JPH06506056A

JPH06506056A - Ｍｈｃ抗原によるペプチド結合検定法

Info

Publication number: JPH06506056A
Application number: JP4505164A
Authority: JP
Inventors: ロスバード，ジョナサン　ビー．; ウィッカー，リンダ　エス．; キューボン，ローズ　エム．; ニコルス，エリザベス　エイ．; ブッシュ，ロバート; バン　シューテン，ウィム; ヒル，シー．　マーク
Original assignee: イミュロジック　ファーマシューティカル　コーポレイション; マーク　アンド　カンパニー，インコーポレイテッド
Priority date: 1990-10-30
Filing date: 1991-10-30
Publication date: 1994-07-07
Also published as: EP0555418A4; CA2095323A1; WO1992007952A1; EP0555418A1; AU1272292A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｍ）ＩＣ抗原によるペプチド結合検定法１血立！本発明は、特定の主要組織適合性遺伝子複合体の糖タンパク質に結合する候補体部分の性能を測定する方法に関する。

有効な候補体は、特定のＭＨＣ糖タンパク質で媒介される症状の治療剤として有用である。

１咀旦宣ｌ免疫系は哺乳類の種の安寧のために必須の器官であるので、免疫系がどのように作動しているのかを理解しようと試みる熱心な研究が行われている。ごく最近になって、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＢＣ）の糖タンパク質が、８９２８球と１９７８球の応答に必須の役割を演じていることが決定された。

）ＡＢＣ糖タンパク質は、２つのタイプすなわちクラス■とクラス１１に分類されるが、それぞれのクラスにおいて、かなり異なる役割を演じていると思われる。加えて、クラスＩとクラスＨの糖タンパク質の構造は異なっている。構造が異なっているにもかかわらず、各々の場合に、免疫系が応答する抗原は細胞内で分解され、その抗原のフラグメントは、ＭＨＣ糖タンパク質と結合した細胞表面で発現されることが分かっている。

ＭＨＣ糖タンパク質は冬型性領域を有し、その領域の溝と関連し、かつ溝に結合するペプチドに対しである程度の特異性を有する。したがって各ＭＨＣ糖タンパク質は、それが結合できる比較的分子量の低い部分となる特異的レパートリ−のみを有する。

以下に述べる本発明は、この低分子量部分のレパートリ−の固定に関する。

ＭＨＣ糖タンパク質ペプチド複合体はＴ細胞レセプターに提示されるが、Ｔ細胞レセプターは、自身が結合されるＭＢＣ糖タンパク質と協同して、フラグメントを特異的に認識する。その結果、Ｔ細胞が刺激されてリンホカインを分泌し、そのためリンパ球が拡大する。

これらのフラグメントはリンパ球の活性化に不可欠のものであるので、特定のリンパ球の活性化を増大もしくは減少させる役割を演するペプチドもしくは低分子量の生体分子が作り出され得るかまたは発見され得る。このように８９２８球および１９７８球の活性化は制御されて、特定の免疫応答を促進するかもしくは抑制する。よって、リンパ球の応答を活性化もしくは阻害する有効候補体部分を同定できることは非常に重要であり、これらの同定部分は、自己免疫疾患、感染症、アレルギーなどの治療に有用となり得る。したがって、問題の特定のＭｌ（Ｃ糖タンパク質を捕捉可能な部分が決定されると、関連ＭＨＣ糖タンパク質が抗原部分を提示することにより媒介される症状に有用な治療用化合物が提供される。

通常の競合結合検定法は、適切な候補体部分を同定することには適切でないと思われる。より一般的なリガンド／レセプターの結合とは異なり、部分／ＭＨＣ糖タンパク質複合体の生成速度は非常に遅いが、生成した複合体は安定である。その結果、未変性の物質から得られるＭＨＣ糖タンノ＜り質は、内因性ペプチドの不均一な配列と複合するので、速度が非常に遅いときと変動するときを除いて、他の候補体部分と結合することを阻害される。単離されたＭｔｌＣ糖タンＪ４り質の約１％だけが他の候補的な部分を直接捕捉できる”オーブン形（ｏｐｅｎ　ｆｏｒ曹）″であり、該製剤の約９９％はすでに内因性ペプチドと複合していると確定される。

したがって、特定のＭＨＣ糖タン１＜り質に対して多数の候補体部分を、迅速かつ効率的な手法でスクリーニングすることができる有効なリガンド結合検定法を考案する必要がある。本発明は上記の目的を達成するためのいくつかのプロトコルを提供するものである。

ｌ１文ぷ以下の文献が関連していると考えられる。すなわち、Ｂａｂｂｌｔｔら、”Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｉａｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｔｏ　Ｉａ旧ｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ”、　ｈ組皿、　ｉｌユ看、　３５９〜３６１頁、１９８５年；Ｂｕｕｓ、−１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｉａ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ−、ｃｅｌｌ、４］ｐｉ、１０７１−１０７７頁、１９８６年、ＷａｔｔｓおよびＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、　”旧ｇｈ　ＡｆｆｉｎｉｔＦＦｌｕｏｒｅｓｅｅｎｔ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｉ−Ａ’　ｉｎ　ＬｉｐｉｄＭｅｍｂｒａｎｅｓ″Ｐ　ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　士−ＵＳＡ、ＬＬ！１．９６６０〜９６６４頁、１９８６年ＨＢｕｓｃｈｓら　＋Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ　ｔｏ　ＨＬＡ−ＤＲＰｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　Ｂ−ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅｓ−、ＬＩｌｉｌｖｓｕｎｏｌ、　ｌｆｉ、４４３−４４１頁、１９９０年；）ｉｏｃｈｅおよびＣｒｅｓｓｖｅｌｌ。

”ＩＨｇｈ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ａｎ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＨＬＡ−ＤＲ”、　Ｊ↓ｍ５ｕｎｏｌ、　！１４Ｊｌｓ１８４９〜１８５６頁、１９９０年；ＣｈｅｎおよびＰａｒｈａｍ、”Ｄｉｒｅｃｔ　Ｂｌｎｄｉｎｇｏｆ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｐｅｐｔｌｄｅｓ　ｔｏ　Ｃ１ａｓｓ　Ｉ　ＢＬＡ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ−、ｌ側１■ｊ、ＬＬ７Ｊｌ、７４３− ７４５頁、１９８９年：およびＢｏｕｌ　ｌ　ｌｏｔら、　−ＰｈｙｓｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　ＭＨＣＣ１ａｓｓ　Ｉ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄＩｗｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｎａｔｕｒｅ、３ｊｊＪ、４７３〜４７５頁、１９８９年である。

ｌ匪段皿土本発明が提供する第１のプロトコルは次のとおりである。

分散された可溶性ＭＲＣ糖タンパク質を、検出可能なアゴニストがＭＢＣ糖タンパク質と複合体を形成することが分かつている条件下で、競合候補体部分の存在下において、該検出可能なアゴニストで処理する。生成した複合体を反応混合物から分離し、複合体中に含有されているアゴニストに対する候補体部分の作用を測定する。

本発明の第２のプロトコルは、例えば精製されたＭＨＣ糖タンパク質が容易に入手できない場合に特に適しているが、以下のとおりである。ＭＨＣ糖タンパク質を検定プレートに捕捉させて、可溶性ＭＨＣの代わりに競合検定法に用いる。この検定プレートは、例えば、抗−Ｍｌ（Ｃ糖タンパク質抗体またはＭｌ（Ｃ糖タンパク質に対して親和性を有する他の試薬に誘導体化されている。

やはり、固定化ＭＨＣの検出可能なアゴニストとの結合に対する候補体部分の作用を測定する。

他のプロトコルでは、単離されたＭＨＣ糖タンパク質は、均一なペプチド製剤が前負荷され、その結果、すでにカップリングされたＭＢＣ糖タンパク質の均一な集団が提供される。前負荷されたペプチドの解離反応が、別の候補体部分の結合反応の律速段階である場合、この方法は、反応速度を制御して、検出可能なアゴニストと候補体間の均一な競合を保証することができる。さらに、生成したＭＢＣ複合体を希釈すると、前負荷されたペプチドの解離が速くなり、そのため、アゴニストもしくは候補体に結合する”中空ポケッ）　（ｅｍｐｔｙ　ｐｏｃｋｅｔ）”（すなわち利用可能なドメインまたは結合部位）を生成する。

均一な前負荷されたペプチドとしては、ＭＨＣ糖タンパク質によって比較的容易に放出され、したがって検定に要する時間が短くなるものを選択することが好ましい。

その他のプロトコルでは、単離されたＭＨＣ糖タンパク質に、このタンパク質からの解離速度が他のペプチドの存在によって影響されることが分かっている標識ペプチドを前負荷する。

そして、ＭＢＣ糖タンパク質からの標識アゴニストの解離もしくは置換の反応を加速する試験化合物の性能を測定する。

さらに、アゴニストおよび／または候補体部分との複合体の形成を検出するのに有用な手段は、Ｔ細胞刺激に対する複合体の作用を測定することである。

したがって、１つの態様において、本発明は、ＭＢＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法に関するものであって、該方法は、反応混合物中に、セルフリー分散ＭＨＣ糖タンパク質、前記糖タンパク質に結合して複合体を形成しかつその複合体中あるとき検出することができる可溶性アゴニスト、および試験化合物を、試験化合物とアゴニストが競合してＭＨＣ糖タンパク質に結合する条件下で混合する工程；ＭＢＣ糖タンパク質に捕捉されたアゴニストを未結合のアゴニストから分離する工程；および、複合体中に結合されているアゴニストの量を、反応混合物中の試験化合物の濃度の関数として検出する工程；を包含する。

第２の態様において、本発明は、特定のＭＨＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法に関するものであって、該方法は、ＭＨＣ糖タンパク質が結合されている固体支持体を、ＭＨＣ糖タンパク質と結合して複合体を形成し、かつその複合体中にあるときは検出することができる可溶性アゴニスト、および試験化合物を含有する反応混合物で、試験化合物と前記アゴニストが競合してＭＢＣ糖タンパク質に結合する条件下で、処理する工程；前記反応混合物を固体支持体から取り出す工程；および、前記固体支持体に結合したアゴニストの量を、反応混合物中の試験化合物の濃度の関数として検出する工程；を包含する。

第３の態様において、本発明は、ＭＨＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法に関するものであって、該方法は、第１アゴニストを前負荷されたＭＨＣ糖タンパク質を、前記ＭＨＣ糖タンパク質と結合して複合体を形成し、かつ前記複合体中にあるときは検出することができる第２アゴニスト、および試験化合物を含有する反応混合物で、試験化合物と第２アゴニストが競合してＭＨＣ糖タンパク質と結合する条件下で、処理する工程；前記ＭＢＣ糖タンパク質は、該反応混合物を添加する前に前負荷するアゴニストで前負荷され、かつ希釈される工程；および、複合体に結合され第２アゴニストの量を、反応混合物中の試験化合物の濃度の関数として検出する工程；を包含する。

第４の態様において（解離速度検定法）、本発明は、ＭＨＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法に関するものであって、該方法は、反応混合物中に、標識アゴニストを前負荷されたＭＨＣ糖タンパク質、および試験化合物を混合する工程であり、前記の前負荷された複合体の解離速度は他のペプチドの存在によって影響されることはわかっているもの；および、試験化合物が存在するときと存在しないときとの上記の前負荷された複合体の解離速度を比較して、試験化合物によって加速されたオフ速度（ｏｆｆ　ｒａｔｅ）を検出する工程；を包含する。

第５の態様において、本発明は、ＭＨＣ糖タンパク質複合体中の（候補体）部分の存在を検出する方法に関するものであって、該方法は、前記複合体を前記部分で感作されたＴ細胞の培養物と接触させて、前記Ｔ細胞の存在、不在、または増殖量を検出する工程を包含する。

図面の簡単な説明図１は、ＤＲ４Ｄｗ４との結合について、未標識１１Ａ３Ｇ？−３１９が標議ＨＡ３０７−３１９と競合的であることを示す代表的阻害曲線である。

図２は、粗溶解物から、抗体でコートされた微量滴定プレートによって捕捉されたＤＲ４Ｄｖ４を用いる、標識１１Ａ３０７−３１９の結合曲線を示す。

図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、ＤＲ４Ｄｖ４　ＭＨＣ糖タンパク質に前負荷した後、種々の試験ペプチドについて測定した”オフ速度”を示す。

図４Ａと４Ｂはそれぞれ、前負荷されたＭＨＣ糖タンパク質および対照ＭＢＣ糖タンパク質に対するＲＭＢＰ９０−１０２ペプチドの結合曲線と阻害曲線を示す。

図５Ａと図５Ｂはそれぞれ、ＨＡ３０？−３１９が存在しない場合と存在する場合の、ビオチニル化ＲＭＢＰ９０−１０２とビオチニル化Ｈ３Ｐ３−１４の解離曲線を示す。

図６は、ビオチニ化ＨＳＰ３−１４のＲＭＢＰ９Ｇ−１０２による置換曲線を示す。

図７は、捕捉されたペプチドの検定法として、感作Ｔ細胞の増殖を用いたＨ＾３０７−３１９ペプチドの結合曲線を示す。

ｌ匪旦裏施１掻数種の有効な検定方法を用いて、検出可能なアゴニストと問題の候補体部分との間の競合を利用し、特定のＭＨＣ糖タンパク質に対する該候補体の結合を測定する方法および組成物を提供する。

解離速度検定法を除く、本発明のすべての方法では、検出可能なアゴニストと候補体間に競合が行われる。その場合、少なくとも１つの濃度および好ましくは種々の濃度の候補体部分の、検出可能なアゴニストの結合に対する作用が測定される。

解離速度検定法では、前負荷されたＭＨＣ／標識アゴニスト複合体の解離速度に対する、少な（とも１つの濃度および好ましくは種々の濃度の候補体部分の作用が測定される。

検出可能な”アゴニスト”とは、試験される特定のＭＨＣ糖タンパク質に結合できることがわかっているペプチドなどの低分子量化合物を意味する。ＤＲ対立遺伝子に対して有用なアゴニストとしては、例えば３０？−３１９の位置で表されるような赤血球凝集素由来のペプチド（ＨＡ３０７−３１９）　（Ｉｎｔ　ｍｍｕｎｏ　、２Ｊ！、４４３頁、１９９０年）がある。ＤＲ対立遺伝子のＭＢＣ糖タンパク質産物を捕捉することが分かった他の有用なアゴニストには、限定はないが、ＨＡＤＰ　３．２．　ＲＲＦＡＡＡＹＡＡＲＡＡＡ、　ＨＡＤＰ　３．６．　ＲＲＦＡＡＱＹＡＡＲＡＡＡ：　ＲＭＢＰ　９０−１０２．　ＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＡ；　ａｓｐ　３−１４　（Ｒ５［１３）、ＲＶＲＲＧＬＴＶＡＶＫＧ；　ＢＳＰ　３−１４　（Ｉｓ　Ｋ１３）、ＲＶＫＲＧＬＴＶＡＶ）［Ｇ、　ＨＳＰ　３−１４　（Ｋ５　Ａ１３）、　ＲＶＩＲＧＬＴＶＡＶＡＧおよびこれらを短くした変形体が含まれる。有効なアゴニストとしては、上記ペプチドおよびそのアミノとカルボキシルの電荷が放出された等傷物が含まれる。いくつかのアゴニストは、百日咳毒素３１−４３．　ブタフサ３５０−６２、およびインフルエンザ・マトリックス１Ｂ−３０のように対立遺伝子特異的である。

アゴニストには一般に、ＭＢＣと複合したとき容易に検出できるような方式で標識が付けられる。しかし、複合したペプチドを測定するＴ細胞増殖検定法について記載したように、検出がアゴニストの性質にのみ依存した方法で行われる場合は、外来性の標識付けを行う必要はない。したがって、アゴニストは複合体中にあるときは、検出可能であることのみが必要である。

しかし、アゴニストが標識によって検出される場合は、標識は種々の形態をとり得る。したがって、放射性同位元素、ビオチン、蛍光剤、化学蛍光剤などのような種々の標識が用いられ得る。標識の選択は、主として、簡便さ、感度、バックグラウンドの最小化、　ＭＨＣ糖タンパク質に対するアゴニストの結合への干渉の最少化などに基づいて行われる。一般にアゴニストの濃度は、ＭＢＣ糖タンパク質の濃度の約０．１〜５０倍である。

特に好ましい標識はビオチンである。ビオチンを”標識”として用いる場合、多種の標識で順に標識付けがなされるストレプトアビジンが検出に用いられ得る。

したがって、ストレプトアビジンは、放射性同位元素、蛍光剤、化学蛍光剤、酵素、コロイド粒子などで標識が付けられ得る。どの標識を採用するかは、上記のように種々の検討を行って決定される。

問題の候補体部分の濃度は、媒体中に存在するアゴニストの濃度、および候補体とアゴニストの相対親和性によって変化する。通常、候補体の量は、媒体中に存在するアゴニストの量とは、約１００倍以上まで異なることはない。

本発明の方法によれば、種々の成分（例えば、ＭＨＣ糖タンパク質、アゴニストおよび試験化合物）を混合し、混合物が平衡状態に達するまで十分な時間静置してお（。一般に温度は約３７℃である。通常、平衡に達する時間は少なくとも約０．５時間で、より一般には約１２時間であり、一般に約４８時間を超えない。

速度測定を利用することができて、複数の試料が用いられ、かつ各試料が複合体の生成量について分析される場合、通常は候補体の濃度を変えて一回測定するだけでよい。

適切な候補体部分としては、問題のＭＨＣ糖タンパク質をブロックすると考えられる低分子量の物質が含まれる。一般に、これらの候補体は、アミノ酸が５以上のオーダーのペプチドまたはこのようなペプチドのフンホメーシ璽ンを模倣する低分子量の生体分子である。広範囲にわたる候補体が、現在活動している合理的な医薬設計の分野で広く知られている。候補体の範囲に理論的制限はないので、活性であると推定されるいずれの化合物も採用され得る。

１つの方法では、溶解状態の可溶性ＭＨＣ糖タンパク質が複合体生成反応に使用される。ＭＩＩＣ糖タンパク質と複合した標識アゴニストが遊離アゴニストから分離され、次いで、複合したアゴニストの量が、候補体のＭＢＣ糖タンパク質に対する親和性の尺度として測定される。この方法は、多数の候補体をスクリーニングし、ＭＨＣ可溶化糖タンパク質に対する候補体の親和性に関連する値を得る迅速、簡単かつ正確な技術を提供する。

この値は、前記ＭＩＩＣ糖タンパク質が細胞膜中のそれらの天然の位置にある場合にみられる親和性に関連があると考えられる値である。

この方法を実施する際には、ＭＨＣ糖タンパク質が細胞膜を含有しない天然産の二量体の糖タンパク質であるが、または貫膜領域を欠（可溶性筒タンパク質である場合、ＭＢＣ糖タンパク質の溶液が調製される。可溶性筒タンパク質は種々の方法で調製され得る。クラス１■のＭＢＣ糖タンパク質のα鎖とβ鎖またはクラス■のＭＨＣ糖タンパク質のα鎖をコードする遺伝°子が貫膜領域の全部または一部を除去することによって端を切り得る場合は、組換え法を用いる。好都合なことには、貫膜配列は、脂質に連結できる領域と置換され得る（例えばＣａｒａｓら、ｔオｌ東、ＬＬＬ！Ｌ、１２８０頁、１９８７年；Ｔｙｋｏｃｉｎｓｋｉら、乙」ｌ」ｌｕ−に旦」虹」鎖、ＬＪ、　３５５５頁、１９８８年参照）。その脂質は次に、適切なエステラーゼ、例えばホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣで除去され得る。ＭＢＣ糖タンパク質の濃度は、一般に約０．０１〜５０μＭの範囲内にあり、より一般に約０．１〜１μＭである。この範囲は利用しゃすく、かつ臨界的なものではない。というのは、いくつかの試験では、結合される混合物の親和性、使用される部分の濃度などによって、上記範囲より高いかまたは低い濃度を用いる方が望ましい場合があるからである。

媒体は、一般に約１０〜２００ｍＭの緩衝剤の濃度によって、はぼ生理的ｐＨの４．５〜８、好ましくは約５〜６．５に緩衝される。他の添加物は、塩を約１０〜２０ｄの濃度で、または非イオン界面活性剤を含有し得る。非イオン界面活性剤は、一般に、約０．１〜２％の濃度で含有される。ペプチドアゴニストを用いる場合そのペプチドは、一般に少なくとも約３つの、多（とも約３０までのアミノ酸からなるものであり、好ましくは約３〜１６のアミノ酸、さらに好ましくは約５〜１５のアミノ酸からなる。

十分なＭＢＣアゴニスト複合体が形成されたならば、その複合体は種々の方法で分離され得る。その複合体は、ゲル濾過法、非還元性ＳＤＳポリアクリルアミド中でのゲル電気泳動法、またはＭＩＩＣ糖タンパク質に対して特異的な抗体もしくは他の親和性試薬（リガンド）でコートしたプレートに複合体を結合させることによって、遊離アゴニストから分離され得る。ゲル分画法（ｇｅｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）には、セファデックスＧ−５０が有用であることが知られる。ゲル電気泳動法には、非還元性条件下の１２．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルが十分であることが知られる。

しかし好ましくはアフィニティ分離法、特に抗体分離法が、好ましくはプレート上で、特に多くのウェルを具備するプレート上で用いられる。例えば、ＭＭＣ糖タンパク質のサブユニットの１つの定常部に対して特異的な過剰な抗体もしくはそのフラグメントを採用することによって、アゴニストとＭＨＣ糖タンパク質との間の複合体を捕捉し得る。次に、非特異的に結合しているかもしくは結合していない標識アゴニストを洗浄して除き、続いて、表面に結合して存在しているアゴニストを検出することによって、表面に結合したアゴニストの量を定量し得る。洗浄は、複合体を生成させるのに用いた媒体を含有する便利な緩衝媒体で実施され得る。アゴニストをビオチンで標識をつける場合、標識アビジンを用いることによって、単一のアゴニスト−ＭＩＩＣ糖タンパク質複合帯に結合された複数の標識が得られ得る。アビジンについて特に重要なのは蛍光標識の使用であり、とりわけランタニド（希土類元素）キレート化合物、さらにとりわけユーロピウムキレート化合物、または酵素、特に西洋ワサビのパーオキシダーゼの使用である。これらの標識は通常の手法に従って定量され得、ランタニドキレート化合物からの蛍光を検出する多数の蛍光分析器、および発色団をもたらすパーオキシダーゼの基質を検出する分光光度計が用いられ得る。

第２の方法は、候補体が、粗溶解物中に存在するＭＢＣ糖タンパク質と複合体を形成する性能を測定するのに特に有用であるが、この方法では、問題のＭＩＴＣ糖タンパク質はまず固体支持体に捕捉され、溶解物の残りの成分は支持体に吸着されたＭＨＣ糖タンパク質を除いて洗浄される。次に、カップリングされた支持体は、ＭＨＣ糖タンパク質および競合する候補的部分と複合したときに検出できるアゴニストを含有する反応混合物で処理される。アゴニストの標識の種類と、必要であれば反応混合物中の競合物質の濃度の種類は、可溶化ＭＨＣ糖タンパク質の使用に関する記載のものと類似している。

誘導体化された固体支持体は、当該技術分野で公知の標準技術によって、問題のＭＨＣ糖タンパク質に対して特異的な親和性試薬の受動的吸着または共有結合カップリングにより調製される。一般に、微量滴定プレートまたは他の多数のウェルを具備する反応マトリックスが固体支持体として使用される。

この方法は、候補体および／またはアゴニストのＭＨＣ糖タンパク質との結合を妨害することがある夾雑物を粗溶屑物から除去するという利点がある。このような夾雑物の活性は最小にしなければならない。というのは、溶解物中に存在するプロテアーゼなどが活性を示す場合、アゴニストのＭＨＣ糖タンパク質との結合は高温下でのみ起こるからである。

したがってこの方法では、適切な量のアゴニストおよび候補体を含有する反応混合物は、固体支持体に結合されたＭＩ’ＩＣ複合体の存在下で適切な期間、通常約３〜４８時間インキュベートされる。インキュベート期間が終わってから、固体支持体を反応混合物から取り出し、洗浄し、そしてＭＨＣ糖タンパク質に結合したアゴニストは上記の標識の性能によって測定される。

第３の方法では、第１の競合プロトコルが用いられ得るが、ＭＨＣ糖タンパク質を、均一な通常ペプチドアゴニストで前負荷することによってさらに最適化され得る。この方法は、アゴニスト／競合体の組み合わせの結合を行うことができる適切なオフ速度を有する。この方法では、精製ＭＨｃ糖タンパク質もしくは粗溶屑物が、前負荷するアゴニストとともにインキユベートされる。一般にオクチルグルコシドを含有する適切な緩衝液中で、未変性ＭＨＣ糖タンパク質中に含有される不均一な内因性ペプチドを、前負荷する均一な部分で置換するのに充分な時間、一般には一晩インキュベートされる。前負荷されたＭＨＣ複合体は次に希釈されて、上記の検定系に用いられる。

この方法は、アゴニストもしくは候補体と結合もしくは力２ブリングを行う”中空”１ｔＨｃ糖タンパク質結合ドメインを均一に提供する。一般に候補体またはアゴニストの結合反応の律速段階を他の方法ででも促進すると、検定時間が短くなり、候補体の結合速度と親和性をより正確に測定し得る。入ってくるアゴニストもしくは候補体は前負荷された部分を追出すことが不必要な場合は、前負荷条件を与えることによって、負荷されていないＭ［ＩＣ糖タンパク質に対する競合体の親和性はより容易に比較され得る。ＭＢＣ分子は、既知の解離速度を有するペプチドで前負荷されるので、検定は、より短い時間で好ましくは３時間で実施され得る。

第４の方法では、ＭＢＣ糖タンパク質は、他のペプチドの存在下で置換されることが実証されている、均一な標識ペプチドアゴニストで前負荷される。この方法では、精製されたＭＩＩＣ糖タンパク質は標識アゴニストとともにインキュベートされる。

一般にオクチルグルコシドを含有する適切な緩衝液中で、不均一な内因性ペプチドを、前負荷する部分で置換するのに充分な時間、一般には一晩インキユベートされる。前負荷されたＭｌ’ＩＣ複合体は次に、置換する候補的部分の溶液で約０．５時間希釈し、次に、候補的部分がある場合およびない場合のカウントの喪失を上記のようにして監視する。

本発明の別の態様では、競合検定法に用いられるアゴニストに標識を付ける必要がない。この方法では、複合体は、感作されたＴ細胞とともにＴ細胞増殖検定法で用いられる。感５°露出　１５゛露出　全収率作されたＴ細胞の増殖促進は、複合体に対するアゴニストの結合の尺度である。

またこの方法は、Ｔ細胞を試験部分で感作することによって、複合体内のいずれの試験部分ともの検出に用いられ得る。

以下の実施例は例示を目的として提供するものであって本発明を限定するものではない。

爽息五工ＨＬＡ−ＤＲおよびＤ　ンパク　の抗ＤＲ（ＬＢ３．１）および抗ＤＱ（ＩＶＤ１２）ノア　７　イニｆ　４−カラムを、球形セルロース樹脂（Ａｍｉｃｏｎ）および上記の各抗体４０ｍｇづつで調製した。カラムに結合する可溶化クラスＨの最大量は、結合された抗体のモル濃度の２倍である。よって、４０ｒａｇの免疫グロブリンは、多くてもクラス１ ■のＭＨＣ糖タンパク質の３２ｍｇ　Ｌか捕捉できない。実際には、アフィニティーカラムの理論的容量の１０〜３０％しか結合できず、これはＤＲとＤＱの３〜９ｍｇに相当する。Ｌ２４３とＬＢ３．１のカラムの比較を、１．８Ｘ　１０ ″９の細胞のＮＰ−４０界面活性剤による抽出物を等しく分割して各カラムに負荷し、ｐＨ１１，５の緩衝液に５分間または１５分間さらして溶離することによって実施した。収量は次のとおりである。

（以下余白）夾ｌ匠又（ｍｇ）　”　（ｍｇ）　（ｍｇ）　（ｍｇ）Ｌ２４３　１．８　０．８１１６　２．６９ＬＢ３．１　２．１０　２．０２　４．１２　６．８１ゲル　°による　ペプチド〜ＭＨＣム　の　ペプチドか゛のヨウ素化されたｌｌＡ３０７−３１９アナログ（２μＭ）を、ＨＬＡ−ＤＲ４Ｄｗ４　（た後、プレートを洗浄して計数した。

ｂ）アミノ末端がビオチニル化された、インフルエンザ赤血球凝集素の残基３０７〜３１９に相当するアゴニスト（ＨＡ３０７−３１９）を、アフィニティ精製したＤＲ４Ｄｗ４（２ｕ　Ｍ）とともＧＣＰＢＳ／１％オクチルグルコシド中でインキュベートした。ペプチドＤＲ複合体を、２５μｌのＰＢＳ／１％オクチルグルコシド（５％ＦＣＳ）と１０μｍのインキュページ言ン混合物を、抗体でコートしたエリザ（ＥＬＩＳＡ）プレートのウェルに添加したことを除いて、ヨウ素化ＨＡと同様に、遊離ペプチドから分離した。１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳｌｏ、０５％Ｔｗｅｅｎ　１０．１％ＢＳＡで洗浄し、結合したＦＩＡ３０７−３１９＜７）量を、１２５■ストレプトアヒジ７　（６−３０ｍｇ／ウェル）とともに４℃で１時間インキュベートシ、次に、洗浄し、計数することによって定量した。

Ｃ）ビオチニル化ＨＡ３０７−３１９のＤＲ４Ｄｖ４との結合に対する競合を、ＰＢＳ７１％オクチルグルコシド中、いくつかのＨＡモノ置換ペプチド（例えば３０９位のｌｙｓ、　ｓｅｔあるいはｐｈｅ）　（２００ｕ　Ｍ）がある場合またはない場合について、上記ｂ）と同様に行った。

抗体ＬＢ３．１の場合、ＤＲ抗原存在下で観察された計数値はバックランドと比べて約２倍であったが、一方非放射性競合体の存在下では、計数値はバックグランドより幾分低かった。抗体１ＶＤ１２の場合、ＤＲの存在下で観察された計数値はバックグランドより低かった。阻害曲線の代表的な結果を図１に示す。

実験ｂ）については、放射性ペプチドとＤＲ抗原の組合わせを除いて、実質的にシグナルは観察されなかった。

競合実験Ｃ）では、点置換（すなわち３０９位でのりシンあるいはセリン）を含有するアナログに相当するペプチド競合体の場合、計数値はバックグランドとほぼ同じであった、一方非放射性ペプチド３０？−３１９または３０９位にフェニルアラニンが存在する場合、実質的に放射能は観察されなかった。

爽胤五まビオチニル　、　アナログのＤＲ４０ｗ４との　Ａに・　る　およびＺ五二人立迄豊検定は、ｔｌＡのビオチニル化アラニンバックボーンのアナログ（ＡＡＦＫＡＡＥＡＡＡＡＲＡ）　２μＭおよびＤＲ４Ｄｖ４０．５ｕＭを用い、実施例３ｂに記載したのと同様に行った。ペプチドＤＲ？ｊ［合体を、蛍光性ユーロピウム結合ストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキダーゼ結合ストレプトアビジンあるいは１２５■結合ストレプトアビジンを用いて定量した。各々の染色試薬を滴下して、バックグランド最高値を越える最大シグナルを得た。

蛍光性ユーロピウムキレートで標識付けたストレプトアビジンの場合　＋２Ｊストレプトアビジンで見られたのと同じ大きさのシグナル／ノイズ比＜８０−１００：１）を観察した。西洋ワサビ・ベルオキダーゼストレプトアビジン結合体で優れたシグナル／ノイズ比（１０−２０：１）をまた観察した。

支胤五ｉ ′　の、・　ＡのＤＲツクラス１分子２μｇ／ｍｌ、　２００μｌ／ウエルに対して特異的なモノクローナル抗体ＬＢ３．１を、コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）ＥＩＡ−ＲＩＡプレートに、５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐａ　９．０中、４℃で一晩あるいは３７℃ で１時間コートした。プレートを洗浄し、５％　ＦＣＳ／ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックし、次にタイターテックプレートウォッ　゛シ＋　−（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　ｐｌａｔｅ　ｗａｓｈｅｒ）を用いて、Ｏ，ＯＳ％Ｔｖｅｅｎ　２０１０．０１％アジド／ＰＢＳ　（洗浄緩衝液）で３〜４回洗浄した。次に、約２０ｎＭのＤＲＭＨＣ糖タンパク質を含有すると考えられる細胞溶解物を、上記のコートされたプレート上にて４℃で４時間インキュベートした。そのプレートを、０．０５％Ｔｖｅｅｎ　２０１０．０１％アジド／ＰＢＳで３〜４回洗浄した。次に、ビオチニル化ＨＡペプチド３０７−３１９を、５％ＦＣＳ／１駕オクチルグルコシド（ＯＧ）／ＰＢＳ中、２００μｌ／ウエルで、プレートに添加し、ＣＯ２インキユベータで３７℃で一晩インキュベートした。

プレートを洗浄緩衝液で３〜４回洗浄し、２００μｌのユーロピウムでキレート化したストレプトアビジン（Ｐｈａｒ璽ａｃｉａ／ＬＫＢ　Ｎｕｃｌｅａｒ）６０ｎｇ／ｍｌとともに４℃で４時間インキュベートした。−回追加の洗浄サイクル後、プレートを、２００μｌ／ウエルの１２３４デルフイアリサーチ（Ｄｅｌｆｌａ　ｒｅｓｅａｒｃｈ）蛍光光度計（Ｐｈａｒ■ａｃｉａ／ＬＫＢ）での検出のために、結合ユーロピウムが放出する促進溶液（Ｐｈａｒｖａｃｉａ／ＩＪＢ）で、３０分間室温で処理した。

代表的な結果を図２に示す。精製ＤＲ４ＭＨＣ糖タンパク質ＩｏｎＭ（白丸印）あるいはＤＲ４Ｄｖ４でトランスフェクトされたＣｏ５７細胞由来の溶解物（白画角印）を用いて、ＭＨＣ糖タンパク質を得たときと同様に、Ｐｒ１ｅｓｓ細胞溶解物（黒丸印）を使用したときも、ビオチニル化ＢＡ３０７−３１９ペプチドの濃度に比例する結合曲線が得られている。対照として使用したＭｏｃｋ　トランスフエフ）　Ｃｏｓ細胞（黒画角印）は標識付きペプチドの取込みを全く示さなかった。

爽息五亙のプレート　゛のプロトコルこの検定法は、抗体をカップリングしたプレートを調製したことを除いて実施例５に述べたのと類似の方式で以下のように実施した。

酸化された抗体をその表面に共有結合するＡｖｉｄ−Ｈ２”″プレート（Ｂｉｏｐｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いた。まず第１にＬＢ３．１モノクローナル抗体を、　５（ｌｓＭ酢酸緩衝液ｐＨ５で、１０μｇ／ｉ＋１まで希釈し、次に１７１０容量の新しく調製した１０■Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加することによって酸化した。室温で３０分後、酢酸緩衝液中、２０５Ｍエチレングリコールの１／１０容量を添加することによつて反応を停止させた。１１５μｌの酸化抗体溶液を、Ａｖｉｄ−Ｈｚ”″プレートのウェルに添加し、４ ℃で一晩インキユベートした。次にそのプレートを洗浄液（ＰＢＳｌｏ、　Ｏ５％Ｔｗｅｅｎ　２０１０．０１％アジ化ナトリウム）で４回洗浄し、次にＰＢＳ１５％ＦＣＳ１０．０１％アジ化ナトリウムを用いて４℃で１時間ブロックした。

ＰＢＳｌｏ、　７５％オクチルグルコシド７０．０１％アジ化ナトリウム（結合緩衝液）中の、ＺＯｎｓ　ＤＲ４Ｄｗ４１２Ｓμｌを各ウェルに添加し、４℃で４時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、結合緩衝液を含有するビオチニル化Ｈ＾３０？−３１９ペプチドの１２５μｌで処理し次いで３７℃で一晩インキコベートした。そのプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、次いでユーロピウムでキレート化されたストレプトアビジン６０ｎｇ／ｍｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）の１２５μｌとともに４℃にて一晩インキユベートした。

１回追加洗浄サイクル後、プレートを１２５μｌ／ウエルの促進溶液（Ｐｂａｒｍａｃｉａ／ＩＪＢ）で室温にて１時間処理し、１２３４デルフイアリサーチ（Ｄｅｌｆｌａ　ｒｅｓｅａｒｃｈ）蛍光光度計で読取った。

実施例５と類似の結果を得た。

爽亀且Ｌ１　されたＭＨＣンバク　の適切な前負荷するペプチドを決定するためにオフ速度をいくつかの候補の前負荷するペプチド；すなわちＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＡの配列を有するラットのミニリン塩基性タンパク質９０−１０２　（ＲＭＢＰ９０−１０２）　；ＲＲＦＡＡＡＹＡＡＲＡＡＡの配列を有するＨＡ由来タンパク質３．２（ＨＡＤＰ３．２）；およびＲＲＦＡＡＱＹＡＡＲＡＡＡの配列を有するＨＡ由来タンパク質３．６（ＨＡＤＰ３．６）について測定した。標識付けた前負荷するペプチド５０ｎＭを、ＰＢＳ　ｐＨ７，０結合緩衝液中、４００ｎＭのＤＲ４Ｄｖ４ともともに４８時間インキュベートした。複合体を、ＰＢＳで１＝４０に希釈し、および未標識のＨＡ３０９−３１９の種々の濃度を、種々の倍率に希釈し、次に上述のようにＬＢ３．１をカップリングさせた抗体プレートに、複合体を捕捉させることによって測定した。図３Ａ〜３Ｃに示すように、どの試験ペプチドも、オフ速度がＨＡ３０？−３１９の存在によって影響を受ることを示さず、ＲＭＢは、未標ｍＲＭＢＰの種々の濃度を用いて得た阻害百分率を示す。

Ｐ２Ｏ−１０２の解離速度は上記３つの中で最も速かった。従って、この検定に用いるために、ＲＭＢＰ９０−１０２による前負荷を選択した。

この検定では、２ＦＭの精製ＤＲ４Ｄｖ４とＩμＭのＲＭＢＰ９０−１０２を、上述のようにＰＢＳ７０．７５％オクチルグルコシド７０．０１％アジ化ナトリウムの結合緩衝液中で一晩インキユベートした。

抗体捕捉プレートは、１１５μｌの２μｓ／ｍｌ　ＬＢ３．１を用いて４℃にて一晩で調製し、洗浄し、上述のようにブロックした。

前負荷された複合体（すなわちＤＲ４Ｄｖ４／ＲＭＢＰ９０−１０２）を１：１００に希釈し、種々の濃度のビオチニル化ＲＭＢＰ９Ｇ−１０２あるいは８．８ μＭのビオチニル化ＲＭＢＰ９０−１０２とともに、種々の量の未標識の同じペプチドの存在下でインキュベートした。対照として用いる、希釈された前負荷されていないＤＲＭＨＣ糖タンパク質もまた同様に処理した。

反応混合物の一部（５０μｌ）を捕捉プレートに移し、４℃で４〜２４時間インキュベートした。そのプレートを上述したように洗浄し、次に、検定緩衝液（カルシウムとマグネシウムを含有しないＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ、　０．１％アジ化ナトリウム中２０μＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）　）　中、６０ｎｇ／謹ｌユーロピウム−ストレプトアビジンの１２５μｌで処理し、４℃で２〜２４時間インキュベートした。追加の洗浄を行った後、プレートを上述のように増強して読み取った。

代表的な結果を図４Ａと４Ｂに示す。図４Ａは、対照としてのビオチニル化ＲＭＢＰと、前負荷されたＤＲの結合曲線を示す。図４Ｂ響されない。しかし、図５Ｂに見られるように、ＨＳＰの解離は他上述のように、結果は、前負荷されたＤＲＭＨＣ糖タンパク質と前負荷されていないＤＲＭＨＣ糖タンパク質について類似している。試薬を滴下した後、Ｏ，ＬＭにＨ２ＰＯ４でｐｔｌを６．５に調節されたカルシウムとマグネシウムを含有していないＰＢＳ中、３７℃で一晩インキユベートすることによって、２μＭ　ＤＲ４Ｄｖ４に２５０ｎＭ　ＲＭＢＰ９０−１０２を前負荷して、スクリーンがなされることを測定した。前形成された複合体は、１／４ｏに希釈し、標識付けたアゴニストと試験化合物を３時間反応させた。このようにして複合体を上述のように捕捉した。

裏亀且エリガント　六　の　のリガンド／受容体の解離速度が、存在する複合体の濃度にのみ依存している場合は、−次反応である。クラスＩＩ／ペプチドの解離速度を研究すると、その反応はいくつかの場合では一次反応であるが、すべてが−次反応ではない。

解離速度を測定するために、４０Ｇ−５００ｎＭ　＋７）ＤＲ４Ｅｖ４を、５゜ｎＭビオチニル化１１ＭＢＰあるいは２５μ閾のビオチニル化Ｈ３Ｐ（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の１９にＤの熱シヨツクタンパク質３−１４）とともに、先に述べたように、３７℃で一晩インキユベートした。これらの前形成された複合体は、次に、ＨＡ３０？−３１９の濃度を変えるが、あるいは変えることなく緩衝液で１００倍に希釈した。図５Ａに見られるように、ＲＭＢＰの解離速度は第２のペプチドによって影のペプチドの存在によって加速し、その解離速度は、他のペプチドの濃度にともなって増加するのでこの解離は明らかに一次反応ではない。

これは置換モデルを示唆し、この場合第２ペプチドは第１ペプチドを押し出す。

従って、第２の前負荷されるスクリーニング検定では、８００ｎＭのＤＲ４Ｄｖ４と６μＭのビオチニル化ＨＳＰ３−１４を上述のようにインキュベートした。

複合体を、競合体の候補的部分を含有するか、あるいは含有していない緩衝液で４０倍に希釈して、置換を３０分間、計数値の減少によって測定した。図６はペプチド競合体（ＲＭＢＰ）による置換を示しているが、どんな小さな分子も潜在的に同じ作用を持っている。

爽立五１されたＴ　によるＨＡ３０？−３１９に対して特異的に反応性のＴ細胞クローンを、ＨＬＡクラスｉ＋に表現型のＤＲ４Ｄｖ４、ＤＲ？、ＤＲｖ５３、ＤＱｖ８、ＤＱｖ９を有する固体から調製した〈実施例１に記載されているように行った）。簡単に述べると、末梢血液の単核細胞を、ストレプトマイシン（１００μｇ／■ｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／■ｌ）および５％のプールしたＡＢ血清（Ｗｂｉｔｔａｋｅｒ　Ｆｒｅｄｉｃｋｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を補足したＲＰＭＩで、１／１００に希釈したインフルエンザワクチン（Ｐａｒｋｓ　Ｄａｖｉｓ）を用い、インビトロで感作させた。５％ＣＯ２中５日間３７℃でインキュベートした後、Ｔ細胞の細胞芽を、−１あたり１０６の同種異系ＰＢＭＣ（３０Ｇｙ照射）、Ｂ細胞に形質転換されたオートロガスＥＢＶの１０５細胞（５ＯＧｙ照射）、インフルエンザウィルスワクチンの１／１００１釈、および１μｇ／ｍ　ＩのロイコアグルチニンーＡ（Ｐｈｓｒ■ａｅｉａ社）を含有する、フィーダー混合物の存在下、３ウエルあたり１細胞に希釈を制限することによってクローンした。

懸濁液を、９６ウエルの平底微量滴定プレートにプレートし、上述したようにインキ５ベートした。増殖培養物を２４−ウェルの組織培養プレートに移し、同じフィーダー混合物で再刺激した。３日後、１０％！Ｌ−２を添加し、細胞を凍結するかまたはさらに再刺激によって膨張させた。特異性をＨＡ３０７−３１９で測定した。

ＤＲ４Ｄｖ４糖タンパク質を、実施例１に記載されているようにして、Ｐｒ１ｅｓｓ　ＥＢＶ−Ｂ細胞からアフィニティー精製した。簡単に述べると、該細胞はウシ胎児血清で補足したＲＰＭＩ培地で増殖させて遠心分離で集め、ＰＢＳで洗浄し、１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０で溶解した。細胞断片を遠心分離で取り除き、生成した溶解物を、製造者の指示にしたがって、４０Ｂの抗体を１０菖ｌのマトリックスセルファインホルミルＡｖｉｃｏｎ＞にカップリングすることによって調製したモノクローナル抗体ＬＢ３．　１セルロースカラムに直列接続したセファロースＣＬ−４Ｂ　カラムへ直接負荷した。これらのカラムを、１０ｍＭ　）リスＨＣＩ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣＩ，　０．１％デオキシフール酸の２０倍容量で洗浄した。次にＬＢ３．１セルロースカラムをカラムの５倍容量の１０ｍＭ　トリスＨＣＩ　ｐＨ７．５、１％ＯＧで洗浄し、５０ｍＭグリシンｐＨ１１、５、１％ＯＧで溶離した。得られた画分はそれぞれｐＨ　２の２Ｍグリシンでｐｎｙ．ｓに調節した。全画分を、ｌＱｍＭ　）リス１ｃ１。

ｐＨ７．５１％ＯＧに対して透析を行い、４℃で貯蔵した。

ＭＢＣ糖タンパク質／ペプチド複合体を調製するために、精製ＤＲ４９ｗ４を、１％ＯＧ／ＰＢＳ中Ｈ＾３０７ー３１９を種々の濃度で、３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌの該混合物を、５μｍｇ／１１のＬＢ３、１含有の５０− ＭトリスＨＣＩ，　ｐＨ　９中で４℃にて一晩インキユベーシツンして、ＬＨ３．１でコートされた９６ウエルの平底エリザプレートに添加した。得られた混合物を、コートされたプレートを用いて４℃で６時間インキュベートし、次にＰＢＳで２回および完全培地で１回洗浄した。

Ｔ細胞増殖検定のために、完全培地２００μｍ中に３Ｘ１０’のＴ細胞を各ウェルに添加した（Ｔ細胞は再刺激１０〜１１日後に使用した）。２４４時間インキュページンした後、トリチウム化したチミジンをウェルあたり１．０μＣｉづつ添加し、次にそのプレートをさらに１８時間インキュベートした。試料を半自動式ハーベスタ−を用いて、ガラス繊維のフィルター上に収集し、チミジンの取り込み量を、シンチレーシロンカウンターで計数することによって測定した。３重反復測定の結果を図７に示した。

図７に示すように、Ｔ細胞の増殖は、試験Ｈ＾３０７ー３１９ペプチド結合曲線を決定するのに用い得る。

特定のＭＨＣ糖タンパク質に対する結合親和性について候補的部分をスクリーニングするための、迅速かつ効率的検定を提供することは上記の結果から明かである、したがって該方法は候補体の広範囲の種類と、ＭＲＣ糖タン、＜り質と相互唇こ作用するそれらの能力とを評価でき、および結局はこのようなＭｌ（Ｃ糖タンパク質を有する宿主中の免疫応答を調節すること力ｆできる。

本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、あたかもこれらの個々の各刊行物ある（旭（マ特許出願力５、特定的におよび個々に参照によって取り込まれ、示されて（するのと同程度に、参照によって本明細書書こ援用される。

本発明は十分に記載されているので、多くの変更および改変を、請求の範囲の精神あるいは適用範囲力）ら逸脱することなく行い得ることは、当業者にとって自明である。

、００１　、０１　、１　１　１０［アンタゴ′ニスト１μＭＦｉｇ．　１＋　ＰＲＩＥＳＳ溶解物、００１　．０１　．１　１　１０ビオチニルイｔ−、！小ちＨＡ３０７−３１９μＭＦｉｇ、　２ＢＲＭＢＰ　９０−１０２の才２速１度　８／１２／９１１１）闇（Ｈｏｕｒｓ）Ｆｉｇ、　３ＡＢＨＡＤＰ３．２のオフ適確　８ハ２／９１−間（Ｈｏｕｒｓ）” ＢＨＡＤＰ　３．６　のオフｊ口賢　８／１２／９１峠間（Ｈｏｕｒｓ）Ｆｉｇ、　３Ｃビオ呼ニル化ｊちＲＭｆＳＰテ０−１ｏ２の直接賜４゛にブヂじ」１賓　（ｎＭ）Ｆｉｇ、　４Ａ１？Ｊ？、Ｍ　Ｂ−ＲＨ８１’　？０−１ｏ２ｃｌ＋ＲＭＢＦとｎｎＡｆｌ省へ °デ科゛（１實　（ｎＭ）Ｆｉｇ、　４Ｂ ”Ｉ’　？　ｋ　Ｌ７＝ｌ　’ＭＪ’ｉＢ　Ｏ急（ε−０１×）　１１１）Ｆｉｇ、　７国際調査報告Ｗτ六Ｒりに真Ｉｎフロントページの続き（７２）発明者　ロスバード、ジョナサン　ビー。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４０２７アサートン、ワトキンズ　アベニュー（７２）発明者　ウィッカー、リンダ　ニス。

アメリカ合衆国　ニューシャーシー〇７０７６　スコッチ　プレーンズ、プルツクサイド　コート　２（７２）発明者　キューポン、ローズ　エム。

アメリカ合衆国　ニューシャーシー０７０２３　ファンウッド、テイロットソンロード　５（７２）発明者　ニコルス、エリザベス　エイ。

アメリカ合衆国　ニューシャーシー０７０９３　ウェストフィールド、グランドアベニュー　８０８（７２）発明者　ブツシュ、ロバートドイツ連邦共和国　６９００　ハイデルベルク１、イン　モイエンハイマー　フェルト２８０、ポストファッハ　１０１　９４９．　トイチェス　クレブスフォルシュングスツエントルム、インスティテユート　フユア　イムノロギー　ラント　ゲネティック（７２）発明者　パン　シューテン、ライムアメリカ合衆国　カリフォルニア　９４３０４パロ　アルド、ウィリアムス　ストリート　２１０３（７２）発明者　ヒル、シー、　マークアメリカ合衆国　カリフォルニア　Ｑ４３０６パロ　アルド、ルーズベルト　サークル

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＭＨＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法であって、反応混合物中に、細胞を含有しない分散されたＭＨＣ糖タンパク質、該ＭＨＣ糖タンパク質に結合して複合体を形成し得かつ該複合体中にあるとき検出し得るアゴニスト、および該試験化合物を、該試験化合物と該アゴニストが競合して該ＭＨＣ糖タンパク質と結合する条件下で混合する工程；ＭＨＣ糖タンパク質に捕捉されたアゴニストを未結合のアゴニストから分離する工程；および該複合体中に結合しているアゴニストの量を、反応混合物中の試験化合物の濃度の関数として検出する工程を包含する、方法。
２．前記ＭＨＣ糖タンパク質が、完全な貫膜配列を欠く、請求項１に記載の方法。
３．前記分離工程が、ゲル濾過法による、請求項１に記載の方法。
４．前記反応混合物が、約４．５から８の範囲のｐＨで、そして約０．１から２％の非イオン界面活性剤を含有する、請求項１に記載の方法。
５．前記アゴニストが、ピオチンにカップリングされ、そして前記検出工程が、前記ＭＨＣ複合体が標識を含有するストレプトアビジンと反応する工程により行われる、請求項１に記載の方法。
６．前記標識が、蛍光、放射活性または酵素標識である、請求項５に記載の方法。
７．前記分離工程が、前記複合体を固体支持体にカップリングすることにより行われ、前記固体支持体が、前記ＭＨＣ複合体に対する親和性リガンドにカップリングされている、請求項１に記載の方法。
８．前記親和性リガンドが、ＭＨＣ糖タンパク質に対して特異的な抗体または免疫学的に反応性のそのフラグメントである、請求項７に記載の方法。
９．前記アゴニストがピオチンにカップリングし、および前記検出工程が、前記ＭＨＣ複合体が標識を含有するストレプトアビジンと反応することによって行われる、請求項７に記載の方法。
１０．特定のＭＨＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法であって、ＭＨＣ糖タンパク質がカップリングされている固体支持体を、ＭＨＣ糖タンパク質に結合して複合体を形成し得かつその複合体中にあるときに検出され得るアゴニスト、および該試験化合物を含有する、反応混合物によって、該試験化合物およびアゴニストが競合してＭＨＣ糖タンパク質に結合する条件下で処理する工程；該反応混合物を該固体支持体から除去する工程；および該固体支持体に結合したアゴニストの量を、該反応混合物中の該試験化合物の濃度の関数として検出する工程を包含する、方法。
１１．前記固体支持体が、ＭＨＣ糖タンパク質に対する親和性リガンドを含有するよう改変された、請求項１０に記載の方法。
１２．前記親和性リガンドが、ＭＨＣ糖タンパク質に対して特異的な抗体あるいは免疫学的に反応性のそのフラグメントである、請求項１１に記載の方法。
１３．前記アゴニストがピオチンにカップリングされ、および前記検出工程が、前記ＭＨＣ複合体が標識を有するストレプトアビジンと反応することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
１４．前記標識が、蛍光、放射活性または酵素標識である、請求項１３に記載の方法。
１５．ＭＨＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法であって、第１アゴニストを前負荷されたＭＨＣ糖タンパク質を、該試験化合物、および該ＭＨＣ糖タンパク質と結合して複合体を形成し得かつ該複合体中にあるときに検出し得る第２アゴニストを含有する反応混合物により、該試験化合物および第２アゴニストが競合して該ＭＨＣ糖タンパク質と結合する条件下で処理する工程；該ＭＨＣ糖タンパク質が、第１前負荷するアゴニストで前負荷される工程；および該複合体中に結合された第２アゴニストの量を、反応混合物中の試験化合物の濃度の関数として検出する工程を包含する、方法。
１６．前記第２アゴニストがビオチンにカップリングされ、および前記検出工程が、前記ＭＨＣ複合体が標識を有するストレプトアビジンと反応することによって行われる、請求項１５に記載の方法。
１７．前記標識が、蛍光、放射活性または酵素標識である、請求項１６に記載の方法。
１８．前記前負荷されたＭＨＣ糖タンパク質が、前記反応混合物を、前記前負荷された糖タンパク質に添加する前に希釈される、請求項１５に記載の方法。
１９．ＭＨＣ糖タンパク質に対する試験化合物の親和性を測定する方法であって、該ＭＨＣ糖タンパク質を、該試験化合物を添加しながら置換可能な標識されたアゴニストで前負荷する工程、および該試験化合物で置換された標識されたアゴニストの量を検出工程を包含する、方法。
２０．ＭＨＣ糖タンパク質複合体中に含有されている部分の存在もしくは濃度を、該部分で測定する方法であって、該複合体を、該部分で感作されたＴ細胞と接触する工程、および該Ｔ細脂の増殖の程度を測定する工程を包含する、方法。
２１．前記検出工程が、前記複合体を、前記アゴニストで感作されたＴ細胞と接触させ、そして前記Ｔ細胞の増殖の程度を測定することによって行われる、請求項１に記載の方法。
２２．前記検出工程が、前記複合体を、前記アゴニストで感作されたＴ細脂と接触させ、そして前記Ｔ細脂の増殖の程度を測定することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
２３．前記検出工程が、前記複合体を、前記第２アゴニストで感作されたＴ細脂と接触させ、そして前記Ｔ細胞の増殖の程度を測定することによって行われる、請求項１５に記載の方法。