JPS5817834A - 担体結合免疫吸着剤およびその製法と用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、担体結合免疫吸着剤およびその製法と用途に
関し、更に詳しくは不動化免疫反応体を担持した担体を
有して成る担体結合免疫吸着剤およびその製法と用途に
関する。

セルロースまたはアガロースの様な炭水化物型担体ニ、
たとえばグルタルアルデヒドの様な架橋剤により共有結
合で結合された不動化抗体は知られティる（　Ｒ，Ｋｏ
ｗａｌ　　ら、Ａｎａｌ　、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ０県リー
。

７２−す６（１９８０））。これら炭水化物の担持能力
は比較的低く、製品は非常に安定ではない。

Ｔ、Ｔ、Ｎｇｏ　（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、第１
１巻４５９〜４６５頁）は、種々の不動化酵素系（免疫
反応試薬とは無関係）を記載している。そこでは、酵素
は、 （ａ）吸着により（この様な酵素は容易に吸着される様
になる）、 （ｂ）　酵素の必須ではないアミノ酸残基をセルロース
、ガラスまたは合成ポリマーの様な化学的活性化支持体
ヘアシト、インシアネート、カルボジイミドおよび支持
体の他の誘導体を介して共有結合することにより、 （Ｃ）ジイソチオシアネート、ビスイミデート、アルキ
ル化剤およびジアルデヒドの様な二官能性架橋剤を用い
て酵素自体を架橋させて凝集体（この中では酵素の所望
の性質の大部分は失われる）を形成させて重縮合させる
ことにより不動化される。

特定の抗体の分析（Ｅｌｉｓａ）に使用する酸素標識免
疫吸着剤は知られティる（　Ａ、Ｖｏｌ　Ｉｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ。

Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、ｌｓｉｏｌｏＭｅｄ、　１６３　、
４０２−５　（１９８０））。吸着またはイオン交換に
より基体に結合された免疫反応体も知られているが、結
合は弱い。

ＳｐｏｒｔｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ　（Ａｎａｌ　
、Ｃｈｅｍ、（１９８Ｑ）、５２．２０１３−２０１８
）は、担体としてのシラン化多孔性ガラスミクロビーズ
の珪素原子に化学結合したグリシドキシプロピルシラン
基の過沃素酸塩酸化により形成されたアルデヒド基に（
シッフ反応および水素化ホウ素ナトリウムによる還元に
より）蛋白アミノ基を介して共有結合された抗体を記載
している。１０ミクロンの直径を有する多孔性ガラスピ
ーズは、グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（Ｇ
ＯＰ　Ｓ　）の溶液に浸漬することによりシラン化され
る。この結果、個々のシラン分子はガラスのシリカの珪
素原子それぞれに化学結合することになる。有機グリシ
ドキシプロピル基は酸化によりアルデヒド基に変換され
、次にアルデヒド基は抗体と反応して抗体を不動化する
。得られる担体結合免疫吸着剤の免疫吸フイ力ラムの能
力を観察して調べられる。この目的のために、２種の抗
原（ヒ）ＩｇＧおよびウシインシュリン）がまず免疫吸
着され、次いでｐＨをア七ト二トリルで低くすることに
よりそれぞれ分離される。免疫吸着剤は、各抗原に異な
る抗体を用いて特別に調製される。抗インシュリンまた
は抗ヒ）ＩｇＧ抗体のいずれも、広い用途を有する免疫
吸着剤の製造には適していない。この方法は、不動化反
応に用いることができる免疫反応体の化学基（アミ７基
）、ならびに結合の配置および特に担体とその表面の化
学的、物理的性質に関して限られた自由度しか有してい
ない。担体が珪素系表面を有するか、またはシリカもし
くはガラスの物理的性質を有することは、常に望ましい
とはいえない（もし、金属または磁性が有用であるなら
ば）。さらに、免疫吸着反応における抗体／抗原（ハプ
テン）対の不動花種が必ず抗体であることは常に望まし
いとはいえない。

従来のガラス球のシラン化は、単分子以上ではなくそれ
以下であろうガラス表面の被覆を作ることになる。この
様な被覆は、一般にではないが、被験物質の非特異的な
、可逆容易な吸収を排除し、このことは特有の強い免疫
吸着の望ましい形の妨げとなる。露出したシラン吸着部
位およびガラス表面上の極性基は、敏感な蛋白ａ化合物
を変性する傾向かある。従来技術のミクロビーズの多孔
性は、ある目的には望ましいけれども、本発明の好まし
い応用分野では明白な不利益を有する。それは、表面積
に予測しえない影響を与え、しかもその影響はビーズご
とに異なる。この様な多孔は、モレキュラーシーブ効果
を有し、これにより排除および分子サイズ依存保持効果
が加わって所望の選択的な純粋な免疫吸着効果が妨害さ
れる。従来技術のビーズの小ささは、本発明の意図する
特定の用途には適していない。

従来技術の担体結合免疫吸着剤は、多かれ少なかれ、安
定性、普遍的な応用性、高性能および標準化の容易性と
いう様な望ましい性質の１またはそれ以上を欠いている
。

本発明の目的は、従来技術の有する上述の欠点や限界を
克服または軽減することにあり、また非常に広い範囲に
対応しつる新規な担体結合（不動）免疫吸着剤であって
、望ましい安定性および所定の水準に合わせられる性能
を有し、容易に標準化できる免疫吸着剤を提供すること
にある。更に詳しくは、才、′、；明の目的は、広範囲
の免疫吸着分析、たとえ゛ｊ、珍断、微量分析、法医学
および薬物動態学の分子’−ｒ＋“易に対応でき、応用
できる新しい型”Ｉ　　１ｒ＝免疫免疫剤を提供するこ
とにある。

不発０１１８（＠Ｙｙの観点から見ることができ、これ
らすべ””（ｊｉ６好ましい態様と組み合せて応用され
る。

本ＪＬ、υｆｌＪ）要旨によれは、不動化免疫反応体を
ｉｌｌ侍１　　：リ　本を有して成り、抗原または抗体
のいずれＩＪ：Ｊる免疫反応体は、その免疫学的に活性
な剖／　’　ｒ　（Ｊ疫吸着に関与しうる形で表面上に
存在するよ）（、担体を包囲した架橋フィルムに共有結
合さｉ７７’、・ることを特徴とする担体結合免疫吸着
剤が、′【される。好ましくは、免疫反応体の活性部分
は露出され、フィルムから突出している。

本明細書では、免疫原および抗原は実質的に同意語とし
て用いる。

本明細酢では、次の定義を採用する。

免疫原：免疫原は、異物、たとえば蛋白質または粒子、
たとえばウィルスやバクテリアであって、自身で免疫応
答を誘起できる。その結果、抗体（Ａｂ　）か、たとえ
ば注射により免疫原にさらされた免疫系を有する動物の
循環系内に発現する。

抗体：抗体（Ａｇ　）は、それに特有の抗体と結合して
Ａｂ−Ａｇ複合体、いわゆる免疫複合体を形成できる物
質または粒子であるが、必ずしもそれ自身で免疫応答を
誘起しない。

ハプテン：ハプテンは、一般に低分子量物質であって、
自身では抗体形成誘起能力はないが、抗体と反応するこ
とができ、担体と結合すると免疫原となる。

免疫反応体：抗原／抗体（またはハプテン）複合体形成
の反応パートナ−の１つとなりうる物質である。

好ましくは、フィルムは架橋された蛋白質分子またはそ
のペプチド部分から成る。好ましくは、免疫反応体自身
が蛋白質分子またはペプチド部分あるいはそれらの少な
くとも実質的部分を供給する。これに関して、抗体の全
ておよび重要な抗原の大部分は蛋白質であることが指摘
される。

フィルム成分の架橋に用いる架橋剤に関しては、後に述
べる本発明の製法の記載が参照される。

フィルムは架橋された他のフィルム形成物質、好ましく
は免疫反応体以外の蛋白質またはペプチドを含んでいて
よい。このことは特に次の２つの場合にあてはまる： （ａ）免疫反応体が、必要なフィルム形成物質全部を供
給するのに十分が程大量に存在していない場合、および （ｂ）免疫反応体が自身単独では満足しうるフィルムを
形成しない場合。この場合、免疫反応体はフィルム形成
物質に、たとえば他のフィルム形成物質と反応する少な
くとも１つの官能基と、免疫反応体の反応性部位、好ま
しくは失われても免疫反応体の所望の免疫的性質に全く
またはできるだけ小さい影響しか与えない部位と結合す
る少なくとも１つの官能基とを有する１種またはそれ以
上の二官能性試薬により共有結合することができる。

再ひ、二官能性試薬については後の記載が参照される。

好ましいフィルム形成物質は、セラチン、特に骨から得
られるゼラチンである。しかしながら、皮、たとえばブ
タ皮から得られるゼラチンまたはコラーゲンから得られ
るゼラチンも用いることができる。望ましい、または必
要な場合、ゼラチンのゲル強度は、たとえは米国特許第
３，６４０，８０９号に記載のように、増すことができ
る。また、他のフィルム形成物質はアルブミン、たとえ
ば卵白アルブミン、血清アルブミン（あまり好ましくな
い）および一般に塩基性蛋白質である。

免疫反応体は、フィルム中に他のフィルム形成物質との
ランダム混合物として存在していてよい。

一方、他のフィルム形成物質単独で担体を包囲し、その
露出表面に免疫反応体を、たとえば上述の架橋剤または
二官能性試薬により結合させることができる。

本明細書において、「フィルム」という語句は、不透性
の高密度層を必すしも意味しない。これは、主要な基準
が、担体を適当な強度で包囲するフィルムの粘着力にあ
るからである。しかし、一般に、フィルムは担体表面を
実質的に完全に被覆することか好ましい。

この点について、本発明は、フィルムの担体表面への化
学結合よりもフィルムによる担体の物理的包囲に依存し
ているＳｐｏｒｔｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎの開示と
は異なっている。さらに、好ましい態様によれば、担体
が蛋白質フィルムにより完全に被覆されれば、非特異吸
着および免疫吸着されるべき感応物質の損傷の危険が最
小になる。

担体の単位表面積当りに結合される免疫反応体の量は、
明らかにある程度免疫反応体の分子量に依存する。３０
０〜８Ｘ１０６の分子量または粒子質量および単独粒子
または分子層とし１それ以上（たとえばバクテリア）の
典型的な蛋白質免疫反応体の場合、量は、通常３０〜／
扉（たとえば粒子直径３０　Ｘｉ　Ｏ’（’１ｆｆ（３
０ｎｍ　）を有するポリオウイルスオヨび直径１２０ｘ
ｌＯ−７ＣＭ（１２０ｎｎｌ）を有するインフルエンザ
ウィルスでは１２０−１ｑ／ｌｔｌ＞からＩ　Ｘ１’Ｏ
−７ｃｍ（１ｎｎｔ　）程度の粒子的径を有するインシ
ュリンの様な物質では１■／ｎｌまでの範囲にある。

免疫反応体として有用なある種のハプテンはさらに小さ
い。しかしながら、量はより多い。この理由は、担体の
くぼんだ表面の故に、好ましい態様では抗原の多層が担
体表面に架橋されるからである。たとえば、十分な色層
反応体が存在するなラバ、または免疫反応体自身がフィ
ルム形成に適していないならば、これらの量の３０〜１
０００Φｈｔ％、好ましくは３００重量悌またはそれ以
下を異なる蛋白質またはペヲチド増量剤で置換または補
充してもよい。

これは、フィルムの全体または一部分を形成する抗体の
量は、抗原または抗体のサイズに依存して他のフィルム
形成物質（増量剤）が用いられているか否かを問わず、
約０．６〜５００〜／イの範囲にあることを意味する。

担体は、フィルムが容易に剥離しない様に包囲するのに
適した形状を有するのが好ましい。担体は、分析が行わ
れる液中に浸漬することができる棒、たとえばガラス棒
の形をとることができる。

さらに好ましいのは、完全に浸漬できる固体状物体また
は粒状物、好ましくは丸みのある、特に回転楕円体の、
より良くは球状の固体ビーズ、たとえばガラスピーズま
たはたとえばステンレススチール製磁性ビーズである。

この様なビーズは、好ましくは１以上の密度を有し、従
って容易に水性液体中に沈む。Ｓｐｏｒｔｓｍａｎらの
技術とは対照的に、本発明の好ましい態様のビーズは、
非多孔性であり、数桁以上大きい直径を有する。

本発明の特定の態様では、蛋白質Ａまたはコンカナバリ
ンＡがフィルムに共有結合され、次いで選択的に捕捉さ
れて分子末尾で保持された抗体分子が担持される。蛋白
質ＡおよびコンカナバリンΔは共に、免疫吸着機構と非
常に類似した方式で多数の抗体を捕捉し、強く保持でき
るという性質を４１している。この様に捕捉された抗体
は、この柱な抗体に対する抗原のための外側に向いた免
疫吸着機構を提供する。

本発明の第２の要旨によれば、不動化免疫反応体を担持
した担体を有して成り、担体またはその七に被覆された
フィルムの表面は、それに共有結合された抗原／抗体対
の一方である第１免疫反応体を担持し、第１免疫反応体
は抗原／抗体反応により該対の他方である第２免疫反応
体を保持し、こ６第２免疫反応体は、第３免疫反応体と
免役吸着反応を起こすための所望や免疫反応性を有する
部分を表面から突出させていることを特徴とする担体結
合免疫吸着剤が提供される。

従って、一種の免疫反応体の「二重層」が存在し、第１
層は固体基体に通常ランダムな配向で結合されているが
、第２層を形成する免疫反応体の適当量を捕捉し、保持
できる様に配向した適当量の免疫反応体を含んでいる。

第２層の免疫反応体の分子は、第１層の免疫反応体の対
応部分により免疫吸着されうる特定の部分および本発明
に従って免疫吸着剤とされるいかなる免疫反応体も免疫
吸着しうる他の部分を有している。この２番目の部分は
、常に、基体から離れる外向きの方向、すなわち第１層
とは反対の方向に突出する様に配向している。第２層の
特定の結合部位は露出しており、自由にその抗原と反応
する。第２層は、適当な架橋剤を用いて所定位置に共有
結合により固定されていてもよいが、これは好ましくな
い。

本発明の第１の要旨のところで記載した製品は、好まし
くは、本発明の第２の要旨の製品の製造に用いる中間体
として利用することができる。さらに、第１の要旨に従
った製品の必須および／または好ましい特性は、第２の
要旨に従った製品に好ましく組み込むことができる。

本発明の範囲は、その様な中間体を、第２層となる免疫
反応体の水性溶液または懸濁体に接触させ、それにより
第２層を免疫吸着的に捕捉する方法および製品にまで広
がる。この方法は、第２層か標準化された量の所望の免
疫反応部位を有するｔＩｉに、標準化された条件下で行
うことができる。

これは、第１層により供給された利用しうる部位を部分
的にのみ飽和するのに十分な既知量の第２層免疫反応体
を用いて達成される。

上述の方法は、本発明の免疫吸着剤の利用方法の一態様
とも見なすことができる。その様な利用方法は、混合′
物中の第１物質上に存在する免疫原決定因子に対しては
特異的であるが、混合物中の他の物質上の決定因子に対
しては特異的でない不動化免疫反応体を表面上に露出し
て担持する免疫吸着剤を混合物と密接に接触させ、それ
により第１物質を選択的に免疫吸着し、次いで混合物と
の接触から免疫吸着体を解放することから成る。好まし
い態様によれば、上述の中間体（これは自体有用な製品
である）は、第１層として特定の免疫原分子種に対する
免疫反応抗体を含んでいる。この分子種は、第２層を形
成するのに望ましい多くの免疫反応体、たとえば種々の
免疫分析用の多種の高特異性抗体の分子（通常高分子の
一端を形成）中に容易に組み込まれる（第１層により捕
捉される適合した相手方として）。実際には、たとえば
第１層は鳥類の卵の卵黄から回収されて抗原として作用
するＩｇＹに対して誘発された補乳類血清ＩｇＧまたは
異なる喘乳類に対して誘発されたある咄乳類の血清１ｇ
Ｇなどの特定の動物から一般に得られる抗体に対して特
異的に誘発された抗体から形成されることを意味する。

従って、この様な第１層は、特定類の動物から誘導され
た全抗体を捕捉するという特異性を除いて特異性を有し
ていない（そして、ＩｇＹに対する特定例の抗体では、
それらが鳥類の卵の卵黄から得られたものである限り、
いかなる特定の抗体も選択的に捕捉するであろう）。

この中間体は、１体有用な製品であり、末端使用者は、
特定の試験に要求される二重層を完成させるために免疫
反応体（たとえは単特異性１ｇＹの様な単特異性抗・体
）を選択し、適用しなければならない。この様な単特異
性抗体は、市販されており、あるいは製造元により与え
られた仕様書に従つて末端使用者か調製しうる。特定の
第１層抗体は正しい起原の第２層抗体（すなわち、動物
内で誘起または誘発され、第１層抗体が特異性を示すも
の、あるいはその様に誘起または誘発された後、組織培
養、たとえば単クローン組織培養により再生産されたも
の）ならばいずれも結合するので、特定の種類の第１層
抗体により被覆されたガラスピーズなどは、第２層に用
いる抗体の選択のみにより決定されるのであるが、多く
の異なる分析（たとえば異なるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ
）に用いることができる。

特に第２層について特別な高特異性抗体を誘発するため
に、当業者は多くの既知の方法を用いることができ、こ
の様な方法には、米国特許出願第２０７８６号、英国特
許出願第７９３０７６４号、日本国特願昭５４−７３１
５０号および西独公開公報第２９５１４１２号に開示の
方法が包含される。本明細書、特にこの部分に関連して
、南アフリカ国特許出願ｇｌ／４８９８号の技術が参照
される。

特異性を増すためにさらに精製を行うのが望ましい、ま
たは必要な場合、既知の方法により、免疫吸着分離の分
離媒体として本発明の免疫吸着剤を用いることにより、
あるいは選択されたｐＨ領域においてたとえばポリアル
レングリコールノ様なポリアルキレングリコールを用い
て分画沈殿を行うことにより精製することができる。こ
の後者の方法は、異なる分子量の免疫原に対する抗体は
異なる等電ｐＨ値を有するという、従来知られていなか
った概念に基づいている。すなわち、抗体は異なったｐ
Ｈ値で最少溶解度を有する。

と“りわけ」−述の目的に有用である免疫吸着分離方法
を（上述の使用法の一態様として）提供する。

その分離方法は、混合物中の第１物質上には存在するが
他の物質上には存在しない免疫原性決定因子に特異的で
ある不動化免疫反応体を表面上に露出して担持する上述
の本発明の免疫吸着剤を、混合物に密接に接触させ、こ
れにより第１物質を免疫吸着し、混合物との接触から免
疫吸着剤を解放し、さらに第１物質を脱吸着して免疫吸
着剤から純体として遊離させることを含んで成る。この
目的に適した脱吸着条件は既知である。弱酸、たとえは
プロピオン酸が脱吸着剤に適しており、たとえはｐＨ３
〜５、特に３．５で免疫吸着された物質は遊離される。

他の例は、アセトニトリルまたはグリシン−塩酸緩衝剤
（ｐＨ２，６〜２．９）である。

これまでの記述から、誘発・明の第３の要旨が導かれる
。すなわち、不動化免疫反応体を担持した担体を有し、
固体基体上に、動物の第２の種の抗体に対して誘発され
た動物の第１の種の抗体を共有結合し、架橋して含有す
る第１層および動物の第２の種の特定の抗原に対して誘
発された特定の抗体から成る、第１層に免疫吸着された
第２層をわして成り、特定の抗原に特異性を示す担体結
合免疫結合剤が提供される。ある目的には、ＩｇＹの結
合性または他の性質が特にすぐれている（高安定性、高
結合特性、入手容易性、蛋白分解酵素無含イ］’）。第
２の種類は、好ましくは鳥、たとえば家禽類、より好ま
しくは家禽鶏であり、鳥類に誘発された抗体は、これら
鳥類の卵の卵黄から回収される。

家禽の卵黄からのＩｇＹの生産については、米国特許出
願第２０，７８６号、英国特許出願第７９３０７６４号
、日本国特願昭−４−７３１５０号および西独特許出願
Ｐ２９５１４１２号が参照される。

さらに本発明によれば、本発明の製剤を用いる方法が提
供される。該方法は、本発明の免疫吸着剤を密接に接触
させ、抗原／抗体対の補第２免疫反応体に特異な第１免
疫反応体の標準量を第２免疫反応体の溶液にその表面上
で接触させ、免疫吸着剤に付着した溶液中の第２免疫反
応体の量を決定することを含んで成る。

一変形態様（特に、比較的大量の抗原の決定に適してい
る）によれば、試料から捕捉された免疫反応体を負荷さ
れた免疫吸着剤は、捕捉された免疫反応体の補体である
標識された免疫反応体の溶液に浸漬される。溶解された
免疫反応体は、基質により測定しうる発色反応を起こす
ことができる酵素で標識しても、あるいはラジオアイソ
トープて標識してもよい。（基質とは、分解または変性
か特定の酵素により加速される物質である。）標識した
物質の量は、ガラスピーズ上で直接決定することも、あ
るいは残渣反応体溶液中のものを差し引くことによって
決定することもできる。

また（たとえば比較的小量の抗原の濃度を決定する必要
がある場合）、同じ免疫反応体を標識された形で含む標
準溶液の既知敞を抗原試料溶液に混合してもよく、混合
物が本発明の免疫吸着剤と接触され、その結果、標識さ
れた免疫反応体と標識されない免疫反応体との間で競争
が起こり、標識された免疫反応体の免疫吸着量は、試料
中の標識されない反応体の量に反比例する。

本発明によれば、特に上述した様な担体結合免疫吸着剤
の製法が提供され、該製゛法は、架橋可能な蛋白質また
はペプチド勧賞を固体担体に適用して包囲し、フィルム
の表面中または上に組み込まれた所望の免疫反応体を包
含し、フィルムを架橋し、免疫反応体をフィルムに共有
結合することから成り、架橋および／または共有結合は
１種またはそれ以上の架橋剤または二官能性架橋試薬を
用いて行うことができる。

該方法、特に使用される材料の性質に関する教示につい
ては、本発明の免疫吸着剤の先の記載が援用でき、ここ
では前掲しない。

従来技術とは対照的に、本発明の態様は、フィルムの担
体表面への物理的包囲または嵌合に依存しており、表面
への直接的な化学反応に依存しているのではない。

物理的嵌合は、表面組織の粗化により助長される。たと
えば、ガラスピーズの表面は、たとえばシリコンカーバ
イド粉末でビーズがつや消しになるまで研摩することに
より有利に粗面化される。

次に、本発明、特に方法について添付図面を参照して詳
細に説明する。

図面は、本発明の免疫吸着剤を製造する本発明の方法の
好ましい態様を示す模式図である。図面中、本発明の製
品は、製品の好ましい使用法と共に模式的に示されてい
る。

■で示された第１ステツプでは、ガラスビーズ１（１個
のみが示されている）は、約０．５〜１５朋の直径を有
しうるが、この例では直径６朋であり、必要なら洗浄お
よび゛脱脂により完全に清浄される。ビーズは、玉子形
または楕円体であつＣもよいが、好ましくは回転楕円体
、特に球形である。

次に、ビーズはステップ■においてシリコンカーバイド
研摩剤と共に振とうされ、表面２はつや消しにされ、不
透明になる。表面を清浄するために、ビーズを濃塩酸中
に入れ、５分間沸騰させる（他の清浄方法として、たと
えば熱クロム酸による方法も明らかに可能である）。冷
却後、ビーズを蒸留水で洗浄する。ビーズを１０％炭酸
ナトリウムと共に１０分間沸騰して残留酸を中和する。

冷却後、ビーズを脱イオン水で繰り返し洗浄し、０．２
５ミクロンフィルタて濾過し、加温オーブンで乾燥し、
再び冷却する。

ステップ■ては、第１層として免疫反応体を適用する。

免疫反応体は自身蛋白質またはペプチドの性質を有して
いると考えられ、従ってフィルム形成蛋白またはペプチ
ド物質として作用するのに好ましい。免疫反応体は、濃
度約１〜３０　ｑ／　ｍｅ、好ましくは１〜２０１１’
ｊ／ｗｅの水性溶液としてビーズに塗布される。０．１
Ｍ塩水または緩衝液が好ましい水性媒体である。免疫反
応体は、選択された蛋白質もしくはペプチド型抗原（た
とえばウィルス抗原）または抗体、あるいは第２層の抗
体または抗原（たとえば蛋白質Ａまたはコンカナバリン
Ａ）と親和性のある蛋白質もしくはペプチド分子のいず
れかである。この例では、選択された特異性を有する抗
体３の層、たとえばヒツジＩｇＧ抗ウサギＩｇＧ（第２
層がウサギ■（の場合）またはヒツジＩｇＧ抗ＩｇＹ（
第２層が家禽卵黄から回収されたＩｇＹである場合）が
第１層として塗布される。

７５個のガラスピーズ１を第１層抗体溶液（濃度約２０
１９　／　ｍｅ、実施例１参照）を含むプラスチックペ
ｌ−ＩＪ皿にとる。ビーズを抗体溶液中でゆっくり回転
させて均等にぬらし、次いで他の乾燥した５個のプラス
チックペトリ皿上で同様に回転させて、過剰の抗体溶液
を乾燥する。先に述べた様に、ビーズ表面上の免疫吸着
部位の濃度を下げるのが望ましい場合、または利用しう
る抗体量が少ない場合、よい低濃度の抗体溶液を用いる
ことができ、Ｉ−分なフィルム形成物質を供給するため
に、溶液の抗体濃度を適当な蛋白質またはペプチドによ
り抗体量を基準にしてたとえば３０〜１０００重量％、
好ましくは３００重量％またはそれ以下に増量する。適
当なフィルム形成増値剤は、たとえばゼラチン、アルブ
ミン、ラクトアルブミン、部分加水分解蛋白質である。

ステップ■では、第１層の抗体は、本例ではグルタルア
ルデヒド蒸気（飽和）により架橋される。

２５％グルタルアルデヒド溶液を平らなガラス皿に深さ
５ＭＭまで入れ、アルミニウム箔で密封し、溶液上の空
間が飽和されるまで数時間放置する。

ステップ■のガラスピーズをペトリ皿に入れ、グルタル
アルデヒド溶液上に浮かせる。ガラス皿を再び密封し、
ビーズを（約１８〜２５°Ｃの室温で）１時間またはそ
れ以上蒸気にさらす。この時間変数は、ある程度、ａ）
第２層を形成するため（ステップＶ１参照）に用いる第
２層抗体の濃度、およびｂ）第２層抗体の吸着（免疫吸
着）のための熟成時間の長さに関係する。これらパラメ
ータの多くの異なる組み合せが良好な結果を与える。従
って、以下の記述は単に指針として読まれるべきである
。

その１つの理由は、第２層の抗体の所望量も免疫吸着剤
の所期用途に依存するからである。たとえは、免疫吸着
剤が特定の分析、たとえば放射免疫分析（ＲＩＡ）また
は齢、素標識免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）に用いられる
ならば、測定されるべき物質（たとえばホルモンや薬品
）を結合するのに必要な抗体の好ましい量は、既知の、
または容易に決定できる範囲内に入る。

たとえば６０〜１２０分で、特に他のパラメータａ）お
よびｂ）が以下の範囲にある場合、良好な結果が得られ
る。ステップ■における６０分から２時間の暴露で一般
の用途の良好な単独層製品が得られる。ステップ■の第
２層抗体濃度（パラメータａ））の増加および／または
第２層につし”Ｃ−の免疫吸着時間（パラメータｂ））
の増加は、最適暴露時間を長くする効果を有し、逆に低
減すると短くな−る。

これらパラメータの組み合せによりガラスピーズ１個当
りの利用しうる免疫吸着部位の数が定まり、ビーズはあ
る特定の所期用途に対して最大値を有しうる。この様な
利用しうる免疫吸着部位の数は、たとえば製品により免
疫吸着される放射活性標識免疫反応体の量を測定するこ
とにより決定することができる。

架橋後に、過剰な架橋剤の官能基（ひげ状の線４ａで模
式的に示す）を除去またはブロックすることが一般に必
要である（ステップＶ）。グルタルアルデヒドの様なア
ルデヒドの場合、エタノールアミンの様な反応−性アミ
ンを用いることができる。この処理を行う前に、未結合
架橋剤を（たとえは水または希食塩水で）洗い流すのが
望ましい。

その後、ビーズは、ｐ）１７．６の０．ＩＭリン酸塩緩
衝戒の様な希釈緩衝液に溶解されて穏和なアルカリ性に
された様な１％エタノールアミン水溶液中に置かれる。

過剰のアルデヒド基をブロックするには一般に１時間で
十分であることがゎがった。

７５個のビーズに対して約１００ｍ／の溶液を用いる。

未反応エタノールアミンはリン酸塩緩衝液（５０ｍ／、
０．１　Ｍ１ｐ８７．６　）で３回洗浄して洗い流す。

エタノールの代りにグリシンを用いることもできるが、
やや好ま１くない。

この緑に調製されたビーズ１ａは本発明の免疫吸着拗の
−Ｂ様であり、以下に記述する加工の為の中間体として
適している。このビーズは、ビーズ１を包囲する、架橋
抗体３を含む、またほから全体が成る架橋蛋白質または
ペプチドのフィルム４（第１層）を有している。抗体３
はＩＩＪｌのフィルム４内でランダムに配向している。

しかし、いくつかの抗体３ａは、免疫吸着部位として働
くのに十分である様にその抗体捕捉部位がフィルムから
外へ向かって面して突出する様に、配向されている。ブ
ロックされたグルタルアルデヒド鎖は４ｂで示される。

抗体の第１層内の利用しうる免疫部位の数は、もし各抗
体が２個の抗原を捕捉すると最も強い免疫吸着が起こる
ので、捕捉されるべき抗原の数の約半分にするのが好ま
しい。

ステップＶの製品は、好ましくは冷所、たとえは４“Ｃ
で長時間貯蔵することができる。

ステップ■の製品は、貯蔵後または製造直後のいずれで
も、ステップ■において免疫反応体の第２層を適用する
ことにより本発明の二層態棟に変換される。第２層免疫
反応体は、この例では異種の抗体である。この抗体は、
一方では第１層の抗体に対して抗原性であり、他方では
特定のハプテン（たとえは免疫吸着分析において測定さ
れる物質）に対して特異的である。分析されるべき物質
は、たとえばチロイドホルモン１゛３であり、第１層抗
体はウサギＩｇＧに対して誘発されたヒツジＩｇＧであ
り、第２層抗体はＴａに対して特異的なウサギＩｇＧと
する。あるいは、第１層抗体は（卵黄の）［ｇＹに対し
て誘発されたヒツジＩｇＧであり、第２層抗体はＴａに
対して活性免疫化されたニワトリの卵黄から回収された
ＩｇＹである。ステップ■の条件は、第２層内の抗体濃
度が所期の免疫吸着に適したものとなる様に選択される
。次の原則が適用される： １、ＲＩＡの様な分析には、抗体の量は試験される抗原
の量より常に少なくなければならない。さもなければ、
結合された放射活性標識抗原の量は非標識抗原の量に反
比例するという仮定が保持されない。

２、第１層により捕捉される第２層抗体の量は、第１層
中の抗体の結合活性（結合能）ならびに量、第２層抗体
溶液の濃度、溶液への暴露時間および温度に依存する。

３、シかしながら、第１層により捕捉されるのに利用さ
れる第２層抗体分子の数は、第２層抗体分子の強い免疫
吸着を達成するために、第１層内の露出抗体部位の数の
少なくとも２倍でなければならない。

４、次に、第２層を形成する抗体分子の数は、二層免疫
吸着剤の最終用途での条件士で第２層抗体それぞれによ
り少なくとも２個の抗原が捕捉される為に存在する様に
制限されなければならない。

５．それにもかかわらず、第２層抗体溶液と第１層の接
触時間は、いくつかの第１層抗体が占有されずに残る様
に、制限されなければならない。

上述の原則に基いて、第２層用の抗体は、ビーズ１個当
り１〜２０μｇ１好ましくは２〜５μｇたとえばヒツジ
またはウサギＩｇＧおよびＴ３に対する卵黄１ｇＹの場
合には２μｇの量で適用される。

抗体は、ビーズを完全に覆うのに十分な量のリン酸緩衝
液（０，１Ｍ、　ｐＨ７，６）に溶解する。ビーズは抗
体溶液に対して、０°Ｃから抗体の変性温度（約５−６
　”ｃ　）の間で接触されるが、接触の少なくとも１部
分は、第１層による第２層の強力な保持をもたらす特有
の効果（明らかには分子形態の変化）が発生する低温で
行う。全接触時間は温度に依存し、高温になると第２層
の形成が促進される。

好ましい手順では、溶液は（水浴により）所定の微温、
詳しくは３０〜４０°Ｃ１特に３７°Ｃに予め加温され
る。次いで、ガラスピーズ１ａが加温された溶液に加え
られ、所定の温度に所定接触時間保持される。この時間
は経験的に定めることができ、温度、抗体溶液の濃度お
よび第１層抗体の結合活性に依存するが、一般に１〜３
時間である。

好ましい３７゛Ｃの温度では、最適時間は、通常１．５
〜２時間、より好ましくは１．７〜１．８時間である。

接触時間が長すぎても短かすきても、ビーズを用いて行
うＲＩＡの様な分析の感度に悪影響があることがわかっ
た。

次いで抗体溶液中のビーズをより低温、好ましくは０〜
１０℃、たとえば３〜５°Ｃ１特に４°Ｃに冷却し、低
温でさらに接触させると優れた結果が得られる。この第
２の接触時間は、同様に経験的に最適化され、一般に１
０〜６０分間（高温では短時間）、好ましくは２０〜４
０分間、特に４°Ｃで３０分間である。

得られたビーズ１ｂは、次いて溶液から取り出し、リン
酸塩緩衝塩水で３回洗浄する。該洗浄液はいくらかの界
面活性剤を含むのが好ましい。

０．０５〜１％、好ましくは０．１％のポリエチレンソ
ルビトールモノオレエー）　（Ｔｗｅｅｎ　２０または
１”ｗｃｅｎ　８Ｑとして市販）は、界面活性剤として
抗体、特にＩｇＹ抗体に対して安定化効果を有する。

ビーズ１ｂは直ちに分析に用いられるか、または後に使
用するために好ましくは低温、たとえば４゛Ｃで貯蔵さ
れる。ビーズは、抗体３を含む架橋フィルム状の第１層
４を含んで成り、いくつかの抗体３ａは外側に向き、突
出している。これら第１層抗体分子３ａの大部分は、そ
れぞれ第２層抗体分子５を２個捕捉している（第２層抗
体５は、太い線で描かれた抗体３と区別するために細い
線で描かれている。抗体は、はぼＹ字状をしており、Ｙ
字の頭部が捕捉部位（それぞれか２個の抗原を免疫吸着
する）を示し、Ｙ字の幹（あるいは尾部）は、第１層の
抗体３ａが特異性を示す抗原性決定因子を含む。従って
、抗体３ａは捕捉された第２層抗体５の対をその尾部で
保持し、その結果、抗体５はその捕捉部位が外向きに放
射状に向く様に周囲に配向される。これは、第１層抗体
３．３３かランダムに配向しているのとは対照的である
。

希釈された第２層抗体溶液は繰り返し使用することかで
きるが、低温（たとえは４℃）で保存しなければならな
い。

ビーズ１ｂは、特定の分析に必要とされる薬品、試薬お
よび標準試料と共にキットとして販売することができる
。放射免疫分析（ＲＩＡ）の場合、キットは、測定され
るべき物質の標準試料および放射活性に（１４Ｃまたは
トリチウムまたは１２５Ｉにより）標識された同じ物質
（または免疫学的に該物質と区別できない物質）を包含
する。

図面のステップ■には、Ｔ３チロイドホルモンのＲＩＡ
において生じる現象が模式的に描かれている。

既知または未知量の通常の′Ｉ゛３および１２５Ｉで標
識された既知量の他のＴ３を含み、０．０６Ｍバルビト
ン緩衝剤でｐＨ８，５に緩衝された溶液（標準溶液また
は未知試料）を、特定の穏和な温度（たとえは３７°Ｃ
）に（水浴上で）予備加熱する。二層被覆ビーズ１ｂを
溶液に加え、所定温度で所定時間、たとえば２時間保つ
。ビーズを含む溶液を、次に所定の低温に冷却し、所定
時間その温度に保つ（たとえば４°Ｃで３０分間）。溶
液をビーズから分離する。ビーズをたとえばリン酵塩緩
衝塩水（好ましくは０．１％の”ｌ’ｗｅｅｎ　２０を
含む）で３回洗浄する。次にビーズを計数バイヤルに入
れ、ガンマカウンタで１分間放射能を測定する。ガンマ
計数は、ステップ■でビーズＩＣにより免疫吸着された
放射標識１゛３７の量に正比例する。図面に示されてい
る様に、抗原６を捕捉（免疫吸着）した第２層抗体５は
、通常の′ｌ゛３および放射標識Ｔ３７両者について、
試料中の比に比例した′ｌ′３と１３７の比で捕捉する
。ただし、溶液中の全抗原量は、ビーズｌｂ上の抗体の
最大捕捉能力を越えている。この場合、測定された放射
線量は試料中のＴ３量に逆比例する。上述の様に、免疫
反応体自身がフィルム形成物質の全体または一部分を提
供してもよく、あるいは他の蛋白質またはベプチドン型
のフィルム形成物質で補充されていてもよく、さらには
その様な他のフィルム形成物質がフィルム自体の形成に
用いられ、免疫反応体は、たとえば二官能性試薬により
フィルムに共有結合されていてもよい。

最後に述べた塵性を実施する場合、図面について説明し
たステップ■は修正され、抗体３の溶液は最初ζｊ全て
フィルム形成蛋白質またはペプチド、たとえばゼラチン
の溶液により置き換えられる。

次いで、たとえばステップ■の様に架橋されて一部のみ
が反応した架橋剤が付着したフィルムにされる。次いで
、ステップ■は、抗体３の反応性部位との反応による架
橋剤の未反応架橋基のブロック化に置き換えられる。こ
の手順は、利用しうる抗体３の量が少なくても、その大
部分がフィルム表面上に免疫吸着部位を与える様に残る
場合に有利である。

架橋剤または二官態性結合剤は、少なくとも２個の官能
基を有していなければならず、その少なくとも１個は免
疫反応体の反応性部位との結合に関与する共有反応性を
有し、一方、他の官能基は、同一または異な、っ、てい
てよいか、フィルム形成物質として役立つあらゆる蛋白
質またはペプチド物質の反応性部位との共有結合反応に
関与する反応性を有していなければならない。

結合剤の官能基か異なっている場合、１個の官能基は免
疫反応体上の特定の型の反応部位と反応する様に特に選
択され、７一方、他の官能基はフィルム形成物質への結
合に有用な特定の型の反応部位と反応する様に特に選択
されるのが好ましい。

多くの免疫反応体は、種々の型の反応部位を有しており
、そのいくつかは他のものよりも、この様な免疫反応体
の特別で特異的な免疫活性により多く関与している。換
言すればより特異的に免疫吸着反応に関与している。こ
の理由により、免疫反応体の特異的な所望の免疫性能を
最大に保存しながら免疫反応体を結合する為に最も適し
た型の部位の選択は、異なる結合剤については要すれば
簡単な実験を行って、この原理′についてなされなけれ
はならない。

結合剤の典型的な官能基は次の通りである：官能基　　
　　　　　反応相手 アルデヒド　　　　　　　　　　第１級アミンイミド　
　　　　　　　　　　第１級アミンアミノ　　　　　　
　　　　　　アルデヒドシアノ（臭化シアン中の）　　
　水酸基ハロゲン（たとえば臭素）　　　チオール又は
水酸基 カルボキシル基　　　　　　　　第１級アミン無水物（
たとえば無水コハク酸 および無水マレイン酸）　　　　第１級アミンマレイミ
ド誘導体　　　　　　　チオール基この様な結合剤の好
ましい例は、ジアルデヒド類、特に脂肪族ジアルデヒド
類、好ましくはグルタルアルデヒドおよび連続したカル
ボニル基に４〜２０の炭素原子を有する高級同族体纂カ
ルボジアミン類、好ましくはアミン基が少なくとも３、
好ましくは４〜２０の炭素原子により隔てられている化
合物、たとえばヘキサメチレンジアミン；臭化シアン、
これはまず相手方のＯＨ基と反応して活性化イミドエス
テルを形成し、このイミドエステルが次に第２の相手方
、たとえば抗原または抗体のアミ７基と反応する。

−Ｌ述の結合剤は、自体既知の方法で、より詳しくは玉
揚の表に従って、それぞれ対応する反応部位と反応を起
こすことができる。

本発明方法のある態様では、結合剤はまず一体に架橋さ
れるべき２つのパートナ−の一方と反応して反応性中間
体を形成し、次にそれが他方のパートナ−こ反応する。

最初のパートナ−は、免疫反応体またはフィルム形成物
質のいずれであってもよい。

一方、両パートナ−がそれぞれ（たとえば別個に）結２
合剤と反応して反応性中間体を形成し、次に該中間体同
志が一体に結合してもよい。

もし免疫反応体が二官能性結合剤と共有結合反応するの
に適した反応性基を有してＣ′ζ゛ないならは、適当な
反応、たとえば異なる二官能性結合化合物との反応によ
り反応性基を導入し不反応性誘導体を形成してよい。同
様のことが、結合反応に供する免疫反応体の存在する反
応性基のいずれも犠牲にするのが好ましくないとされる
場合にもあてはまるが、これは反応性基の保存が所望の
免疫吸着反応に重要、であると考えられるからである。

従って、図面に示した例（ここでは、架橋蛋白質フィル
ムがまずステップ■および■で形成され、次にステップ
■においてのみ抗体がフィルムに付着した未反応結合基
に結合される）の上述の一変形では、第１層（抗体３、
または第１層に免疫吸着される抗体に対するハプテンの
いずれであってもよい）に導入される免疫反応体を結合
剤と反応させて、フィルムの未反応結合基と極めて容易
に反応する中間体を形成するのが有利である。

幾可学的および改良された免疫吸着性の理由がは ら、比較的長い結合鎖、好まし♀なくとも３がら２０ま
で、より好ましくは４〜１ｏの炭素原子を有する脂肪族
炭素鎖を免疫反応体とフィルムとの間に供給できる様に
結合化合物を選択するのが有利である。

上述のところでは二官能性有機結合剤の使用が特に強調
されているが、結合または架橋の他の手段または方法、
たとえは遊離ラジカル法（たとえは放射誘起による）ま
たは架橋分子の挿入を行わない直接縮合反応（フィルム
形成蛋白質と免疫反応体との間の）などを採用できるこ
とは当業者なら容易に考えうる。

次の実施例では、チロイドホルモン分析が特に説明され
ている。この−理由は、この分析が比較的進んだ段階に
あって、同じ目的に本発明の一態林を用いると当業者の
理解が容易になることである。さらに、より優れたチロ
イド分析の開発の必要性が存在している。本発明はその
様な改良に新しい道を開くものである。

しかしながら、実施例に示した方法か、臨床診断、法医
学または薬物動態学の研究（たとえは、従来の方法によ
る測定には低すきる血中レベルの高潜在能薬品に対する
）に有用であるほとんど無限の分析に同様に応用できる
ことは当業者なら容易に理解できる。たたし、分析すべ
き物質に対して特異的な抗体が存在するか、または製造
できるという条件が必要であるが。この目的については
、従来の技術または教示が本発明でも前後参照される。

実施例は、本明細書全体の内容に照らして理解されるべ
きである。

実施例１ 直径６緒のガラスピーズを上記ステップ■に従ってまず
粗面化した。

ステップ■はＩｇＧで下記のごとく行なった。

ヒツジの頚静脈あるいはウサギの耳に血液を供給してい
る大動脈から血液を抽出した。この血液を常温で３〜５
時間かけて耐量させ、次いで、３０００Ｘｌ’で３０分
間遠心分離して繊維素凝固物およびすべての細胞質物質
を除去【た。得られた清澄な血清を硼酸塩緩衝液（０，
０１Ｍ、ｐＨＢ、６）２倍量で希釈した。１５％ｍ　／
　ｖの最終濃度となる棟にポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ６０００）を加えた。懸濁液を１２０００Ｘｇで１
０分間遠心分離した。沈澱ペレットを取除いて同量の硼
酸塩緩衝液（０，０１Ｍ、　ｐＨ８，６）に再懸澗させ
た。

１）ＥＣを１５％ｍ　／　ｖの最終濃度となる様に再び
加え、懸濁液を１２０００）ｌで１０分間遠心分離した
。上澄液を捨て、ペレットをリン酸塩緩衝液（０，１Ｍ
ｌｐｉｌ　７．６　）に最初の血清量の半分溶解させた
。

上記のステップ■を行なうために、２０　ＩＱ　／　ａ
ｔの濃度を持ったＩｇＧ１）−溶液を用いた（ガラスピ
ーズ７５個に対し１履／）。

図面のステップ■に関して記述したように飽和クルタル
アルデヒド蒸気に２０°Ｃで６０分間曝して架橋を形成
し、次いで図面のステップ■に関して記述したようなエ
タノールアミン処理をした。

実施例２ カラスビーズを卵黄から取ったＩｇＹで被覆するために
実施例１に記載したのと同じ方法を採った。

ＩｇＹは下記のようにして分離した。

卵黄を卵白から分離して流水で十分水洗してできるだけ
卵白を除去した。測量シリンダに支持されたロート内に
卵黄を落しながら卵黄サックをキープパックした。卵黄
の量を測り、卵黄の２倍相当ｈ；°の０．１Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７，５）を加えて充分に混合した。３．５
％ｍ　／　ｖの最終濃度になる様に粉砕したＰＥＧ６０
００を加えた。ポリマーが溶解するまで混合液を攪拌し
、次いで１４０００ｇで１０分間遠心分離して遠心分離
管内で三相ｐ分離を生じさせた。即ち遠心分離管内の物
質の合計量の約３分の１に当る、表面の黄色の脂肪層、
清澄な上澄液層、およびカゼモノ状卵黄素の半固型の柔
軟な底部層となった。脂肪層を含む上澄液をロートの頚
部に脱脂綿の固い栓を含むロートに注意深く傾注して脂
質４−Ｆ去した。清澄なＰ液の量を測り、一層粉砕した
ＰＥＧ６０００を加えて濃度を１２％ｍ　／　ｖに調整
し、それによってＩｇＹを・液から完全に置換した。沈
澱を１４０００ｘｆで１０分間遠心分離した。ペレット
を卵黄の原量に相当するリン酸塩緩衝液に再溶解し、Ｉ
ｇＹを再び１２％ｍ　／　ｖで沈澱させて上記のように
遠心分離した。ＰＥＧを含む上澄液を吸引にｉらて除去
した。最終ペレットを卵黄の原量の１／６　に相当する
量の緩衝液ｈｅ再溶解した。蛋白質の濃度はここで２０
Ｍｆ／／ｎｌとなった。分離したＩｇＹを保存するため
に緩衝液に０．０１％のナトリウムアジドを加えた。

実施例３ 蛋白質抗原の第１層を抗体のかわりにガラスピーズにつ
ける場合には実施例１による方法に従えはよい。このよ
うな抗原の例はバクテリア、バクテリア免疫性決定因子
担持バクテリア片、精製ウィルス、ウィルス性抗原、蛋
白質、薬、ホルモンおよび毒素である。非蛋白質性の薬
あるいはホルモンの場合には、これらは先ず担体蛋白質
に、好ましくはゼラチンに、被覆スーテツプに先立って
付着され乞。蛋白質抗原１１１Ｉｌ当り１〜２０　ｍｌ
の溶液を用いて被覆ステップを行なう。

実施例４ 通常の方法で卵黄１ｇＹに対してウサギに免疫を施すこ
とによってウサギＩｇＧを調製した。実施例１に記載し
た方法でガラスピーズにウサギＩｇＧを被覆した。次に
、このようにして被覆したガラスピーズをウィルス抗原
ｒｘＪに対して特異性を持った卵黄抗体（ＩｇＹ）を１
〜２０〜／　ｙｉｌ　（典型的には２ＷＫ／／Ｒ１）を
含む緩衝溶液（ｐａｌ　７．６　）に浸漬した。ゆっく
り攪拌しながら３０分間浸漬した後、ガラスピーズを０
．１％１”ｗｅｅｎ　２０　（市販界面活性剤）または
０．１％１’ｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ（リン酸塩緩
衝塩水）または他の非イオン性界面活性剤を含む塩水で
充分洗浄して非付着１ｇＹを除去した。このようにして
調製した二層特異抗体製剤を下記のように貯蔵した。

被覆したガラスピーズを湿っている間に４°Ｃの栓付ガ
ラス容器に入れた。あるいは、ビーズをデシケータまた
は同様の装置に入れて適当な乾燥剤上で４”Ｃで乾燥さ
せた。Ｐ２Ｏ５は適当な乾燥剤である。

水溶液中でウィルス抗原「ｘ」を測定するために下記の
試かを行なった２１個のビーズを微量滴定管に入れ、こ
れに試験すべき溶液Ｑ、　３　ｍｌを加えた。管を常温
で５分間ゆっくりと攪拌した。このようにして忙イルス
はガラスピーズに付着された特異な抗体Ｒよって不動化
されるようになった。

捕捉されたりイノースを負荷したビーズを、０．１係の
Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳて洗浄し、次に酵素（更
に詳細に（：酵素アルカリ性リン酸塩）で標識した抗原
「Ｘ」（例えばプロメグラス・モザイク・ウィルス）に
対する特異抗体０．０１〜０．ＩＭｙを含む水溶液０．
３ｍに浸漬した。これらの抗体は、捕捉されたウィルス
粒子の数に比例して捕捉されたウィルス粒子に付着した
。

酵素標識されたＩｇＹは下記のようにして作成した： １１９のアルカリ性リン酸塩を１ゴのＩｇＹ溶液（２■
／ｌ１１１蛋白質）に溶解した。塩水に溶かしたグルタ
ルアルデヒドの０．２５％溶液０．２　ｄを加えた。

常温で２時間放置し、次にリン酸塩緩衝塩水（ＰＩ′％
Ｓ）に対して１６時間透析した。その後ＰＢＳで０．５
％に希釈した。

抗体を標識するのに用いた酵素は、酵素の基質であるリ
ン酸バラニトロフェニルと発色反応を起こすことができ
、その発色反応の強度は色度計で測定して存在する酵素
の量の尺４度を示すことができ、それは本例の場合には
捕捉されたウィルスの量の尺度ともなる。発色反応はガ
ラスピーズ（未付着の過剰量を洗い落した後の）に対す
る付着によって試薬溶液から除去された酵素の量に基づ
いて、あるいはガラスピーズの除去後に溶液に残存する
酵素の量に基づいてのいずれかによって行なうことがで
きる。

好ましい方法においては１２区画滴定板を用い、る。各
区画に０．１　ｄの塩水（Ｔｗｅｅｎ入り）をピペット
で取る。第１の区画の塩水に０．１　ｍｌのＩｇＹ酵素
複合体を加える。０．１１を第１の区画から第２の区画
へ移し、同様に第２の区画から第３の区画へ移すことに
よって連続した希釈液を作る。次に被覆したビーズ１個
を各区画に加えて３７°Ｃで１時間培養する。ビーズを
取除き、ＰＢＳで充分洗浄する。緩衝液（ジェタノール
アミン９７ｍ、水８００ｆｆｉ／、”ａＮ３０．２０　
Ｅｌ、ＰＨを９．８ニ調節する塩酸で１４にしたもの）
に溶解したＰ−ニトロフェニルフォスフェートを１■／
ｄの濃度にスル。

この溶液０．１　ｍｌを微量滴定板の１２の区画の各々
に載せて、ビーズを区画に正しい順序で入れる。

板を常温で２時間培養する。

これがいわゆる［エリザ（Ｅｌｉｓａ）　Ｊ試験の改良
法である。これはすべての抗原−抗体反応に、例えはバ
クテリア、ウィルス、蛋白質、毒素−こ適用できる。

実施例５ 卵１ｇＹに対して誘発したウサギＩｇＧを被覆した同型
のガラスピーズを前実施例と同様に用いた。

また、抗原「ｘ」に対して特異型の抗体をつけるステッ
プは前実施例と同様に行なった。しかし、Ｅｌｉｓａ分
析の下記の変更方法においては、測定すべき抗原「ｘ」
を含む試料を、酵素（実施例４における酵素と同じもの
でよい）で標識した適当な濃度の抗原ｒＸＪを含む等量
の溶液と混合した。

通常は、抗原「Ｘ　Ｊ　０．１　”９／ｒｕｇが最大で
ある。実際にはガラスピーズにつく溶液の量は少量であ
る。

それゆえ何百ものビーズに免疫試薬の１種ＩＩＩＩｌを
被覆することができる。

この方法においては、試験試料の標識抗原と未標識抗原
との間に競合があり、ガラスピーズの表面の特異な抗体
に付着するに至また酵素標識抗原「ｘ」の量はこの試料
から派生した未標識抗原「Ｘ」の濃度に反比例する。ガ
ラスピーズについた酵素の量あるいは溶液に残された酵
素の量のいずれかの色度計測定は前実施例と同様に実施
する。

本実施例による方法はバクテリアを含む分子量３００〜
８Ｘ１０６およびそれ以上の抗原に適する。

実施例６ ６ＭＩＲガラスピーズに第１層として抗つサギＩｇＧヒ
ツジＩｇＧを実施例１に記載した方法によって被覆した
。第２層を作るために（図面におけるステップ■）、ド
イツ連邦共和国ベルリン在ＨｅｎｎｉｎｇＡＧによって
製造された市販の抗′１゛３ウサギ全血清を用いた。こ
の凍結乾燥製品を蒸溜水で再構成して原量にもどし、リ
ン酸塩緩衝液で１：３２０の割合で希釈した。

ステップ■について上記と同様の方法を３７°Ｃで１．
７５時間、続いて４°Ｃで３０分間実施した。

ビーズを抗体溶液から取り出し、上記のようにして０．
１％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄した
。

ｌｉに対するＲＩＡ試験は上記のごとく行ｄっだ二分析
は内径１０ＭＭの丸底ポリプロピレン製の丸薬ひん内で
各々の未標識Ｔ３濃度について３回行なった。

緩衝液中に下記のＴ３ａ度を持つように標準試料を作成
した： ０、０５　ｎｇ／Ｑｌ　、　０．７　ｎｇ／ｗｒｌ　、
２　ｎｇ／ｘｉおよび５ｎｇ　、／：耐 各分析管に下記のものを加える： １、分析緩衝液（１００μｅ、０．１Ｍリン酸塩緩衝液
、ｐＨ７’、　６　） 、、　　１２５１Ｔ　　分析緩衝液溶液（１００μｌ　
）１１１、標準゛Ｉ゛３分析緩衝液溶液（１００μｅ　
）容管の内容物をゆっくり叩くことによって混合する。

管は水浴に入れて３７゛Ｃに予熱する。上記の二重被覆
ガラスピーズ１個を容管の溶液に加える。管を３７°Ｃ
で２時間培養し、続いて４°Ｃで更に３０分培養する。

容管の液体内容物を吸出し、１個のビーズをＰＢＳ溶液
（０，１％”ｌ−ｗｅｅｎ　、ビーズ１個当りｌ　ｍｅ
　）で３回洗浄する。ビーズを計量ひんに入れてガンマ
カウンタで１分間計測する。

未知の血清試料についてのＴ３　ＲＩＡは下記のごとく
行なった。

各分析管に対して下記のものを加える：１、分析緩衝液
（１００μ１１バルビツール酸塩緩衝液０．０６Ｍ、ｐ
Ｈ８，６） ＋＋、　　１２ｓ■１３　分析緩衝液溶液（１００μｌ
　）＋ｉ＋、　　０．１％ポルオールを含む分析緩衝液
（１００μｅ　） １ｖ、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）抑制剤の
分析緩衝液（Ｚｏｏμｌ　） ■、標を化血清または未知血清（５０μｌ　）１゛３標
準化血清をつくるには、Ｔ３を含まない血清をつくり、
所定量の１゛３を加える。

緩衝液の１３の分析に用いたのと同じＴ３標準の濃度を
血漿の分析に用いる、即ち、０．０５　ｎｇ　／　ｍｅ
。

０、７　ｎｇ　／ｍｅ、２　ｎｇ／ａｔ　、　５　ｎｇ
／ｓｌ　　である。これらの値について標準曲線を作成
する。

その他の点においては分析方法は緩衝液中の゛ｌ゛３溶
液について上記したものと全く同じである。

実施例７ 下記のこと（変更して実施例６を繰返した。

実施例１に記載した方法で第１層としてガラスピーズに
ヒツジＩｇＧ−抗１ｇＹを被覆した。

第２層にはＩｇＹ−抗′ｌ゛３を免疫したにわとりの卵
徴から回収し、実施例２に記載した方法に従って回収し
た。抗１“３抗体を被覆ステップに先立ってト記の方法
によって更に濃縮した。抗Ｔ３Ｉ　ｇ　Ｙ抗体製剤を０
．２Ｍ酢酸に対して４時間透析して…を約４に下げた。

溶液を４’Ｃに冷却し、ｐＨを４．６に調節した。ＰＥ
Ｇ６０００を８％ｍ　／　ｖの濃度に加えて、生成する
沈澱物を１４０００１＋で遠心分離した。次に０．１Ｍ
水酸化ナトリウムを加えテｐＨヲ５．０　ニ上Ｖ、ＰＥ
Ｇ濃度を再びｓ　％ｍ／Ｖに・・調節した。生成する沈
澱物を遠心分離し、高い′ｌ゛３結合能力を持ったＩｇ
Ｙ分子の濃縮液として回収した。この濃縮液をＰＨ７，
６のＰＢＳに溶解して１η／耐の蛋白質を含む溶液を作
った。その後の方法は実施例６の場合と同様である。Ｐ
ＥＧなどにより、ｐＨ調節をしながら沈澱することによ
って特異な抗体を富化することあるいは分画することは
哺乳動物の抗体にも適用できる。特異な両分を回収する
ための正しいｐＨおよび沈澱物の最適濃度は経験的に定
められるものである。

実施例８ ガラス小球（ビーズ径０．０５〜０．１　ＭＭ　）を粗
面化し、実施例１に記載したようにＰＢＳに溶解した５
％Ｅ）ＩｇＧを被覆した。ビーズを小型カラムに詰め、
５鷹ｌ中１００＃のＩｇＹ抗ヒトＩｇＧ（実施例２に記
載したようにして回収したもの）をカラム（０，１ｆヒ
ト免疫グロブリンを被覆したバロチ−＝２０ｇを話めた
２５ｃＩＲ×１．５ｃＭのもの）に付し、ゆっくりと浸
出させた。溶出液が７哄過塩素酸で負の反応を示すよう
になるまでＰＢＳで洗浄することによって非結合蛋白質
を除去した。ＩｇＧ−ＩｇＹ複合体を解離し、プロピオ
ン酸を含むＰＢＳでｐｔｌを３．８に下げてＩｇＹを溶
出した。飽和ポリエチレングリコールに対する過浸透に
よって溶出液を２１ｍ１に濃縮した。溶出液は期待した
ＩｇＹ活性を持っていた。

実験を通じて０．１％”Ｉ’ｗｅｅｎ　２ＱをＰＢＳに
加えるへきである。

実施例９ カラス小球に実施例２に記載した方法で抗蛋白質１ｇＹ
２肩／（２０′ＩＩｇ／渭ｌ）を被覆する様に変更をし
た他は、実施例８を繰返した。ＩｇＧ抗体抗体２壱ｌ用
し、ゆっくりと浸出させた。カラムをｐｉ−１７，２の
リン酸塩緩衝液で洗浄して非結合１ｇＧを除去した。特
異ＩｇＧ抗体をプロピオン酸およびプロパツール（ｐＨ
３，６）を用いてＩｇＹ抗原から解離した。

溶出液を重リン酸ナトリウム（０，２Ｍ）１０ｍｌを入
れたビーカーに集めて直ちにプロピオン酸を中和した。

ＰＢＳを２４時間透析して塩を除去した。

ＩｇＧ−抗１ｇＹをカラムから回収した。

実施例１０ にわとりをチロキシン（’ｒ４）に対して免疫した。

実施例２に記載した方法に従って免疫した卵黄からＩｇ
Ｙ抗１゛４　を回収した。これらの抗体を実施例１に記
載したように６朋ガラスピーズの第１層に被覆した。

ＩｇＹ抗チロキシン（Ｔ４）の２ｏｏμｌ量を６個のガ
ラス管内にピペットで取った。上記のように作ったＩｇ
Ｇ抗１ｇＹ被覆ガラスピーズを各管内に入れて３７’Ｃ
’ｒ１時間培養した・次に３−″″を１％Ｔｗｅｅｎ　
　２０．　１％ポリビニルピロリドンおよび０．２％卵
白アルブミンを含むＰＢＳで洗浄した。

放射標識したＴ４および非放射性Ｔ４を下記のように加
えた。

１　　　　　０、２　　　　０．　Ｏ５５０００２０，
２０，０２２０００ ３０，２０，０１１０００ ４０，２０，００５５００ ５０、２０，００２２００ ６０，２０，００ 来　「冷」（非放射性）Ｔ４の濃度は１０μｇ１０、１
　ｗｔｌであった。

次にビーズを取り除き、ｐ紙で吸取り乾燥させ、シンチ
レーションびんに入れ、そして放射性を測定した。測定
した放射性を標本の非活性１゛４の濃度と反比例させた
。

実施例１１ ２０１９７　ＩＩ／のゼラチンおよび１１９／ｗ＋ｌの
蛋白質Ａ（かなりの種類の起源の免疫グロブリンを結合
させる能力を持ったスタフィロコッカス・アウレウスか
ら誘導した蛋白質）を含む溶液を作成した。

ＩｇＧ溶液の代わりに上記の溶液を用いることによって
図面を参照して記述した方法のステップ■をゆ更した。

架橋ステップ（ステップ■）およびエタノールアミンで
のブロック化ステップ（ステップ■）を、図面を参照し
て記載した通り確実に行なった。

次いでこのようにして被覆したビーズを用いて蛋白質Ａ
が親和性を持っている抗体を不動化した。

これは実施例６に記載したように行なった。

第２層の量を事前に決めなけれはならず、そしてこれが
第２層抗体溶液の最適濃度およびこのような溶液に対す
るビーズの露出時間を定めることになる。これを個々の
場合について経験的に行なった。

上記の方法は蛋白質への代わりにコンカナピリンへにつ
いても行なうことができる。

実施例１２ 第１層被覆を、下記の方法の１つによって図面のステッ
プ■を参照して記述したようにして塗布した。

（ａ）　　実施例１および２のそれぞれに記述した通り
ＩｇＧ溶液またはＩｇＹ溶液の適用、（ｂ）３０〜３０
０重量％のゼラチンまたはアルブミン増量剤（ガンマグ
ロブリンに基づく）を含むＩｇＧまたはＩｇＹ溶液の適
用、 （Ｃ）　　アルブミンまたはゼラチンのような純担体蛋
白質（１ｍｅ当りゼラチンまたはアルブミン２０ｔｎｇ
の溶液として用いたもの）の適用。

このよ゛うにして被覆した（しかしまだ架橋してない）
ビーズを真空乾燥した。ジシクロへキシルカルボジイミ
ドを用いてＮ−ヒドロキシスクシンイミドの縮合によっ
て作ったゲルタール酸（またはピメリン酸）のジエステ
ルを２〜２０〜／　ｍｅの溶液として作った（　Ｊ、Ａ
ｍ、Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ　、　８６　。

１８３９−１８４２（１９６４））。架橋溶液１０ｍ１
に７５個のビーズを入れた。架橋の程度は一般に１〜１
８時間である露出時間によって制御することができる。

ビーズを洗浄し、未反応の反応性基をメルカプトエチル
アミン（リン酸塩緩衝液０、ＩＭ中１％、ｐＨ７，６）
で１時間ブロックした。

但しブロックステップをフィルムに適用されるべき第１
層免疫反応体の溶液にビーズを浸漬することに変える上
記（Ｃ）の場合は除く。

所望の第２層免疫反応体の第２層を次に実施例６または
７に記載したように適用した。

この実施例においてはへ一ヒドロキシスクシンイミドの
ゲルタール酸およびピメリン酸ジエステルは蛋白質分子
上のアミン基と反応してＮ−ヒドロキシスクシンイミド
を遊離させる。

実施例１３ 二官能性架橋試薬として下記の構造式を有する１、３−
ビスマレイミドプロパンを用いることによって実施例１
２を変更した。

この試薬をＧｏｏｄ　ｆ　ｒ　ｉ　ｅｎｄらの方法Ｃ５
ｃｉｅｎｃｅ。

１４４．１３４４−１３４６（１９６４）’）に従って
作成した。残部については方法は同一とした。

ビスマレイミドはマレイミド環の二重結合に付加して蛋
白質および同様の分子のスルフヒドリル基と反応する。

未反応のマレイミド誘導体をその後メルカプトエチルア
ミンによる処理によってブロックした。

実施例１４ 二官能性架橋試薬としてＮ−（４−カルボキシシクロヘ
キシルメチル）マレイｉドのＮ−ヒドロ羊シスクシンイ
ミドエステルを用いて、実施例１２を変更した。

その場合に生じる反応は実施例１２および１３に含まれ
る反応の組合わせであった。

実施例１５ 実施例１２を変更して、二官能性架橋剤とじてて示され
る３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸のヘーヒド
ロキシスクシンイミドエステルを用いた。

この実施例においては蛋白質などのアミン基は架橋剤の
１端と反応−し丈Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを脱離
したが、他端はジスルヒド変換によってスルフヒドリル
基と反応して２−メルカプトピリジンを脱離した。

未反応の官能基のブロックをメルカプトエチルアミンで
再び行なった。

実施例１６ Ｃａｒｌｓｏｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１
７３　、７２３−７３７　（１９７８）　）に従ってウ
シのガンマグロブリンをＮ−スクシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応
させた。過剰の５ＰＤＰ試薬を限界透析によって除去し
た。この反応においてガンマグロブリンのアミノ基は５
ＰＤＰと反応してＮ−ヒドロキシスクシンイミドが脱離
され、反応性、、、２−ピリジルジチオ基を持った反応
性中間体が生じた。

ガラスピーズに実施例１２に記載したように架橋ゼラチ
ンを被覆した。反応性架橋基を下記のように導入したニ ジチオジグリコール酸１８２１１５！　（ｄｔｄｇ）を
２モル水酸化ナトリウム１ｍ／に溶解した。ｄｔｄｇ溶
液を硼酸塩緩衝塩水（ｐＨ６）で２５−に希釈した。

上記のようにゼラチンを被覆し、ゼラチンをゲルタール
アルデヒドで架橋し２、過剰のアルデヒド基をエタノー
ルアミンでブロックしたビーズ７５個を次に上記の溶液
に入れ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ｅｄｃｉ）２５０〜を含む別の水
２．５　ｍｌ溶液を混合しながら加えた。混合を常温で
３０分間継続した。

次にビーズをホスフィト緩衝塩水（０，１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含む）で４回洗浄した。

゛　次にこのようにして処理したガラスピーズをジチオ
スレイトール（ｄｔｔ）による還元に付した。

１ｋｌｄ口をリン酸塩緩衝塩水１５ｍ／で希釈し、上記
のように処理したガラスピーズ７５個を加えて時々攪拌
しなから１時間反応させた。次いでビーズをリン酸塩緩
衝塩水（０，１％’Ｉ”ｗｅｅｎ　　２０　）で４回洗
浄してその後直ちに次のステップに移った。

Ｌ記のウシのガンマグロブリン中間体２■のリン酸塩緩
衝塩水１０ｍ／溶液を作成し、新らたに作成した処理ガ
ラスピーズを加えた。２５°Ｃで一夜反応を進行させた
。ガラスピーズは反応基として１’ｚｌ（−Ｃｏ−ＣＨ
２−ＳＨ残基を持ッテいた。ＳＨ基はジチオピリジル基
と反応して２−メルカプトピリジンを脱離した。ウシの
ガンマグロブリン分子をセラチン被膜に共有結合させた
生成ガラスピーズを０．１％Ｔｗｅｅｎ　　２０を含む
リン酸塩緩衝塩水で４回洗浄した。

実施例１７ 実施例６を変更した。抗Ｔ３゛つ、５サギ全血清のかわ
りにアルファーフェト−蛋白質（ＡＦＰ）に対するウサ
ギ抗血清を第２層に用いた。

ＡＦＰに対するＲＩＡ測定を羊膜液または血清二層ガラ
スピーズを用いた。その方法は実質的には市販の放射免
疫分析キット〔例えは、ＢａＸＬｅｒＴ’ｒａｖｅｎｏ
ｌ　Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ、＜（よる”Ｇａｍｍａ−Ｄａｂ
”　（Ｒ）〕に記載された通りである。しかし、本発明
は、ガンマ計測用のペレットを回収するための液体試薬
での沈澱、遠心分離、及び傾しゃのような不便なステッ
プが、ガラスピーズ上での免疫吸着に置き替えられてビ
ーズが次に計測にかけられるという、大きな利点を提供
する。

実施例１８ 実施例１７を変更して実施例７と同様に第１層としてヒ
ツジＩｇＧ−抗１ｇＹを用いた。南アフリカ特許出願８
１／４８９８号ならびに米国、英国、日本、およＯドイ
ツ連邦共和国における対応出願に記載されｔようにして
作成されたＡＦＰ共役物に対してポルソンの方法によっ
て免疫されたにわとりからＩｇＸを回収した。ＩｇＹは
、ウサギを起源とする従来の抗体（６，ＱｘＩＱ９Ｌ１
モル）よりも高い結合活性（Ｋ＝２Ｘ１０”Ｌ１モル）
を持つていた。

実施例１９ カラスビーズに、グルタルアルデヒドで架橋し　　−た
ゼラチンを被覆し、過剰のアルデヒド基を図面を参照し
てステップエ〜１■について記述したようにエタノール
アミンでブロックした。ゼラチン（２０〜／′ｓ＋／）
はガンマグロブリンの溶液の代わりに用いた。

１’ａｎｔｃｈｏｕおよびＳｌａｕｎｗｈｉｔｅの方法
（Ｊ、ｏｆＩｍｎｔｕｎｏａｓｓａｙ　　、　　１　　
（１）　　、１　２　９　−　１　４　７　　（１９８
０）に従って、その１３９頁に”　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　
ｏｆｉｒｘｌｏｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ　ｅｓｔｅｒｓ　”の題目で記載されたよ
うにして、テストステロン・ヘミスクシネートのヨード
ヒスタミンエステルを作成した。エステル５ｍｌをＰＢ
　５２０　ｄに溶解し、次にゼラチン被覆カラスビーズ
７５個をその溶液で被覆した。その後、ビーズをペトリ
皿に拡けて、皿内で静かにころがしながら紫外線溶（波
長２１１ｎＩＩＩ−水銀燈）に５分間露出させた。その
後ガラスピーズを０．１％”ｌ−ｗｅｅｎ　　２Ｑを含
むＰＢＳで洗浄した。

前記の実施例においては本発明をカラスビーズを用いて
例示したが、被覆方法は実質的な点てゆ史することなく
ガラス以外の材料で作ったビーズあるいは他の適当な支
持体を用いることもできることが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明の免疫吸着剤の製法および使用法の一態
様を模式的に示す図である。 １・・・ガラスピーズ、２・・・ビーズ表面、３・・・
抗体、４・・・フィルム（第１層）、５・・・抗体、６
・・・抗原。 特１ｒ「出願人　サウスアフリカン・インウ゛エンショ
ンズ・デイウ゛エロツプメント・コーポレーション代理
　（弁理士　青山葆　（外１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、不動化免疫反応体を担持した担体を有して成り、抗
   原または抗体のいずれかである免疫反応体は、その免疫
   学的に活性な部分が免疫吸着に関与しうる形で表面上に
   存在するように、担体を包囲した架橋フィルムに共有結
   合されていることを特徴とする担体結合免疫吸着剤。 ２、免疫反応体の免疫学的に活性な部分が、露出され、
   フィルムから突出している第１項記載の免疫吸着剤。 ３、フィルムが、架橋された蛋白質分子または蛋白質の
   ペプチド部分を有して成る第１項記載の免疫吸着剤。 ４、免疫反応体自身が、蛋白質またはペプチド部分、あ
   るいは少なくともその実質的部分を供給する第３項記載
   の免疫吸着剤。 ５、フィルムが、免疫反応体の他に他の架橋フィルム形
   成物質を含有する第１項記載の免疫吸着剤。 ６、他のフィルム形成物質が蛋白質またはペプチドであ
   る第５項記載の免疫吸着剤。 ７、免疫反応体が、バクテリアの場合３００〜８×１０
   ６の分子量または粒子質量を有し、担体の表面に０．６
   〜５００ｑ／ｍの割合でフィルムに結合されている第１
   項記載の免疫吸着剤。 ８、フィルムが、免疫反応体の量を基準にして３０〜１
   ０００重置％の蛋白質またはペプチド増量剤を含む第７
   項記載の免疫吸着剤。 ９、担体が棒状またはビーズ状である第１項記載の免疫
   吸着剤。 １０、担体が密度１以上の固体ビーズである第９項記載
   の免疫吸着剤。 １１、蛋白質ＡまたはコンカナバリンＡがフィルムに共
   有結合され、選択的に捕捉されて分子末尾で保持された
   抗体分子を担持する第１項記載の免疫吸着剤。 １２、免疫吸着剤製造用中間体として用いられる場合、
   フィルムは、フィルムに共有結合された抗原／抗体対の
   一方である第１免疫反応体を担持し、第１免疫反応体は
   抗原／抗体反応により該対の他方である第２免疫反応体
   を保持し、この第２免疫反応体は、第３免疫反応体と免
   疫吸着反応を起こすための所望の免疫反応性を有する部
   分を表面から突出させている第１項記載の免疫吸着剤。 １３、フィルムは、フィルムに共有結合された抗原／抗
   体対の一方である第１免疫反応体を担持し、第１免疫反
   応体は抗原／抗体反応により該対の他方である第２免疫
   反応体を保持し、この第２免疫反応体は、第３免疫反応
   体と免役吸着反応を起こすための所望の免疫反応性を有
   する部分を表面から突出させている第１項記載の免疫吸
   着剤。 １４、不動化免疫反応体を担持した担体を有して成り、
   担体またはその上に被覆されたフィルムの表面は、それ
   に共有結合された抗原／抗体対の一方である第１免疫反
   応体を担持し、第１免疫反応体は抗原／抗体反応により
   該対の他方である第２免疫反応体を保持し、この第２免
   疫反応体は、第３免疫反応体と免疫吸着反応を起こすた
   めの所望の免疫反応性を有する部分を表面から突出させ
   ていることを特徴とする担体結合免疫吸着剤。 １５、第１層が、動物の第２の種の抗体に対して誘発さ
   れた動物の第１の種の抗体を共有結合し、架橋して含有
   し、第２層が、動物の第２の種の特定の抗原に対して誘
   発された特定の抗体から成る、第１層に免疫吸着されて
   いる第１４項記載の免疫吸着剤。 １６、不動化免疫反応体を担持した担体を有し、固体基
   体上に、動物の第２の種の抗体に対して誘発された動物
   の第１の種の抗体を共有結合し、架橋して含有する第１
   層および動物の第２の種の特定の抗原に対して誘発され
   た特定の抗体から成る、第１層に免疫吸着された第２層
   を有して成り、特定の抗原に特異性を示す担体結合免疫
   吸着剤。 １７、第１層の抗体がランダムに配向し、第２層の抗体
   がその抗原捕捉部分を外側へ向けながら主として放射状
   に外側へ：向かって配向している第１６項記載の免疫吸
   着剤。 １８、第２の種が鳥類である第１６項記載の免疫吸着剤
   。 １９、鳥類内に誘発された抗体ｂ（該鳥類の卵の卵黄か
   ら採取されたものである第１８項記載の免疫吸着剤。 ２０、使用される時は、診断または分析試薬として適用
   され、供給される第１項記載の免疫吸着剤。 ２１、放射免疫分析または酵素標識免疫分析に使用され
   る第２０項記載の免疫吸着剤。 ２２、架橋可能な蛋白質またはペプチド物質を固体担体
   に適用して包囲し、フィルムの表面中または」―に組み
   込まれた所望の免疫反応体を包含し、フィルムを架橋し
   、免疫反応体をフィルムに共有結合することを特徴とす
   る担体結合免疫吸着剤の製法。 ２３、免疫反応体自身が、フィルムを形成する物質の全
   体または一部分を供給する％２２項記載の製法。 ２４、免疫反応体が他の蛋白質またはペプチド型フイル
   ム形成物質により補充されている第２２項記載の製法。 ２５、他のフィルム形成物質がフィルム自体を形成する
   のに用いられ、免疫反応体はフィルムに共有結合してい
   る第２２項記載の製法。 ２６、フィルムの架橋および／またはフィルムへの免疫
   反応体の結合を行うために架橋剤または二官能性結合剤
   を用いる第２２項記載の製法。 ２７、架橋剤または二官能性結合剤が、アルデヒド、イ
   ミド、アミノ、シアノ、ハロゲン、カルボキシル、活性
   化カルボキシル、酸無水物およびマレイミドの中の同一
   または異なる２種またはそれ以上の官能基を有する第２
   ６項記載の製法。 ２８、架橋剤がまず一体にグラフトされる２つの相手の
   一方と反応して反応性中間体を形成し、次いで該中間体
   が他方の相手と反応する第２６項記載の製法。 ２９、免疫反応体が、二官能性結合剤と共有結合するの
   に適した反応性基を有しておらず、反応性誘導体が、適
   当な反応、たとえば異なる二官能性結合化合物との反応
   によりその様な基を導入して形成される第２７項記載の
   製法。 ３０、免疫反応体の遊離ラジカル中間体が形成され１．
   遊離ラジカル中間体が反応してフィルムに共有結合され
   る第２２項記載の製法。 ３１、遊離ラジカル中間体が照射により造られる第３０
   項記載の製法。 ３２、第１層を、第２層の抗体に対する抗体をフィルム
   に結合させて形成し、第１層を含む担体を、必要喰の第
   ２層抗体か第１層に免疫吸着されるまで第２層抗体の溶
   液に接触させる第２２項記載の製法。 ３３、第１層により捕捉されるのに利用しうる第２層抗
   体分子の数が、第１層中の露出抗体部位の数の少なくと
   も２倍である第３２項記載の製法。 ３４．９％２層抗体の溶液への接触を、接触の少なくと
   も一部分が第１層による第２層の強固な保持をもたらす
   変化が生じる様な低温でなされることを条件に、０゛Ｃ
   から抗体の変性温度までの温度で行なう第３２項記載の
   製法。 ３５、接触をまず免疫吸着が促進される比較的高温で行
   い、続いて低温でさらに接触を行う第３４項記載の製法
   。 ３６、第１項記載の免疫吸着剤を使用する方法であって
   、混合物中の第１物質上には存在するが他の物質上には
   存在しない免疫原性決定因子に特異的である不動化免疫
   反応体を表面上に露出して担持する免疫吸着剤を、混合
   物に密接に接触させ、これにより第１物質を免疫吸着し
   、混合物との接触から免疫吸着剤を解放することを特徴
   とする方法。 ３７、放射免疫分析（ＲＩＡ）の一部を成す第３６項記
   載の方法。 ３８、酵素標識免疫分析（Ｅｔ　Ｉ　Ｓ　Ａ　）の一部
   を成す第３６項記載の方法。 ３９、混合物から免疫吸着剤を除去した後、第１物質を
   脱吸着して免疫吸着剤から純体として遊離させることを
   含んで成る第３６項記載の方法。 ４０、第１項記載の免疫吸着剤を用いて行い、抗体を吸
   着して他の免疫吸着剤を製造する第３６項記載の方法で
   あり、フィルムはそれに共有結合された抗原／抗体対の
   一方である第１免疫反応体を担持し、第１免疫反応体は
   抗原／抗体反応により該対の他方である第２免疫反応体
   を保持し、この第２免疫反応体は、第３免疫反応体と免
   疫吸着反応を起こすための所望の免疫反応性を有する部
   分を表面から突出させている方法。 ４１、免疫吸着剤を密接に接触させ、抗原／抗体対の補
   第２免疫反応体に特異な第１免疫反応体の標準量を第２
   免疫反応体の溶液にその表面上で接触させ、免疫吸着剤
   に付着した溶液中の第２免疫反応体の量を決定すること
   を含む第３６項記載の方法。