JP2835781B2 - Ｔｓｈトレーサーの製造方法 - Google Patents
Ｔｓｈトレーサーの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、粗製のウシTSH（チロトロピン）から精製
によって得られるTSH製剤をもとにした、放射性ヨウ素
化TSHトレーサーの製造方法、及びTSH受容体自己抗体の
測定の為のTSH放射性受容体検体に於ける、その放射性
ヨウ素化TSHトレーサーの用途に関する。
によって得られるTSH製剤をもとにした、放射性ヨウ素
化TSHトレーサーの製造方法、及びTSH受容体自己抗体の
測定の為のTSH放射性受容体検体に於ける、その放射性
ヨウ素化TSHトレーサーの用途に関する。
TSHは、甲状腺機能の調節に中心的な任務を行なう下
垂体ホルモンである。その放出は、視床下部で形成され
るホルモンであるTRHによって刺激され、最も重要な甲
状腺ホルモンのチロキシン（T4）の生成と放出を制御す
る。甲状腺細胞によるチロキシンの形成がTSHによって
刺激されるのは、下垂体によって放出されるTSHが甲状
腺細胞膜のTSH受容体に結合するためである。
垂体ホルモンである。その放出は、視床下部で形成され
るホルモンであるTRHによって刺激され、最も重要な甲
状腺ホルモンのチロキシン（T4）の生成と放出を制御す
る。甲状腺細胞によるチロキシンの形成がTSHによって
刺激されるのは、下垂体によって放出されるTSHが甲状
腺細胞膜のTSH受容体に結合するためである。
しかし、そのTSH受容体に対して、種々異なる病理学
的条件において、種々のタイプの自己抗体が形成され得
る。自己抗体のタイプにもよるが、チロキシンの形成と
放出は、TSH受容体におけるTSH分子の遮蔽（shieldin
g）によって抑制され得るか、または、この甲状腺ホル
モンは、TSH受容体の自己抗体がTSHと同様に、甲状腺ホ
ルモン類の合成と放出を刺激するため抑制されることな
く放出される。後者の場合に生ずる過剰な甲状腺ホルモ
ンは、とりわけバセドウ病のような甲状腺機能亢進症と
して現われる。
的条件において、種々のタイプの自己抗体が形成され得
る。自己抗体のタイプにもよるが、チロキシンの形成と
放出は、TSH受容体におけるTSH分子の遮蔽（shieldin
g）によって抑制され得るか、または、この甲状腺ホル
モンは、TSH受容体の自己抗体がTSHと同様に、甲状腺ホ
ルモン類の合成と放出を刺激するため抑制されることな
く放出される。後者の場合に生ずる過剰な甲状腺ホルモ
ンは、とりわけバセドウ病のような甲状腺機能亢進症と
して現われる。
このため、TSH受容体自己抗体の検出は実際の臨床に
非常に重要であり、生物体液中のこのような自己抗体を
測定できるような幾つかの放射性受容体検定法がすでに
知られている。
非常に重要であり、生物体液中のこのような自己抗体を
測定できるような幾つかの放射性受容体検定法がすでに
知られている。
TSH受容体が古典的なラジオイムノアッセイでの抗体
の代わりに、この検定法で特異的結合剤として使用され
ることを除けば、このようなTSH受容体検定は、競争的
なラジオイムノアッセイと同様に機能する。既知のTSH
受容体自己抗体検定法では、これらの受容体は動物の甲
状腺組織に由来しており、特にブタTSH受容体製剤が使
用される。これらは溶液型で入手でき、化学量論量より
少ない量で使用される。検定を行なう時に、患者の血清
からのTSH受容体自己抗体と、トレーサーとして使用さ
れる、通常は125Iで標識したウシTSHである、標識TSHと
が、この受容体試薬の限られた数の結合位置に対して競
争する。血清試料中にある自己抗体の数が少ないほど、
より多く標識TSHトレーサー分子が受容体によって結合
される。
の代わりに、この検定法で特異的結合剤として使用され
ることを除けば、このようなTSH受容体検定は、競争的
なラジオイムノアッセイと同様に機能する。既知のTSH
受容体自己抗体検定法では、これらの受容体は動物の甲
状腺組織に由来しており、特にブタTSH受容体製剤が使
用される。これらは溶液型で入手でき、化学量論量より
少ない量で使用される。検定を行なう時に、患者の血清
からのTSH受容体自己抗体と、トレーサーとして使用さ
れる、通常は125Iで標識したウシTSHである、標識TSHと
が、この受容体試薬の限られた数の結合位置に対して競
争する。血清試料中にある自己抗体の数が少ないほど、
より多く標識TSHトレーサー分子が受容体によって結合
される。
ヒト血清中のTSH受容体自己抗体測定の基本原理とそ
の詳細は、多数の刊行物に記載がある。中でも、検定法
に関連した種々のメーカーの製品情報（本出願人のTRAK
(A)、Byk Sangtec、Biocode、及びChronusなどの会社の
検定法）のほか、以下について特に言及できる。エル・
シー・ハリソン（L.C.Harrison）及びピー・ジェイ・リ
ードマン（P.J.Leedman）によるClin.Biochem.23巻43−
48頁（1990年）の記事；バーナード・リース・スミス
（Bernard Rees Smith）ら、Endocrine Reviews 9巻１
号106−121頁（1989年）；及びバーナード・リース・ス
ミス及びレジナルド・ホール（Reginald Hall）、Metho
ds in Enzymology 74巻405−420頁（1981年）。TSH受容
体検定法に必要なTSH受容体は、通常、ふつうはブタか
らの、甲状腺膜の消化と洗剤抽出によって、比較的単純
な方法で得られ、使用できるものとなるが、トレーサー
として使用されるTSHは非常に高い品質要件を満たさな
ければならない。このため、TSH受容体自己抗体検定法
向けに臨床上の期待を満たすためには、放射性TSHはTSH
受容体に対する特異的結合についてのある最少値（約30
−50％の特異的結合）と、非特異的結合に対する対応的
に低い値（使用の放射性マーカーの全活性の５％まで）
をもたなければならない。この目的はこれまで、相当な
複雑さを伴うことでしか達成されなかった。こればバー
ナード・リース・スミスを著者とする上の刊行物で詳細
に説明されている。
の詳細は、多数の刊行物に記載がある。中でも、検定法
に関連した種々のメーカーの製品情報（本出願人のTRAK
(A)、Byk Sangtec、Biocode、及びChronusなどの会社の
検定法）のほか、以下について特に言及できる。エル・
シー・ハリソン（L.C.Harrison）及びピー・ジェイ・リ
ードマン（P.J.Leedman）によるClin.Biochem.23巻43−
48頁（1990年）の記事；バーナード・リース・スミス
（Bernard Rees Smith）ら、Endocrine Reviews 9巻１
号106−121頁（1989年）；及びバーナード・リース・ス
ミス及びレジナルド・ホール（Reginald Hall）、Metho
ds in Enzymology 74巻405−420頁（1981年）。TSH受容
体検定法に必要なTSH受容体は、通常、ふつうはブタか
らの、甲状腺膜の消化と洗剤抽出によって、比較的単純
な方法で得られ、使用できるものとなるが、トレーサー
として使用されるTSHは非常に高い品質要件を満たさな
ければならない。このため、TSH受容体自己抗体検定法
向けに臨床上の期待を満たすためには、放射性TSHはTSH
受容体に対する特異的結合についてのある最少値（約30
−50％の特異的結合）と、非特異的結合に対する対応的
に低い値（使用の放射性マーカーの全活性の５％まで）
をもたなければならない。この目的はこれまで、相当な
複雑さを伴うことでしか達成されなかった。こればバー
ナード・リース・スミスを著者とする上の刊行物で詳細
に説明されている。
十分な品質の放射性ヨウ素化されたTSHトレーサーを
得るためには、以下の操作が必要である。
得るためには、以下の操作が必要である。
1.ウシ下垂体からのウシTSHを複雑な方法で精製しなけ
ればならない。文献によれば、原則として、最も好まし
い場合にタンパク質mg当たり約30 IUの特異的活性が得
られる。市販の最もよいウシTSHは、メーカー（UCB社）
のデータによると、タンパク質mg当たり20 IUの特異的
活性をもっている。しかし、他のウシTSH製剤も市販さ
れており、いずれもより低い特異的活性をもっている。
ればならない。文献によれば、原則として、最も好まし
い場合にタンパク質mg当たり約30 IUの特異的活性が得
られる。市販の最もよいウシTSHは、メーカー（UCB社）
のデータによると、タンパク質mg当たり20 IUの特異的
活性をもっている。しかし、他のウシTSH製剤も市販さ
れており、いずれもより低い特異的活性をもっている。
2.放射性ヨウ素化TSHトレーサーを得るためには、この
入手できるウシTSHを125Iで標識しなければならない。
複雑であるが穏和とみられるヨウ素産生法が、この目的
に好ましく使用される。［バーナード・リース・スミ
ス、Methods n Enzymology74巻408−412頁を参照。］タ
ンパク質製剤への25−70％のヨウ素125取り入れ率が得
られる。その後のゲル濾過による遊離ヨウ素の精製又は
分離により５−10×108dpmの全収量が得られる。1mCi
（2.22×109dpm）の放射能使用量に基づいて、これはこ
の既知トレーサー産生法において22−45％の放射能収率
に相当する。しかし、放射性受容体試験で直接使用する
時は、このトレーサーはわずか約11％（BO−UB）の特異
的結合しか生じない（BO＝結合放射能の全量;UB＝非特
異的結合）。換言すれば、放射能の主要部分は、受容体
結合能力をもたないTSH誘導体や断片に結合される。こ
のような特異的結合は、実施上満足できるようなTSH受
容体自己抗体検定法を提供するには、とても十分とは言
ない。
入手できるウシTSHを125Iで標識しなければならない。
複雑であるが穏和とみられるヨウ素産生法が、この目的
に好ましく使用される。［バーナード・リース・スミ
ス、Methods n Enzymology74巻408−412頁を参照。］タ
ンパク質製剤への25−70％のヨウ素125取り入れ率が得
られる。その後のゲル濾過による遊離ヨウ素の精製又は
分離により５−10×108dpmの全収量が得られる。1mCi
（2.22×109dpm）の放射能使用量に基づいて、これはこ
の既知トレーサー産生法において22−45％の放射能収率
に相当する。しかし、放射性受容体試験で直接使用する
時は、このトレーサーはわずか約11％（BO−UB）の特異
的結合しか生じない（BO＝結合放射能の全量;UB＝非特
異的結合）。換言すれば、放射能の主要部分は、受容体
結合能力をもたないTSH誘導体や断片に結合される。こ
のような特異的結合は、実施上満足できるようなTSH受
容体自己抗体検定法を提供するには、とても十分とは言
ない。
3.これまで、専門家の議論の余地のない決った意見とし
て、125I−TSHの受容体結合分画を増加するために、ウ
シTSHの放射性ヨウ素化によって得られるトレーサー
を、更にアフィニティ精製にかけることが、この段階で
絶対的に必要である。すでに放射性ヨウ素化されたTSH
についてこの段階で実施される精製段階は、以下の工程
段階からなる。
て、125I−TSHの受容体結合分画を増加するために、ウ
シTSHの放射性ヨウ素化によって得られるトレーサー
を、更にアフィニティ精製にかけることが、この段階で
絶対的に必要である。すでに放射性ヨウ素化されたTSH
についてこの段階で実施される精製段階は、以下の工程
段階からなる。
ａ） ブタから精製された甲状腺膜を調製する（バーナ
ード・リース・スミス、Methods in Enzymologyを参
照）。
ード・リース・スミス、Methods in Enzymologyを参
照）。
ｂ） 上で得られるトレーサーを膜ホモジネートと一緒
に培養する。十分な受容体結合能力をもったトレーサー
が膜ホモジネートに結合される。
に培養する。十分な受容体結合能力をもったトレーサー
が膜ホモジネートに結合される。
ｃ） 膜に結合されたトレーサーを含有するペレットを
得るために、37℃で15分培養し、続いて17,000gで15分
の遠心分離にかける。
得るために、37℃で15分培養し、続いて17,000gで15分
の遠心分離にかける。
ｄ） 上澄み液を除去後、2M濃度で塩化ナトリウムを含
有する緩衝液中に於てこのペレットを再ホモジナイズ
し、それによって精製に使用された受容体へのTSHトレ
ーサーの結合を排除する。
有する緩衝液中に於てこのペレットを再ホモジナイズ
し、それによって精製に使用された受容体へのTSHトレ
ーサーの結合を排除する。
ｅ） 100,000gで２時間の遠心分離にかけると、精製さ
れた放射性ヨウ素化TSHトレーサーが上澄み液中に見出
される。
れた放射性ヨウ素化TSHトレーサーが上澄み液中に見出
される。
最終段階は脱食塩カラムに通してトレーサー溶液から
塩化ナトリウムを除去することである。
塩化ナトリウムを除去することである。
この極端に不都合な方法の収率は５％であり、これ
は、1.1〜2.2％の範囲の全放射能収率となる。TSH受容
体自己抗体検定法に使用されるとき、この方法で精製さ
れたトレーサーは全使用活性の約45％の特異的結合値を
与え、これは自己抗体検定に十分である。しかし、放射
性ヨウ素化TSHトレーサーの調製に使用される方法の複
雑さは、相当な材料損失と低い放射能収率をもたらし、
これはコストを高めるだけでなく、労力と環境上の理由
からも不利であり、検定法に使用できるトレーサー量
と、測定精度や測定時間に関しても経済的な限界を設け
ることになる。
は、1.1〜2.2％の範囲の全放射能収率となる。TSH受容
体自己抗体検定法に使用されるとき、この方法で精製さ
れたトレーサーは全使用活性の約45％の特異的結合値を
与え、これは自己抗体検定に十分である。しかし、放射
性ヨウ素化TSHトレーサーの調製に使用される方法の複
雑さは、相当な材料損失と低い放射能収率をもたらし、
これはコストを高めるだけでなく、労力と環境上の理由
からも不利であり、検定法に使用できるトレーサー量
と、測定精度や測定時間に関しても経済的な限界を設け
ることになる。
Endocrinology 116巻４号1379及び1382頁（1985年）
とそこに引用されている文献は、粗製ウシTSHの精製法
を記載している。極めて高い生物活性をもった非常に純
粋なTSHが、この文献に記載された逆相HPLC（RPLC）ク
ロマトグラフィ法によって得られることが報告されてい
る。しかし、上記の文献中に記載されている精製法を繰
り返すと、上記の文献に従って、クロマトグラフィの溶
離に応じて非常に純粋なタンパク質分画が得られるけれ
ども、下記の検定法によれば、これらの分画は少なくと
もTSH受容体検定法に記載されたブタTSH受容体に関して
は、その受容体結合能力を失っていること、従って高い
生物学的活性をもったTSHトレーサーの調製に使用でき
ないこともわかった。
とそこに引用されている文献は、粗製ウシTSHの精製法
を記載している。極めて高い生物活性をもった非常に純
粋なTSHが、この文献に記載された逆相HPLC（RPLC）ク
ロマトグラフィ法によって得られることが報告されてい
る。しかし、上記の文献中に記載されている精製法を繰
り返すと、上記の文献に従って、クロマトグラフィの溶
離に応じて非常に純粋なタンパク質分画が得られるけれ
ども、下記の検定法によれば、これらの分画は少なくと
もTSH受容体検定法に記載されたブタTSH受容体に関して
は、その受容体結合能力を失っていること、従って高い
生物学的活性をもったTSHトレーサーの調製に使用でき
ないこともわかった。
更に、Endocrinology 1988、Vol.122,No.1、319〜324
頁は、単一段階で、粗製ウシTSHを、抗TSHセファロース
上のアフィニティークロマトグラフィによって均質近く
に精製する方法を記載している。アフィニティー精製さ
れた生成物の純度を示す為に、競争的RIAによるTSH抗原
に対する異なる分画を検定することを含む、HPLC陽イオ
ン交換クロマトグラフィ、及び放射性ヨウ素化された生
成物のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動が実施され
た。生物活性は、FRTL5細胞（クローン化ラット甲状腺
細胞系）のの［H3］チミジン取込みを測定することによ
って決定した。しかし、発明者等は、アフィニティー精
製TSH調製物の放射性ヨウ素化は、ブタTSH受容体へのた
った約9.7％の特異的結合を有する生成物を導き、従っ
て先行技術の記載に従う放射性ヨウ素化生成物を精製す
る段階は、上記の通り必要であるようである。
頁は、単一段階で、粗製ウシTSHを、抗TSHセファロース
上のアフィニティークロマトグラフィによって均質近く
に精製する方法を記載している。アフィニティー精製さ
れた生成物の純度を示す為に、競争的RIAによるTSH抗原
に対する異なる分画を検定することを含む、HPLC陽イオ
ン交換クロマトグラフィ、及び放射性ヨウ素化された生
成物のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動が実施され
た。生物活性は、FRTL5細胞（クローン化ラット甲状腺
細胞系）のの［H3］チミジン取込みを測定することによ
って決定した。しかし、発明者等は、アフィニティー精
製TSH調製物の放射性ヨウ素化は、ブタTSH受容体へのた
った約9.7％の特異的結合を有する生成物を導き、従っ
て先行技術の記載に従う放射性ヨウ素化生成物を精製す
る段階は、上記の通り必要であるようである。
従って、本発明に至る研究を始めたとき、解決すべき
問題は、今日まで専門家の間で必須とみなされている放
射性ヨウ素化TSHトレーサーの複雑な調製に代わるもの
を見つけることであり、この代替法で材料損失をより少
なくし、放射能収率を高め、より簡単で、もっと信頼で
きる形でトレーサーの調製を可能にすることであった。
問題は、今日まで専門家の間で必須とみなされている放
射性ヨウ素化TSHトレーサーの複雑な調製に代わるもの
を見つけることであり、この代替法で材料損失をより少
なくし、放射能収率を高め、より簡単で、もっと信頼で
きる形でトレーサーの調製を可能にすることであった。
驚いたことに、下記の検定法において特異的受容体結
合活性として測定されるその生物活性が改良されてお
り、トレーサーとして直接使用できる直接の放射性ヨウ
素化による放射性ヨウ素化された高活性のTSHトレーサ
ーを生ずる点で今日までに知られたTSH製剤とは区別さ
れる新しいTSH製剤が提供されるならば、この問題がす
ぐに解決できることがわかった。
合活性として測定されるその生物活性が改良されてお
り、トレーサーとして直接使用できる直接の放射性ヨウ
素化による放射性ヨウ素化された高活性のTSHトレーサ
ーを生ずる点で今日までに知られたTSH製剤とは区別さ
れる新しいTSH製剤が提供されるならば、この問題がす
ぐに解決できることがわかった。
本発明の第一の面によれば、粗製ウシTSHの精製によ
って得られる本発明が提供しているTSH製剤は、市販の
最良のTSH製剤に比べて２倍よりもっと改良された生物
活性をもち、またその組成、例えば実際の生物学活性TS
Hの伴っている物質に関しては、既知方法による直接の
放射性ヨウ素化が活性の有害な損失なしに可能である純
度をもっている。
って得られる本発明が提供しているTSH製剤は、市販の
最良のTSH製剤に比べて２倍よりもっと改良された生物
活性をもち、またその組成、例えば実際の生物学活性TS
Hの伴っている物質に関しては、既知方法による直接の
放射性ヨウ素化が活性の有害な損失なしに可能である純
度をもっている。
本発明のもう一つの面は、それ以上精製せずにTSH放
射性受容体自己抗体検定に上記放射性ヨウ素化されたTS
Hトレーサーを使用することに関する。
射性受容体自己抗体検定に上記放射性ヨウ素化されたTS
Hトレーサーを使用することに関する。
更に本発明の一つの面に従って、この新規な高品質放
射性ヨウ素化TSHトレーサーは、それ自体は知られてい
る原理に従ってTSH受容体自己抗体検定法に使用される
時に、高められたトレーサー放射能のために、検定時間
の相当な減少が可能である検定法の提供を可能としてい
る。
射性ヨウ素化TSHトレーサーは、それ自体は知られてい
る原理に従ってTSH受容体自己抗体検定法に使用される
時に、高められたトレーサー放射能のために、検定時間
の相当な減少が可能である検定法の提供を可能としてい
る。
先行技術の問題を解決する本発明のこれらの種々の面
は、放射性ヨウ素化TSHトレーサーの新規製法に関す
る、法請求項１〜９項、及びTSH受容体自己抗体の測定
用のTSH放射性受容体検定のTSHトレーサーの用途に関す
る。用途請求項10〜11項によりカバーされる。
は、放射性ヨウ素化TSHトレーサーの新規製法に関す
る、法請求項１〜９項、及びTSH受容体自己抗体の測定
用のTSH放射性受容体検定のTSHトレーサーの用途に関す
る。用途請求項10〜11項によりカバーされる。
本出願において特許請求され説明されている本発明の
更に有利な態様と主題は、下に述べる説明と態様から当
業者に明らかである。
更に有利な態様と主題は、下に述べる説明と態様から当
業者に明らかである。
本発明は、慣用法で得られる粗製（天然）TSH製剤を
なおも精製にかけると、先行技術とは異なって、受容体
結合能力として現われるTSH製剤の生物活性の相当な増
加をもたらしうるという驚くべき発見に基づいている。
この増加は、市販の最良の製剤と比べて２倍を越えるも
のであり、低生物活性をもった市販製剤と比べると非常
に高い係数の増加である。また、その後の標識化反応に
干渉する物質の生物を伴っていない。
なおも精製にかけると、先行技術とは異なって、受容体
結合能力として現われるTSH製剤の生物活性の相当な増
加をもたらしうるという驚くべき発見に基づいている。
この増加は、市販の最良の製剤と比べて２倍を越えるも
のであり、低生物活性をもった市販製剤と比べると非常
に高い係数の増加である。また、その後の標識化反応に
干渉する物質の生物を伴っていない。
トレーサーを得るために、標識と結合させることによ
る更なる加工の前、特に放射性ヨウ素化の前に、TSH製
剤を精製し、その活性を高めることにより、これまで文
献中で必要と記載された、アフィニティ・クロマトグラ
フィによる標識つきTSH製剤の複雑な精製を必要とせず
に、TSH受容体への高い特異的結合を示すとともに、高
い放射能収率をもった製剤を得ることが、直接の標識化
によって可能である。
る更なる加工の前、特に放射性ヨウ素化の前に、TSH製
剤を精製し、その活性を高めることにより、これまで文
献中で必要と記載された、アフィニティ・クロマトグラ
フィによる標識つきTSH製剤の複雑な精製を必要とせず
に、TSH受容体への高い特異的結合を示すとともに、高
い放射能収率をもった製剤を得ることが、直接の標識化
によって可能である。
本発明によって得られる結合放射能の値は、良好な受
容体結合能力との組み合わせにより、統計的に関連性の
ある結果にとって必要な測定値が既知のすべての商業的
方法よりもはるかに短い時間で得られるやりかたで、TS
H自己抗体測定用の既知TSH受容体検定法を変更すること
を、原理的に可能とした。
容体結合能力との組み合わせにより、統計的に関連性の
ある結果にとって必要な測定値が既知のすべての商業的
方法よりもはるかに短い時間で得られるやりかたで、TS
H自己抗体測定用の既知TSH受容体検定法を変更すること
を、原理的に可能とした。
本発明は、先行技術に比べて約40倍高い放射能収率を
もったトレーサーとして適しており、標識化反応中に取
り入れられなかった放射性ヨウ素の分離後、TSH放射性
受容体試験にトレーサーとして直接に使用でき、また複
雑な手順で精製された既知の放射性ヨウ素化TSHトレー
サーに比肩するか又はそれより優れてさえいる受容体結
合能力をもっている、放射性ヨウ素化されたウシTSHを
得ることを可能とした。
もったトレーサーとして適しており、標識化反応中に取
り入れられなかった放射性ヨウ素の分離後、TSH放射性
受容体試験にトレーサーとして直接に使用でき、また複
雑な手順で精製された既知の放射性ヨウ素化TSHトレー
サーに比肩するか又はそれより優れてさえいる受容体結
合能力をもっている、放射性ヨウ素化されたウシTSHを
得ることを可能とした。
粗製ウシTSHの精製によって得られる本発明によるTSH
製剤は、タンパク質mg当たり約40 IU TSHを越える生物
活性を特徴とするが、典型的にはタンパク質mg当たり約
55 IU TSHの生物活性を特徴とする。
製剤は、タンパク質mg当たり約40 IU TSHを越える生物
活性を特徴とするが、典型的にはタンパク質mg当たり約
55 IU TSHの生物活性を特徴とする。
本発明によるTSH製剤の生物活性は、下の方法によっ
て測定され、また生物活性について記載の値は既知の商
業的生成物の対応する値と直接比べることが可能であ
る。というのは、下に定義された、国際単位（IU）の設
定に有効な基準が、標準物質として使用されているから
である。
て測定され、また生物活性について記載の値は既知の商
業的生成物の対応する値と直接比べることが可能であ
る。というのは、下に定義された、国際単位（IU）の設
定に有効な基準が、標準物質として使用されているから
である。
ウシTSHの特異的受容体結合活性（生物活性）の測定 本説明と特許請求の範囲では、生物活性は下記の測定
で得られた値で記載されている。
で得られた値で記載されている。
生物活性は、ヘニング・ベルリン社から市販されてい
るTRAK−AssayRによって測定される。この試験で、125
ヨウ素で標識されたウシTSHはブタTSH受容体に結合す
る。
るTRAK−AssayRによって測定される。この試験で、125
ヨウ素で標識されたウシTSHはブタTSH受容体に結合す
る。
生物活性を測定しようとする対象のTSH製剤は、この
検定法で試料として使用され、試験で使用されるTSH受
容体の結合位置に対して、トレーサーとして使用される
125I−標識つきウシTSHと競争する。各場合に検査され
るTSH製剤のタンパク質濃度を考慮して、高い特異的受
容体結合活性をもったTSH製剤は、標識つきTSHトレーサ
ーの結合量又は結合放射能が低すぎる結果になる。
検定法で試料として使用され、試験で使用されるTSH受
容体の結合位置に対して、トレーサーとして使用される
125I−標識つきウシTSHと競争する。各場合に検査され
るTSH製剤のタンパク質濃度を考慮して、高い特異的受
容体結合活性をもったTSH製剤は、標識つきTSHトレーサ
ーの結合量又は結合放射能が低すぎる結果になる。
国際基準を使用するか、又はタンパク質mg当たりのIU
TSHでの生物活性が知られているTSH製剤を使用して、
未知のTSH製剤の生物活性をこの方法で決定できる。本
発明による製剤は、タンパク質mg当たり40 IU TSH以
上、及び典型的にはタンパク質mg当たり約55 IU TSHの
生物活性によって区別される。
TSHでの生物活性が知られているTSH製剤を使用して、
未知のTSH製剤の生物活性をこの方法で決定できる。本
発明による製剤は、タンパク質mg当たり40 IU TSH以
上、及び典型的にはタンパク質mg当たり約55 IU TSHの
生物活性によって区別される。
生物活性の測定に使用される市販のTRAK−AssayRは、
成分として125I−標識つきウシTSHとブタTSH受容体をも
ち、両成分の調製は、最初に述べた、そしてバーナード
・リース・スミス及びホール（Meth.Enzym.74巻405−42
0頁、1981年）によって前掲文献中に記載されている先
行技術に従って実施される。
成分として125I−標識つきウシTSHとブタTSH受容体をも
ち、両成分の調製は、最初に述べた、そしてバーナード
・リース・スミス及びホール（Meth.Enzym.74巻405−42
0頁、1981年）によって前掲文献中に記載されている先
行技術に従って実施される。
既知検定法の試験原理は以下のように要約される。
ウシTSHをウシ下垂体から既知の方法で抽出し、クロ
マトグラフィ法で濃縮し、125ヨウ素で標識し、最後に
ブタTSH受容体でのアフィニティ精製にかけると、トレ
ーサーが得られる。ブタTSH受容体の調製には、ウシ甲
状腺を洗剤なしの緩衝液中でホモジナイズする。遠心分
離を行ない、水溶性タンパク質を伴った上澄み液を捨
て、生ずるペレットを洗剤含有緩衝液（膜タンパク質は
可溶化される）で再ホモジナイズし、この後２度めの遠
心分離を行ない、生ずる上澄み液が試験に使用されるTS
H受容体製剤である。
マトグラフィ法で濃縮し、125ヨウ素で標識し、最後に
ブタTSH受容体でのアフィニティ精製にかけると、トレ
ーサーが得られる。ブタTSH受容体の調製には、ウシ甲
状腺を洗剤なしの緩衝液中でホモジナイズする。遠心分
離を行ない、水溶性タンパク質を伴った上澄み液を捨
て、生ずるペレットを洗剤含有緩衝液（膜タンパク質は
可溶化される）で再ホモジナイズし、この後２度めの遠
心分離を行ない、生ずる上澄み液が試験に使用されるTS
H受容体製剤である。
TRAK−AssayRは、メーカーのヘニング・ベルリン社に
よって試験とともに提供された作業指針のとおりに、以
下の段階に従って実施される。
よって試験とともに提供された作業指針のとおりに、以
下の段階に従って実施される。
1. 50μｌの試料又は標準（それぞれ測定しようとする
TSH製剤又は既知の生成活性及び濃度をもったTSH製剤）
をピペットで取る。
TSH製剤又は既知の生成活性及び濃度をもったTSH製剤）
をピペットで取る。
2. 50μｌの受容体をピペットで取る。
3. 室温で15分培養する。
4. トレーサー（測定当たり約12,500dpm）として、125
Iで標識されたウシTSH100μｌをピペットで取る。
Iで標識されたウシTSH100μｌをピペットで取る。
5. 温で２時間培養する。
6. 氷冷PEG用溶液（ポリエチレングリコール6000、18
％）2mlをピペットで取る。
％）2mlをピペットで取る。
7. 2000g、20分の遠心分離にかける。
8. 生ずる上澄み液を傾斜させる。
9. 残った堆積物中の放射能を測定する。
試験しようとするTSH製剤の受容体結合活性を測定す
るには、製剤は異なる希釈度で測定される。試験しよう
とする製剤のタンパク質濃度の測定は、既知方法でピア
ース社からのBCA法によって実施される。較正は、標準
材料「チロトロピン国際標準、ウシ、コード53/1、国立
生物標準・対照研究所、英国」による上の測定系の標準
化によって行なった。
るには、製剤は異なる希釈度で測定される。試験しよう
とする製剤のタンパク質濃度の測定は、既知方法でピア
ース社からのBCA法によって実施される。較正は、標準
材料「チロトロピン国際標準、ウシ、コード53/1、国立
生物標準・対照研究所、英国」による上の測定系の標準
化によって行なった。
種々のTSH製剤について、以下の値が測定された。
本発明に従って、相当に改良された生物活性をもった
TSH製剤は、このように得られる。生物活性の尺度とし
ての役目をもつ受容体結合能力は、極めて敏感な生成物
の性質であって、その性質を生成物のクロマトグラフィ
的な均質性と混同してはならないこと、及び同時にその
性質は、例えば抗体結合能力よりはるかに敏感な尺度を
表わしていることをここで指摘すべきである。
TSH製剤は、このように得られる。生物活性の尺度とし
ての役目をもつ受容体結合能力は、極めて敏感な生成物
の性質であって、その性質を生成物のクロマトグラフィ
的な均質性と混同してはならないこと、及び同時にその
性質は、例えば抗体結合能力よりはるかに敏感な尺度を
表わしていることをここで指摘すべきである。
本発明によるTSH製剤は、慣用法で得られる任意のTSH
製剤又は任意の市販の粗製ウシTSH製剤を、始めに抗TSH
抗体カラム上でのアフィニティ・クロマトグラフィによ
る穏和な精製にかけ、次に弱酸性陽イオン交換装置での
イオン交換クロマトグラフィにかけることによって得ら
れ、全操作は室温より低温で行なわれ、操作中の不要な
待ち時間を回避できる。
製剤又は任意の市販の粗製ウシTSH製剤を、始めに抗TSH
抗体カラム上でのアフィニティ・クロマトグラフィによ
る穏和な精製にかけ、次に弱酸性陽イオン交換装置での
イオン交換クロマトグラフィにかけることによって得ら
れ、全操作は室温より低温で行なわれ、操作中の不要な
待ち時間を回避できる。
本発明による放射性ヨウ素化TSHトレーサーの製法
は、具体例を参照して下に詳細に記載されている。
は、具体例を参照して下に詳細に記載されている。
粗製ウシTSHから得られ、改良された生物活性をもったT
SH製剤の調製 1.アフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシTSH
精製用の抗TSHアフィニティ・カラムの製造。
SH製剤の調製 1.アフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシTSH
精製用の抗TSHアフィニティ・カラムの製造。
製造は、ピアース社（イリノイ州ロックフォード）か
らの「カーボリンクＲ」マニュアル中の指示に従って実
施し、そのタンパク質結合ゲルを使用した。
らの「カーボリンクＲ」マニュアル中の指示に従って実
施し、そのタンパク質結合ゲルを使用した。
（ａ） 酸化された抗TSH抗体をつくるために、モノク
ローナル抗TSH抗体5405（ロット番号SP005、オイ・メデ
ィックス・バイオケミカ社、フィンランド国カウニアイ
ネンから入手）25mgと0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.0）25mlに、室温で過ヨウ素酸ナトリウム100mgを加
え、溶液が完全に透明になるまで混合を続けた。次に、
室温で30分の培養を行なった。
ローナル抗TSH抗体5405（ロット番号SP005、オイ・メデ
ィックス・バイオケミカ社、フィンランド国カウニアイ
ネンから入手）25mgと0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.0）25mlに、室温で過ヨウ素酸ナトリウム100mgを加
え、溶液が完全に透明になるまで混合を続けた。次に、
室温で30分の培養を行なった。
抗TSH抗体5405はhTSH（又はhTSHのβサブユニット）
に対して特異的であり、hTSHのモル当たり５×1091のア
フィニティ定数をもっている。これは生体外で調製さ
れ、0.1％のNaN3含有量をもったNaClg当たり0.15molの
アフィニティ精製されたIg分画（タンパク質濃度1.02mg
/ml）として販売されている。ウシTSHの精製へのその使
用は、メーカーにより記載された可能な用途に入ってい
ない。
に対して特異的であり、hTSHのモル当たり５×1091のア
フィニティ定数をもっている。これは生体外で調製さ
れ、0.1％のNaN3含有量をもったNaClg当たり0.15molの
アフィニティ精製されたIg分画（タンパク質濃度1.02mg
/ml）として販売されている。ウシTSHの精製へのその使
用は、メーカーにより記載された可能な用途に入ってい
ない。
上記の抗体の代わりに、他の抗TSH抗体を使用するこ
とも可能であり、その妥当性は、ここに述べたアフィニ
ティ精製によって粗製ウシTSHを精製する能力に基づい
て比較的簡単に測定できる。
とも可能であり、その妥当性は、ここに述べたアフィニ
ティ精製によって粗製ウシTSHを精製する能力に基づい
て比較的簡単に測定できる。
（ｂ） 段階ａ）で得られる酸化ずみ抗体を、脱塩カラ
ム［ファーマシア社（スエーデン国ウプサラ）からのNA
P−25］によって、低分子量成分から分離する。使用の
脱塩緩衝液は0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.5）である。
ム［ファーマシア社（スエーデン国ウプサラ）からのNA
P−25］によって、低分子量成分から分離する。使用の
脱塩緩衝液は0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.5）である。
（ｃ） 脱塩後、抗体（40ml）を0.1Mリン酸ナトリウム
（pH7.0）中で前もって洗ったカーボリンクゲルと混合
し、穏やかに振とうしながら、４℃で20時間培養する。
（pH7.0）中で前もって洗ったカーボリンクゲルと混合
し、穏やかに振とうしながら、４℃で20時間培養する。
（ｄ） 次に、カラム材料をガラス製カラム（バイオラ
ド社、１×20cm）に移し、0.1MグリシンHCl緩衝液（pH
2.8）100mlで洗い、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）中で平
衡化させる。
ド社、１×20cm）に移し、0.1MグリシンHCl緩衝液（pH
2.8）100mlで洗い、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）中で平
衡化させる。
2.アフィニティ・クロマトグラフィによる粗製ウシTSH
の精製 粗製ウシTSH（シクマ社、アーマー社、カルバイオケ
ム社、及びフルカ社から入手）の種々の試料［20mNリン
酸ナトリウム（pH7.0）5ml中50 IU］を、上のように調
製された抗TSHアフィニティ・カラム中に４℃で滲出さ
せ、30分培養する。次に、20mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）（流量1.5ml/分、全量180mL）でカラムを洗
い、このあと50mMグリシンHCl緩衝液（pH2.8）による接
合ペプチドの溶離を1.5ml/分、４℃で実施する。カラム
流出液は、280nmでの光学密度を測定するために、継続
的に流量測定し、溶離タンパク質を回収する（最終容量
6ml）。所望のタンパク質を含有する溶液を直ちに水で
1:2に希釈し、続いてイオン交換クロマトグラフィに使
用する。
の精製 粗製ウシTSH（シクマ社、アーマー社、カルバイオケ
ム社、及びフルカ社から入手）の種々の試料［20mNリン
酸ナトリウム（pH7.0）5ml中50 IU］を、上のように調
製された抗TSHアフィニティ・カラム中に４℃で滲出さ
せ、30分培養する。次に、20mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）（流量1.5ml/分、全量180mL）でカラムを洗
い、このあと50mMグリシンHCl緩衝液（pH2.8）による接
合ペプチドの溶離を1.5ml/分、４℃で実施する。カラム
流出液は、280nmでの光学密度を測定するために、継続
的に流量測定し、溶離タンパク質を回収する（最終容量
6ml）。所望のタンパク質を含有する溶液を直ちに水で
1:2に希釈し、続いてイオン交換クロマトグラフィに使
用する。
上記のアフィニティ・クロマトグラフィ精製中に行な
った検査は、上記の条件下に（pH7.0）、ウシTSHがカラ
ム材料に完全に結合されることを示した。未結合物質が
ないようにカラムを洗浄後、酸性緩衝液での溶離によっ
て約80％の収率でこれを脱着する。本発明による結果
は、非常に異なる特異的活性をもった種々の粗製TSH製
剤（シグマ社の粗製TSH、特異的活性1.8IU/mg; カルバイオケム社、アーマー社、及びフルカ社からの
同様な製剤；及び新しく直接調製されたウシ下垂体抽出
物）を使用して得られた。
った検査は、上記の条件下に（pH7.0）、ウシTSHがカラ
ム材料に完全に結合されることを示した。未結合物質が
ないようにカラムを洗浄後、酸性緩衝液での溶離によっ
て約80％の収率でこれを脱着する。本発明による結果
は、非常に異なる特異的活性をもった種々の粗製TSH製
剤（シグマ社の粗製TSH、特異的活性1.8IU/mg; カルバイオケム社、アーマー社、及びフルカ社からの
同様な製剤；及び新しく直接調製されたウシ下垂体抽出
物）を使用して得られた。
従って、任意の汚染された製剤を、ウシTSHの迅速効
果的な精製に使用できる。
果的な精製に使用できる。
3.弱酸性陽イオン交換樹脂でのイオン交換クロマトグラ
フィ アフィニティ・クロマトグラフィでの精製で得られ２
倍の容量に希釈したTSH製剤を、４℃、毎分0.8mlの流量
で直接にカラムに適用する。カラムは10mM酢酸アンモニ
ウム（pH4.5）で平衡化され、弱酸性陽イオン交換樹脂
（ユーラミッドWCEX、末端カルボキシル基をもち、ポリ
アミド被覆されたシリカゲル基盤のもの）を含有してい
る。適用後、10mM酢酸アンモニウム（pH4.5）から1M酢
酸アンモニウム（pH4.5）への直線勾配で、毎分0.8mlで
30分間にペプチドを溶離する。280nmでのUV吸光度のた
めに、カラム流量を継続的に測定する。ウシTSHは約19
分後に溶離し、固体二酸化炭素で冷却されたガラス容器
にこれを直接集める。TSHの凍結乾燥後、物質を20mMリ
ン酸塩（pH7.0）でもどすと、使用できるものとなり、
125ヨウ素で標識を付けることができる。
フィ アフィニティ・クロマトグラフィでの精製で得られ２
倍の容量に希釈したTSH製剤を、４℃、毎分0.8mlの流量
で直接にカラムに適用する。カラムは10mM酢酸アンモニ
ウム（pH4.5）で平衡化され、弱酸性陽イオン交換樹脂
（ユーラミッドWCEX、末端カルボキシル基をもち、ポリ
アミド被覆されたシリカゲル基盤のもの）を含有してい
る。適用後、10mM酢酸アンモニウム（pH4.5）から1M酢
酸アンモニウム（pH4.5）への直線勾配で、毎分0.8mlで
30分間にペプチドを溶離する。280nmでのUV吸光度のた
めに、カラム流量を継続的に測定する。ウシTSHは約19
分後に溶離し、固体二酸化炭素で冷却されたガラス容器
にこれを直接集める。TSHの凍結乾燥後、物質を20mMリ
ン酸塩（pH7.0）でもどすと、使用できるものとなり、
125ヨウ素で標識を付けることができる。
イオン交換クロマトグラフィでは、無傷のTSHはその
サブユニットに分解されたTSHから分離される。これは
本発明による条件下に迅速、効果的に、高収率で実施で
きる。本発明による精製TSHは、溶液で、又は凍結乾燥
後、乾燥型で直接に得られ、その生物活性（特異的受容
体結合能力）はタンパク質mg当たり約55 IU TSHであ
る。
サブユニットに分解されたTSHから分離される。これは
本発明による条件下に迅速、効果的に、高収率で実施で
きる。本発明による精製TSHは、溶液で、又は凍結乾燥
後、乾燥型で直接に得られ、その生物活性（特異的受容
体結合能力）はタンパク質mg当たり約55 IU TSHであ
る。
4.本発明によるTSH製剤の放射性ヨウ素化 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）100μｌ中の上
で得られた本発明によるTSH製剤24μｇを、125ヨウ素
（アマーシャム）2.5mCi（25μｌ）と混合し、クロラミ
ンT3μｇ（水20μｌ中）を加えて反応を開始させる。30
秒培養後、反応混合物はウォータース（米国、ミリポア
・コーポレーション）からのタンパク質Pak−125カラム
［移動相:300mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.1％ラブ
ロール（シグマ社）、流量0.5ml/分］上で直接に分離さ
れる。放射能用にカラム流出量を継続的に測定する。放
射性ヨウ素化ウシTSHは、17.5分の溶離時間で溶離され
る。
で得られた本発明によるTSH製剤24μｇを、125ヨウ素
（アマーシャム）2.5mCi（25μｌ）と混合し、クロラミ
ンT3μｇ（水20μｌ中）を加えて反応を開始させる。30
秒培養後、反応混合物はウォータース（米国、ミリポア
・コーポレーション）からのタンパク質Pak−125カラム
［移動相:300mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.1％ラブ
ロール（シグマ社）、流量0.5ml/分］上で直接に分離さ
れる。放射能用にカラム流出量を継続的に測定する。放
射性ヨウ素化ウシTSHは、17.5分の溶離時間で溶離され
る。
放射性ヨウ素化の収率は極めて高い。放射性ヨウ素化
に使用される125ヨウ素2.5mCiのうち、1.0〜1.25mCiが
生成物中に存在し、これをいつまでも使えるトレーサー
として直接に使用できる。このように、使用放射能の約
50％が単離されたトレーサーに含まれている。
に使用される125ヨウ素2.5mCiのうち、1.0〜1.25mCiが
生成物中に存在し、これをいつまでも使えるトレーサー
として直接に使用できる。このように、使用放射能の約
50％が単離されたトレーサーに含まれている。
上記のクロラミンＴ法による放射性ヨウ素化の代わり
に、他の既知の方法、例えばヨウ素発生法（iodogenicm
ethod）を用いても、放射性ヨウ素化を行なうことがで
きる。しかし、実験的に簡単なクロラミンＴ法によっ
て、有害な活性損失なしに放射性ヨウ素化を行なえるこ
とは、相当な実際的な利点をなしており、本発明による
TSH製剤の純度を反映している。
に、他の既知の方法、例えばヨウ素発生法（iodogenicm
ethod）を用いても、放射性ヨウ素化を行なうことがで
きる。しかし、実験的に簡単なクロラミンＴ法によっ
て、有害な活性損失なしに放射性ヨウ素化を行なえるこ
とは、相当な実際的な利点をなしており、本発明による
TSH製剤の純度を反映している。
5.TSH受容体自己抗体検定法での放射性ヨウ素化TSHトレ
ーサーの使用 単離された放射性ヨウ素化ウシTSHを、10mMトリス−H
Cl緩衝液（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、及び0.1％ウ
シ血清アルブミン中で、所望の全最終合計活性まで希釈
し、TSH受容体検定法にトレーサーとして直接使用す
る。
ーサーの使用 単離された放射性ヨウ素化ウシTSHを、10mMトリス−H
Cl緩衝液（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、及び0.1％ウ
シ血清アルブミン中で、所望の全最終合計活性まで希釈
し、TSH受容体検定法にトレーサーとして直接使用す
る。
冒頭に引用された刊行物中での今日までの一致した意
見とは反対に、本発明によって得られるトレーサーが、
アフィニティ・クロマトグラフィによるその後の精製な
しにでも、必要な受容体結合能力をもち、複雑な慣用法
で調製されてからアフィニティ・クロマトグラフィで精
製されたトレーサーより優れてはいないとしても、定性
的に比肩しうるものであることが、驚異的に発見された
（表１を参照）。
見とは反対に、本発明によって得られるトレーサーが、
アフィニティ・クロマトグラフィによるその後の精製な
しにでも、必要な受容体結合能力をもち、複雑な慣用法
で調製されてからアフィニティ・クロマトグラフィで精
製されたトレーサーより優れてはいないとしても、定性
的に比肩しうるものであることが、驚異的に発見された
（表１を参照）。
本発明方法の高収率のため、プロセス技術による重大
な欠陥及び今日まで使用されたトレーサーの調製とその
製法に関する重大な欠陥を相殺することができる。
な欠陥及び今日まで使用されたトレーサーの調製とその
製法に関する重大な欠陥を相殺することができる。
すなわち、慣用の放射性ヨウ素化TSHトレーサーの劣
った収率と高価格のため、TSH受容体自己抗体検定法の
知られた全製造業者（本発明の出願人や、Byk Sangtec
社、バイオコード社、及びクロナス社を除く）は、低い
全放射能（10,000−15,000dpm）で操作せざるをえな
い。これためユーザーは、TSH受容体に対する自己抗体
の測定において、好ましくないほどの長い計測時間をか
けることになる（全製造業者は試料当たり５分の程度の
計測時間を特定している）。
った収率と高価格のため、TSH受容体自己抗体検定法の
知られた全製造業者（本発明の出願人や、Byk Sangtec
社、バイオコード社、及びクロナス社を除く）は、低い
全放射能（10,000−15,000dpm）で操作せざるをえな
い。これためユーザーは、TSH受容体に対する自己抗体
の測定において、好ましくないほどの長い計測時間をか
けることになる（全製造業者は試料当たり５分の程度の
計測時間を特定している）。
本発明の第一段階で得られるTSH製剤の高い生物活性
（受容体結合能力）と純度のため、特異的受容体結合能
力の不利な低下なしに、また十分な生物活性をもった生
成物を得るために、アフィニティ・クロマトグラフィに
よって更に精製する必要なしに、この製剤を直接に放射
性ヨウ素化できる。本発明方法では、放射性ヨウ素化TS
Hトレーサーを多量でも問題なく調製でき、TSH受容体自
己抗体検定法で実質的に多量の放射能の使用が可能とな
り、従ってユーザーにとって、もっと短い計数時間が得
られる。
（受容体結合能力）と純度のため、特異的受容体結合能
力の不利な低下なしに、また十分な生物活性をもった生
成物を得るために、アフィニティ・クロマトグラフィに
よって更に精製する必要なしに、この製剤を直接に放射
性ヨウ素化できる。本発明方法では、放射性ヨウ素化TS
Hトレーサーを多量でも問題なく調製でき、TSH受容体自
己抗体検定法で実質的に多量の放射能の使用が可能とな
り、従ってユーザーにとって、もっと短い計数時間が得
られる。
表２は種々の面で本発明と先行技術との間の相違をま
とたものである。
とたものである。
これまで知られた粗製ウシTSH製剤を比較的簡単な方
法で精製して、市販の全TSH製剤に比べて相当に改良さ
れた生物活性（受容体結合能力）をもったTSH製剤を回
収できることは、先行技術では知られておらず、また更
に任意のTSH製剤の直接的放射性ヨウ素化によって、TSH
放射性受容体検定法での使用に必要な高い特異的結合性
を、高い放射能収率とともにもつ放射性ヨウ素化TSHが
得られることも、先行技術から知られていないため、本
発明は相当に驚異的な技術の進歩をなすものである。
法で精製して、市販の全TSH製剤に比べて相当に改良さ
れた生物活性（受容体結合能力）をもったTSH製剤を回
収できることは、先行技術では知られておらず、また更
に任意のTSH製剤の直接的放射性ヨウ素化によって、TSH
放射性受容体検定法での使用に必要な高い特異的結合性
を、高い放射能収率とともにもつ放射性ヨウ素化TSHが
得られることも、先行技術から知られていないため、本
発明は相当に驚異的な技術の進歩をなすものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/564 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｃ (56)参考文献 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ ｌ．122，Ｎｏ．１（1988） ｐ．319− 324 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/534 G01N 33/53
Claims (8)
- 【請求項１】以下の段階（ｉ）〜（iv） （ｉ） 抗TSH抗体アフィニティゲル上で粗製のウシTSH
を処理し、中間精製TSH調製物の溶出液を回収し； （ii） 段階（ｉ）からの該中間精製されたTSH調製物
を、弱酸性陽イオン交換樹脂上のイオン交換クロマトグ
ラフィによって処理し； （iii） 段階（ii）の溶出液のうち、280nmで吸光する
分画を回収し；そして （iv） 段階（iii）から得られる溶出液分画を凍結乾
燥する； を含む方法によって、後でアフィニティークロマトグラ
フィーで直接放射性ヨウ素化TSH調製物を更に精製する
ことなく得ることが出来、タンパク質mg当たり約40 IU
TSHを越える生物活性をもったTSH調製物を直接放射性ヨ
ウ素化することからなる、放射性ヨウ素化されたTSHト
レーサーの製造方法。 - 【請求項２】段階（ｉ）のアフィニティ・クロマトグラ
フィによる粗製ウンTSHの精製が、抗TSH抗体アフィニテ
ィゲルを含有しているカラムの助けによって行なわれる
ことを特徴とし、該ゲルが （ａ） 過ヨウ素酸ナトリウムによりモノクローナル抗
TSH抗体を酸化し； （ｂ） 脱塩カラムにより低分子量成分から該酸化抗体
を分離し； （ｃ） タンパク質結合ゲルで該脱塩された酸化抗体を
培養し；そして （ｄ） 該結合した抗TSH抗体を有するゲルを慣用のカ
ラムへ移すこと； によって得られ、全段階を通じて慣用の緩衝液と洗浄液
が使用される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】段階（ii）のイオン交換クロマトグラフィ
が、末端カルボキシル基をもちポリアミド被覆されたシ
リカゲルに基づく弱酸性陽イオン交換樹脂を使用して実
施される、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４】段階（ｉ）から得られる溶出液が希釈され
て、段階（ii）に直接に使用され、また段階（iii）か
ら得られる溶出液が固体二酸化炭素の温度に直ちに冷却
される、請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項５】クロラミンＴを使用する放射性ヨウ素化法
により該放射性ヨウ素化が行なわれることを特徴とす
る、請求項１〜４のいずかに記載の方法。 - 【請求項６】30％を越える特異的結合をもった放射性ヨ
ウ素化TSHトレーサーが製造されることを特徴とする、
請求項１〜５のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項７】放射性ヨウ素化の合計放射能収率が45〜50
％であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一
に記載の方法。 - 【請求項８】放射性ヨウ素化されるべき該TSH調製物の
生物活性が、55 IU TSH/蛋白質mgである請求項１〜７の
いずれか一に記載の方法。
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