JPH06506056A - Mhc抗原によるペプチド結合検定法 - Google Patents

Mhc抗原によるペプチド結合検定法

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JPH06506056A JP4505164A JP50516492A JPH06506056A JP H06506056 A JPH06506056 A JP H06506056A JP 4505164 A JP4505164 A JP 4505164A JP 50516492 A JP50516492 A JP 50516492A JP H06506056 A JPH06506056 A JP H06506056A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 M)IC抗原によるペプチド結合検定法1血立! 本発明は、特定の主要組織適合性遺伝子複合体の糖タンパク質に結合する候補体 部分の性能を測定する方法に関する。
有効な候補体は、特定のMHC糖タンパク質で媒介される症状の治療剤として有 用である。
1咀旦宣l 免疫系は哺乳類の種の安寧のために必須の器官であるので、免疫系がどのように 作動しているのかを理解しようと試みる熱心な研究が行われている。ごく最近に なって、主要組織適合性遺伝子複合体(MBC)の糖タンパク質が、8928球 と1978球の応答に必須の役割を演じていることが決定された。
)ABC糖タンパク質は、2つのタイプすなわちクラス■とクラス11に分類さ れるが、それぞれのクラスにおいて、かなり異なる役割を演じていると思われる 。加えて、クラスIとクラスHの糖タンパク質の構造は異なっている。構造が異 なっているにもかかわらず、各々の場合に、免疫系が応答する抗原は細胞内で分 解され、その抗原のフラグメントは、MHC糖タンパク質と結合した細胞表面で 発現されることが分かっている。
MHC糖タンパク質は冬型性領域を有し、その領域の溝と関連し、かつ溝に結合 するペプチドに対しである程度の特異性を有する。したがって各MHC糖タンパ ク質は、それが結合できる比較的分子量の低い部分となる特異的レパートリ−の みを有する。
以下に述べる本発明は、この低分子量部分のレパートリ−の固定に関する。
MHC糖タンパク質ペプチド複合体はT細胞レセプターに提示されるが、T細胞 レセプターは、自身が結合されるMBC糖タンパク質と協同して、フラグメント を特異的に認識する。その結果、T細胞が刺激されてリンホカインを分泌し、そ のためリンパ球が拡大する。
これらのフラグメントはリンパ球の活性化に不可欠のものであるので、特定のリ ンパ球の活性化を増大もしくは減少させる役割を演するペプチドもしくは低分子 量の生体分子が作り出され得るかまたは発見され得る。このように8928球お よび1978球の活性化は制御されて、特定の免疫応答を促進するかもしくは抑 制する。よって、リンパ球の応答を活性化もしくは阻害する有効候補体部分を同 定できることは非常に重要であり、これらの同定部分は、自己免疫疾患、感染症 、アレルギーなどの治療に有用となり得る。したがって、問題の特定のMl(C 糖タンパク質を捕捉可能な部分が決定されると、関連MHC糖タンパク質が抗原 部分を提示することにより媒介される症状に有用な治療用化合物が提供される。
通常の競合結合検定法は、適切な候補体部分を同定することには適切でないと思 われる。より一般的なリガンド/レセプターの結合とは異なり、部分/MHC糖 タンパク質複合体の生成速度は非常に遅いが、生成した複合体は安定である。そ の結果、未変性の物質から得られるMHC糖タンノ<り質は、内因性ペプチドの 不均一な配列と複合するので、速度が非常に遅いときと変動するときを除いて、 他の候補体部分と結合することを阻害される。単離されたMtlC糖タンJ4り 質の約1%だけが他の候補的な部分を直接捕捉できる”オーブン形(open  for曹)″であり、該製剤の約99%はすでに内因性ペプチドと複合している と確定される。
したがって、特定のMHC糖タン1<り質に対して多数の候補体部分を、迅速か つ効率的な手法でスクリーニングすることができる有効なリガンド結合検定法を 考案する必要がある。本発明は上記の目的を達成するためのいくつかのプロトコ ルを提供するものである。
l1文ぷ 以下の文献が関連していると考えられる。すなわち、Babblttら、”Th e Binding of Iamunogenic Peptides to  Ia旧stocompatibility Mo1ecules”、 h組皿 、 ilユ看、 359〜361頁、1985年;Buus、−1solati on and Characterization of Antigen−I a Complexes in T−cell Recognition−、c ell、4]pi、1071−1077頁、1986年、WattsおよびMc Connell、 ”旧gh AffinitFFluoreseent Pe ptide Binding to I−A’ in LipidMembra nes″P oc Natl Acad 士−USA、LL!1.9660〜9 664頁、1986年HBuschsら +Degenerate Bindi ng of ImmunogenicPeptides to HLA−DRP roteins on B−cell 5urfaces−、LIlilvsu nol、 lfi、443−441頁、1990年;)iocheおよびCre ssvell。
”IHgh Affinity Binding of an 1nfluen za Hemagglutinin−derived Peptide to  Purified HLA−DR”、 J↓m5unol、 !14Jls18 49〜1856頁、1990年;ChenおよびParham、”Direct  Blndingof Influenza Peptldes to C1a ss I BLA Mo1ecules−、l側1■j、LL7Jl、743− 745頁、1989年:およびBoul l lotら、 −Physical Association Between MHCC1ass I Mo1ec ules andIwmunogenic Peptides”、Nature 、3jjJ、473〜475頁、1989年である。
l匪段皿土 本発明が提供する第1のプロトコルは次のとおりである。
分散された可溶性MRC糖タンパク質を、検出可能なアゴニストがMBC糖タン パク質と複合体を形成することが分かつている条件下で、競合候補体部分の存在 下において、該検出可能なアゴニストで処理する。生成した複合体を反応混合物 から分離し、複合体中に含有されているアゴニストに対する候補体部分の作用を 測定する。
本発明の第2のプロトコルは、例えば精製されたMHC糖タンパク質が容易に入 手できない場合に特に適しているが、以下のとおりである。MHC糖タンパク質 を検定プレートに捕捉させて、可溶性MHCの代わりに競合検定法に用いる。こ の検定プレートは、例えば、抗−Ml(C糖タンパク質抗体またはMl(C糖タ ンパク質に対して親和性を有する他の試薬に誘導体化されている。
やはり、固定化MHCの検出可能なアゴニストとの結合に対する候補体部分の作 用を測定する。
他のプロトコルでは、単離されたMHC糖タンパク質は、均一なペプチド製剤が 前負荷され、その結果、すでにカップリングされたMBC糖タンパク質の均一な 集団が提供される。前負荷されたペプチドの解離反応が、別の候補体部分の結合 反応の律速段階である場合、この方法は、反応速度を制御して、検出可能なアゴ ニストと候補体間の均一な競合を保証することができる。さらに、生成したMB C複合体を希釈すると、前負荷されたペプチドの解離が速くなり、そのため、ア ゴニストもしくは候補体に結合する”中空ポケッ) (empty pocke t)”(すなわち利用可能なドメインまたは結合部位)を生成する。
均一な前負荷されたペプチドとしては、MHC糖タンパク質によって比較的容易 に放出され、したがって検定に要する時間が短くなるものを選択することが好ま しい。
その他のプロトコルでは、単離されたMHC糖タンパク質に、このタンパク質か らの解離速度が他のペプチドの存在によって影響されることが分かっている標識 ペプチドを前負荷する。
そして、MBC糖タンパク質からの標識アゴニストの解離もしくは置換の反応を 加速する試験化合物の性能を測定する。
さらに、アゴニストおよび/または候補体部分との複合体の形成を検出するのに 有用な手段は、T細胞刺激に対する複合体の作用を測定することである。
したがって、1つの態様において、本発明は、MBC糖タンパク質に対する試験 化合物の親和性を測定する方法に関するものであって、該方法は、反応混合物中 に、セルフリー分散MHC糖タンパク質、前記糖タンパク質に結合して複合体を 形成しかつその複合体中あるとき検出することができる可溶性アゴニスト、およ び試験化合物を、試験化合物とアゴニストが競合してMHC糖タンパク質に結合 する条件下で混合する工程;MBC糖タンパク質に捕捉されたアゴニストを未結 合のアゴニストから分離する工程;および、複合体中に結合されているアゴニス トの量を、反応混合物中の試験化合物の濃度の関数として検出する工程;を包含 する。
第2の態様において、本発明は、特定のMHC糖タンパク質に対する試験化合物 の親和性を測定する方法に関するものであって、該方法は、MHC糖タンパク質 が結合されている固体支持体を、MHC糖タンパク質と結合して複合体を形成し 、かつその複合体中にあるときは検出することができる可溶性アゴニスト、およ び試験化合物を含有する反応混合物で、試験化合物と前記アゴニストが競合して MBC糖タンパク質に結合する条件下で、処理する工程;前記反応混合物を固体 支持体から取り出す工程;および、前記固体支持体に結合したアゴニストの量を 、反応混合物中の試験化合物の濃度の関数として検出する工程;を包含する。
第3の態様において、本発明は、MHC糖タンパク質に対する試験化合物の親和 性を測定する方法に関するものであって、該方法は、第1アゴニストを前負荷さ れたMHC糖タンパク質を、前記MHC糖タンパク質と結合して複合体を形成し 、かつ前記複合体中にあるときは検出することができる第2アゴニスト、および 試験化合物を含有する反応混合物で、試験化合物と第2アゴニストが競合してM HC糖タンパク質と結合する条件下で、処理する工程;前記MBC糖タンパク質 は、該反応混合物を添加する前に前負荷するアゴニストで前負荷され、かつ希釈 される工程;および、複合体に結合され第2アゴニストの量を、反応混合物中の 試験化合物の濃度の関数として検出する工程;を包含する。
第4の態様において(解離速度検定法)、本発明は、MHC糖タンパク質に対す る試験化合物の親和性を測定する方法に関するものであって、該方法は、反応混 合物中に、標識アゴニストを前負荷されたMHC糖タンパク質、および試験化合 物を混合する工程であり、前記の前負荷された複合体の解離速度は他のペプチド の存在によって影響されることはわかっているもの;および、試験化合物が存在 するときと存在しないときとの上記の前負荷された複合体の解離速度を比較して 、試験化合物によって加速されたオフ速度(off rate)を検出する工程 ;を包含する。
第5の態様において、本発明は、MHC糖タンパク質複合体中の(候補体)部分 の存在を検出する方法に関するものであって、該方法は、前記複合体を前記部分 で感作されたT細胞の培養物と接触させて、前記T細胞の存在、不在、または増 殖量を検出する工程を包含する。
図面の簡単な説明 図1は、DR4Dw4との結合について、未標識11A3G?−319が標議H A307−319と競合的であることを示す代表的阻害曲線である。
図2は、粗溶解物から、抗体でコートされた微量滴定プレートによって捕捉され たDR4Dv4を用いる、標識11A307−319の結合曲線を示す。
図3A、3Bおよび3Cは、DR4Dv4 MHC糖タンパク質に前負荷した後 、種々の試験ペプチドについて測定した”オフ速度”を示す。
図4Aと4Bはそれぞれ、前負荷されたMHC糖タンパク質および対照MBC糖 タンパク質に対するRMBP90−102ペプチドの結合曲線と阻害曲線を示す 。
図5Aと図5Bはそれぞれ、HA30?−319が存在しない場合と存在する場 合の、ビオチニル化RMBP90−102とビオチニル化H3P3−14の解離 曲線を示す。
図6は、ビオチニ化HSP3−14のRMBP9G−102による置換曲線を示 す。
図7は、捕捉されたペプチドの検定法として、感作T細胞の増殖を用いたH^3 07−319ペプチドの結合曲線を示す。
l匪旦裏施1掻 数種の有効な検定方法を用いて、検出可能なアゴニストと問題の候補体部分との 間の競合を利用し、特定のMHC糖タンパク質に対する該候補体の結合を測定す る方法および組成物を提供する。
解離速度検定法を除く、本発明のすべての方法では、検出可能なアゴニストと候 補体間に競合が行われる。その場合、少なくとも1つの濃度および好ましくは種 々の濃度の候補体部分の、検出可能なアゴニストの結合に対する作用が測定され る。
解離速度検定法では、前負荷されたMHC/標識アゴニスト複合体の解離速度に 対する、少な(とも1つの濃度および好ましくは種々の濃度の候補体部分の作用 が測定される。
検出可能な”アゴニスト”とは、試験される特定のMHC糖タンパク質に結合で きることがわかっているペプチドなどの低分子量化合物を意味する。DR対立遺 伝子に対して有用なアゴニストとしては、例えば30?−319の位置で表され るような赤血球凝集素由来のペプチド(HA307−319) (Int mm uno 、2J!、443頁、1990年)がある。DR対立遺伝子のMBC糖 タンパク質産物を捕捉することが分かった他の有用なアゴニストには、限定はな いが、HADP 3.2. RRFAAAYAARAAA、 HADP 3.6 . RRFAAQYAARAAA: RMBP 90−102. HFFKNI VTPRTPA; asp 3−14 (R5[13)、RVRRGLTVAV KG; BSP 3−14 (Is K13)、RVKRGLTVAV)[G、  HSP 3−14 (K5 A13)、 RVIRGLTVAVAGおよびこ れらを短くした変形体が含まれる。有効なアゴニストとしては、上記ペプチドお よびそのアミノとカルボキシルの電荷が放出された等傷物が含まれる。いくつか のアゴニストは、百日咳毒素31−43. ブタフサ350−62、およびイン フルエンザ・マトリックス1B−30のように対立遺伝子特異的である。
アゴニストには一般に、MBCと複合したとき容易に検出できるような方式で標 識が付けられる。しかし、複合したペプチドを測定するT細胞増殖検定法につい て記載したように、検出がアゴニストの性質にのみ依存した方法で行われる場合 は、外来性の標識付けを行う必要はない。したがって、アゴニストは複合体中に あるときは、検出可能であることのみが必要である。
しかし、アゴニストが標識によって検出される場合は、標識は種々の形態をとり 得る。したがって、放射性同位元素、ビオチン、蛍光剤、化学蛍光剤などのよう な種々の標識が用いられ得る。標識の選択は、主として、簡便さ、感度、バック グラウンドの最小化、 MHC糖タンパク質に対するアゴニストの結合への干渉 の最少化などに基づいて行われる。一般にアゴニストの濃度は、MBC糖タンパ ク質の濃度の約0.1〜50倍である。
特に好ましい標識はビオチンである。ビオチンを”標識”として用いる場合、多 種の標識で順に標識付けがなされるストレプトアビジンが検出に用いられ得る。
したがって、ストレプトアビジンは、放射性同位元素、蛍光剤、化学蛍光剤、酵 素、コロイド粒子などで標識が付けられ得る。どの標識を採用するかは、上記の ように種々の検討を行って決定される。
問題の候補体部分の濃度は、媒体中に存在するアゴニストの濃度、および候補体 とアゴニストの相対親和性によって変化する。通常、候補体の量は、媒体中に存 在するアゴニストの量とは、約100倍以上まで異なることはない。
本発明の方法によれば、種々の成分(例えば、MHC糖タンパク質、アゴニスト および試験化合物)を混合し、混合物が平衡状態に達するまで十分な時間静置し てお(。一般に温度は約37℃である。通常、平衡に達する時間は少なくとも約 0.5時間で、より一般には約12時間であり、一般に約48時間を超えない。
速度測定を利用することができて、複数の試料が用いられ、かつ各試料が複合体 の生成量について分析される場合、通常は候補体の濃度を変えて一回測定するだ けでよい。
適切な候補体部分としては、問題のMHC糖タンパク質をブロックすると考えら れる低分子量の物質が含まれる。一般に、これらの候補体は、アミノ酸が5以上 のオーダーのペプチドまたはこのようなペプチドのフンホメーシ璽ンを模倣する 低分子量の生体分子である。広範囲にわたる候補体が、現在活動している合理的 な医薬設計の分野で広く知られている。候補体の範囲に理論的制限はないので、 活性であると推定されるいずれの化合物も採用され得る。
1つの方法では、溶解状態の可溶性MHC糖タンパク質が複合体生成反応に使用 される。MIIC糖タンパク質と複合した標識アゴニストが遊離アゴニストから 分離され、次いで、複合したアゴニストの量が、候補体のMBC糖タンパク質に 対する親和性の尺度として測定される。この方法は、多数の候補体をスクリーニ ングし、MHC可溶化糖タンパク質に対する候補体の親和性に関連する値を得る 迅速、簡単かつ正確な技術を提供する。
この値は、前記MIIC糖タンパク質が細胞膜中のそれらの天然の位置にある場 合にみられる親和性に関連があると考えられる値である。
この方法を実施する際には、MHC糖タンパク質が細胞膜を含有しない天然産の 二量体の糖タンパク質であるが、または貫膜領域を欠(可溶性筒タンパク質であ る場合、MBC糖タンパク質の溶液が調製される。可溶性筒タンパク質は種々の 方法で調製され得る。クラス1■のMBC糖タンパク質のα鎖とβ鎖またはクラ ス■のMHC糖タンパク質のα鎖をコードする遺伝°子が貫膜領域の全部または 一部を除去することによって端を切り得る場合は、組換え法を用いる。好都合な ことには、貫膜配列は、脂質に連結できる領域と置換され得る(例えばCara sら、tオl東、LLL!L、1280頁、1987年;Tykocinski ら、乙」l」lu−に旦」虹」鎖、LJ、 3555頁、1988年参照)。そ の脂質は次に、適切なエステラーゼ、例えばホスファチジルイノシトール特異的 ホスホリパーゼCで除去され得る。MBC糖タンパク質の濃度は、一般に約0. 01〜50μMの範囲内にあり、より一般に約0.1〜1μMである。この範囲 は利用しゃすく、かつ臨界的なものではない。というのは、いくつかの試験では 、結合される混合物の親和性、使用される部分の濃度などによって、上記範囲よ り高いかまたは低い濃度を用いる方が望ましい場合があるからである。
媒体は、一般に約10〜200mMの緩衝剤の濃度によって、はぼ生理的pHの 4.5〜8、好ましくは約5〜6.5に緩衝される。他の添加物は、塩を約10 〜20dの濃度で、または非イオン界面活性剤を含有し得る。非イオン界面活性 剤は、一般に、約0.1〜2%の濃度で含有される。ペプチドアゴニストを用い る場合そのペプチドは、一般に少なくとも約3つの、多(とも約30までのアミ ノ酸からなるものであり、好ましくは約3〜16のアミノ酸、さらに好ましくは 約5〜15のアミノ酸からなる。
十分なMBCアゴニスト複合体が形成されたならば、その複合体は種々の方法で 分離され得る。その複合体は、ゲル濾過法、非還元性SDSポリアクリルアミド 中でのゲル電気泳動法、またはMIIC糖タンパク質に対して特異的な抗体もし くは他の親和性試薬(リガンド)でコートしたプレートに複合体を結合させるこ とによって、遊離アゴニストから分離され得る。ゲル分画法(gel frac tionation)には、セファデックスG−50が有用であることが知られ る。ゲル電気泳動法には、非還元性条件下の12.5%5DS−PAGEゲルが 十分であることが知られる。
しかし好ましくはアフィニティ分離法、特に抗体分離法が、好ましくはプレート 上で、特に多くのウェルを具備するプレート上で用いられる。例えば、MMC糖 タンパク質のサブユニットの1つの定常部に対して特異的な過剰な抗体もしくは そのフラグメントを採用することによって、アゴニストとMHC糖タンパク質と の間の複合体を捕捉し得る。次に、非特異的に結合しているかもしくは結合して いない標識アゴニストを洗浄して除き、続いて、表面に結合して存在しているア ゴニストを検出することによって、表面に結合したアゴニストの量を定量し得る 。洗浄は、複合体を生成させるのに用いた媒体を含有する便利な緩衝媒体で実施 され得る。アゴニストをビオチンで標識をつける場合、標識アビジンを用いるこ とによって、単一のアゴニスト−MIIC糖タンパク質複合帯に結合された複数 の標識が得られ得る。アビジンについて特に重要なのは蛍光標識の使用であり、 とりわけランタニド(希土類元素)キレート化合物、さらにとりわけユーロピウ ムキレート化合物、または酵素、特に西洋ワサビのパーオキシダーゼの使用であ る。これらの標識は通常の手法に従って定量され得、ランタニドキレート化合物 からの蛍光を検出する多数の蛍光分析器、および発色団をもたらすパーオキシダ ーゼの基質を検出する分光光度計が用いられ得る。
第2の方法は、候補体が、粗溶解物中に存在するMBC糖タンパク質と複合体を 形成する性能を測定するのに特に有用であるが、この方法では、問題のMITC 糖タンパク質はまず固体支持体に捕捉され、溶解物の残りの成分は支持体に吸着 されたMHC糖タンパク質を除いて洗浄される。次に、カップリングされた支持 体は、MHC糖タンパク質および競合する候補的部分と複合したときに検出でき るアゴニストを含有する反応混合物で処理される。アゴニストの標識の種類と、 必要であれば反応混合物中の競合物質の濃度の種類は、可溶化MHC糖タンパク 質の使用に関する記載のものと類似している。
誘導体化された固体支持体は、当該技術分野で公知の標準技術によって、問題の MHC糖タンパク質に対して特異的な親和性試薬の受動的吸着または共有結合カ ップリングにより調製される。一般に、微量滴定プレートまたは他の多数のウェ ルを具備する反応マトリックスが固体支持体として使用される。
この方法は、候補体および/またはアゴニストのMHC糖タンパク質との結合を 妨害することがある夾雑物を粗溶屑物から除去するという利点がある。このよう な夾雑物の活性は最小にしなければならない。というのは、溶解物中に存在する プロテアーゼなどが活性を示す場合、アゴニストのMHC糖タンパク質との結合 は高温下でのみ起こるからである。
したがってこの方法では、適切な量のアゴニストおよび候補体を含有する反応混 合物は、固体支持体に結合されたMI’IC複合体の存在下で適切な期間、通常 約3〜48時間インキュベートされる。インキュベート期間が終わってから、固 体支持体を反応混合物から取り出し、洗浄し、そしてMHC糖タンパク質に結合 したアゴニストは上記の標識の性能によって測定される。
第3の方法では、第1の競合プロトコルが用いられ得るが、MHC糖タンパク質 を、均一な通常ペプチドアゴニストで前負荷することによってさらに最適化され 得る。この方法は、アゴニスト/競合体の組み合わせの結合を行うことができる 適切なオフ速度を有する。この方法では、精製MHc糖タンパク質もしくは粗溶 屑物が、前負荷するアゴニストとともにインキユベートされる。一般にオクチル グルコシドを含有する適切な緩衝液中で、未変性MHC糖タンパク質中に含有さ れる不均一な内因性ペプチドを、前負荷する均一な部分で置換するのに充分な時 間、一般には一晩インキュベートされる。前負荷されたMHC複合体は次に希釈 されて、上記の検定系に用いられる。
この方法は、アゴニストもしくは候補体と結合もしくは力2ブリングを行う”中 空”1tHc糖タンパク質結合ドメインを均一に提供する。一般に候補体または アゴニストの結合反応の律速段階を他の方法ででも促進すると、検定時間が短く なり、候補体の結合速度と親和性をより正確に測定し得る。入ってくるアゴニス トもしくは候補体は前負荷された部分を追出すことが不必要な場合は、前負荷条 件を与えることによって、負荷されていないM[IC糖タンパク質に対する競合 体の親和性はより容易に比較され得る。MBC分子は、既知の解離速度を有する ペプチドで前負荷されるので、検定は、より短い時間で好ましくは3時間で実施 され得る。
第4の方法では、MBC糖タンパク質は、他のペプチドの存在下で置換されるこ とが実証されている、均一な標識ペプチドアゴニストで前負荷される。この方法 では、精製されたMIIC糖タンパク質は標識アゴニストとともにインキュベー トされる。
一般にオクチルグルコシドを含有する適切な緩衝液中で、不均一な内因性ペプチ ドを、前負荷する部分で置換するのに充分な時間、一般には一晩インキユベート される。前負荷されたMl’IC複合体は次に、置換する候補的部分の溶液で約 0.5時間希釈し、次に、候補的部分がある場合およびない場合のカウントの喪 失を上記のようにして監視する。
本発明の別の態様では、競合検定法に用いられるアゴニストに標識を付ける必要 がない。この方法では、複合体は、感作されたT細胞とともにT細胞増殖検定法 で用いられる。感5°露出 15゛露出 全収率 作されたT細胞の増殖促進は、複合体に対するアゴニストの結合の尺度である。
またこの方法は、T細胞を試験部分で感作することによって、複合体内のいずれ の試験部分ともの検出に用いられ得る。
以下の実施例は例示を目的として提供するものであって本発明を限定するもので はない。
爽息五工 HLA−DRおよびD ンパク の 抗DR(LB3.1)および抗DQ(IVD12)ノア 7 イニf 4−カラ ムを、球形セルロース樹脂(Amicon)および上記の各抗体40mgづつで 調製した。カラムに結合する可溶化クラスHの最大量は、結合された抗体のモル 濃度の2倍である。よって、40ragの免疫グロブリンは、多くてもクラス1 ■のMHC糖タンパク質の32mg Lか捕捉できない。実際には、アフィニテ ィーカラムの理論的容量の10〜30%しか結合できず、これはDRとDQの3 〜9mgに相当する。L243とLB3.1のカラムの比較を、1.8X 10 ″9の細胞のNP−40界面活性剤による抽出物を等しく分割して各カラムに負 荷し、pH11,5の緩衝液に5分間または15分間さらして溶離することによ って実施した。収量は次のとおりである。
(以下余白) 夾l匠又 (mg) ” (mg) (mg) (mg)L243 1.8 0.8116  2.69LB3.1 2.10 2.02 4.12 6.81ゲル °によ る ペプチド〜MHC ム の ペプチドか゛の ヨウ素化されたllA307−319アナログ(2μM)を、HLA−DR4D w4 (た後、プレートを洗浄して計数した。
b)アミノ末端がビオチニル化された、インフルエンザ赤血球凝集素の残基30 7〜319に相当するアゴニスト(HA307−319)を、アフィニティ精製 したDR4Dw4(2u M)とともGCPBS/1%オクチルグルコシド中で インキュベートした。ペプチドDR複合体を、25μlのPBS/1%オクチル グルコシド(5%FCS)と10μmのインキュページ言ン混合物を、抗体でコ ートしたエリザ(ELISA)プレートのウェルに添加したことを除いて、ヨウ 素化HAと同様に、遊離ペプチドから分離した。1時間インキュベートした後、 プレートをPBSlo、05%Tween 10.1%BSAで洗浄し、結合し たFIA307−319<7)量を、125■ストレプトアヒジ7 (6−30 mg/ウェル)とともに4℃で1時間インキュベートシ、次に、洗浄し、計数す ることによって定量した。
C)ビオチニル化HA307−319のDR4Dv4との結合に対する競合を、 PBS71%オクチルグルコシド中、いくつかのHAモノ置換ペプチド(例えば 309位のlys、 setあるいはphe) (200u M)がある場合ま たはない場合について、上記b)と同様に行った。
抗体LB3.1の場合、DR抗原存在下で観察された計数値はバックランドと比 べて約2倍であったが、一方非放射性競合体の存在下では、計数値はバックグラ ンドより幾分低かった。抗体1VD12の場合、DRの存在下で観察された計数 値はバックグランドより低かった。阻害曲線の代表的な結果を図1に示す。
実験b)については、放射性ペプチドとDR抗原の組合わせを除いて、実質的に シグナルは観察されなかった。
競合実験C)では、点置換(すなわち309位でのりシンあるいはセリン)を含 有するアナログに相当するペプチド競合体の場合、計数値はバックグランドとほ ぼ同じであった、一方非放射性ペプチド30?−319または309位にフェニ ルアラニンが存在する場合、実質的に放射能は観察されなかった。
爽胤五ま ビオチニル 、 アナログのDR40w4との Aに・ る および Z五二人立迄豊 検定は、tlAのビオチニル化アラニンバックボーンのアナログ(AAFKAA EAAAARA) 2μMおよびDR4Dv40.5uMを用い、実施例3bに 記載したのと同様に行った。ペプチドDR?j[合体を、蛍光性ユーロピウム結 合ストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキダーゼ結合ストレプトアビジンある いは125■結合ストレプトアビジンを用いて定量した。各々の染色試薬を滴下 して、バックグランド最高値を越える最大シグナルを得た。
蛍光性ユーロピウムキレートで標識付けたストレプトアビジンの場合 +2Jス トレプトアビジンで見られたのと同じ大きさのシグナル/ノイズ比<80−10 0:1)を観察した。西洋ワサビ・ベルオキダーゼストレプトアビジン結合体で 優れたシグナル/ノイズ比(10−20:1)をまた観察した。
支胤五i ′ の、・ Aの DRツクラス1分子2μg/ml、 200μl/ウエルに対して特異的なモノ クローナル抗体LB3.1を、コスタ−(Costar)EIA−RIAプレー トに、50mM トリス−HCl pa 9.0中、4℃で一晩あるいは37℃ で1時間コートした。プレートを洗浄し、5% FCS/PBSを用いて室温で 1時間ブロックし、次にタイターテックプレートウォッ ゛シ+ −(Tite rtek plate washer)を用いて、O,OS%Tveen 20 10.01%アジド/PBS (洗浄緩衝液)で3〜4回洗浄した。次に、約2 0nMのDRMHC糖タンパク質を含有すると考えられる細胞溶解物を、上記の コートされたプレート上にて4℃で4時間インキュベートした。そのプレートを 、0.05%Tveen 2010.01%アジド/PBSで3〜4回洗浄した 。次に、ビオチニル化HAペプチド307−319を、5%FCS/1駕オクチ ルグルコシド(OG)/PBS中、200μl/ウエルで、プレートに添加し、 CO2インキユベータで37℃で一晩インキュベートした。
プレートを洗浄緩衝液で3〜4回洗浄し、200μlのユーロピウムでキレート 化したストレプトアビジン(Phar璽acia/LKB Nuclear)6 0ng/mlとともに4℃で4時間インキュベートした。−回追加の洗浄サイク ル後、プレートを、200μl/ウエルの1234デルフイアリサーチ(Del fla research)蛍光光度計(Phar■acia/LKB)での検 出のために、結合ユーロピウムが放出する促進溶液(Pharvacia/IJ B)で、30分間室温で処理した。
代表的な結果を図2に示す。精製DR4MHC糖タンパク質IonM(白丸印) あるいはDR4Dv4でトランスフェクトされたCo57細胞由来の溶解物(白 画角印)を用いて、MHC糖タンパク質を得たときと同様に、Pr1ess細胞 溶解物(黒丸印)を使用したときも、ビオチニル化BA307−319ペプチド の濃度に比例する結合曲線が得られている。対照として使用したMock トラ ンスフエフ) Cos細胞(黒画角印)は標識付きペプチドの取込みを全く示さ なかった。
爽息五亙 のプレート ゛のプロトコル この検定法は、抗体をカップリングしたプレートを調製したことを除いて実施例 5に述べたのと類似の方式で以下のように実施した。
酸化された抗体をその表面に共有結合するAvid−H2”″プレート(Bio probe International)を用いた。まず第1にLB3.1モ ノクローナル抗体を、 5(lsM酢酸緩衝液pH5で、10μg/i+1まで 希釈し、次に1710容量の新しく調製した10■Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム を添加することによって酸化した。室温で30分後、酢酸緩衝液中、205Mエ チレングリコールの1/10容量を添加することによつて反応を停止させた。1 15μlの酸化抗体溶液を、Avid−Hz”″プレートのウェルに添加し、4 ℃で一晩インキユベートした。次にそのプレートを洗浄液(PBSlo、 O5 %Tween 2010.01%アジ化ナトリウム)で4回洗浄し、次にPBS 15%FCS10.01%アジ化ナトリウムを用いて4℃で1時間ブロックした 。
PBSlo、 75%オクチルグルコシド70.01%アジ化ナトリウム(結合 緩衝液)中の、ZOns DR4Dw412Sμlを各ウェルに添加し、4℃で 4時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、結合緩衝液を 含有するビオチニル化H^30?−319ペプチドの125μlで処理し次いで 37℃で一晩インキコベートした。そのプレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、次 いでユーロピウムでキレート化されたストレプトアビジン60ng/ml (P harmacia/LKB)の125μlとともに4℃にて一晩インキユベート した。
1回追加洗浄サイクル後、プレートを125μl/ウエルの促進溶液(Pbar macia/IJB)で室温にて1時間処理し、1234デルフイアリサーチ( Delfla research)蛍光光度計で読取った。
実施例5と類似の結果を得た。
爽亀且L 1 されたMHCンバク の 適切な前負荷するペプチドを決定するためにオフ速度をいくつかの候補の前負荷 するペプチド;すなわちHFFKNIVTPRTPAの配列を有するラットのミ ニリン塩基性タンパク質90−102 (RMBP90−102) ;RRFA AAYAARAAAの配列を有するHA由来タンパク質3.2(HADP3.2 );およびRRFAAQYAARAAAの配列を有するHA由来タンパク質3. 6(HADP3.6)について測定した。標識付けた前負荷するペプチド50n Mを、PBS pH7,0結合緩衝液中、400nMのDR4Dv4ともともに 48時間インキュベートした。複合体を、PBSで1=40に希釈し、および未 標識のHA309−319の種々の濃度を、種々の倍率に希釈し、次に上述のよ うにLB3.1をカップリングさせた抗体プレートに、複合体を捕捉させること によって測定した。図3A〜3Cに示すように、どの試験ペプチドも、オフ速度 がHA30?−319の存在によって影響を受ることを示さず、RMBは、未標 mRMBPの種々の濃度を用いて得た阻害百分率を示す。
P2O−102の解離速度は上記3つの中で最も速かった。従って、この検定に 用いるために、RMBP90−102による前負荷を選択した。
この検定では、2FMの精製DR4Dv4とIμMのRMBP90−102を、 上述のようにPBS70.75%オクチルグルコシド70.01%アジ化ナトリ ウムの結合緩衝液中で一晩インキユベートした。
抗体捕捉プレートは、115μlの2μs/ml LB3.1を用いて4℃にて 一晩で調製し、洗浄し、上述のようにブロックした。
前負荷された複合体(すなわちDR4Dv4/RMBP90−102)を1:1 00に希釈し、種々の濃度のビオチニル化RMBP9G−102あるいは8.8 μMのビオチニル化RMBP90−102とともに、種々の量の未標識の同じペ プチドの存在下でインキュベートした。対照として用いる、希釈された前負荷さ れていないDRMHC糖タンパク質もまた同様に処理した。
反応混合物の一部(50μl)を捕捉プレートに移し、4℃で4〜24時間イン キュベートした。そのプレートを上述したように洗浄し、次に、検定緩衝液(カ ルシウムとマグネシウムを含有しないPBS+0.5%BSA、 0.1%アジ 化ナトリウム中20μMのジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA) )  中、60ng/謹lユーロピウム−ストレプトアビジンの125μlで処理し、 4℃で2〜24時間インキュベートした。追加の洗浄を行った後、プレートを上 述のように増強して読み取った。
代表的な結果を図4Aと4Bに示す。図4Aは、対照としてのビオチニル化RM BPと、前負荷されたDRの結合曲線を示す。図4B響されない。しかし、図5 Bに見られるように、HSPの解離は他上述のように、結果は、前負荷されたD RMHC糖タンパク質と前負荷されていないDRMHC糖タンパク質について類 似している。試薬を滴下した後、O,LMにH2PO4でptlを6.5に調節 されたカルシウムとマグネシウムを含有していないPBS中、37℃で一晩イン キユベートすることによって、2μM DR4Dv4に250nM RMBP9 0−102を前負荷して、スクリーンがなされることを測定した。前形成された 複合体は、1/4oに希釈し、標識付けたアゴニストと試験化合物を3時間反応 させた。このようにして複合体を上述のように捕捉した。
裏亀且エ リガント 六 の の リガンド/受容体の解離速度が、存在する複合体の濃度にのみ依存している場合 は、−次反応である。クラスII/ペプチドの解離速度を研究すると、その反応 はいくつかの場合では一次反応であるが、すべてが−次反応ではない。
解離速度を測定するために、40G−500nM +7)DR4Ev4を、5゜ nMビオチニル化11MBPあるいは25μ閾のビオチニル化H3P(マイコバ クテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tubercu losis)由来の19にDの熱シヨツクタンパク質3−14)とともに、先に 述べたように、37℃で一晩インキユベートした。これらの前形成された複合体 は、次に、HA30?−319の濃度を変えるが、あるいは変えることなく緩衝 液で100倍に希釈した。図5Aに見られるように、RMBPの解離速度は第2 のペプチドによって影のペプチドの存在によって加速し、その解離速度は、他の ペプチドの濃度にともなって増加するのでこの解離は明らかに一次反応ではない 。
これは置換モデルを示唆し、この場合第2ペプチドは第1ペプチドを押し出す。
従って、第2の前負荷されるスクリーニング検定では、800nMのDR4Dv 4と6μMのビオチニル化HSP3−14を上述のようにインキュベートした。
複合体を、競合体の候補的部分を含有するか、あるいは含有していない緩衝液で 40倍に希釈して、置換を30分間、計数値の減少によって測定した。図6はペ プチド競合体(RMBP)による置換を示しているが、どんな小さな分子も潜在 的に同じ作用を持っている。
爽立五1 されたT による HA30?−319に対して特異的に反応性のT細胞クローンを、HLAクラス i+に表現型のDR4Dv4、DR?、DRv53、DQv8、DQv9を有す る固体から調製した〈実施例1に記載されているように行った)。簡単に述べる と、末梢血液の単核細胞を、ストレプトマイシン(100μg/■l)、ペニシ リン(100U/■l)および5%のプールしたAB血清(Wbittaker  Fredicksburg、MD)を補足したRPMIで、1/100に希釈 したインフルエンザワクチン(Parks Davis)を用い、インビトロで 感作させた。5%CO2中5日間37℃でインキュベートした後、T細胞の細胞 芽を、−1あたり106の同種異系PBMC(30Gy照射)、B細胞に形質転 換されたオートロガスEBVの105細胞(5OGy照射)、インフルエンザウ ィルスワクチンの1/1001釈、および1μg/m Iのロイコアグルチニン ーA(Phsr■aeia社)を含有する、フィーダー混合物の存在下、3ウエ ルあたり1細胞に希釈を制限することによってクローンした。
懸濁液を、96ウエルの平底微量滴定プレートにプレートし、上述したようにイ ンキ5ベートした。増殖培養物を24−ウェルの組織培養プレートに移し、同じ フィーダー混合物で再刺激した。3日後、10%!L−2を添加し、細胞を凍結 するかまたはさらに再刺激によって膨張させた。特異性をHA307−319で 測定した。
DR4Dv4糖タンパク質を、実施例1に記載されているようにして、Pr1e ss EBV−B細胞からアフィニティー精製した。簡単に述べると、該細胞は ウシ胎児血清で補足したRPMI培地で増殖させて遠心分離で集め、PBSで洗 浄し、1%Non1det P−40で溶解した。細胞断片を遠心分離で取り除 き、生成した溶解物を、製造者の指示にしたがって、40Bの抗体を10菖lの マトリックスセルファインホルミル Avicon>にカップリングすることによって調製したモノクローナル抗体L B3. 1セルロースカラムに直列接続したセファロースCL−4B カラムへ 直接負荷した。これらのカラムを、10mM )リスHCI pH7.5、15 0mM NaCI, 0.1%デオキシフール酸の20倍容量で洗浄した。次に LB3.1セルロースカラムをカラムの5倍容量の10mM トリスHCI p H7.5、1%OGで洗浄し、50mMグリシンpH11、5、1%OGで溶離 した。得られた画分はそれぞれpH 2の2Mグリシンでpny.sに調節した 。全画分を、lQmM )リス1c1。
pH7.51%OGに対して透析を行い、4℃で貯蔵した。
MBC糖タンパク質/ペプチド複合体を調製するために、精製DR49w4を、 1%OG/PBS中H^307ー319を種々の濃度で、37℃で一晩インキュ ベートした。50μlの該混合物を、5μmg/11のLB3、1含有の50− MトリスHCI, pH 9中で4℃にて一晩インキユベーシツンして、LH3 .1でコートされた96ウエルの平底エリザプレートに添加した。得られた混合 物を、コートされたプレートを用いて4℃で6時間インキュベートし、次にPB Sで2回および完全培地で1回洗浄した。
T細胞増殖検定のために、完全培地200μm中に3X10’のT細胞を各ウェ ルに添加した(T細胞は再刺激10〜11日後に使用した)。244時間インキ ュページンした後、トリチウム化したチミジンをウェルあたり1.0μCiづつ 添加し、次にそのプレートをさらに18時間インキュベートした。試料を半自動 式ハーベスタ−を用いて、ガラス繊維のフィルター上に収集し、チミジンの取り 込み量を、シンチレーシロンカウンターで計数することによって測定した。3重 反復測定の結果を図7に示した。
図7に示すように、T細胞の増殖は、試験H^307ー319ペプチド結合曲線 を決定するのに用い得る。
特定のMHC糖タンパク質に対する結合親和性について候補的部分をスクリーニ ングするための、迅速かつ効率的検定を提供することは上記の結果から明かであ る、したがって該方法は候補体の広範囲の種類と、MRC糖タン、<り質と相互 唇こ作用するそれらの能力とを評価でき、および結局はこのようなMl(C糖タ ンパク質を有する宿主中の免疫応答を調節すること力fできる。
本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、あたかもこれらの 個々の各刊行物ある(旭(マ特許出願力5、特定的におよび個々に参照によって 取り込まれ、示されて(するのと同程度に、参照によって本明細書書こ援用され る。
本発明は十分に記載されているので、多くの変更および改変を、請求の範囲の精 神あるいは適用範囲力)ら逸脱することなく行い得ることは、当業者にとって自 明である。
、001 、01 、1 1 10 [アンタゴ′ニスト1μM Fig. 1 + PRIESS溶解物 、001 .01 .1 1 10 ビオチニルイt−、!小ちHA307−319μMFig、 2 BRMBP 90−102の才2速1度 8/12/9111)闇(Hours ) Fig、 3A BHADP3.2のオフ適確 8ハ2/91−間(Hours)” BHADP 3.6 のオフj口賢 8/12/91峠間(Hours) Fig、 3C ビオ呼ニル化jちRMfSPテ0−1o2の直接賜4゛にブヂじ」1賓 (nM ) Fig、 4A 1?J?、M B−RH81’ ?0−1o2cl+RMBFとnnAfl省へ °デ科゛(1實 (nM) Fig、 4B ”I’ ? k L7=l ’MJ’iB O急(ε−01×) 111) Fig、 7 国際調査報告 Wτ六Rりに真In フロントページの続き (72)発明者 ロスバード、ジョナサン ビー。
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94027アサートン、ワトキンズ アベニ ュー (72)発明者 ウィッカー、リンダ ニス。
アメリカ合衆国 ニューシャーシー 〇7076 スコッチ プレーンズ、プルツクサイド コート 2 (72)発明者 キューポン、ローズ エム。
アメリカ合衆国 ニューシャーシー 07023 ファンウッド、テイロットソンロード 5 (72)発明者 ニコルス、エリザベス エイ。
アメリカ合衆国 ニューシャーシー 07093 ウェストフィールド、グランドアベニュー 808 (72)発明者 ブツシュ、ロバート ドイツ連邦共和国 6900 ハイデルベルク1、イン モイエンハイマー フ ェルト280、ポストファッハ 101 949. トイチェス クレブスフォ ルシュングスツエントルム、インスティテユート フユア イムノロギー ラン ト ゲネティック (72)発明者 パン シューテン、ライムアメリカ合衆国 カリフォルニア  94304パロ アルド、ウィリアムス ストリート 2103 (72)発明者 ヒル、シー、 マークアメリカ合衆国 カリフォルニア Q4 306パロ アルド、ルーズベルト サークル

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.MHC糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法であって、 反応混合物中に、細胞を含有しない分散されたMHC糖タンパク質、該MHC糖 タンパク質に結合して複合体を形成し得かつ該複合体中にあるとき検出し得るア ゴニスト、および該試験化合物を、 該試験化合物と該アゴニストが競合して該MHC糖タンパク質と結合する条件下 で混合する工程; MHC糖タンパク質に捕捉されたアゴニストを未結合のアゴニストから分離する 工程;および 該複合体中に結合しているアゴニストの量を、反応混合物中の試験化合物の濃度 の関数として検出する工程を包含する、方法。
  2. 2.前記MHC糖タンパク質が、完全な貫膜配列を欠く、請求項1に記載の方法 。
  3. 3.前記分離工程が、ゲル濾過法による、請求項1に記載の方法。
  4. 4.前記反応混合物が、約4.5から8の範囲のpHで、そして約0.1から2 %の非イオン界面活性剤を含有する、請求項1に記載の方法。
  5. 5.前記アゴニストが、ピオチンにカップリングされ、そして前記検出工程が、 前記MHC複合体が標識を含有するストレプトアビジンと反応する工程により行 われる、請求項1に記載の方法。
  6. 6.前記標識が、蛍光、放射活性または酵素標識である、請求項5に記載の方法 。
  7. 7.前記分離工程が、前記複合体を固体支持体にカップリングすることにより行 われ、前記固体支持体が、前記MHC複合体に対する親和性リガンドにカップリ ングされている、請求項1に記載の方法。
  8. 8.前記親和性リガンドが、MHC糖タンパク質に対して特異的な抗体または免 疫学的に反応性のそのフラグメントである、請求項7に記載の方法。
  9. 9.前記アゴニストがピオチンにカップリングし、および前記検出工程が、前記 MHC複合体が標識を含有するストレプトアビジンと反応することによって行わ れる、請求項7に記載の方法。
  10. 10.特定のMHC糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法で あって、 MHC糖タンパク質がカップリングされている固体支持体を、MHC糖タンパク 質に結合して複合体を形成し得かつその複合体中にあるときに検出され得るアゴ ニスト、および該試験化合物を含有する、反応混合物によって、 該試験化合物およびアゴニストが競合してMHC糖タンパク質に結合する条件下 で処理する工程; 該反応混合物を該固体支持体から除去する工程;および該固体支持体に結合した アゴニストの量を、該反応混合物中の該試験化合物の濃度の関数として検出する 工程を包含する、方法。
  11. 11.前記固体支持体が、MHC糖タンパク質に対する親和性リガンドを含有す るよう改変された、請求項10に記載の方法。
  12. 12.前記親和性リガンドが、MHC糖タンパク質に対して特異的な抗体あるい は免疫学的に反応性のそのフラグメントである、請求項11に記載の方法。
  13. 13.前記アゴニストがピオチンにカップリングされ、および前記検出工程が、 前記MHC複合体が標識を有するストレプトアビジンと反応することによって行 われる、請求項10に記載の方法。
  14. 14.前記標識が、蛍光、放射活性または酵素標識である、請求項13に記載の 方法。
  15. 15.MHC糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法であって 、第1アゴニストを前負荷されたMHC糖タンパク質を、 該試験化合物、および該MHC糖タンパク質と結合して複合体を形成し得かつ該 複合体中にあるときに検出し得る第2アゴニストを含有する反応混合物により、 該試験化合物および第2アゴニストが競合して該MHC糖タンパク質と結合する 条件下で処理する工程;該MHC糖タンパク質が、第1前負荷するアゴニストで 前負荷される工程;および 該複合体中に結合された第2アゴニストの量を、反応混合物中の試験化合物の濃 度の関数として検出する工程を包含する、方法。
  16. 16.前記第2アゴニストがビオチンにカップリングされ、および前記検出工程 が、前記MHC複合体が標識を有するストレプトアビジンと反応することによっ て行われる、請求項15に記載の方法。
  17. 17.前記標識が、蛍光、放射活性または酵素標識である、請求項16に記載の 方法。
  18. 18.前記前負荷されたMHC糖タンパク質が、前記反応混合物を、前記前負荷 された糖タンパク質に添加する前に希釈される、請求項15に記載の方法。
  19. 19.MHC糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法であって 、該MHC糖タンパク質を、該試験化合物を添加しながら置換可能な標識された アゴニストで前負荷する工程、および 該試験化合物で置換された標識されたアゴニストの量を検出工程を包含する、方 法。
  20. 20.MHC糖タンパク質複合体中に含有されている部分の存在もしくは濃度を 、該部分で測定する方法であって、該複合体を、該部分で感作されたT細胞と接 触する工程、および該T細脂の増殖の程度を測定する工程を包含する、方法。
  21. 21.前記検出工程が、前記複合体を、前記アゴニストで感作されたT細胞と接 触させ、そして前記T細胞の増殖の程度を測定することによって行われる、請求 項1に記載の方法。
  22. 22.前記検出工程が、前記複合体を、前記アゴニストで感作されたT細脂と接 触させ、そして前記T細脂の増殖の程度を測定することによって行われる、請求 項10に記載の方法。
  23. 23.前記検出工程が、前記複合体を、前記第2アゴニストで感作されたT細脂 と接触させ、そして前記T細胞の増殖の程度を測定することによって行われる、 請求項15に記載の方法。
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