .,-standardisierten Seren werden
zunächst T3-freie Seren hergestellt und mit bekannten
Mengen T3 versetzt.
* 59 -
,Co.
Man verwendet die gleichen T3-Konzentrationen für die
Standardlösungen wie für die Bestimmung von T3 in Puffer,
d.h. 0,05 ng/mi , 0,7 ng/ml, 2 ng/ml , 5 ng/ml. Auf Grund
dieser Werte wird eine Standardkurve angefertigt.
In sonstiger Hinsicht verläuft die Bestimmungsprozedur genau wie weiter oben für die T,-Lösungen in Puffer beschrieben
wurde.
Beispiel 6 wird wiederholt, aber in folgender Weise abgeändert:
Die Glasperlen werden mit Schaf-IgG - Anti-IgY als
"erste Schicht" in der Weise gemäss Beispiel 1 beschichtet
Für die "zweite Schicht" wird IgY-Anti-T., aus Eigelb
von immunisierten Hennen gewonnen, und gemäss Beispiel 2 gereinigt. Die Anti~T3 Antikörper werden ausserdem
vor dem Beschichten der Glasperlen folgendermassen weiter konzentriert: Zunächst wird das Anti-T3-IgG-Antikörper-Präparat
gegen 0,2 M Essigsäure 4 Stunden lang zur Senkung des pH-Wertes auf etwa 4 dialysiert. Die
Lösung wird auf 40C abgekühlt und der pH-Wert auf 4,6
eingestellt. PEG 6000 wird in einer Menge von 8 % m/v hinzugefügt und der gebildete Niederschlag wird bei
14000 χ g abzentrifugiert. Dann wird das pH auf 5,0 durch
- 60 -
Hinzufügung von 0,1 M Natriumhydroxyd angehoben und die PEG-Konzentration wird wieder auf 8% m/v eingestellt.
Der nun gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und als IgY-konzentrat mit hoher T3-Bindungskapazität gewonnen.
Das Konzentrat wird in PBS, pH 7,6 gelöst in einer Konzentration von 1 mg/ml Protein. Ansonsten wird wie
in Beispiel 6 vorgegangen.
Die Anreicherung bzw. 'Fraktionierung spezifischer Antikörper
durch Fällung mit Polyäthylenglykol oder dergleichen bei
kontrolliertem pH ist auch auf Säugetiereantikörper anwendbar.
Der richtige pH Wert für die Gewinnung einer bestimmten Fraktion und die Optimumkonzentration des Fällungsmittels
wird jeweils empirisch bestimmt.
Glasballotini (Perlendurchmesser 0,05 bis 0,1 mm) werden
wie in Beispiel 1 aufgerauht und beschichtet mit 5% mensch-Iisehem
IgG, gelöst in PBS. Die Perlen werden in eine kleine Säule gepackt, IgY-Anti-menschliches IgG (gewonnen gemäss
Beispiel 2) wird auf die Säule (25 cm χ 1,5 cm gefüllt mit
20g BaI lotini ,beschichtet mit 0,1 g menschlichem Immunoglobulin)
in einer Menge von 100 mg gelöst in 5 ml aufgetragen und langsam in die Säule eindringen gelassen. Das ungebundene
Protein wird dann mit PBS ausgewaschen bis das Eluat eine negative Reaktion gegen 7% Perchlorsäure
zeigt. Zur Dissoziation des IgG/IgY Komplexes eluiert man
das IgY mit PBS,dessen pH-Wert mit Propionsäure auf 3,8
- 61 -
gesenkt wurde. Man konzentriert das Eluat durch Perosmose
gegen gesättigtes Polyäthylenglykol auf ein Volumen von 2 ml. Das Eluat hat die erwartete IgY-Aktivität.
Während des gesamten Versuches sollte die PBS-Lösung 0,1%
Tween 20 enthalten.
Beispiel 8 wird wiederholt, dahingehend abgeändert, dass die Glasballotini mit 2 ml Antialbumin IgY (20 mg/ml)
in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise beschichtet werden 2 ml IgY Anti-IgY werden auf die Säule aufgetragen und
langsam eindringen gelassen. Zur Auswaschung des ungebundenen IgGs wäscht man die Säule mit Phosphatpuffer,
pH 7,2. Der spezifische IgG-Antikörper wird vom IgY-Antigen
mit Propionsäure und Propanol (pH 3,6) gelöst und eluiert. Das Eluat wird in einem Becher mit 10 ml" Natriumbiphosphat
(o,2 M) gesammelt und sofort neutralisiert. Danach dialysiert man gegen PBS 24 Stunden lang. Das
gereinigte Produkt besteht aus I gG-Anti-IgY.
6 mm Glasperlen werden mit IgG-Anti-IgY in der in Beispiel
1 beschriebenen Weise zur Herstellung der "ersten Schicht" beschichtet. Man immunisiert Hühner gegen Thyroxin (T4).
IgY-Anti-T. wird aus dem Eigelb der immunisierten Hennen
62
gemäss Beispiel 2 gewonnen. Diese Antikörper werden
als "erste Schicht" auf, die Glasperlen wie in Beispiel 1 aufgetragen.
Ul IgY-Anti-Thyroxin (T,) wird- in 6 Gl asröhrchen
hineirpipettiert. Jedes der Röhrchen erhält eine der
obenbeschriebenen IgG-Anti- IgY- beschichteten Glasperlen.
Danach wird eine Stunde bei 370C inkubiert. Die Perlen
werden dann mit einer Lösung von λ% Tween 20, Λ% Polyvinyl
pyrrolidon und 0,2% OvaTbumin in PBS gewaschen.
Radioaktiv-markiertes T. und nicht-radioaktives T.
werden wie folgt hinzugegeben:
| Röhrchennummer | 25I-T4CuI | ) "Kaltes" T4 | (ml) | "Kaltes"T4 (/ig) |
| 0,2 | 0,05 | 5 000 | ||
| 1 | 0,2 | 0,02 | 2 000 | |
| CVl | 0,2 | 0,01 | 1 000 | |
| 3 | 0,2 | " 0,005 | 500 | |
| 4 | 0,2 | 0,002 | 200 | |
| 5 | 0,2 | 0,0 | 0 | |
| 6 |
* Die Konzentration des "kalten" nicht-radioaktiven T4
war 10 jug/0,1 ml .
Die Perlen wurden entfernt und mit Löschpapier getrocknet
und die Radioaktivität wurde in einem Scintillationsrohr
bestimmt. Die gemessenen Radioaktivitäten standen im umgekehrten
Verhältnis zu den Konzentrationen des nicht-aktiven T4
in den Proben.
- 63 -
Beispiel "11:
Eine Lösung von 20 mg/ml Gelatine und 1 mg/ml Protein A
(ein aus Staphylococcus aureus gewonnenes Protein das
die Fähigkeit besitzt, Immunoglobuline unterschiedlicher Herkunft zu binden) wird angemacht und in der Stufe III
des anhand der Zeichnung beschriebenen Verfahrens an Stelle der dort verwendeten IgG-Lösung verwendet. Die Vernetzung
(Stufe IV) und die Blockierung mit Ethanolamin (Stufe V) findet wie dort beschrieben statt.
Die so beschichteten 6 mm grossen Glasperlen werden dann
zur Immobilisierung von Antikörpern,für die Protein A
eine Affinität besitzt* verwendet, wie in Beispiel 6.
Die gewünschte Menge Antikörper der "zweiten Schicht" muss jeweils im voraus festgelegt werden,und daraus ergibt
sich wiederum die Optimumkonzentration für die Antikörperlösung der "zweiten Schicht" und die Dauer der Tränkung
der Perlen in dieser Lösung. Die Bestimmung findet jeweils empirisch statt.
Die obenbeschriebene Verfahrensweise lässt sich auch mit
ConcanaviHin A,statt Protein A durchführen.
Die Beschichtung mit der "ersten Schicht" findet wieder
in der zu Verfahrensstufe III der Zeichnung beschriebenen
Weise statt:
- 64 -
(a) Aufbringen einer IgG-Lösung oder einer IgY-Lösung
wie in Beispiel 1 bzw. 2 beschrieben.
(b) Aufbringen einer Lösung von IgG oder IgY
mit einem Gehalt von 30 bis 300 Gew.-% Gelatine
oder Albumin-Streckmittel (bezogen auf Gammaglobulin)
(c) Aufbringen von reinem Trägerprotein, wie Albumin oder
Gelatine (angewandt in einer Lösung von 20 mg Gelatine oder Albumin pro ml).
Die so beschichteten (aber noch nicht vernetzten) Perlen werden im Vakuum getrocknet. Es wird eine Lösung hergestellt,
enthaltend 2 bis 20 mg pro ml des Diesters von Glutarsäure (oder Pimelinsäure) hergestellt durch
Kondensation von N-Hydroxysuccinimid unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimxd (J. Am. Chem. Soc.
86,1839-1842, (1964)). 75 Perlen werden in 10 ml der Vernetzungslösung gegeben. Das Ausmass der Vernetzung
kann geregelt werden durch die Zeit, der die Perlen dieser Lösung ausgesetzt werden und die im allgemeinen
zwischen 1 und 18 StundEn liegt. Die Perlen werden gewaschen und nicht umgesetzte reaktionsfähige
Gruppen mit Merkaptoathylamin (1 % in Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,6) eine Stunde blockiert - mit Ausnahme von
(c), wo die Blockierungsstufe ersetzt wird durch ein Eintauchen der Perlen in eine Lösung des Immunoreagens
der "ersten Schicht", das auf den Film aufgebracht wird.
- 65 -
Die "zweiten Schichten" der gewünschten. ImmaJnöreakti onsteilnehmer
für die "jeweilige zweite Schicht" werden in der in Beispiel 6 oder 7 beschriebenen Weise aufgetragen.
Im vorliegenden Beispiel reagieren die Glutar-und Pimi 1 i nsäure·
diester der N-Hydroxysuccinimide mit Amingruppen an Proteinmolekülen
durch Freisetzung von N-Hydroxysuccinimid.
In Beispiel 12 wird diesmal als bifunktione!les Vernetzungsmittel
1 ,3-BismaleinimidO'-propax]rfolgender Strukturformel
verwendet:
N-CH2-CH2-CH2-N
Dieses Vernetzungsmittel wird nach dem Verfahren von
'Goodfriend et alia (Science 144, 1344-1346 (1964) ) hergestellt.
Di e Bismaleinimide reagieren mit SuIf hydrylgruppen in
Protein- und ähnlichen Molekülen durch Addition an die Doppelbindungen der Maleinimidringe. Etwaige nichtabreagierte
Maleiimidderivate werden anschliessend
durch Behandlung mit Mercaptoäthylamin blockiert.
- 66 -
3 224 S 37
Beispiel 14:
In Beispiel 12 wird an Stelle des dort beschriebenen
bifunktionell en Vernetzungsmittels der N-Hydroxysuccinimid·
ester von N-(4)-Carboxycyclohexylmethyl)maleiimid verwendet.
Die in diesem Fall stattfindenden Vernetzungsreaktionen stellen eine Kombination der Reaktionen gemäss
Beispiel 12 u-nd 13 dar.
In Beispiel 12 verwendet man statt des dort beschriebenen
bifunktionel len Vernetzungsmittels den N-Hydroxysuccinimidester
von 3(2-pyridyl -dithio) -propionsäure der Formel
0
N-O-C-CH9-CH0-S-S-Vv /
N-O-C-CH9-CH0-S-S-Vv /
2 W //
In diesem Beispiel reagiert die Amingruppe eines Proteins
oder dergleichen mit dem einen Ende des Vernetzungsmittels unter Freisetzung von N-Hydroxysuccinimid während das
andere Ende mit SuIfhydrylgruppen eine Disulfidaustauschreaktion
eingeht, wobei 2-Mercaptopyridin ausfällt.
Die Blockierung eventueller nicht-reagierter funktioneller
- 67 -
Gruppen findet wiederum mit Mercaptoäthylamin statt.
Rinder-Gammagiobulin wird mit N-Succinimidil-3-(2-Pyridyldithio)-propionat(Spdp)
nach dem Verfahren von Carlson et alia (Biochem. J. J_7_3, 723-737 (1978) ) zur Reaktion
gebracht. Der Überschuss an Spdp wird durch sorgfältige Dialyse entfernt. In diesem Verfahren reagieren die
Aminogruppen des Gammaglobulins mit dem Spdp, wobei
N-Hydroxysuccinimid ausfällt und ein reaktionsfähiges
Zwischenprodukt mit der reaktiven 2-Pyridyldithio -Gruppe
gebi1det wi rd.
Glasperlen werden wieder wie in Beispiel 12 mit vernetzter
Gelatine beschichtet. Reaktive Kupplungsgruppen werden
folgendermassen eingeführt: 182 mg Dithiodiglycolsäure
(Dtdg) werden in 1ml 2M NaOH gelöst. Die Dtdg-Lösung
wird auf 25 ml mit Borat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 6) verdünnt. 75 Glasperlen werden wie oben
beschrieben mit Gelatine beschichtet, die anschliessend mit Glutefaldehyd vernetzt wird, wonach die übriggebliebenen
Aldehydgruppen mit Äthanolamin blockiert werden. Die
Perlen werden in der obenlbeschriebenen Lösung getränkt und eine weitere Lösung von 250 mg 1-Äthyl-3,3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid(idci)
in 2,5 ml Wasser wird hinzugemischt. Das Mischen wird 30 Minuten lang bei
Zimmertemperatur fortgesetzt. Die Perlen werden dann 4-mal in 50 ml PBS (mit 0,1% Tween 20) gewaschen.
- 68 - '
Die so vorbehandelten Glasperlen werden nun mit
Dithiothreitol (Dtt) reduziert. 0,5 ml <^er frisch
vorbereiteten IM Lösung von Dtt wird mit 15 ml PBS verdünnt und damit werden die 75 obengenannten
Glasperlen eine Stunde lang mit gelegentlichem Mischen
reagieren gelassen. Man wäscht die Perlen anschliessend
4-mal mit PBS (mit 0,1% Tween 20)und danach folgt sofort
der nächste Schritt.
Man stellt eine Lösung von 2 mg des obenbeschriebenen
Gammaglobulin-Zwischenproduktes in 10 ml PBS her, und
tränkt darin die frisch bereiteten vorbehandelten Glasperlen.
Man lässt die Reaktion über Nacht bei 250C
stattfinden. Die Glasperlen tragen die reaktiven - NH-CO-CHp-SH Gruppen. Die SH-Gruppe reagiertmit der Dithiopyridylgruppe,
wobei 2-Mercaptopyridin freigesetzt wird. Die Glasperlen
tragen nun Rindergammaglobulinmoleküle , die kovalent
an die Gelatinschicht gebunden sind. Sie werden vierm'al mit
PBS (einschliesslich 0,1% Tween 20) gewaschen.
-•69 -
Beispiel 6 wird abgeändert indem für die "zweite Schicht"
an Stelle von Anti-T- ganzes Kaninchenserum ein Kaninchenantiserum
gegen Alpha-Fetoprotein (AFP) verwendet.
Die "doppelbeschichtete" Glasperle kommt in Kombination
125
mit einem I markierten AFP zwecks Bestimmung von AFP in amniotischer Flüssigkeit oder in Serum mittels RIA zur Anwendung. Die Verfahrensweise ist im wesentlichen die gleiche , wie sie für handelsübliche"Radioimmunoanalysenkits"( z.B. "Gammadab" (R) von Baxter Travenol Labs. Inc.) vorgeschrieben wird* Die vorliegende Erfindung bietet jedoch grosse Vorteile, indem die aufwendigen Massnahmen wie Fällung mit flüssigen Reagenzien, ZentrifugietfuHg und Dekantierung zur Gewinnung der gefällten Pille für die Gammazählung entfaTTen und an deren stelle eine einfache Immunosorption auf der Glasperle tritt, deren Gammaradioaktivität dann gezählt wird.
mit einem I markierten AFP zwecks Bestimmung von AFP in amniotischer Flüssigkeit oder in Serum mittels RIA zur Anwendung. Die Verfahrensweise ist im wesentlichen die gleiche , wie sie für handelsübliche"Radioimmunoanalysenkits"( z.B. "Gammadab" (R) von Baxter Travenol Labs. Inc.) vorgeschrieben wird* Die vorliegende Erfindung bietet jedoch grosse Vorteile, indem die aufwendigen Massnahmen wie Fällung mit flüssigen Reagenzien, ZentrifugietfuHg und Dekantierung zur Gewinnung der gefällten Pille für die Gammazählung entfaTTen und an deren stelle eine einfache Immunosorption auf der Glasperle tritt, deren Gammaradioaktivität dann gezählt wird.
Beispiel 17 wird dahingehend abgeändert, dass Schaf-IgG-Anti-IgY
als erste Schicht wie in Beispiel 7 verwendet wird.
IgY wird nach dem Verfahren von Poison aus den Eiern von Hühnern gewönne
die gegen AFP-Konjugate, hergestellt gemäss der gleichzeitig
eingereichten Anmeldung entsprechend der südafrikanischen
Priorität 81/4898 (unser Zeichen:1A-56 226)
hingewiesen. Das IgY hat eine höhere Avidität,
K = 2 χ 10 /Mol als herkömmliche Antikörper aus Kaninchen
(6,0 χ 109 L/Mol).
- 70 -
Beispiel 19:
Glasperlen werden mit Gelatine beschichtet. Diese wird mit Glutaraldehyd vernetzt und die übrigbleibenden
Aldehydgruppen werden mit flthanolamin gemäss der
Verfahrensstufen I bis IV der Zeichnungen abblockiert,
wobei statt des dort beschriebenen Gammaglobulins Gelatine (20 mg/ml) verwendet wird.
Der Iodhistaminester von Testosteron-Hemisuccinat wird
nach dem Verfahren von Tantchou und Slaunwhite, J of Immunoassay, 1(1), 129-147 (1980) wie dort auf Seite 139
unter der Überschrift "Reaction of iodohystamine with activated esters" hergestellt. 5mg des Esters werden in
20 ml PBS gelöst, und die 75 Gelatine-beschichteten Glasperlen werden mit der Lösung beschichtet. Die Perlen
werden dann in einer Petrischale ausgebreitet und 5 Minuten lang mit UltravioletÖ icht bestrahlt (Wellenlänge
211 nm - Quecksilberlampe), wobei man sie sanft in der
Schale umwälzt. Anschliessend werden die Glasperlen mit PBS und 0,1% Tween 20 gewaschen.
Obwohl in den obenbeschriebenen Beispielen die Erfindung in erster Linie hinsichtlich Glasperlen erläutert wurde,
können selbstverständlich andere geeignete Trägerkörper
verwendet werden, auch aus anderem Material als Glas, ohne dass die Beschichtungsmethoden deshalb wesentliche
geändert zu werden brauchen.
- 71 -
Leerseite
Claims (36)
1. Trägergebundenes Immunosorptionsmittel mit einem
Trägerkörper, der einen immobilisierten Immunoreaktionsteilnehmer
trägt, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunoreaktionsteilnehmer - entweder ein Antigen oder ein Antikörper
- kovalent an eine vernetzte den Trägerkörper
umhüllende Schicht so gebunden ist, dass immunologisch aktive Teile des Immunoreaktionstei1nehmers an der Schichtoberfläche
in einer für die Immunosorption zugänglichen Form vorliegen.
2. Immunosorptionsmittel gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass immunologisch aktive Teile des Immunoreaktionsteilnehmers auf der Schicht exponiert
sind und daraus hervorragen.
3. Immunosorptionsmittel gemäss Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht ganz oder teilweise aus vernetzten Proteinmolekülen bzw. Peptidteilen von
Proteinmolekülen besteht,
4. Immunosorptionsnnttel gemäss Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, dass der Immunoreaktionsteilnehmer selbst
die Proteinmoleküle oder Peptidteile für die Schicht oder
mindestens einen wesentlichen Teil davon liefert.
5. Immunosorptionsmittel· gemäss einem der Ansprüche
1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht ausser
dem Immunoreaktionsteilnehmer ein zusätzliches, vernetztes
schichtbildendes Material, insbesondere ein Protein oder Peptid,enthält.
6. Immunosorptionsmittel gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunoreaktionsteil
nehmer mit einem Molekular- bzw. Teilchengewicht von etwa 300 bis zu 8 χ 10 (oder mehr im Falle
von Bakterien oder dergleichen) an die Schicht in einer Menge von 0,6 bis 500 mg/m'
Trägerkörpers gebunden vorliegt.
2 einer Menge von 0,6 bis 500 mg/m der Oberfläche des
7. Immunosorptionsmittel gemäss Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, dass die Schicht zwischen 30 und 1000 % Protein-bzw. Peptidstreckmittel bezogen auf das Gewicht
des Immunoreaktionstei Inehmer's enthält.
8. Immunosorptionsmittel gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerkörper
in Stab- oder Perlenform vorliegt.
9. Immunosorptionsmittel gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerkörper als massive Perle(n)
mit einer Dichte von mehr als 1 vorliegt.
10. Immunosorptionsmittel gemäss einem der Ansprüche
1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Protein A oder Concanavillin A kovalent an die Schicht gebunden ist und
seinerseits selektiv eingefangene, am Stielende der Moleküle festgehaltende Antikörpermoleküle bindet.
11. Immunosorptionsmittel gemäss einem der Ansprüche 1
bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass an die Schicht ein erster Immunoreaktionsteilnehmer - d.h. ein Vertreter
eines Antigen/Antikörperpaars kovalent gebunden ist, und der erste Immunoreaktionsteilnehmer durch Antigen/
Antikörperkomplexbildung den zweiten Vertreter des Paares festhält, wobei dieser zweite Vertreter aus der Oberfläche
mit einem Molekularbereich herausragt, der seinerseits wiederum eine gewünschte Immunoreaktivität für eine
Immunosorptionsreaktion mit einem dritten Immunoreaktionsteilnehmer besitzt,
12. Trägergebundenes Immunosorptionsmittel bestehend aus
einem Trägerkörper, der einen immobilisierten Immunoreaktionsteilnehmer
trägt, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Trägerkörpers bzw. eine diese beschichtende
Schicht kovalent gebunden einen ersten Immunoreaktionsteilnehmer trägt - d.h. einen Vertreter eines Antigen/
Antikörperpaares, wobei der erste Immunoreaktionsteilnehmer
durch Antigen/Antikörperkomplexbildung den zweiten Vertreter
des Paares festhält, und dieser zweite Vertreter aus der Ober-
fläche mit einem Molekularbereich herausragt, der selbst
eine gewünschte Immunoreaktivität für eine Immunosorptionsreaktion
mit einem dritten Immunoreaktionsteiinehmer besitzt.
13. Immunosorptionsmittel gemä'ss einem der Ansprüche 1
bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Zwischenprodukt für die Herstellung eines Immunosorptionsmittels gemäss
Anspruch 11 oder 12 verwendet wird.
14. Immunosorptionsmittel gemäss Anspruch 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet, dass in einer ersten Schicht kovalent gebundene und vernetzte Antikörper vor!iegen ,die spezifisch
in einer ersten Tierart gegen Antikörper einer zweiten Tierart hervorgerufen wurden,und dass auf der ersten Schicht
eine zweite Schicht immunosorbiert vorliegt, die aus spezifischen Antikörpern besteht, die in der zweiten Tierart
gegen ein spezifisches Antigen hervorgerufen wurden.
15. Trägergebundenes Immunosorptionsmittel bestehend
aus einem Trägerkörper, der einen immobilisierten Immunoreaktionsteiinehmer
trägt,und der spezifisch ein spezifisches Antigen immunosorbiert, dadurch gekennzeichnet, dass
auf einer festen Unterlage eine erste Schicht mit kovalent
gebundenen und vernetzten Antikörpern, die in einer ersten Tierart gegen Antikörper einer zweiten Tierart hervorgerufen wurden, vorliegt, und dass auf der ersten Schicht
eine zweite Schicht immunosorbiert vorliegt, die aus spezifischen Antikörpern besteht, die in der zweiten
Tierart gegen das spezifische Antigen hervorgerufen
worden sind.
16. Immunosorptionsmittel gemäss Anspruch 14 oder 15,
dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörpermoleküle
in der ersten Schicht unorientiert vorliegenund die Antikörper der zweiten Schicht überwiegend radial nach aussen
gerichtet sind mit ihren Antigeneinfangmolekülbereichen
nachaussengerichtet.
17. Immunosorptionsmittel gemäss einem der Ansprüche
14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper der zweiten
Schicht Antikörper sind, die in einem Vogel hervorgerufen und vorzugsweise aus dem Eidotter von einem oder mehreren Eiern des Vogels
gewonnen wurden.
18. Immunosorptionsmittel gemäss einem der Ansprüche
bis 17, gekennzeichnet durch dessen Verwendung als diagnostisches oder analytisches Reagenz, insbesondere
für Radioimmunoanalysen (RiA) oder enzymgebundene Immunosorptionsanalysen (ELISA).
19. Verfahren zur Herstellung eines trägergebundenen
Immunosorptionsmittels gemäss einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf einen
festen Trägerkörper eine diesen umhüllende Schicht aus vernetzbarem Protein oder Peptidmaterial aufgetragen wird,
'·■'■'- c
wobei in die Schicht oder auf deren Oberfläche ein
gewünschter Immunoreaktionsteilnehmer eingebaut wird, die Schicht vernetzt und der Immunoreaktionsteilnehmer
kovalent an die Schicht'vorzugsweise mittels mindestens eines Vernetzungs-
bzw. zweiseitig reaktiven Kupplungsmittels gebunden wi rd.
20. Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,
dass der Immunoreaktionsteilnehmer selbst ganz oder teilweise das Beschichtungsmaterial liefert.
21. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 19 oder 20,
dadurch gekennzeichnet, dass der Immunoreaktionsteilnehmer
mittels eines weiteren protein- oder peptidartigen schichtbildenden Materials gestreckt wird.
22. Verfahren gemäss Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass für die eigentliche Schichtbildung
ein zusätzliches schichtbildendes Material verwendet
wird, an welches der Immunoreaktionsteilnehmer mittels
des zweiseitig reaktiven Kupplungsmittels kovalent gebunden wird.
23. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass als zweiseitig reaktives
Kupplungsmittel eine Verbindung verwendet wird, die in
ihrem Molekül zwei oder mehr der folgenden reaktiven
'"■ ■■ >,
Gruppen besitzt, die entweder gleich oder unterschiedlich
sein können; Aldehyd, Imid, Ami η, Cyan, Halogen,
Carboxyl, aktiviertes Carboxyl, Säureanhydrid, Mal einsäureimid.
24. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 19 bis 23,
dadurch gekennzeichnet, dass das Kupplungsmittel zunächst mit einem der beiden zu verbindenden Reaktionspartner
zur Reaktion gebracht wird, und eine reaktive Zwischenverbindung bildet, die dann mit dem anderen Partner
zur Reaktion gebracht wird.
25. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunoreaktionstei1nehmer
selbst keine für die kovalente Bindungsreaktion geeignete
reaktive Gruppe besitzt, und zunächst, z.B. mittels einer weiteren zweiseitig reaktiven Kupplungsverbindung; durch
entsprechende Reaktion eine solche reaktive Gruppedarin eingebaut wi rd.
26. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine freie Radikal verbindung
des Immunoreaktionsteil nehmers oder Schichtmaterials als Zwischenprodukt
gebildet wird, und das Zwischenprodukt reagiert, um den Inmunoreaktionsteilnehmer kovalent an die Schicht zu binden.
27. Verfahren gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
dass die freie Radikalbildung für das Zwischenprodukt durch
Bestrahlung angeregt wird.
28. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass eine "erste Schicht"
gebildet wird mit an die Schicht gebundenen Antikörpern gegen Antikörper für eine "zweite Schicht", und dass der
Trägerkörper einschliesslich der "ersten Schicht" solange
mit einer Lösung der Antikörper für die "zweite Schicht" in Berührung gebracht wird, bis die benötigte Menge der
Antikörper der "zweiten Schicht" von der "ersten Schicht" immunosorbiert worden ist.
29. Verfahren gemäss Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Antikörpermoleküle der "zweiten Schicht",
die der "ersten Schicht" zur Immunosorption angeboten wird,mindestens zweimal der Anzahl der verfügbaren Antikörper-Immunosorptionsstellen
in der "ersten Schicht" entspricht.
30. Verfahren gema'ss einem der Ansprüche 28 oder 29,
dadurch gekennzeichnet, dass die Berührung mit der Lösung der Antikörper für die "zweite Schicht" zwischen O0C und
der Denaturierungstemperatur der Antikörper stattfindet, wobei die Berührung mindestens zum Teil in einem
Niedertemperaturbereich stattfindet, bei dem eine Umwandlung, stattfindet, die eine starke Bindung der "zweiten Schicht"
an der "ersten Schicht" verursacht.
31. Verfahren gemäss Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet,
dass die Berührung zunächst bei einer verhäl tnisma'ssig
hohen Temperatur stattfindet, bei der die Immunosorption beschleunigt wird und anschliessend die Berührung bei
der niederen Temperatur stattfindet.
32. Anwendungsmethode für ein Immunosorptionsmittel
gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet,
dass man das Immunosorptionsmittel, welches auf seiner Oberfläche freiliegend einen immobilisierten
Immunoreaktionstei Inehmer besitzt, der Spezifizität gegen immunogenische
Determinanten einer ersten Substanz eines Gemisches aufweist, die nicht bei anderen Substanzen
des Gemisches vorliegen,- mit dem Gemisch innig in Berührung bringt, und dadurch die erste Substanz selektiv immunosorbiert
und man anschl iessend die Berührung des Immunosorptionsmittels
mit dem Gemisch unterbricht.
33. Verfahren gemäss Anspruch 32 , dadurch gekennzeichnet, dass es als Teil einer Radioimmunoanalyse (RIA) oder
Enzymgebundenen Immunosorptionsanalyse (ELISA) durchgeführt wird.
34. Verfahren gemäss Anspruch 32 , dadurch gekennzeichnet, dass die immunosorbierte erste Substanz anschliessend
in gereinigter Form vom Immunosorptionsmittel desorbiert wird.
/IO
35. Verfahren gemäss Anspruch 32, wobei ein Immunosorptionsmittel
gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass mittels des Immunosorptionsmittels
Antikörper immunosorbiert werden und dadurch ein neues Immunosorptionsmittel gemäss einem der Ansprüche
11 bis 18 gebildet wird.
36. Anwendungsmethode für ein Immunosorptionsmittel
gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet,
dass man das Immunosorptionsmittel, welches an seiner Oberfläche exponiert eine genormte Menge eines Immunoreaktionsteil
nehmers trägt, in innige Berührung bringt mit einer Lösung des zweiten Immunoreaktionsteilnehmers und
die Menge des zweiten Immunoreaktionsteilnehmers der
Lösung bestimmt wird, die am Immunosorptionsmittel immunosorbiert wird.
- 10 -
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