JPS6311626B2 - - Google Patents
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- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
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-
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Description
本発明は膵グルカゴン
の酵素免疫測定法に関する。膵グルカゴンは動物
の血糖調節に重要な役割を演じているホルモンで
あり、この分泌動態を知ることは、糖代謝異常の
解明に不可欠である。したがつて、簡便でかつ精
度の高い測定法の確立は極めて重要であり、現在
ラジオイノムノアツセイ（以下、RIAと称する。）
が広く行われている。 しかしながら、このRIAにおいては衆知の如
く、放射性同位元素の使用が不可欠となるため、
放射性同位元素による人体への影響や環響汚染の
懸念が多く、また法律上必要な特殊な設備・機器
あるいは取扱い資格を持つ検査員を配置しなけれ
ばならないという欠点がある。このようなRIAの
欠点を補い、かつ簡便にして高感度な定量性を有
した測定法として登場したのが酵素免疫測定法
（以下、EIAと称する。）である。 EIAはRIAと類似の測定原理に基づいている
が、標識物質として酵素を用いるため、通常の実
験室・臨床検査室で手軽に採用できる手法であ
る。しかし膵グルカゴンの血中濃度は極めて微量
であるため、感度においてRIAに劣る従来のEIA
では実験の臨床検体について満足すべき結果を得
ていないのが現状である。 本発明者らは、かかる技術的背景のもとに、
RIAと同等もしくはそれ以上の感度と精度で体液
中の膵グルカゴンを特異的に定量できるEIAを得
ることを目的とし、種々のペプチドを合成し、そ
の酵素標識体を用いて検討した結果、特異抗体の
調製に用いるペプチドとは異なるペプチドと標識
酵素との縮合体が、本目的に極めて有用であると
いう新知見を得、これに基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成したものである。 本発明は、(1)一般式 Ｈ−R1−Phe−Val−Gln−Trp −Leu−R2−Asn−Thr−OH 〔式中、R1は で示されるペプチドの10位のAspを含む１〜10個
の部分ペプチド鎖を、R2はMetまたはNleを、そ
れぞれ表わす。〕で表わされるペプチドと標識酵
素とを縮合して得られるペプチド−酵素縮合体、
および(2)ペプチド−酵素複合体を試薬の一種とし
て用いる膵グルカゴンの酵素免疫測定法におい
て、該ペプチド−酵素複合体として一般式 Ｈ−R1−Phe−Val−Gln−Trp −Leu−R2−Asn−Thr−OH 〔式中、R1は で示されるペプチドの10位のAspを含む１〜10個
の部分ペプチド鎖を、R2はMetまたはNleを、そ
れぞれ表わす。〕で表わされるペプチドと標識酵
素とを縮合して得られるペプチド−酵素縮合体を
用いることを特徴とする膵グルカゴンの酸素免疫
測定法、である。 本発明におけるR1で示される のペプチドの10位のAspを含む１〜10個の部分ペ
プチド鎖としては、たとえばAsp、Gln−Asp、
Ala−Gln−Asp、Arg−Ala−Gln−Asp、Arg−
Arg−Ala−Gln−Asp、Ser−Arg−Arg−Ala−
Gln−Asp、Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp、Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp、Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala
−Gln−Asp、β−Ala−Tyr−Leu−Asp−Ser
−Arg−Arg−Ala−Gln−Aspなどが挙げられ
る。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Arg：アルギニン Trp：トリプトフアン Asn：アスパラギン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ser：セリン Glu：グラタミン酸 Gln：グルタミン Ala：アラニン Val：バリン Met：メチオニン Met（Ｏ）：メチオニンスルフオキシド Leu：ロイシン Tyr：チロシン β−Ala：β−アラニン Nle：ノルロイシン Phe：フエニルアラニン Ｚ：カルボベンゾキシ Boc：ｔ−ブチルオキシカルボニル OBut：ｔ−ブチルエステル OBzl：ベンジルエステル ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキシイミドエステル MBS：ｐ−メトキシベンゼンスルホニル HONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド DCC：Ｎ，N′−ジシクロヘキシカルボジイミド DCU：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルウレア PMF：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド NMP：Ｎ−メチル−２−ピロリドン TFA：トリフルオロ酢酸 THF：テトラヒドロフラン TEA：トリエチルアミン DCHA：ジシクロヘキシルアミン CMC：カルボキシメチルセルロース ECDI：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド CMCT：１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）−カルボジイミドメト−ｐ−トル
エンスルホネート GLA：グルタルアルデヒド ｍ−MBHS：メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ハイドロキシスクシンイミドエステル ｐ−MCHS：パラ−マレイミドメチルシクロヘ
キサン−１−カルボキシル−Ｎ−ハイドロキシ
スクシンイミドエステル BSA：牛血清アルブミン 本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチ
ド合成の公知の常套手段で製造しうる。固相合成
法、液相合成法のいずれによつてもよいが、液相
合成法が有利な場合が多い。そのようなペプチド
合成手段は、たとえば“The Peptides”、第１巻
（1966）、Schro¨der and Lubke著、Academic
Press、New、York、U.S.A.あるいは“ペプチ
ド合成”、泉屋ら著、丸善株式会社（1975年）に
記載されており、たとえばアジド法、クロライド
法、酸無水物法、混酸無水、物法、DCC法、活
性エステル法、ウツドワード試薬Ｋを用いる方
法、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、
DCC／アデイテイブ（例、HONB、HOBt、
HOSu）法などがあげられる。 膵グルカゴンの酵素免疫測定法としては、(1)未
知量の膵グルカゴンを含有する体液、たとえば血
清にペプチド−酵素複合体の一定量および不溶性
の形をした膵グルカゴン特異抗体の一定量を加
え、液相中のペプチド−酵素複合体または固相中
の反応したペプチド−酵素複合体について酵素活
性を測定することによつて検液中の膵グルカゴン
を定量する方法〔フエブス・レターズ（FEBS
Letters）15巻232頁（1971年）参照〕、(2)膵グル
カゴン含有検液にペプチド−酵素複合体の一定量
および溶解性の膵グルカゴン特異抗体の一定量を
加え、競合的に結合させたのち、最初の抗体に対
する不溶性の第２抗体〔たとえば、ウサギを用い
て膵グルカゴン特異抗体を調製した時はウサギイ
ムノグロブリンＧ（IgG）抗体〕の一定量を加え、
上記(1)と同様に液相または固相中の酵素活性を測
定し検液中の膵グルカゴンを定量する方法（上記
フエブス・レターズ参照）、および(3)上記(2)と同
様に膵グルカゴン含有検液にペプチド−酸素複合
体の一定量および溶解性の膵グルカゴン特異抗体
の一定量を加え、競合的に結合させたのち、第２
抗体と第２抗体が抗動物（例、ウサギ）IgG抗体
の時は正常動物（例、ウサギ）血清との一定量を
加えて沈澱を生ぜしめ、(1)と同様に液相または固
相中の酵素活性を測定し、検液中の膵グルカゴン
を定量する方法〔クリニカ・キミカ・アクタ
（Clinica Chimica Acta）67巻263頁（1976年）〕
に適用できる。いずれの方法においても、液相中
の酵素活性を測定する場合は検液中に存在する夾
雑物により酵素活性の測定が妨害されることがあ
るので、固相の活性を測定するのが有利である。
また再現性および感度の点からは、微量の膵グル
カゴン特異抗体の使用で測定の可能な「二重抗体
法」、即ち(2)および(3)の方法がより好ましく用い
られる。 これらいずれの方法においても、抗体に対する
ペプチド−酵素複合体の親和力を膵グルカゴンの
それよりも減少させうるならば、これらの測定系
では複合体と抗体との結合は微量の膵グルカゴン
の存在により容易に置換され、膵グルカゴンの非
常に低い濃度を測定することができる。 標識物質として用いられる酸素は安定で比活性
の大きなものであれば良く、たとえばペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グ
ルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリ
ホスフアターゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラ
ーゼ、タカアミラーゼＡ、ウレアーゼ、コリンエ
ステラーゼ等が都合よく用いられ、好ましくはβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼが良く用いられる。 本発明中のペプチド−酵素縮合体を調製するた
めに、ペプチドおよび酵素の各成分中に存在して
いる置換基、たとえばアミノ基、カルボキシル
基、ヒドロキシ基またはスルフヒドリル基などを
利用することができる。縮合試薬としては、たと
えば(1)ペプチドと酵素いずれか一方の反応性アミ
ノ基と他方の反応性カルボキシル基とを水性溶媒
中で脱水縮合させるECDIやCMCTなどの水溶性
カルボジイミド試薬、(2)ペプチドの反応性アミノ
基をＮ−ハイドロキスクシンイミドの活性エステ
ルと反応させマレイミド化したのち酵素と反応さ
せ、酵素のスルフヒドリル基と結合させるｍ−
MBHSやｐ−MCHSなどのＮ−ハイドロキシス
クシンイミドエステルのマレイミド化試薬、(3)ペ
プチドと酵素いずれか一方の反応性アミノ基を他
方の反応性アミノ基と結合させるスクシンジアル
デヒドやGLAなどのジアルデヒド試薬などが用
いられる。 ペプチドと酵素との縮合反応においては、ペプ
チドと酵素との縮合反応に使用しうる縮合試薬な
らいずれを用いてもよく、好ましくは上記のカル
ボジイミド試薬、マレイミド試薬およびジアルデ
ヒド試薬などが用いられる。またこれら縮合反応
は水性溶媒中で行うことができるが、この水性溶
媒としては、ペプチドと酵素との縮合反応に使用
しうることが知られているものから適宜選択され
うる。その例としては、たとえばPH６〜８のリン
酸緩衝液、PH７〜９のホウ酸緩衝液などが挙げら
れる。 ペプチドと酵素との縮合反応の反応時間は通常
30分〜20時間であるが、酵素の安定性を考慮する
と、30分〜３時間の短時間が好ましい。しかし低
温における縮合反応では２〜４日に及ぶ反応時間
を採用することもできる。反応温度は通常約４℃
〜50℃、好ましくは約15℃〜30℃の範囲から適宜
選択される。 本縮合反応終了後、ペプチド−酵素縮合体はセ
フアデツクスG100もしくはG200（フアルマシ
ア・フアイン・ケミカルズ社製）またはセフアロ
ース6Bもしくは4B（フアルマシア・フアイン・
ケミカルズ社製）などのカラムクロマトグラフイ
ーにより精製、分取できる。 本発明方法に用いる好ましいペプチド−酵素縮
合体の例としては、膵グルカゴンを用いてウサギ
で調製した30KやG21特異抗体等により膵グルカ
ゴンを定量する時は、式 （R1は膵グルカゴンの21位までの１−９個の部
分ペプチド鎖、R2はMetまたはNleをそれぞれ示
す。）で表わされるペプチドと酵素とを縮合せし
めて得たペプチド−酵素縮合体を用いると感度の
良い結果を与え、特に で表わされるペプチド（）と酵素との複合体を
用いると良く、またペプチド（）を用いてウサ
ギで得たN6c抗体により膵グルカゴンを定量する
時は、式 （R1は膵グルカゴンの21位までの１−７個の部
分ペプチド鎖、R2はMetまたはNleをそれぞれ示
す。）で表わされるペプチドと酵素とを縮合せし
めて得たペプチド−酵素縮合体を用いると感度の
良い結果を与え、特に 〔ペプチド（）〕もしくは 〔ペプチド（）〕と酵素との縮合体を用いると
感度の良い結果を与える。 本発明方法で用いる抗体は、膵グルカゴンおよ
びペプチド−酵素縮合体と反応性を有する抗体の
いずれを用いてもよく、たとえばUngerらの30K
（“Diabetes”、第17巻（1968年）、第321頁）、大
根田らのG21（“Diabetes”、第18巻（1969年）、第
１頁）、桜井らのR517（“内科宝函”、第23巻
（1975年）第247頁）および参考例８、実施例９で
挙げられたN6cおよびN16a膵グルカゴン特異抗
体が好都合に用いられる。 また本発明方法に用いる第２抗体は、膵グルカ
ゴン特異抗体を調製する時使用した動物種（例、
ウサギ）のIgGを他の動物種（例、ヤギ）に頻回
注射して調製することができる。この免疫方法は
通常の抗体調製法のいずれを用いてもよく、たと
えばフロイント・コンプリート・アジユバンド
（Freund complete adjuvant）と共に１回約２
mgのIgGを３週間おきに約４回皮下投与すると満
足すべき抗体が得られる。また市販の抗ウサギ
IgG血清（ヤギ）（マイルズ・ラボラトリー社）
などを使用してもよい。 不溶性の第２抗体は、上記のごとく得られた抗
IgG血清を硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウ
ムで塩析沈澱させ、更にDEAE−セルロースカラ
ムクロマトグラフイーで分取した抗IgG血清の
IgGフラクシヨンを、ブロムシアンで活性化し
た、たとえばセルロースやセフアデツクスなどの
固相に結合させることによつて得られる
（“FEBS Letters”、第15巻（1971年）、第232
頁）。または上記の抗血清のIgGフラクシヨンを、
ガラスビーズ、シリコン片またはポリスチレン粒
子などに接触させることによつて物理的にこれら
固相に第２抗体を吸着させて得ることもできる
（“化学と生物”、第14巻（1976年）、第741頁）。 本発明のEIAにおいて用いられる血清としては
被検血清として用いられうるものであればどのよ
うな血清を用いてもよく、たとえばヒト、ラツ
ト、マウス、モルモツトなどの哺乳動物の血清が
挙げられ、とりわけヒト血清中の膵グルカゴン動
態を知る目的でヒト血清が繁用される。 本発明方法は従来行なわれている膵グルカゴン
のEIAに比し、感度の良い結果を与えるので、利
用価値の高いものである。その感度はRIAに匹敵
するものであり、したがつて本発明のEIAは、放
射性同位元素（以下、RIと称する。）の使用に併
う種々の欠点を有するRIAにとつて代り、RI管
理設備を有しないいずれの臨床検査室においても
採用可能であり、血中の膵グルカゴン濃度を簡便
に定量できる特徴を有する。また本発明のペプチ
ド−酵素複合体は、半減期をもつRIと異なり、
安定であるため、同一ロツトにより多数の検体の
測定が可能で再現性の良い結果を与える。 以下に、本発明を実施例・参考例によりさらに
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。 以下の参考例において、薄層クロマトグラフイ
ーは、メルク社製シリカゲルプレート60F254又
は、フナコシ薬品社製セルロースプレートアビセ
ルSFを用い、下記の展開溶媒を用いた。 Rf1：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5 Rf2：クロロホルム：メタノール：水＝７：３：
0.5 Rf3：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24 参考例 １ 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 (1) Boc−Asn−Thr−OBzlの製法 Boc−Thr OBzl112ｇをTFA300mlに溶か
し、室温で20分間振り混ぜた後、濃塩酸30mlを
加え、溶液を減圧濃縮する。残留物をTHF1
に溶かし、氷冷し、TEA50mlを加えて中和す
る。これにBoc−Asn−OH76.7ｇ、
HONB64.5ｇ、DCC74.3ｇを加えて15時間かき
混ぜる。析出したDCUをろ去した後、溶媒を
減圧で留去し、残留物を酢酸エチル１に溶か
す。これを10％クエン酸水（300ml×３）、飽和
炭酸水素ナトリウム水（300ml×３）、水（300
ml×３）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで
乾燥する。溶媒を減圧で留去した後、残留物に
エーテル（１）を加えて、粉末として、ろ取
した後、アセトニトリルより再結晶する。収量
105.1ｇ（75.2％）m.p.165−166℃〔α〕23 D−
13.9゜（ｃ＝0.9、DMF中）、Rf10.51、
C20H29O7N3としての元素分析計算値：
C56.75；H6.90；N9.92、実験値：C57.01；
H6.89；N9.94 (2) Boc−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Asn−Thr−OBzl50.0ｇにTFA170ml
を加えて、室温で30分間振り混ぜた後、濃縮し
エーテル500mlを加えて粉末としてろ取し、乾
燥する。これをTHF400mlに溶かし、氷冷し
TEA20mlを加えた後、Boc−Met（Ｏ）−ONB
（Boc−Met（Ｏ）・OH31.3ｇ、HONB23.3ｇを
THF200mlに溶解し、氷冷し、DCC26.8ｇを加
えて、４時間かき混ぜて調製する。）を加え、
15時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去したの
ち、残留物に酢酸エチル（200ml）、エーテル
（200ml）を加え、粉末としてろ取し、アセトニ
トリルより再沈澱する。収量48.5ｇ（72.0％）、
m.p.145−147℃〔α〕23 D−6.5（ｃ＝1.1、DMF
中）、Rf10.19、C25H38O9N4Sとしての元素分析
計算値：C52.62；H6.71；N9.82；S5.62、実験
値：C52.44；H6.73；N9.60；S5.15 (3) Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの
製法 Boc−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl15.0ｇに
TFA45mlを加え、室温で45分間振り混ぜた後、
濃縮し、エーテル100mlを加えて粉末としてろ
取し、乾燥する。これをDMF50mlに溶解し、
氷冷し、TEA5.7mlを加え、これにBoc−Leu
−ONB（Boc−Leu−OH6.69ｇ、HONB5.70
ｇ、DCC6.56ｇより調製）を加えて、15時間か
き混ぜる。溶媒を減圧で留去した後、残留物に
酢酸エチル200mlを加えて、粉末としてろ取し、
アセトニトリル−酢酸エチルより再沈澱する。
収量15.0ｇ（83.4％）、m.p.134−136℃、〔α〕24 D
−15.1゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.25、
C31H49O10N5Sとしての元素分析計算値：
C54.45；H7.22；N10.24；S4.69、実験値：
C54.62；H7.60；N9.89；S3.95 (4) Boc−Gln−Trp−OBzlの製造 Ｈ−Trp−OBzl・パラトルエンスルホン酸
塩50.0ｇをTHE500mlに溶かし、氷冷し、
TEA15.4ml、Ｚ−Gln−OH28.0ｇ、
HONB19.7ｇ、DCC22.7ｇを加えて、15時間か
き混ぜる。析出したDCUをろ去した後、濃縮
し、残留物を酢酸エチル300mlに溶かす。これ
を飽和炭酸水素ナトリウム水（150ml×２）、10
％クエン酸水（150ml×２）、水（150ml×２）
で順次洗浄する。溶媒を減圧で留去した後、残
留物をTHF300mlに溶かし、不溶物をろ去す
る。これを濃縮した後、エーテル500mlを加え
て、粉末としてろ取し、アセトニトリルより再
結晶する。収量46.1ｇ（82.8％）、〔α〕23 D＋5.8゜
（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.60、C31H32O6N4と
しての元素分析計算値：C66.89；H5.80；
N10.07、実験値；C66.79；H5.71；N10.20 (5) Ｚ−Val−Gln−Trp−OHの製造 Ｚ−Gln−Trp−OBzl50.0ｇをメタノール
700mlに溶かし、５時間接触還元（触媒：パラ
ジウム黒）すると、結晶が析出するので、これ
をろ取する。これをDMF300mlに懸濁し、
TEA13mlを加えて溶かし、触媒をろ去する。
これにＺ−Val−ONB37.0ｇを加えて、10時間
かき混ぜた後、1N−塩酸100mlを加えて中和
し、さらに水500mlを加えて粉末としてろ取す
る。これをメタノールで十分洗浄する。収量
43.0ｇ（84.7％）、m.p.246−247℃〔α〕23 D＋
12.4゜（ｃ＝0.9、DMF中）、Rf10.14、
C29H35O7N5としての元素分析計算値：
C61.58；H6.24；N12.38、実験値：C61.86；
H6.30；N12.36 (6) Ｚ−Phe−Val−Gln−Trp−OHの製造 Ｚ−Val−Gln−Trp−OH5.1ｇを酢酸10ml
に溶かし、３時間接触還元したのち触媒をろ去
し、濃縮する。これをDMF200mlに懸濁し、こ
れにTEA2ml、Ｚ−Phe−OH2.70ｇより調製し
たＺ−Phe−ONBを加えて、７時間かき混ぜ
る。溶媒を減圧で留去し、残留物に酢酸水を加
えてゲルとしてろ取する。これをメタノールよ
り再沈澱する。収量5.50ｇ（84.5％）、m.p.240
℃、〔α〕24 D＋4.1゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.15、
C38H44O8N6・1/2H2Oとしての元素分析計算
値：C63.23；H6.28；N11.64、実験値：
C63.11；H6.29；N11.80 (7) Boc−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−
OHの製造 Ｚ−Phe−Val−Gln−Trp−OH8.5ｇを、
DMF150ml、酢酸50mlの混液に溶かし、５時間
接触還元する。触媒をろ去した後、濃縮し、残
留物にメタノール100mlを加えて結晶としてろ
取する。これを、DMF200mlに懸濁し、
TEA3.0ml、Boc−Asp（OBzl）ONB（Boc−
Asp（OBzl）−OH3.9ｇ、HONB2.4ｇ、DCC2.7
ｇより調製）を加えて、10時間かき混ぜる。溶
媒を減圧で留去したのち、残留物に酢酸水を加
えて、ゲルとしてろ取し、DMF、水より再沈
澱する。収量6.3ｇ（58.1％）、m.p.191−192℃
（分解）、〔α〕24 D−6.2゜（ｃ＝1.1、DMF中）、
Rf10.11、C46H57O11N7・3/2H2Oとしての元素
分析計算値：C60.64；H6.63；N10.76、実験
値：C60.30；H6.48；N11.34 (8) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−OHの製造 Boc−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−
OH6.0ｇに、TFA50mlを窒素気流中加え、10
分間ふり混ぜた後、濃縮しエーテルを加えて粉
末としてろ取する。これをDMF100mlに溶かし
TEA2.0mlを加え、Boc−Gln−ONB（Boc−
Gln−OH1.76ｇ、HONB1.34ｇ、DCC1.54ｇか
ら調製）を加えて、15時間かき混ぜる。これに
酢酸水を加えて、粉末として、ろ取したのち、
アセトニトリル、水より再沈澱する。収量5.50
ｇ（82.6％）、m.p.210−212℃（分解）、〔α〕24 D
−10.1゜（ｃ＝1.1、DMF中）、Rf10.09、
C51H65O13N9としての元素分析計算値：
C60.52；H6.47；N12.46、実験値：C60.19；
H6.37；N12.23 (9) Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OButの製造 Ｚ−Ala−OBut31.0ｇをメタノール300mlに
溶かし、５時間接触還元した後、触媒をろ去
し、濃縮する。一方、Ｚ−Arg（MBS）−OH・
DCHA53.0ｇを酢酸エチル500mlに懸濁し、10
％クエン酸200mlを加えてよく振り混ぜた後、
水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。これ
をTHF500mlに溶かし、これに、先に調製した
Ｈ−Ala−OButを加えHONB14.9ｇを加えて
氷冷し、DCC17.1ｇを加えて10時間かき混ぜ
る。析出したDCUをろ去し、濃縮した後、酢
酸エチル500mlに溶かし、10％クエン酸水（200
ml×３）、飽和炭酸水素ナトリウム水（200ml×
３）、水（200ml×３）で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥する。溶媒を減圧下で留去したの
ち、残留物にエーテル300mlを加えて粉末とし
て、ろ取する。収量44.5ｇ（66.8％）、mp126−
127℃、〔α〕25 D−6.0゜（ｃ＝1.0、DMF中）、
Rf10.62、C28H39O8N5Sとしての元素分析計算
値：C55.52；H6.49；N11.56；S5.27、実験
値：C55.71；H6.49；N11.81；S5.29 (10) Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−OBut
の製造 Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OBut43ｇをメタノ
ール500mlに溶かし、５時間還元したのち、濃
縮する。残留物をDMF200mlに溶かし、Ｚ−
Arg（MBS）−OH（Ｚ−Arg（MBS）−OH・
DCHA49.7ｇより調製）、HONB14.0ｇを加え、
氷冷し、DCC16.1ｇを加えて、15時間かき混ぜ
る。析出したDCUをろ去した後、濃縮し、残
留物をクロロホルム500mlに溶かす。これを10
％クエン酸水（300ml×３）、飽和炭酸水素ナト
リウム水（300ml×３）、水（300ml×３）の順
に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒
を減圧で留去したのち、メタノール300mlを加
えて、結晶としてろ取し、メタノールより再結
晶する。収量52.4ｇ（79.2％）、m.p.116−118
℃、〔α〕25 D−8.8゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.42、
C41H57O12N9S2・2H2Oとしての元素分析計算
値：C50.86；H6.35；N13.02；S6.62、実験
値：C51.05；H6.08；N13.11；S6.62 (11) Boc−Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala
−OButの製造 Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−OBuu
30.0ｇをDMF80ml、メタノール300mlの混液に
溶かし、７時間接触還元する。触媒をろ去し、
メタノールを減圧で留去したのち、これにBoc
−Ser−OH7.3ｇ、HNB6.3ｇを加え、氷冷し、
DCC7.3ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出し
たDCUをろ去し、溶媒を減圧で留去し、残留
物をクロロホルム500mlに溶かす。これを飽和
炭酸水素ナトリウム（300ml×２）、水（300ml
×２）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥す
る。溶媒を留去したのち、クロロホルム30mlに
とかしシリカゲルのカラム（400ｇ）につける。
クロロホルム：メタノール：酢酸（９：0.7：
0.35）の溶媒で展開し、800mlから２までの
画分を集めて、濃縮し、エーテルを加えて粉末
とする。収量25.5ｇ（79.0％）、m.p.85−88℃、
〔α〕26 D−20.9゜（ｃ＝1.0、メタノール中）、
Rf10.33、C41H64O14N10S2・H2Oとしての元素
分析計算値：C49.09；H6.63；N13.96；S6.39、
実験値：C48.96；H6.55；N13.70；S5.84 (12) Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−OHの製造 Boc−Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala
−OBut10.5ｇにTFA50mlを加え、室温で60分
振り混ぜた後、濃縮し、エーテル300mlを加え
て粉末としてろ取する。これをDMF50mlに溶
かし、TEA4.1ml、Boc−Asp（OBzl）−ONB
（Boc−Asp（OBzl）・OH3.40ｇ、HONB1.97
ｇ、DCC2.27ｇより調製）を加えて15時間かき
混ぜる。溶媒を減圧で留去したのち、残留物に
酢酸水を加えて、粉末として、ろ取し乾燥す
る。これをアセトニトリル・エーテルより再沈
澱する。収量6.0ｇ（51.5％）、m.p.126−130℃、
〔α〕24 D＋3.5゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.17、
C48H67O17N11S2・2H2Oとして元素分析計算
値：C49.26；H6.12；N13.17；S5.48、実験
値：C49.62；H5.84；N13.00；S5.03 (13) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln
−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの
製造 Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OBzl3.25ｇにTFA25mlを加え室温で15分間ふ
り混ぜた後、濃縮し、残留物にエーテル100ml
を加えて粉末として、ろ取し、乾燥する。これ
をNMP10mlに溶かし、TEA2ml加えてよく振
り混ぜたのち、エーテル100mlを加え、粉末と
して再びろ取する。これをDMF100mlに溶か
し、さらにBoc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−
Val−Gln−Trp−OH4.80ｇ、HONB2.70ｇを
加えて溶かしたのち、氷冷し、DCC1.55ｇを加
えて58時間かき混ぜると反応液がゲル状にな
る。溶媒を減圧で留去したのち、残留物を含水
アセトニトリルで十分に洗浄する。収量5.75ｇ
（76.8％）、m.p.23.4℃（分解）、〔α〕26 D−15.8゜
（ｃ＝0.4、酢酸中）、Rf20.63、C77H104O20N14S
としての元素分析計算値：C58.61；H6.64；
N12.43；S2.03、実験値；C59.13；H6.96；
N12.40；S1.70 (14) Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−
Arg（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−
Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr
−OBzlの製造 Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl5.20
ｇにアニソール１mlを加え、さらに窒素気流
中、TFA35mlを加えて、室温で15分間かき混
ぜ、濃縮し、残留物にエーテル100mlを加えて
粉末としてろ取する。これをNMP20mlにとか
し、TEA2.77mlを加えて十分に振り混ぜたの
ち、エーテル200mlを加えて、粉末としてろ取
する。これをDMF150mlに溶かし、Boc−Asp
（OBzl）：Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala
−OH3.66ｇ、HONB2.36ｇを加え、氷、食塩
で−10℃に冷却し、DCC1.02ｇを加える。反応
液を０℃で10時間、室温で24時間かき混ぜたの
ち、析出したDCUをろ去し、溶媒を減圧で留
去する。残留物に水50mlを加えて粉末としてろ
取したのち、含水アセトニトリルで十分に洗浄
する。収量5.3ｇ（61.1％）、m.p.237℃（分解）、
〔α〕26 D−7.1゜（ｃ＝0.9、酢酸中）、Rf20.63、
C120H161O34N25S3・2H2Oとしての元素分析計
算値：C54.82；H6.32；N13.32；S3.57、実験
値：C54.47；H6.16；N13.07；S3.47 (15) Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）
−Asn−Thr−OHの製造 Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val
−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OBzl400mgにアニソール0.25mlを加え、これに
メタンスルホン酸５mlを加えて、室温で60分振
り混ぜた後、エーテル100mlを加えて油状物を
沈澱させる。エーテルを傾斜法で除いたのち、
残留物を水10mlにとかし、アンバーライトIRA
−410（酢酸型）のカラム（１×10cm）を通し、
溶出液（液量50ml）を氷冷し、3Nアンモニア
水10mlを加えて０℃で30分間かき混ぜたのち、
凍結乾燥する。これを水30mlにとかし、CMC
のカラム（2.2×18cm）に付し、水（500ml）か
ら0.2M酢酸アンモニア水（500ml）までの線型
勾配法で溶出し、150mlから195mlまでの画分を
集めて凍結乾燥する。収量150mg。次にこれを
水20mlに溶かし、アンバーライトXAD−２の
カラム（1.6×５cm）に付し、水（200ml）から
80％エタノール（200ml）までの線型勾配法で
溶出し、180mlから225mlまでの画分を集め、エ
タノールを留去したのち、凍結乾燥する。収量
115mg、〔α〕24 D−33.6゜（ｃ＝0.6、50％酢酸水中、
Rf30.54（アビセル）、アミノ酸分析（４％チオ
グリコール酸、5.7N−塩酸加水分解）：
Arg2.03(2)；Trp0.87(1)；Asp3.03(3)；Thr0.97
(1)；Ser0.73(1)；Glu2.13(2)；Ala1.00(1)；
Val1.03(1)；Met1.00(1)；Leu1.03(1)；Phe1.03
(1)、（ペプチド含量85.7％） (16) 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）
−Asn−Thr−OH225mgを５％チオグリコール
酸水20mlに溶かし、50℃で20時間放置するとゲ
ルが析出する。水を減圧で留去したのち、残留
物を50％酢酸５mlに溶かし、セフアデツクスＧ
−25のカラム（2.3×118cm）に付す。50％酢酸
水で溶出し、180mlから240mlまでの画分を集め
て凍結乾燥する。収量220mg、〔α〕24 D−30.0゜（ｃ
＝0.3、50％酢酸水中）、Rf30.59（アビセル）、
アミノ酸分析（４％チオグリコール酸、5.7N
−塩酸加水分解）：Arg2.15(2)；Trp0.91(1)；
Asp3.13(3)；Thr0.99(1)；Ser0.87(1)；Glu2.20
(2)；Ala1.05(1)；Val0.96(1)；Met1.00(1)；
Leu1.07(1)；Phe1.07(1)；ペプチド含量79.3％ 参考例 ２ 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 (1) Boc−Nle−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Asn−Thr−OBzl3.10ｇをTFA30mlに
溶かし、室温で10分間振り混ぜたのち、濃縮
し、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取し、
乾燥する。これをDMF30mlに溶かし、氷冷し、
TEA1.5mlを加えたのち、Boc−Nle−ONB
（Boc−Nle−OH1.69ｇ、HONB1.50ｇ、
DCC1.73ｇより調製する）を加え、15時間かき
混ぜる。溶媒を減圧で留去したのち、残留物に
水50mlを加えて粉末としてろ取し、乾燥する。
これをエーテルでよく洗浄する。収量3.80ｇ
（96.7％）m.p.160−163℃〔α〕21.5 D−13.6゜（ｃ＝
0.8、DMF中）、Rf10.58、C26H40O8N4としての
元素分析計算値：C58.19；H7.51；N10.44、実
験値：C58.40；H7.60；N10.37 (2) Boc−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Nle−Asn−Thr−OBzl3.50ｇを
TFA30mlに溶かし、室温で10分間振り混ぜた
のち、濃縮し、エーテル150mlを加えて粉末と
してろ取し、乾燥する。これをDMF30mlに溶
かし、氷冷しTEA1.2mlを加えたのち、Boc−
Leu−ONB（Boc−Leu−OH1.66ｇ、
HONB1.41ｇ、DCC1.63ｇより調製する）を加
え、15時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去した
のち、残留物に水50mlを加えて粉末としてろ取
し、乾燥する。これを酢酸エチルでよく洗浄す
る。収量3.60ｇ（83.8％）m.p.200−201℃、
〔α〕21.5 D−22.7゜（ｃ＝0.8、DMF中）、Rf10.60、
C32H51O9N5・1/2H2Oとしての元素分析計算
値：C58.34；H7.96；N10.63、実験値：
C58.06；H7.99；N11.02 (3) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzl2.00ｇを
TFA20mlに溶かし、室温で10分間振り混ぜた
のち濃縮し、エーテル70mlを加えて、粉末とし
てろ取し乾燥する。これをDMF10mlに溶かし、
氷冷し、TEA1.3mlを加えてよく振り混ぜたの
ち、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取す
る。これをDMF40mlに溶かし、Boc−Gln−
Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−OH3.00
ｇ、HONB2.20ｇを加えて氷冷したのち、
DCC1.27ｇを加えて、48時間かき混ぜる。溶媒
を減圧で留去したのち、水50mlを加え粉末とし
てろ取し、含水アセトニトリルで十分に洗浄す
る。収量3.30ｇ、m.p.210−214℃（分解）、
〔α〕21.5 D−11.8゜（ｃ＝0.6、NMP中）、Rf30.66、
C78H106O19N14としての元素分析計算値：
C60.68；H6.92；N12.73、実験値：C60.92；
H7.30；N12.76 (4) 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzl3.0ｇにエ
タンジオール0.2ml、TFA25mlを加えて室温で
10分間振り混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加
えて粉末としてろ取し、乾燥する。これを
NMP15mlに溶かし、氷冷し、TEA0.8mlを加
えて振り混ぜたのち、エーテルを加えて粉末と
してろ取する。これをDMF50mlに溶かし、
Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−OH2.1ｇ、HONB0.71ｇを加
えて、氷−食塩で冷却したのち、DCC0.60ｇを
加えて24時間かき混ぜる。析出したDCUをろ
去したのち、ろ液を濃縮し、残留物に、酢酸エ
チルを加えて粉末としてろ取する。収量3.6ｇ。
この様にして得られた保護ペプチド1.0ｇにア
ニソール１mlを加え、無水弗化水素10mlを加え
て０℃、60分間かき混ぜたのち、減圧濃縮す
る。残留物を、水50mlに溶かし、エーテルで洗
浄したのち、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×10cm）を通し、溶出液を、
凍結乾燥する。これを50％酢酸10mlに溶かし、
セフアデツクスLH−20のカラム（2.2×110cm）
に付し、50％酢酸で溶出し、125−180mlの画分
を集めて凍結乾燥する。さらにこれを水50mlに
溶かし、CMCのカラム（2.2×20cm）に付す。
0.005M酢酸アンモニア水（500ml）から0.2M
酢酸アンモニア水（500ml）までの線型勾配で
溶出し、265−440mlまでの画分を集めて凍結乾
燥する。収量145mg、〔α〕22 D−30.9゜（ｃ＝0.3、
50％酢酸中）、Rf30.60（アビセル）、アミノ酸分
析（４％チオグリコール酸、5.7N塩酸加水分
解）：Arg2.11(2)；Trp0.97(1)；Asp3.40(3)；
Thr0.93(1)；Ser0.83(1)；Glu2.10(2)；Ala1.00
(1)；Val1.04(1)；Leu0.91(1)；Phe0.84(1)；
Nle1.06(1)。（ペプチド含量74％） 参考例 ３ 〔ペプチド（）（21−29）〕の製造 Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl1.0ｇ
をTFA10mlに溶かし、室温で10分間振り混ぜた
のち濃縮し、エーテル50mlを加えて、粉末として
ろ取し、乾燥する。これをDMF10mlに溶かし、
氷冷し、TEA1.1mlを加えて、よく振り混ぜたの
ち、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取する。
これをDMF20mlに溶かし、Boc−Asp（OBzl）−
Phe−Val−Gln−Trp−OH1.33ｇ、HONB520
mgを加えて氷冷し、DCC450mgを加えて48時間か
き混ぜる。溶媒を減圧で留去したのち、水50mlを
加えて粉末としてろ取し、含水アセトニトリルで
洗浄する。収量1.72ｇ。このようにして得られた
保護ペプチド1.0ｇにアニソール0.5mlを加え、メ
タンスルホン酸10mlを加えて室温で10分間振り混
ぜたのち、エーテル100mlを加えて、油状物を沈
澱させる。傾斜法にてエーテルを除いたのち、残
留物を30％酢酸20mlに溶かし、アンバーライト
IRA−410（酢酸型）のカラム（１×10cm）を通
し、凍結乾燥する。これを、50％酢酸５mlに溶か
し、セフアデツクスLH−20のカラム（2.4×110
cm）に付す。50％酢酸で溶出し、195−235mlの画
分を集めて、凍結乾燥する。収量550mg。このよ
うにして得られたペプチドのうち150mgを、50％
酢酸５mlに溶かし、チオグリコール酸0.3mlを加
えて、45℃で16時間還元したのち、セフアデツク
スLH−20のカラム（３×135cm）に付す。30％
酢酸で溶出し、510−580mlの画分を集めて凍結乾
燥する。収量64mg。〔α〕23 D−26.0゜（ｃ＝0.2、80％
酢酸中）、Rf30.76（アビセル）、アミノ酸分析（４
％チオグリコール酸、5.7N塩酸加水分解）：
Trp1.07(1)；Asp2.06(2)；Thr0.98(1)；Glu1.06
(1)；Val0.97(1)；Met1.00(1)；Leu1.04(1)：
Phe1.11(1)、ペプチド含量73％ 参考例 ４ 〔ペプチド（）（13−29）〕の製造 (1) Ｚ−βAla−Tyr−Leu−OMeの製造 Boc−Tyr−Leu−OMe10.2ｇをTFA100ml
に溶かし、室温で15分間振り混ぜたのち、濃縮
し、エーテル10.0mlを加えて粉末としてろ取し
乾燥する。これをTHF150mlに溶かし、氷冷し
TEA4.0mlを加え、次にＺ−βAlaONB8.5ｇを
加えて15時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物を酢酸エチル300mlに溶かし、
飽和炭酸水素ナトリウム水（200ml×３）、10％
クエン酸水（200ml×３）、水（200ml×３）の
順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。
溶媒を留去したのち、残留物に石油ベンジンを
加えて粉末としてろ取し、さらに酢酸エチル−
石油ベンジンより再沈澱する。収量10.7ｇ
（83.3％）m.p.112−113℃、〔α〕21.5 D−12.8゜（ｃ
＝0.8、DMF中）、C27H35O7N3としての元素分
析計算値：C63.14；H6.87：N8.18、実験値：
C62.97；H6.91；N8.09 (2) Ｚ−βAla−Tyr−Leu−OHの製造 Ｚ−βAla−Tyr−Leu−OMe5.0ｇをメタノ
ール40mlに溶かし、氷冷し、2N−水酸化ナト
リウム水12mlを加えたのち、室温にもどし、90
分間かき混ぜる。これを氷冷し、1N塩酸24ml
を加えて中和したのち、溶媒を減圧で留去す
る。残留物を酢酸エチル200mlに溶かしたのち、
水洗（200ml×２）し、無水硫酸ナトリウムで
乾燥する。溶媒を留去すると結晶が析出するの
で、これにエーテルを加えて洗浄したのち、ろ
取する。収量4.4ｇ（90.5％）m.p.144−145℃
〔α〕21.5 D−5.7゜（ｃ＝0.9、DM中）、C26H33O7N3
としての元素分析計算値：C62.50；H6.66；
N8.41、実験値：C62.27；H6.58；N8.82 (3) 〔ペプチド（）（13−29）〕の製造 Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val
−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OBzl4.6ｇにアニソール0.5ｇを加え、窒素気流
中、TFA35mlを加えて、室温で15分振り混ぜ
たのち、濃縮し、エーテルを加えて粉末として
ろ取する。これをNMP20mlにとかし、氷冷
し、TEA0.8mlを加えてよく振り混ぜたのち、
エーテルを加えて粉末としてろ取する。これを
DMF550mlにとかし、Ｚ−βAla−Tyr−Leu−
OH0.90ｇ、HONB0.64ｇを加えて氷−食塩で
冷却し、DCC0.55ｇを加えて、15時間かき混ぜ
る。析出したDCUをろ去したのち、溶媒を減
圧で留去し、残留物に、酢酸エチル70mlを加え
て粉末としてろ取する。収量4.3ｇ。この様に
して得られた保護ペプチド１ｇに、アニソール
1.5mlを加え、無水弗化水素10mlを加えて０℃、
60分間かき混ぜたのち、濃縮し、残留物を水50
mlにとかす。これをエーテル50mlで洗浄したの
ち、アンバーライトIRA−410（酢酸型）のカラ
ム（１×10cm）を通し、凍結乾燥する。これを
水100mlに溶かし、CMCのカラム（2.2×23cm）
に付す。0.005M酢酸アンモニア水（500ml）か
ら0.2M酢酸アンモニア水（500ml）までの線型
勾配で溶出し、220−360mlまでの画分を集めて
凍結乾燥する。これを50％酢酸５mlに溶かし、
セフアデツクスLH20のカラム（2.4×118cm）
に付し、50％酢酸で溶出し、130−166mlまでの
画分を集めて凍結乾燥する。収量80mg。この様
にして得られたペプチドのうち、70mgを50％酢
酸７mlに溶かし、チオグリコール酸0.35mlを加
えて45℃で12時間放置したのち、チオグリコー
ル酸を0.35mlを追加し、45℃でさらに24時間放
置すると反応が完結する。これをセフアデツク
スＧ−25のカラム（2.4×120cm）に付し、50％
酢酸で溶出し、160−220mlまでの画分を集め
て、凍結乾燥する。収量66mg、〔α〕21.5 D−29.3゜
（ｃ＝0.4、50％酢酸中）Rf30.61（アビセル）、
アミノ酸分析（４％チオグリコール酸、5.7N
塩酸加水分解）：Arg2.19(2)；Trp0.92(1)；
Asp3.44(3)；Thr0.91(1)；Ser0.69(1)；Glu2.32
(2)；Ala1.12(1)；Val1.14(1)；Met1.00(1)；
Leu2.02(2)；Tyr1.05(1)；Phe1.05(1)；βAla1.13
(1)（ペプチド含量81％）。 参考例 ５ ペプチド（）（15−29）とBSAとの結合体の
製造 (1) 参考例１で得られたペプチド（）（15−29）
10mg、BSA20mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.3）
４mlに溶解し、５％GLA水溶液４mlを加えて
室温で３間かき混ぜた後、４℃で透析（水２
×４）し、凍結乾燥し、結合体を得た。収量38
mg。 参考例 ６ ペプチド（）（15−29）とBSAとの結合体の
製造 (2) 0.2％のBSA水溶液10mlに無水コハク酸２mg
の小片を徐々に加え、0.1N−NaOHでPHを7.0
から8.0に保ちながら反応させBSAをスクシニ
ル化する。反応終了後、４℃で透析（水２×
４）し、凍結乾燥する。得られたスクシニル化
BSAに参考例１で得られたペプチド（）（15
−29）10mgを加え、0.05Mリン酸緩衝液（PH
6.5）10mlに溶解し、更にECDI10mgを徐々に添
加して、４℃で２日間ゆるやかに撹拌しながら
反応させる。反応終了後、４℃で透析（水２
×４）し、凍結乾燥し、結合体を得た。収量39
mg。 参考例 ７ ペプチド（）（13−29）とBSAとの結合体の
製造 参考例５におけるペプチド（）（15−29）10
mgの代りに、参考例４で得られたペプチド（）
（13−29）10mgを用いて、以下、全く同様に処理
してBSAとの結合体を得た。収量39mg。 参考例 ８ 抗体の製造法 参考例５、６、もしくは７と同様な方法で製造
したペプチドとBSAとの結合物２mgを生理食塩
水１mlに溶解し、これにフロインドの完全アジユ
バンド（Freund′s complete adjuvant）１mlを
加えてよく混和し、乳剤を作り、これをウサギの
両大腿部筋肉内および背部皮下数ケ所に注射す
る。以上の操作を２週おきに５回行ない、最終免
疫後１週間で採血し、パイロツトアツセイを行
う。その結果、膵グルカゴンと特異的に反応し、
腸管グルカゴンとは反応せず、最終希釈倍数
00000〜500000倍で使用可能なグルカゴン抗体を
得ることができた。 実施例 １ ペプチド（）（15−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの結合体の製造 参考例１で得られたペプチド（Ｉ）（15−29）
２mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH6.3）２に懸濁
し、得られた混合物に、THFに溶解した0.5％ｍ
−MBHS0.5mlを添加して30℃で30分反応させ
る。反応混合物を0.1Mリン酸緩衝液で平衡させ
たセフアデツクスＧ−25のカラム（0.9×53cm）
に通し、過剰の試薬とマレイミド化ペプチドとを
分離する。得られたマレイミド化ペプチド溶液１
mlにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（５mg／ml）
0.1mlを添加し、時々振り混ぜながら室温で２時
間反応させる。反応終了後、0.1％BSA、0.1％
NaN3、0.1MNaClおよび１ｍＭ MgCl2を含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いるセフアロ
ース6Bカラムクロマトグラフイーで精製し、酵
素含有フラクシヨンを分取し、ペプチド−酵素縮
合体を得た。 以下、本縮合体の物性について述べる。 本縮合体はEIAで用いる合成基質。−ニトロ
フエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドや４−
メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを分解し、それぞれｏ−ニトロフエノ
ールや４−メチルウンベリフエロンを遊離す
る。 酵素活性の至適PHは7.0〜7.7である。 酵素活性を有する本縮合体の約90％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で６ケ月以上安
定である。 分子量は約55万でペプチド（）／酸素のモ
ル比は約７である。 PH５−９の水性溶媒に易溶である。 紫外吸収スペクトルは第２図を参照。 アミノ酸分析値は第５表を参照。 他の物性はβ−Ｄ−ガラトシダーゼの物性
（“The Enzymes”、第７巻（1972年）、第617
頁、Boyer著、Academic Press、New、
York−London）に準ずる。 実施例 ２ ペプチド（）（15−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、参考例２で得られたペプチド（）
（15−29）２mgを用いて、以下、全く同様に処理
してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとの縮合体を得
た。 本縮合体の物性は次の項目（および）を除
いて実施例１で述べた縮合体の物性（、、
、および）と類似である。 酵素活性を有する本縮合体の約80％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で６ケ月以上安
定である。 分子量は約55万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約６である。 実施例 ３ ペプチド（）（21−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、参考例３で得られたペプチド（）
（21−29）1.2mgを用いて、以下、全く同様に処理
してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとの縮合体を得
た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例１で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約55万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約８である。 実施例 ４ ペプチド（）（13−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、実施例４で得られたペプチド（）
（13−29）2.4mgを用いて、以下、全く同様に処理
してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとの縮合体を得
た。 本縮合体の物性は次の項目（、および）
を除いて実施例１で述べた結合体の物性（、
、、および）と類似である。 酵素活性を有する本縮合体の約75％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で６ケ月以上安
定である。 分子量は約55万でペプチド（）／酵素モル
比は約５である。 アミノ酸分析値は第６表を参照。 実施例 ５ ペプチド（）（15−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 アルカリホスフアターゼ懸濁液（５mg／ml）
0.2mlを遠心分離し、得られた沈澱物を0.1Mリン
酸緩衝液（PH6.8）0.1mlに溶解する。一方、参考
例１で得られたペプチド（）（15−29）１mgを
同じ緩衝液１mlに溶解し、上記の酵素溶液に添加
する。次いで２％GLA溶液0.1mlを添加し室温で
２時間反応させたのち、同じリン酸緩衝液に対し
て約５℃で一夜透析する。更に0.1MNaClを含む
リン酸緩衝液（PH6.8）を用いるセフアデツクス
G100カラムクロマトグラフイーで精製し酵素含
有フラクシヨンを分取し、ペプチド−酵素縮合体
を得た。 以下、本縮合体の物性について述べる。 本縮合体はEIAで用いる合成基質フエニルリ
ン酸やｐ−ニトロフエニルリン酸を分解し、そ
れぞれフエノールやｐ−ニトロフエノールを遊
離する 酵素活性の至適PHは9.5−10.5である。 酵素活性を有する本縮合体の約90％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で３ケ月以上安
定である。 分子量は約14万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約20である。 PH６−11の水性溶媒に易溶である。 紫外吸収スペクトルは第３図を参照。 アミノ酸分析値は第７表を参照。 他の物性はアルカリホスフアターゼの物性
（“The、Enzymes”、第４巻（1971年）、第417
頁、Boyer著、Academic Press、New York
−London）に準ずる。 実施例 ６ ペプチド（）（15−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、参考例２で得られたペプチド（）
（15−29）１mgを用いて、以下、全く同様に処理
してアルカリホスフアターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例５で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約14万でペプチド（）／酵素モル
比は約20である。 実施例 ７ ペプチド（）（21−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、参考例３で得られたペプチド（）
（21−29）0.6mgを用いて、以下、全く同様に処理
してアルカリホスフアターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例５で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約13万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約23である。 実施例 ８ ペプチド（）（13−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、参考例４で得られたペプチド（）
（13−29）1.2mgを用いて、以下、全く同様に処理
してアルカリホスフアターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（および）を除
いて実施例５で述べた縮合体の物性（、、
、、および）と類似である。 分子量は約14万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約16である。 アミノ酸分析値は第８表を参照。 参考例 ９ 膵グルカゴン（１−29）とβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、膵グルカゴン（１−29）４mgを用い
て、以下、全く同様に処理してβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（および）を除
いて実施例１で述べた縮合体の物性（、、
、、および）と類似である。 酵素活性を有する本縮合体の約65％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で３ケ月以上安
定である。 分子量は約55万で膵グルカゴン／酵素のモル
比は約３である。 参考例 10 膵グルカゴン（１−29）とアルカリホスフアタ
ーゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、膵グルカゴン（１−29）２mgを用い
て、以下、全く同様に処理してアルカリホスフア
ターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例５で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約15万で膵グルカゴン／酵素のモル
比は約13である。 実施例 ９ 予備試験において各抗血清（30K、N16aおよ
びN6c）について、種々の希釈度の抗血清濃度
〔緩衝液0.2ml、ペプチド−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ複合体0.1mlおよび抗血清（１：100〜１：
1000000に希釈したもの）0.1ml〕の試料を５℃で
一昼夜保つことによつて、各々のペプチド−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体〔予め決定しておい
た適当な濃度（約10μU／ml）を有する〕の酵素
活性をもつ部分を抗血清に結合させる。次に抗ウ
サギIgG血清（市販の抗血清を予め10倍希釈した
もの）0.1mlおよび１％の正常ウサギ血清を含む
緩衝液0.1mlを加え、得られた混合物を５℃で一
夜放置する。次に、この混合物を遠心分離してか
ら沈澱物を洗浄し、酸素基質液〔0.1％、BSA、
0.1％NaN3、0.1M NaClおよび１ｍＭ MgCl2
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した
20μｇ／mlの４−メチルウンベリフエリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド〕0.5mlに懸濁し、37℃
で２時間反応させる。反応終了後、励起波長
365nｍ、螢光波長450nｍで酵素分解の結果遊離
した４−メチルウンベリフエロンの螢光強度を測
定した。 次に検液中の膵グルカゴンの定量の場合には、
上記のごとく定めた一定の希釈度の抗血清とペプ
チド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体とのそれ
ぞれ0.1mlを、検液0.1mlと緩衝液0.1mlとの混合物
に添加して、以後上記のごとく定量した。 得られた結果は第１〜３表に示す通りであつ
た。 第１表で明らかなように30K抗血清は、ペプチ
ド（）−もしくはペプチド（）−酵素縮合体と
組み合せて用いられる時、従来のhomologousな
結合様式を示す膵グルカゴン−酵素縮合体と共に
用いられる時よりはるかに感度の高い結果を与え
ることが分る。 同様にN16a（第２表）やN6c（第３表）抗血清
も、本発明方法に従うheterologousな結合様式を
示すペプチド（）−もしくはペプチド（）−酵
素縮合体と組み合せて用いられる時、膵グルカゴ
ンの低濃度域で感度が特に良くなる。 以上のように、膵グルカゴンの酵素免疫測定法
において、アツセイで用いる膵グルカゴン抗体の
調製に用いるペプチドとは異なるペプチドと標識
酵素との縮合体を、その抗体と組み合せて用いる
時（heterologousなアツセイ系）、きわめて感度
の高い結果が得られることが分る。
の血糖調節に重要な役割を演じているホルモンで
あり、この分泌動態を知ることは、糖代謝異常の
解明に不可欠である。したがつて、簡便でかつ精
度の高い測定法の確立は極めて重要であり、現在
ラジオイノムノアツセイ（以下、RIAと称する。）
が広く行われている。 しかしながら、このRIAにおいては衆知の如
く、放射性同位元素の使用が不可欠となるため、
放射性同位元素による人体への影響や環響汚染の
懸念が多く、また法律上必要な特殊な設備・機器
あるいは取扱い資格を持つ検査員を配置しなけれ
ばならないという欠点がある。このようなRIAの
欠点を補い、かつ簡便にして高感度な定量性を有
した測定法として登場したのが酵素免疫測定法
（以下、EIAと称する。）である。 EIAはRIAと類似の測定原理に基づいている
が、標識物質として酵素を用いるため、通常の実
験室・臨床検査室で手軽に採用できる手法であ
る。しかし膵グルカゴンの血中濃度は極めて微量
であるため、感度においてRIAに劣る従来のEIA
では実験の臨床検体について満足すべき結果を得
ていないのが現状である。 本発明者らは、かかる技術的背景のもとに、
RIAと同等もしくはそれ以上の感度と精度で体液
中の膵グルカゴンを特異的に定量できるEIAを得
ることを目的とし、種々のペプチドを合成し、そ
の酵素標識体を用いて検討した結果、特異抗体の
調製に用いるペプチドとは異なるペプチドと標識
酵素との縮合体が、本目的に極めて有用であると
いう新知見を得、これに基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成したものである。 本発明は、(1)一般式 Ｈ−R1−Phe−Val−Gln−Trp −Leu−R2−Asn−Thr−OH 〔式中、R1は で示されるペプチドの10位のAspを含む１〜10個
の部分ペプチド鎖を、R2はMetまたはNleを、そ
れぞれ表わす。〕で表わされるペプチドと標識酵
素とを縮合して得られるペプチド−酵素縮合体、
および(2)ペプチド−酵素複合体を試薬の一種とし
て用いる膵グルカゴンの酵素免疫測定法におい
て、該ペプチド−酵素複合体として一般式 Ｈ−R1−Phe−Val−Gln−Trp −Leu−R2−Asn−Thr−OH 〔式中、R1は で示されるペプチドの10位のAspを含む１〜10個
の部分ペプチド鎖を、R2はMetまたはNleを、そ
れぞれ表わす。〕で表わされるペプチドと標識酵
素とを縮合して得られるペプチド−酵素縮合体を
用いることを特徴とする膵グルカゴンの酸素免疫
測定法、である。 本発明におけるR1で示される のペプチドの10位のAspを含む１〜10個の部分ペ
プチド鎖としては、たとえばAsp、Gln−Asp、
Ala−Gln−Asp、Arg−Ala−Gln−Asp、Arg−
Arg−Ala−Gln−Asp、Ser−Arg−Arg−Ala−
Gln−Asp、Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp、Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp、Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala
−Gln−Asp、β−Ala−Tyr−Leu−Asp−Ser
−Arg−Arg−Ala−Gln−Aspなどが挙げられ
る。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Arg：アルギニン Trp：トリプトフアン Asn：アスパラギン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ser：セリン Glu：グラタミン酸 Gln：グルタミン Ala：アラニン Val：バリン Met：メチオニン Met（Ｏ）：メチオニンスルフオキシド Leu：ロイシン Tyr：チロシン β−Ala：β−アラニン Nle：ノルロイシン Phe：フエニルアラニン Ｚ：カルボベンゾキシ Boc：ｔ−ブチルオキシカルボニル OBut：ｔ−ブチルエステル OBzl：ベンジルエステル ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキシイミドエステル MBS：ｐ−メトキシベンゼンスルホニル HONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド DCC：Ｎ，N′−ジシクロヘキシカルボジイミド DCU：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルウレア PMF：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド NMP：Ｎ−メチル−２−ピロリドン TFA：トリフルオロ酢酸 THF：テトラヒドロフラン TEA：トリエチルアミン DCHA：ジシクロヘキシルアミン CMC：カルボキシメチルセルロース ECDI：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド CMCT：１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）−カルボジイミドメト−ｐ−トル
エンスルホネート GLA：グルタルアルデヒド ｍ−MBHS：メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ハイドロキシスクシンイミドエステル ｐ−MCHS：パラ−マレイミドメチルシクロヘ
キサン−１−カルボキシル−Ｎ−ハイドロキシ
スクシンイミドエステル BSA：牛血清アルブミン 本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチ
ド合成の公知の常套手段で製造しうる。固相合成
法、液相合成法のいずれによつてもよいが、液相
合成法が有利な場合が多い。そのようなペプチド
合成手段は、たとえば“The Peptides”、第１巻
（1966）、Schro¨der and Lubke著、Academic
Press、New、York、U.S.A.あるいは“ペプチ
ド合成”、泉屋ら著、丸善株式会社（1975年）に
記載されており、たとえばアジド法、クロライド
法、酸無水物法、混酸無水、物法、DCC法、活
性エステル法、ウツドワード試薬Ｋを用いる方
法、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、
DCC／アデイテイブ（例、HONB、HOBt、
HOSu）法などがあげられる。 膵グルカゴンの酵素免疫測定法としては、(1)未
知量の膵グルカゴンを含有する体液、たとえば血
清にペプチド−酵素複合体の一定量および不溶性
の形をした膵グルカゴン特異抗体の一定量を加
え、液相中のペプチド−酵素複合体または固相中
の反応したペプチド−酵素複合体について酵素活
性を測定することによつて検液中の膵グルカゴン
を定量する方法〔フエブス・レターズ（FEBS
Letters）15巻232頁（1971年）参照〕、(2)膵グル
カゴン含有検液にペプチド−酵素複合体の一定量
および溶解性の膵グルカゴン特異抗体の一定量を
加え、競合的に結合させたのち、最初の抗体に対
する不溶性の第２抗体〔たとえば、ウサギを用い
て膵グルカゴン特異抗体を調製した時はウサギイ
ムノグロブリンＧ（IgG）抗体〕の一定量を加え、
上記(1)と同様に液相または固相中の酵素活性を測
定し検液中の膵グルカゴンを定量する方法（上記
フエブス・レターズ参照）、および(3)上記(2)と同
様に膵グルカゴン含有検液にペプチド−酸素複合
体の一定量および溶解性の膵グルカゴン特異抗体
の一定量を加え、競合的に結合させたのち、第２
抗体と第２抗体が抗動物（例、ウサギ）IgG抗体
の時は正常動物（例、ウサギ）血清との一定量を
加えて沈澱を生ぜしめ、(1)と同様に液相または固
相中の酵素活性を測定し、検液中の膵グルカゴン
を定量する方法〔クリニカ・キミカ・アクタ
（Clinica Chimica Acta）67巻263頁（1976年）〕
に適用できる。いずれの方法においても、液相中
の酵素活性を測定する場合は検液中に存在する夾
雑物により酵素活性の測定が妨害されることがあ
るので、固相の活性を測定するのが有利である。
また再現性および感度の点からは、微量の膵グル
カゴン特異抗体の使用で測定の可能な「二重抗体
法」、即ち(2)および(3)の方法がより好ましく用い
られる。 これらいずれの方法においても、抗体に対する
ペプチド−酵素複合体の親和力を膵グルカゴンの
それよりも減少させうるならば、これらの測定系
では複合体と抗体との結合は微量の膵グルカゴン
の存在により容易に置換され、膵グルカゴンの非
常に低い濃度を測定することができる。 標識物質として用いられる酸素は安定で比活性
の大きなものであれば良く、たとえばペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グ
ルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリ
ホスフアターゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラ
ーゼ、タカアミラーゼＡ、ウレアーゼ、コリンエ
ステラーゼ等が都合よく用いられ、好ましくはβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼが良く用いられる。 本発明中のペプチド−酵素縮合体を調製するた
めに、ペプチドおよび酵素の各成分中に存在して
いる置換基、たとえばアミノ基、カルボキシル
基、ヒドロキシ基またはスルフヒドリル基などを
利用することができる。縮合試薬としては、たと
えば(1)ペプチドと酵素いずれか一方の反応性アミ
ノ基と他方の反応性カルボキシル基とを水性溶媒
中で脱水縮合させるECDIやCMCTなどの水溶性
カルボジイミド試薬、(2)ペプチドの反応性アミノ
基をＮ−ハイドロキスクシンイミドの活性エステ
ルと反応させマレイミド化したのち酵素と反応さ
せ、酵素のスルフヒドリル基と結合させるｍ−
MBHSやｐ−MCHSなどのＮ−ハイドロキシス
クシンイミドエステルのマレイミド化試薬、(3)ペ
プチドと酵素いずれか一方の反応性アミノ基を他
方の反応性アミノ基と結合させるスクシンジアル
デヒドやGLAなどのジアルデヒド試薬などが用
いられる。 ペプチドと酵素との縮合反応においては、ペプ
チドと酵素との縮合反応に使用しうる縮合試薬な
らいずれを用いてもよく、好ましくは上記のカル
ボジイミド試薬、マレイミド試薬およびジアルデ
ヒド試薬などが用いられる。またこれら縮合反応
は水性溶媒中で行うことができるが、この水性溶
媒としては、ペプチドと酵素との縮合反応に使用
しうることが知られているものから適宜選択され
うる。その例としては、たとえばPH６〜８のリン
酸緩衝液、PH７〜９のホウ酸緩衝液などが挙げら
れる。 ペプチドと酵素との縮合反応の反応時間は通常
30分〜20時間であるが、酵素の安定性を考慮する
と、30分〜３時間の短時間が好ましい。しかし低
温における縮合反応では２〜４日に及ぶ反応時間
を採用することもできる。反応温度は通常約４℃
〜50℃、好ましくは約15℃〜30℃の範囲から適宜
選択される。 本縮合反応終了後、ペプチド−酵素縮合体はセ
フアデツクスG100もしくはG200（フアルマシ
ア・フアイン・ケミカルズ社製）またはセフアロ
ース6Bもしくは4B（フアルマシア・フアイン・
ケミカルズ社製）などのカラムクロマトグラフイ
ーにより精製、分取できる。 本発明方法に用いる好ましいペプチド−酵素縮
合体の例としては、膵グルカゴンを用いてウサギ
で調製した30KやG21特異抗体等により膵グルカ
ゴンを定量する時は、式 （R1は膵グルカゴンの21位までの１−９個の部
分ペプチド鎖、R2はMetまたはNleをそれぞれ示
す。）で表わされるペプチドと酵素とを縮合せし
めて得たペプチド−酵素縮合体を用いると感度の
良い結果を与え、特に で表わされるペプチド（）と酵素との複合体を
用いると良く、またペプチド（）を用いてウサ
ギで得たN6c抗体により膵グルカゴンを定量する
時は、式 （R1は膵グルカゴンの21位までの１−７個の部
分ペプチド鎖、R2はMetまたはNleをそれぞれ示
す。）で表わされるペプチドと酵素とを縮合せし
めて得たペプチド−酵素縮合体を用いると感度の
良い結果を与え、特に 〔ペプチド（）〕もしくは 〔ペプチド（）〕と酵素との縮合体を用いると
感度の良い結果を与える。 本発明方法で用いる抗体は、膵グルカゴンおよ
びペプチド−酵素縮合体と反応性を有する抗体の
いずれを用いてもよく、たとえばUngerらの30K
（“Diabetes”、第17巻（1968年）、第321頁）、大
根田らのG21（“Diabetes”、第18巻（1969年）、第
１頁）、桜井らのR517（“内科宝函”、第23巻
（1975年）第247頁）および参考例８、実施例９で
挙げられたN6cおよびN16a膵グルカゴン特異抗
体が好都合に用いられる。 また本発明方法に用いる第２抗体は、膵グルカ
ゴン特異抗体を調製する時使用した動物種（例、
ウサギ）のIgGを他の動物種（例、ヤギ）に頻回
注射して調製することができる。この免疫方法は
通常の抗体調製法のいずれを用いてもよく、たと
えばフロイント・コンプリート・アジユバンド
（Freund complete adjuvant）と共に１回約２
mgのIgGを３週間おきに約４回皮下投与すると満
足すべき抗体が得られる。また市販の抗ウサギ
IgG血清（ヤギ）（マイルズ・ラボラトリー社）
などを使用してもよい。 不溶性の第２抗体は、上記のごとく得られた抗
IgG血清を硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウ
ムで塩析沈澱させ、更にDEAE−セルロースカラ
ムクロマトグラフイーで分取した抗IgG血清の
IgGフラクシヨンを、ブロムシアンで活性化し
た、たとえばセルロースやセフアデツクスなどの
固相に結合させることによつて得られる
（“FEBS Letters”、第15巻（1971年）、第232
頁）。または上記の抗血清のIgGフラクシヨンを、
ガラスビーズ、シリコン片またはポリスチレン粒
子などに接触させることによつて物理的にこれら
固相に第２抗体を吸着させて得ることもできる
（“化学と生物”、第14巻（1976年）、第741頁）。 本発明のEIAにおいて用いられる血清としては
被検血清として用いられうるものであればどのよ
うな血清を用いてもよく、たとえばヒト、ラツ
ト、マウス、モルモツトなどの哺乳動物の血清が
挙げられ、とりわけヒト血清中の膵グルカゴン動
態を知る目的でヒト血清が繁用される。 本発明方法は従来行なわれている膵グルカゴン
のEIAに比し、感度の良い結果を与えるので、利
用価値の高いものである。その感度はRIAに匹敵
するものであり、したがつて本発明のEIAは、放
射性同位元素（以下、RIと称する。）の使用に併
う種々の欠点を有するRIAにとつて代り、RI管
理設備を有しないいずれの臨床検査室においても
採用可能であり、血中の膵グルカゴン濃度を簡便
に定量できる特徴を有する。また本発明のペプチ
ド−酵素複合体は、半減期をもつRIと異なり、
安定であるため、同一ロツトにより多数の検体の
測定が可能で再現性の良い結果を与える。 以下に、本発明を実施例・参考例によりさらに
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。 以下の参考例において、薄層クロマトグラフイ
ーは、メルク社製シリカゲルプレート60F254又
は、フナコシ薬品社製セルロースプレートアビセ
ルSFを用い、下記の展開溶媒を用いた。 Rf1：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5 Rf2：クロロホルム：メタノール：水＝７：３：
0.5 Rf3：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24 参考例 １ 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 (1) Boc−Asn−Thr−OBzlの製法 Boc−Thr OBzl112ｇをTFA300mlに溶か
し、室温で20分間振り混ぜた後、濃塩酸30mlを
加え、溶液を減圧濃縮する。残留物をTHF1
に溶かし、氷冷し、TEA50mlを加えて中和す
る。これにBoc−Asn−OH76.7ｇ、
HONB64.5ｇ、DCC74.3ｇを加えて15時間かき
混ぜる。析出したDCUをろ去した後、溶媒を
減圧で留去し、残留物を酢酸エチル１に溶か
す。これを10％クエン酸水（300ml×３）、飽和
炭酸水素ナトリウム水（300ml×３）、水（300
ml×３）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで
乾燥する。溶媒を減圧で留去した後、残留物に
エーテル（１）を加えて、粉末として、ろ取
した後、アセトニトリルより再結晶する。収量
105.1ｇ（75.2％）m.p.165−166℃〔α〕23 D−
13.9゜（ｃ＝0.9、DMF中）、Rf10.51、
C20H29O7N3としての元素分析計算値：
C56.75；H6.90；N9.92、実験値：C57.01；
H6.89；N9.94 (2) Boc−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Asn−Thr−OBzl50.0ｇにTFA170ml
を加えて、室温で30分間振り混ぜた後、濃縮し
エーテル500mlを加えて粉末としてろ取し、乾
燥する。これをTHF400mlに溶かし、氷冷し
TEA20mlを加えた後、Boc−Met（Ｏ）−ONB
（Boc−Met（Ｏ）・OH31.3ｇ、HONB23.3ｇを
THF200mlに溶解し、氷冷し、DCC26.8ｇを加
えて、４時間かき混ぜて調製する。）を加え、
15時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去したの
ち、残留物に酢酸エチル（200ml）、エーテル
（200ml）を加え、粉末としてろ取し、アセトニ
トリルより再沈澱する。収量48.5ｇ（72.0％）、
m.p.145−147℃〔α〕23 D−6.5（ｃ＝1.1、DMF
中）、Rf10.19、C25H38O9N4Sとしての元素分析
計算値：C52.62；H6.71；N9.82；S5.62、実験
値：C52.44；H6.73；N9.60；S5.15 (3) Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの
製法 Boc−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl15.0ｇに
TFA45mlを加え、室温で45分間振り混ぜた後、
濃縮し、エーテル100mlを加えて粉末としてろ
取し、乾燥する。これをDMF50mlに溶解し、
氷冷し、TEA5.7mlを加え、これにBoc−Leu
−ONB（Boc−Leu−OH6.69ｇ、HONB5.70
ｇ、DCC6.56ｇより調製）を加えて、15時間か
き混ぜる。溶媒を減圧で留去した後、残留物に
酢酸エチル200mlを加えて、粉末としてろ取し、
アセトニトリル−酢酸エチルより再沈澱する。
収量15.0ｇ（83.4％）、m.p.134−136℃、〔α〕24 D
−15.1゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.25、
C31H49O10N5Sとしての元素分析計算値：
C54.45；H7.22；N10.24；S4.69、実験値：
C54.62；H7.60；N9.89；S3.95 (4) Boc−Gln−Trp−OBzlの製造 Ｈ−Trp−OBzl・パラトルエンスルホン酸
塩50.0ｇをTHE500mlに溶かし、氷冷し、
TEA15.4ml、Ｚ−Gln−OH28.0ｇ、
HONB19.7ｇ、DCC22.7ｇを加えて、15時間か
き混ぜる。析出したDCUをろ去した後、濃縮
し、残留物を酢酸エチル300mlに溶かす。これ
を飽和炭酸水素ナトリウム水（150ml×２）、10
％クエン酸水（150ml×２）、水（150ml×２）
で順次洗浄する。溶媒を減圧で留去した後、残
留物をTHF300mlに溶かし、不溶物をろ去す
る。これを濃縮した後、エーテル500mlを加え
て、粉末としてろ取し、アセトニトリルより再
結晶する。収量46.1ｇ（82.8％）、〔α〕23 D＋5.8゜
（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.60、C31H32O6N4と
しての元素分析計算値：C66.89；H5.80；
N10.07、実験値；C66.79；H5.71；N10.20 (5) Ｚ−Val−Gln−Trp−OHの製造 Ｚ−Gln−Trp−OBzl50.0ｇをメタノール
700mlに溶かし、５時間接触還元（触媒：パラ
ジウム黒）すると、結晶が析出するので、これ
をろ取する。これをDMF300mlに懸濁し、
TEA13mlを加えて溶かし、触媒をろ去する。
これにＺ−Val−ONB37.0ｇを加えて、10時間
かき混ぜた後、1N−塩酸100mlを加えて中和
し、さらに水500mlを加えて粉末としてろ取す
る。これをメタノールで十分洗浄する。収量
43.0ｇ（84.7％）、m.p.246−247℃〔α〕23 D＋
12.4゜（ｃ＝0.9、DMF中）、Rf10.14、
C29H35O7N5としての元素分析計算値：
C61.58；H6.24；N12.38、実験値：C61.86；
H6.30；N12.36 (6) Ｚ−Phe−Val−Gln−Trp−OHの製造 Ｚ−Val−Gln−Trp−OH5.1ｇを酢酸10ml
に溶かし、３時間接触還元したのち触媒をろ去
し、濃縮する。これをDMF200mlに懸濁し、こ
れにTEA2ml、Ｚ−Phe−OH2.70ｇより調製し
たＺ−Phe−ONBを加えて、７時間かき混ぜ
る。溶媒を減圧で留去し、残留物に酢酸水を加
えてゲルとしてろ取する。これをメタノールよ
り再沈澱する。収量5.50ｇ（84.5％）、m.p.240
℃、〔α〕24 D＋4.1゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.15、
C38H44O8N6・1/2H2Oとしての元素分析計算
値：C63.23；H6.28；N11.64、実験値：
C63.11；H6.29；N11.80 (7) Boc−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−
OHの製造 Ｚ−Phe−Val−Gln−Trp−OH8.5ｇを、
DMF150ml、酢酸50mlの混液に溶かし、５時間
接触還元する。触媒をろ去した後、濃縮し、残
留物にメタノール100mlを加えて結晶としてろ
取する。これを、DMF200mlに懸濁し、
TEA3.0ml、Boc−Asp（OBzl）ONB（Boc−
Asp（OBzl）−OH3.9ｇ、HONB2.4ｇ、DCC2.7
ｇより調製）を加えて、10時間かき混ぜる。溶
媒を減圧で留去したのち、残留物に酢酸水を加
えて、ゲルとしてろ取し、DMF、水より再沈
澱する。収量6.3ｇ（58.1％）、m.p.191−192℃
（分解）、〔α〕24 D−6.2゜（ｃ＝1.1、DMF中）、
Rf10.11、C46H57O11N7・3/2H2Oとしての元素
分析計算値：C60.64；H6.63；N10.76、実験
値：C60.30；H6.48；N11.34 (8) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−OHの製造 Boc−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−
OH6.0ｇに、TFA50mlを窒素気流中加え、10
分間ふり混ぜた後、濃縮しエーテルを加えて粉
末としてろ取する。これをDMF100mlに溶かし
TEA2.0mlを加え、Boc−Gln−ONB（Boc−
Gln−OH1.76ｇ、HONB1.34ｇ、DCC1.54ｇか
ら調製）を加えて、15時間かき混ぜる。これに
酢酸水を加えて、粉末として、ろ取したのち、
アセトニトリル、水より再沈澱する。収量5.50
ｇ（82.6％）、m.p.210−212℃（分解）、〔α〕24 D
−10.1゜（ｃ＝1.1、DMF中）、Rf10.09、
C51H65O13N9としての元素分析計算値：
C60.52；H6.47；N12.46、実験値：C60.19；
H6.37；N12.23 (9) Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OButの製造 Ｚ−Ala−OBut31.0ｇをメタノール300mlに
溶かし、５時間接触還元した後、触媒をろ去
し、濃縮する。一方、Ｚ−Arg（MBS）−OH・
DCHA53.0ｇを酢酸エチル500mlに懸濁し、10
％クエン酸200mlを加えてよく振り混ぜた後、
水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。これ
をTHF500mlに溶かし、これに、先に調製した
Ｈ−Ala−OButを加えHONB14.9ｇを加えて
氷冷し、DCC17.1ｇを加えて10時間かき混ぜ
る。析出したDCUをろ去し、濃縮した後、酢
酸エチル500mlに溶かし、10％クエン酸水（200
ml×３）、飽和炭酸水素ナトリウム水（200ml×
３）、水（200ml×３）で洗浄し、無水硫酸ナト
リウムで乾燥する。溶媒を減圧下で留去したの
ち、残留物にエーテル300mlを加えて粉末とし
て、ろ取する。収量44.5ｇ（66.8％）、mp126−
127℃、〔α〕25 D−6.0゜（ｃ＝1.0、DMF中）、
Rf10.62、C28H39O8N5Sとしての元素分析計算
値：C55.52；H6.49；N11.56；S5.27、実験
値：C55.71；H6.49；N11.81；S5.29 (10) Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−OBut
の製造 Ｚ−Arg（MBS）−Ala−OBut43ｇをメタノ
ール500mlに溶かし、５時間還元したのち、濃
縮する。残留物をDMF200mlに溶かし、Ｚ−
Arg（MBS）−OH（Ｚ−Arg（MBS）−OH・
DCHA49.7ｇより調製）、HONB14.0ｇを加え、
氷冷し、DCC16.1ｇを加えて、15時間かき混ぜ
る。析出したDCUをろ去した後、濃縮し、残
留物をクロロホルム500mlに溶かす。これを10
％クエン酸水（300ml×３）、飽和炭酸水素ナト
リウム水（300ml×３）、水（300ml×３）の順
に洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒
を減圧で留去したのち、メタノール300mlを加
えて、結晶としてろ取し、メタノールより再結
晶する。収量52.4ｇ（79.2％）、m.p.116−118
℃、〔α〕25 D−8.8゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.42、
C41H57O12N9S2・2H2Oとしての元素分析計算
値：C50.86；H6.35；N13.02；S6.62、実験
値：C51.05；H6.08；N13.11；S6.62 (11) Boc−Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala
−OButの製造 Ｚ−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala−OBuu
30.0ｇをDMF80ml、メタノール300mlの混液に
溶かし、７時間接触還元する。触媒をろ去し、
メタノールを減圧で留去したのち、これにBoc
−Ser−OH7.3ｇ、HNB6.3ｇを加え、氷冷し、
DCC7.3ｇを加えて10時間かき混ぜる。析出し
たDCUをろ去し、溶媒を減圧で留去し、残留
物をクロロホルム500mlに溶かす。これを飽和
炭酸水素ナトリウム（300ml×２）、水（300ml
×２）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥す
る。溶媒を留去したのち、クロロホルム30mlに
とかしシリカゲルのカラム（400ｇ）につける。
クロロホルム：メタノール：酢酸（９：0.7：
0.35）の溶媒で展開し、800mlから２までの
画分を集めて、濃縮し、エーテルを加えて粉末
とする。収量25.5ｇ（79.0％）、m.p.85−88℃、
〔α〕26 D−20.9゜（ｃ＝1.0、メタノール中）、
Rf10.33、C41H64O14N10S2・H2Oとしての元素
分析計算値：C49.09；H6.63；N13.96；S6.39、
実験値：C48.96；H6.55；N13.70；S5.84 (12) Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−OHの製造 Boc−Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala
−OBut10.5ｇにTFA50mlを加え、室温で60分
振り混ぜた後、濃縮し、エーテル300mlを加え
て粉末としてろ取する。これをDMF50mlに溶
かし、TEA4.1ml、Boc−Asp（OBzl）−ONB
（Boc−Asp（OBzl）・OH3.40ｇ、HONB1.97
ｇ、DCC2.27ｇより調製）を加えて15時間かき
混ぜる。溶媒を減圧で留去したのち、残留物に
酢酸水を加えて、粉末として、ろ取し乾燥す
る。これをアセトニトリル・エーテルより再沈
澱する。収量6.0ｇ（51.5％）、m.p.126−130℃、
〔α〕24 D＋3.5゜（ｃ＝1.0、DMF中）、Rf10.17、
C48H67O17N11S2・2H2Oとして元素分析計算
値：C49.26；H6.12；N13.17；S5.48、実験
値：C49.62；H5.84；N13.00；S5.03 (13) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln
−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzlの
製造 Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OBzl3.25ｇにTFA25mlを加え室温で15分間ふ
り混ぜた後、濃縮し、残留物にエーテル100ml
を加えて粉末として、ろ取し、乾燥する。これ
をNMP10mlに溶かし、TEA2ml加えてよく振
り混ぜたのち、エーテル100mlを加え、粉末と
して再びろ取する。これをDMF100mlに溶か
し、さらにBoc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−
Val−Gln−Trp−OH4.80ｇ、HONB2.70ｇを
加えて溶かしたのち、氷冷し、DCC1.55ｇを加
えて58時間かき混ぜると反応液がゲル状にな
る。溶媒を減圧で留去したのち、残留物を含水
アセトニトリルで十分に洗浄する。収量5.75ｇ
（76.8％）、m.p.23.4℃（分解）、〔α〕26 D−15.8゜
（ｃ＝0.4、酢酸中）、Rf20.63、C77H104O20N14S
としての元素分析計算値：C58.61；H6.64；
N12.43；S2.03、実験値；C59.13；H6.96；
N12.40；S1.70 (14) Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−
Arg（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−
Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr
−OBzlの製造 Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl5.20
ｇにアニソール１mlを加え、さらに窒素気流
中、TFA35mlを加えて、室温で15分間かき混
ぜ、濃縮し、残留物にエーテル100mlを加えて
粉末としてろ取する。これをNMP20mlにとか
し、TEA2.77mlを加えて十分に振り混ぜたの
ち、エーテル200mlを加えて、粉末としてろ取
する。これをDMF150mlに溶かし、Boc−Asp
（OBzl）：Ser−Arg（MBS）−Arg（MBS）−Ala
−OH3.66ｇ、HONB2.36ｇを加え、氷、食塩
で−10℃に冷却し、DCC1.02ｇを加える。反応
液を０℃で10時間、室温で24時間かき混ぜたの
ち、析出したDCUをろ去し、溶媒を減圧で留
去する。残留物に水50mlを加えて粉末としてろ
取したのち、含水アセトニトリルで十分に洗浄
する。収量5.3ｇ（61.1％）、m.p.237℃（分解）、
〔α〕26 D−7.1゜（ｃ＝0.9、酢酸中）、Rf20.63、
C120H161O34N25S3・2H2Oとしての元素分析計
算値：C54.82；H6.32；N13.32；S3.57、実験
値：C54.47；H6.16；N13.07；S3.47 (15) Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）
−Asn−Thr−OHの製造 Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val
−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OBzl400mgにアニソール0.25mlを加え、これに
メタンスルホン酸５mlを加えて、室温で60分振
り混ぜた後、エーテル100mlを加えて油状物を
沈澱させる。エーテルを傾斜法で除いたのち、
残留物を水10mlにとかし、アンバーライトIRA
−410（酢酸型）のカラム（１×10cm）を通し、
溶出液（液量50ml）を氷冷し、3Nアンモニア
水10mlを加えて０℃で30分間かき混ぜたのち、
凍結乾燥する。これを水30mlにとかし、CMC
のカラム（2.2×18cm）に付し、水（500ml）か
ら0.2M酢酸アンモニア水（500ml）までの線型
勾配法で溶出し、150mlから195mlまでの画分を
集めて凍結乾燥する。収量150mg。次にこれを
水20mlに溶かし、アンバーライトXAD−２の
カラム（1.6×５cm）に付し、水（200ml）から
80％エタノール（200ml）までの線型勾配法で
溶出し、180mlから225mlまでの画分を集め、エ
タノールを留去したのち、凍結乾燥する。収量
115mg、〔α〕24 D−33.6゜（ｃ＝0.6、50％酢酸水中、
Rf30.54（アビセル）、アミノ酸分析（４％チオ
グリコール酸、5.7N−塩酸加水分解）：
Arg2.03(2)；Trp0.87(1)；Asp3.03(3)；Thr0.97
(1)；Ser0.73(1)；Glu2.13(2)；Ala1.00(1)；
Val1.03(1)；Met1.00(1)；Leu1.03(1)；Phe1.03
(1)、（ペプチド含量85.7％） (16) 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 Ｈ−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−
Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）
−Asn−Thr−OH225mgを５％チオグリコール
酸水20mlに溶かし、50℃で20時間放置するとゲ
ルが析出する。水を減圧で留去したのち、残留
物を50％酢酸５mlに溶かし、セフアデツクスＧ
−25のカラム（2.3×118cm）に付す。50％酢酸
水で溶出し、180mlから240mlまでの画分を集め
て凍結乾燥する。収量220mg、〔α〕24 D−30.0゜（ｃ
＝0.3、50％酢酸水中）、Rf30.59（アビセル）、
アミノ酸分析（４％チオグリコール酸、5.7N
−塩酸加水分解）：Arg2.15(2)；Trp0.91(1)；
Asp3.13(3)；Thr0.99(1)；Ser0.87(1)；Glu2.20
(2)；Ala1.05(1)；Val0.96(1)；Met1.00(1)；
Leu1.07(1)；Phe1.07(1)；ペプチド含量79.3％ 参考例 ２ 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 (1) Boc−Nle−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Asn−Thr−OBzl3.10ｇをTFA30mlに
溶かし、室温で10分間振り混ぜたのち、濃縮
し、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取し、
乾燥する。これをDMF30mlに溶かし、氷冷し、
TEA1.5mlを加えたのち、Boc−Nle−ONB
（Boc−Nle−OH1.69ｇ、HONB1.50ｇ、
DCC1.73ｇより調製する）を加え、15時間かき
混ぜる。溶媒を減圧で留去したのち、残留物に
水50mlを加えて粉末としてろ取し、乾燥する。
これをエーテルでよく洗浄する。収量3.80ｇ
（96.7％）m.p.160−163℃〔α〕21.5 D−13.6゜（ｃ＝
0.8、DMF中）、Rf10.58、C26H40O8N4としての
元素分析計算値：C58.19；H7.51；N10.44、実
験値：C58.40；H7.60；N10.37 (2) Boc−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Nle−Asn−Thr−OBzl3.50ｇを
TFA30mlに溶かし、室温で10分間振り混ぜた
のち、濃縮し、エーテル150mlを加えて粉末と
してろ取し、乾燥する。これをDMF30mlに溶
かし、氷冷しTEA1.2mlを加えたのち、Boc−
Leu−ONB（Boc−Leu−OH1.66ｇ、
HONB1.41ｇ、DCC1.63ｇより調製する）を加
え、15時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去した
のち、残留物に水50mlを加えて粉末としてろ取
し、乾燥する。これを酢酸エチルでよく洗浄す
る。収量3.60ｇ（83.8％）m.p.200−201℃、
〔α〕21.5 D−22.7゜（ｃ＝0.8、DMF中）、Rf10.60、
C32H51O9N5・1/2H2Oとしての元素分析計算
値：C58.34；H7.96；N10.63、実験値：
C58.06；H7.99；N11.02 (3) Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzlの製造 Boc−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzl2.00ｇを
TFA20mlに溶かし、室温で10分間振り混ぜた
のち濃縮し、エーテル70mlを加えて、粉末とし
てろ取し乾燥する。これをDMF10mlに溶かし、
氷冷し、TEA1.3mlを加えてよく振り混ぜたの
ち、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取す
る。これをDMF40mlに溶かし、Boc−Gln−
Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−Trp−OH3.00
ｇ、HONB2.20ｇを加えて氷冷したのち、
DCC1.27ｇを加えて、48時間かき混ぜる。溶媒
を減圧で留去したのち、水50mlを加え粉末とし
てろ取し、含水アセトニトリルで十分に洗浄す
る。収量3.30ｇ、m.p.210−214℃（分解）、
〔α〕21.5 D−11.8゜（ｃ＝0.6、NMP中）、Rf30.66、
C78H106O19N14としての元素分析計算値：
C60.68；H6.92；N12.73、実験値：C60.92；
H7.30；N12.76 (4) 〔ペプチド（）（15−29）〕の製造 Boc−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val−Gln−
Trp−Leu−Nle−Asn−Thr−OBzl3.0ｇにエ
タンジオール0.2ml、TFA25mlを加えて室温で
10分間振り混ぜたのち、濃縮し、エーテルを加
えて粉末としてろ取し、乾燥する。これを
NMP15mlに溶かし、氷冷し、TEA0.8mlを加
えて振り混ぜたのち、エーテルを加えて粉末と
してろ取する。これをDMF50mlに溶かし、
Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−OH2.1ｇ、HONB0.71ｇを加
えて、氷−食塩で冷却したのち、DCC0.60ｇを
加えて24時間かき混ぜる。析出したDCUをろ
去したのち、ろ液を濃縮し、残留物に、酢酸エ
チルを加えて粉末としてろ取する。収量3.6ｇ。
この様にして得られた保護ペプチド1.0ｇにア
ニソール１mlを加え、無水弗化水素10mlを加え
て０℃、60分間かき混ぜたのち、減圧濃縮す
る。残留物を、水50mlに溶かし、エーテルで洗
浄したのち、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×10cm）を通し、溶出液を、
凍結乾燥する。これを50％酢酸10mlに溶かし、
セフアデツクスLH−20のカラム（2.2×110cm）
に付し、50％酢酸で溶出し、125−180mlの画分
を集めて凍結乾燥する。さらにこれを水50mlに
溶かし、CMCのカラム（2.2×20cm）に付す。
0.005M酢酸アンモニア水（500ml）から0.2M
酢酸アンモニア水（500ml）までの線型勾配で
溶出し、265−440mlまでの画分を集めて凍結乾
燥する。収量145mg、〔α〕22 D−30.9゜（ｃ＝0.3、
50％酢酸中）、Rf30.60（アビセル）、アミノ酸分
析（４％チオグリコール酸、5.7N塩酸加水分
解）：Arg2.11(2)；Trp0.97(1)；Asp3.40(3)；
Thr0.93(1)；Ser0.83(1)；Glu2.10(2)；Ala1.00
(1)；Val1.04(1)；Leu0.91(1)；Phe0.84(1)；
Nle1.06(1)。（ペプチド含量74％） 参考例 ３ 〔ペプチド（）（21−29）〕の製造 Boc−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−OBzl1.0ｇ
をTFA10mlに溶かし、室温で10分間振り混ぜた
のち濃縮し、エーテル50mlを加えて、粉末として
ろ取し、乾燥する。これをDMF10mlに溶かし、
氷冷し、TEA1.1mlを加えて、よく振り混ぜたの
ち、エーテル100mlを加えて粉末としてろ取する。
これをDMF20mlに溶かし、Boc−Asp（OBzl）−
Phe−Val−Gln−Trp−OH1.33ｇ、HONB520
mgを加えて氷冷し、DCC450mgを加えて48時間か
き混ぜる。溶媒を減圧で留去したのち、水50mlを
加えて粉末としてろ取し、含水アセトニトリルで
洗浄する。収量1.72ｇ。このようにして得られた
保護ペプチド1.0ｇにアニソール0.5mlを加え、メ
タンスルホン酸10mlを加えて室温で10分間振り混
ぜたのち、エーテル100mlを加えて、油状物を沈
澱させる。傾斜法にてエーテルを除いたのち、残
留物を30％酢酸20mlに溶かし、アンバーライト
IRA−410（酢酸型）のカラム（１×10cm）を通
し、凍結乾燥する。これを、50％酢酸５mlに溶か
し、セフアデツクスLH−20のカラム（2.4×110
cm）に付す。50％酢酸で溶出し、195−235mlの画
分を集めて、凍結乾燥する。収量550mg。このよ
うにして得られたペプチドのうち150mgを、50％
酢酸５mlに溶かし、チオグリコール酸0.3mlを加
えて、45℃で16時間還元したのち、セフアデツク
スLH−20のカラム（３×135cm）に付す。30％
酢酸で溶出し、510−580mlの画分を集めて凍結乾
燥する。収量64mg。〔α〕23 D−26.0゜（ｃ＝0.2、80％
酢酸中）、Rf30.76（アビセル）、アミノ酸分析（４
％チオグリコール酸、5.7N塩酸加水分解）：
Trp1.07(1)；Asp2.06(2)；Thr0.98(1)；Glu1.06
(1)；Val0.97(1)；Met1.00(1)；Leu1.04(1)：
Phe1.11(1)、ペプチド含量73％ 参考例 ４ 〔ペプチド（）（13−29）〕の製造 (1) Ｚ−βAla−Tyr−Leu−OMeの製造 Boc−Tyr−Leu−OMe10.2ｇをTFA100ml
に溶かし、室温で15分間振り混ぜたのち、濃縮
し、エーテル10.0mlを加えて粉末としてろ取し
乾燥する。これをTHF150mlに溶かし、氷冷し
TEA4.0mlを加え、次にＺ−βAlaONB8.5ｇを
加えて15時間かき混ぜる。溶媒を減圧で留去し
たのち、残留物を酢酸エチル300mlに溶かし、
飽和炭酸水素ナトリウム水（200ml×３）、10％
クエン酸水（200ml×３）、水（200ml×３）の
順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。
溶媒を留去したのち、残留物に石油ベンジンを
加えて粉末としてろ取し、さらに酢酸エチル−
石油ベンジンより再沈澱する。収量10.7ｇ
（83.3％）m.p.112−113℃、〔α〕21.5 D−12.8゜（ｃ
＝0.8、DMF中）、C27H35O7N3としての元素分
析計算値：C63.14；H6.87：N8.18、実験値：
C62.97；H6.91；N8.09 (2) Ｚ−βAla−Tyr−Leu−OHの製造 Ｚ−βAla−Tyr−Leu−OMe5.0ｇをメタノ
ール40mlに溶かし、氷冷し、2N−水酸化ナト
リウム水12mlを加えたのち、室温にもどし、90
分間かき混ぜる。これを氷冷し、1N塩酸24ml
を加えて中和したのち、溶媒を減圧で留去す
る。残留物を酢酸エチル200mlに溶かしたのち、
水洗（200ml×２）し、無水硫酸ナトリウムで
乾燥する。溶媒を留去すると結晶が析出するの
で、これにエーテルを加えて洗浄したのち、ろ
取する。収量4.4ｇ（90.5％）m.p.144−145℃
〔α〕21.5 D−5.7゜（ｃ＝0.9、DM中）、C26H33O7N3
としての元素分析計算値：C62.50；H6.66；
N8.41、実験値：C62.27；H6.58；N8.82 (3) 〔ペプチド（）（13−29）〕の製造 Boc−Asp（OBzl）−Ser−Arg（MBS）−Arg
（MBS）−Ala−Gln−Asp（OBzl）−Phe−Val
−Gln−Trp−Leu−Met（Ｏ）−Asn−Thr−
OBzl4.6ｇにアニソール0.5ｇを加え、窒素気流
中、TFA35mlを加えて、室温で15分振り混ぜ
たのち、濃縮し、エーテルを加えて粉末として
ろ取する。これをNMP20mlにとかし、氷冷
し、TEA0.8mlを加えてよく振り混ぜたのち、
エーテルを加えて粉末としてろ取する。これを
DMF550mlにとかし、Ｚ−βAla−Tyr−Leu−
OH0.90ｇ、HONB0.64ｇを加えて氷−食塩で
冷却し、DCC0.55ｇを加えて、15時間かき混ぜ
る。析出したDCUをろ去したのち、溶媒を減
圧で留去し、残留物に、酢酸エチル70mlを加え
て粉末としてろ取する。収量4.3ｇ。この様に
して得られた保護ペプチド１ｇに、アニソール
1.5mlを加え、無水弗化水素10mlを加えて０℃、
60分間かき混ぜたのち、濃縮し、残留物を水50
mlにとかす。これをエーテル50mlで洗浄したの
ち、アンバーライトIRA−410（酢酸型）のカラ
ム（１×10cm）を通し、凍結乾燥する。これを
水100mlに溶かし、CMCのカラム（2.2×23cm）
に付す。0.005M酢酸アンモニア水（500ml）か
ら0.2M酢酸アンモニア水（500ml）までの線型
勾配で溶出し、220−360mlまでの画分を集めて
凍結乾燥する。これを50％酢酸５mlに溶かし、
セフアデツクスLH20のカラム（2.4×118cm）
に付し、50％酢酸で溶出し、130−166mlまでの
画分を集めて凍結乾燥する。収量80mg。この様
にして得られたペプチドのうち、70mgを50％酢
酸７mlに溶かし、チオグリコール酸0.35mlを加
えて45℃で12時間放置したのち、チオグリコー
ル酸を0.35mlを追加し、45℃でさらに24時間放
置すると反応が完結する。これをセフアデツク
スＧ−25のカラム（2.4×120cm）に付し、50％
酢酸で溶出し、160−220mlまでの画分を集め
て、凍結乾燥する。収量66mg、〔α〕21.5 D−29.3゜
（ｃ＝0.4、50％酢酸中）Rf30.61（アビセル）、
アミノ酸分析（４％チオグリコール酸、5.7N
塩酸加水分解）：Arg2.19(2)；Trp0.92(1)；
Asp3.44(3)；Thr0.91(1)；Ser0.69(1)；Glu2.32
(2)；Ala1.12(1)；Val1.14(1)；Met1.00(1)；
Leu2.02(2)；Tyr1.05(1)；Phe1.05(1)；βAla1.13
(1)（ペプチド含量81％）。 参考例 ５ ペプチド（）（15−29）とBSAとの結合体の
製造 (1) 参考例１で得られたペプチド（）（15−29）
10mg、BSA20mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.3）
４mlに溶解し、５％GLA水溶液４mlを加えて
室温で３間かき混ぜた後、４℃で透析（水２
×４）し、凍結乾燥し、結合体を得た。収量38
mg。 参考例 ６ ペプチド（）（15−29）とBSAとの結合体の
製造 (2) 0.2％のBSA水溶液10mlに無水コハク酸２mg
の小片を徐々に加え、0.1N−NaOHでPHを7.0
から8.0に保ちながら反応させBSAをスクシニ
ル化する。反応終了後、４℃で透析（水２×
４）し、凍結乾燥する。得られたスクシニル化
BSAに参考例１で得られたペプチド（）（15
−29）10mgを加え、0.05Mリン酸緩衝液（PH
6.5）10mlに溶解し、更にECDI10mgを徐々に添
加して、４℃で２日間ゆるやかに撹拌しながら
反応させる。反応終了後、４℃で透析（水２
×４）し、凍結乾燥し、結合体を得た。収量39
mg。 参考例 ７ ペプチド（）（13−29）とBSAとの結合体の
製造 参考例５におけるペプチド（）（15−29）10
mgの代りに、参考例４で得られたペプチド（）
（13−29）10mgを用いて、以下、全く同様に処理
してBSAとの結合体を得た。収量39mg。 参考例 ８ 抗体の製造法 参考例５、６、もしくは７と同様な方法で製造
したペプチドとBSAとの結合物２mgを生理食塩
水１mlに溶解し、これにフロインドの完全アジユ
バンド（Freund′s complete adjuvant）１mlを
加えてよく混和し、乳剤を作り、これをウサギの
両大腿部筋肉内および背部皮下数ケ所に注射す
る。以上の操作を２週おきに５回行ない、最終免
疫後１週間で採血し、パイロツトアツセイを行
う。その結果、膵グルカゴンと特異的に反応し、
腸管グルカゴンとは反応せず、最終希釈倍数
00000〜500000倍で使用可能なグルカゴン抗体を
得ることができた。 実施例 １ ペプチド（）（15−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの結合体の製造 参考例１で得られたペプチド（Ｉ）（15−29）
２mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH6.3）２に懸濁
し、得られた混合物に、THFに溶解した0.5％ｍ
−MBHS0.5mlを添加して30℃で30分反応させ
る。反応混合物を0.1Mリン酸緩衝液で平衡させ
たセフアデツクスＧ−25のカラム（0.9×53cm）
に通し、過剰の試薬とマレイミド化ペプチドとを
分離する。得られたマレイミド化ペプチド溶液１
mlにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（５mg／ml）
0.1mlを添加し、時々振り混ぜながら室温で２時
間反応させる。反応終了後、0.1％BSA、0.1％
NaN3、0.1MNaClおよび１ｍＭ MgCl2を含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いるセフアロ
ース6Bカラムクロマトグラフイーで精製し、酵
素含有フラクシヨンを分取し、ペプチド−酵素縮
合体を得た。 以下、本縮合体の物性について述べる。 本縮合体はEIAで用いる合成基質。−ニトロ
フエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドや４−
メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを分解し、それぞれｏ−ニトロフエノ
ールや４−メチルウンベリフエロンを遊離す
る。 酵素活性の至適PHは7.0〜7.7である。 酵素活性を有する本縮合体の約90％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で６ケ月以上安
定である。 分子量は約55万でペプチド（）／酸素のモ
ル比は約７である。 PH５−９の水性溶媒に易溶である。 紫外吸収スペクトルは第２図を参照。 アミノ酸分析値は第５表を参照。 他の物性はβ−Ｄ−ガラトシダーゼの物性
（“The Enzymes”、第７巻（1972年）、第617
頁、Boyer著、Academic Press、New、
York−London）に準ずる。 実施例 ２ ペプチド（）（15−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、参考例２で得られたペプチド（）
（15−29）２mgを用いて、以下、全く同様に処理
してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとの縮合体を得
た。 本縮合体の物性は次の項目（および）を除
いて実施例１で述べた縮合体の物性（、、
、および）と類似である。 酵素活性を有する本縮合体の約80％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で６ケ月以上安
定である。 分子量は約55万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約６である。 実施例 ３ ペプチド（）（21−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、参考例３で得られたペプチド（）
（21−29）1.2mgを用いて、以下、全く同様に処理
してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとの縮合体を得
た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例１で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約55万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約８である。 実施例 ４ ペプチド（）（13−29）とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、実施例４で得られたペプチド（）
（13−29）2.4mgを用いて、以下、全く同様に処理
してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとの縮合体を得
た。 本縮合体の物性は次の項目（、および）
を除いて実施例１で述べた結合体の物性（、
、、および）と類似である。 酵素活性を有する本縮合体の約75％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で６ケ月以上安
定である。 分子量は約55万でペプチド（）／酵素モル
比は約５である。 アミノ酸分析値は第６表を参照。 実施例 ５ ペプチド（）（15−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 アルカリホスフアターゼ懸濁液（５mg／ml）
0.2mlを遠心分離し、得られた沈澱物を0.1Mリン
酸緩衝液（PH6.8）0.1mlに溶解する。一方、参考
例１で得られたペプチド（）（15−29）１mgを
同じ緩衝液１mlに溶解し、上記の酵素溶液に添加
する。次いで２％GLA溶液0.1mlを添加し室温で
２時間反応させたのち、同じリン酸緩衝液に対し
て約５℃で一夜透析する。更に0.1MNaClを含む
リン酸緩衝液（PH6.8）を用いるセフアデツクス
G100カラムクロマトグラフイーで精製し酵素含
有フラクシヨンを分取し、ペプチド−酵素縮合体
を得た。 以下、本縮合体の物性について述べる。 本縮合体はEIAで用いる合成基質フエニルリ
ン酸やｐ−ニトロフエニルリン酸を分解し、そ
れぞれフエノールやｐ−ニトロフエノールを遊
離する 酵素活性の至適PHは9.5−10.5である。 酵素活性を有する本縮合体の約90％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で３ケ月以上安
定である。 分子量は約14万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約20である。 PH６−11の水性溶媒に易溶である。 紫外吸収スペクトルは第３図を参照。 アミノ酸分析値は第７表を参照。 他の物性はアルカリホスフアターゼの物性
（“The、Enzymes”、第４巻（1971年）、第417
頁、Boyer著、Academic Press、New York
−London）に準ずる。 実施例 ６ ペプチド（）（15−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、参考例２で得られたペプチド（）
（15−29）１mgを用いて、以下、全く同様に処理
してアルカリホスフアターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例５で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約14万でペプチド（）／酵素モル
比は約20である。 実施例 ７ ペプチド（）（21−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、参考例３で得られたペプチド（）
（21−29）0.6mgを用いて、以下、全く同様に処理
してアルカリホスフアターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例５で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約13万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約23である。 実施例 ８ ペプチド（）（13−29）とアルカリホスフア
ターゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、参考例４で得られたペプチド（）
（13−29）1.2mgを用いて、以下、全く同様に処理
してアルカリホスフアターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（および）を除
いて実施例５で述べた縮合体の物性（、、
、、および）と類似である。 分子量は約14万でペプチド（）／酵素のモ
ル比は約16である。 アミノ酸分析値は第８表を参照。 参考例 ９ 膵グルカゴン（１−29）とβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼとの縮合体の製造 実施例１におけるペプチド（）（15−29）２
mgの代りに、膵グルカゴン（１−29）４mgを用い
て、以下、全く同様に処理してβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（および）を除
いて実施例１で述べた縮合体の物性（、、
、、および）と類似である。 酵素活性を有する本縮合体の約65％以上が抗
膵グルカゴン抗体との反応性を有し、その免疫
活性は酵素活性と共に冷蔵保存で３ケ月以上安
定である。 分子量は約55万で膵グルカゴン／酵素のモル
比は約３である。 参考例 10 膵グルカゴン（１−29）とアルカリホスフアタ
ーゼとの縮合体の製造 実施例５におけるペプチド（）（15−29）１
mgの代りに、膵グルカゴン（１−29）２mgを用い
て、以下、全く同様に処理してアルカリホスフア
ターゼとの縮合体を得た。 本縮合体の物性は次の項目（）を除いて実施
例５で述べた縮合体の物性（、、、、
および）と類似である。 分子量は約15万で膵グルカゴン／酵素のモル
比は約13である。 実施例 ９ 予備試験において各抗血清（30K、N16aおよ
びN6c）について、種々の希釈度の抗血清濃度
〔緩衝液0.2ml、ペプチド−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ複合体0.1mlおよび抗血清（１：100〜１：
1000000に希釈したもの）0.1ml〕の試料を５℃で
一昼夜保つことによつて、各々のペプチド−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体〔予め決定しておい
た適当な濃度（約10μU／ml）を有する〕の酵素
活性をもつ部分を抗血清に結合させる。次に抗ウ
サギIgG血清（市販の抗血清を予め10倍希釈した
もの）0.1mlおよび１％の正常ウサギ血清を含む
緩衝液0.1mlを加え、得られた混合物を５℃で一
夜放置する。次に、この混合物を遠心分離してか
ら沈澱物を洗浄し、酸素基質液〔0.1％、BSA、
0.1％NaN3、0.1M NaClおよび１ｍＭ MgCl2
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した
20μｇ／mlの４−メチルウンベリフエリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド〕0.5mlに懸濁し、37℃
で２時間反応させる。反応終了後、励起波長
365nｍ、螢光波長450nｍで酵素分解の結果遊離
した４−メチルウンベリフエロンの螢光強度を測
定した。 次に検液中の膵グルカゴンの定量の場合には、
上記のごとく定めた一定の希釈度の抗血清とペプ
チド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体とのそれ
ぞれ0.1mlを、検液0.1mlと緩衝液0.1mlとの混合物
に添加して、以後上記のごとく定量した。 得られた結果は第１〜３表に示す通りであつ
た。 第１表で明らかなように30K抗血清は、ペプチ
ド（）−もしくはペプチド（）−酵素縮合体と
組み合せて用いられる時、従来のhomologousな
結合様式を示す膵グルカゴン−酵素縮合体と共に
用いられる時よりはるかに感度の高い結果を与え
ることが分る。 同様にN16a（第２表）やN6c（第３表）抗血清
も、本発明方法に従うheterologousな結合様式を
示すペプチド（）−もしくはペプチド（）−酵
素縮合体と組み合せて用いられる時、膵グルカゴ
ンの低濃度域で感度が特に良くなる。 以上のように、膵グルカゴンの酵素免疫測定法
において、アツセイで用いる膵グルカゴン抗体の
調製に用いるペプチドとは異なるペプチドと標識
酵素との縮合体を、その抗体と組み合せて用いる
時（heterologousなアツセイ系）、きわめて感度
の高い結果が得られることが分る。
【表】
【表】
【表】
３） 参考例７および８参照。
【表】
３） 参考例５および８参照。
実施例 10 30K抗血清とペプチド（）（15−29）−β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ結合体とを用いる前記の操作
法に従つたEIAで、数種のラツトの血漿中の膵グ
ルカゴン濃度を測定し、従来実施されている同じ
30K抗血清を用いるRIAでの結果と比較した。 結果は第４表に示す通りであつた。 第４表に示されるように、本発明方法の膵グル
カゴンの酵素免疫測定法は、従来より実施され最
も信頼性の高いアツセイの１つとされる30K抗血
清を用いるRIAの結果と良く一致した。このこと
から本測定法は各種血清検体の膵グルカゴン濃度
を簡便かつ高感度に測定でき信頼性の高い結果を
与えることが分る。
実施例 10 30K抗血清とペプチド（）（15−29）−β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ結合体とを用いる前記の操作
法に従つたEIAで、数種のラツトの血漿中の膵グ
ルカゴン濃度を測定し、従来実施されている同じ
30K抗血清を用いるRIAでの結果と比較した。 結果は第４表に示す通りであつた。 第４表に示されるように、本発明方法の膵グル
カゴンの酵素免疫測定法は、従来より実施され最
も信頼性の高いアツセイの１つとされる30K抗血
清を用いるRIAの結果と良く一致した。このこと
から本測定法は各種血清検体の膵グルカゴン濃度
を簡便かつ高感度に測定でき信頼性の高い結果を
与えることが分る。
【表】
実施例 11
実施例９と同様に30K抗血清について、種々の
希釈度の抗血清濃度〔緩衝液0.2ml、ペプチド
（）−アルカリホスフアターゼ縮合体またはペプ
チド（）−アルカリホスフアターゼ結合体0.1ml
および抗血清（１：100−１：100000に希釈した
もの）0.1ml〕の試料を５℃で一昼夜保つことに
よつて、各々のペプチド−アルカリホスフアター
ゼ縮合体〔予め決定しておいた適当な濃度（約４
ｍＵ／ml）を有する〕の酵素活性をもつ部分を抗
血清に結合させる。次に抗ウサギIgG血清（市販
の抗血清を予め10倍希釈したもの）0.1mlおよび
１％の正常ウサギ血清を含む緩衝液0.1mlを加え、
得られた混合物を５℃で一夜放置する。次に、こ
の混合物を遠心分離してから沈澱物を洗浄し、酸
素基質液〔１ｍＭ MgCl2を含む0.05M炭酸ナト
リウム緩衝液（PH9.8）に溶解した２mg／mlのパ
ラ−ニトロフエニルリン酸〕0.5mlに懸濁し37℃
で一夜反応させる。反応終了後、405nｍで酵素
分解の結果遊離したパラ−ニトロフエノールの吸
収強度を測定した。 次に検液中の膵グルカゴンの定量の場合には、
上記のごとく定めた一定の希釈度の30K抗血清と
ペプチド−アルカリホスフアターゼ縮合体とのそ
れぞれ0.1mlを、検液0.1mlと緩衝液0.1mlとの混合
物に添加して、以後上記のごとく定量した。 得られた結果は第１図に示す通りであつた。第
１図において、−●−はペプチド（）−酵素縮合
体の結果を、…×…はペプチド（）−酵素縮合
体の結果を、−Γ−は膵グルカゴン−酵素縮合体
の結果を、それぞれ示す。 第１図は膵グルカゴンの標準曲線である。30K
抗血清は、実施例５で得られたペプチド（）−
アルカリホスフアターゼ縮合体と組み合せて用い
られる時（heterologous アツセイ系）、最も感
度が高く、参考例10で得られた膵グルカゴン−ア
ルカリホスフアターゼと共に用いる従来の
homologousアツセイ系では感度が低いことが分
る。
希釈度の抗血清濃度〔緩衝液0.2ml、ペプチド
（）−アルカリホスフアターゼ縮合体またはペプ
チド（）−アルカリホスフアターゼ結合体0.1ml
および抗血清（１：100−１：100000に希釈した
もの）0.1ml〕の試料を５℃で一昼夜保つことに
よつて、各々のペプチド−アルカリホスフアター
ゼ縮合体〔予め決定しておいた適当な濃度（約４
ｍＵ／ml）を有する〕の酵素活性をもつ部分を抗
血清に結合させる。次に抗ウサギIgG血清（市販
の抗血清を予め10倍希釈したもの）0.1mlおよび
１％の正常ウサギ血清を含む緩衝液0.1mlを加え、
得られた混合物を５℃で一夜放置する。次に、こ
の混合物を遠心分離してから沈澱物を洗浄し、酸
素基質液〔１ｍＭ MgCl2を含む0.05M炭酸ナト
リウム緩衝液（PH9.8）に溶解した２mg／mlのパ
ラ−ニトロフエニルリン酸〕0.5mlに懸濁し37℃
で一夜反応させる。反応終了後、405nｍで酵素
分解の結果遊離したパラ−ニトロフエノールの吸
収強度を測定した。 次に検液中の膵グルカゴンの定量の場合には、
上記のごとく定めた一定の希釈度の30K抗血清と
ペプチド−アルカリホスフアターゼ縮合体とのそ
れぞれ0.1mlを、検液0.1mlと緩衝液0.1mlとの混合
物に添加して、以後上記のごとく定量した。 得られた結果は第１図に示す通りであつた。第
１図において、−●−はペプチド（）−酵素縮合
体の結果を、…×…はペプチド（）−酵素縮合
体の結果を、−Γ−は膵グルカゴン−酵素縮合体
の結果を、それぞれ示す。 第１図は膵グルカゴンの標準曲線である。30K
抗血清は、実施例５で得られたペプチド（）−
アルカリホスフアターゼ縮合体と組み合せて用い
られる時（heterologous アツセイ系）、最も感
度が高く、参考例10で得られた膵グルカゴン−ア
ルカリホスフアターゼと共に用いる従来の
homologousアツセイ系では感度が低いことが分
る。
【表】
【表】
モル数
【表】
モル数。
【表】
モル数。
【表】
【表】
モル数。
実施例 12 予備試験において各抗血清（30K、G21、G7、
R517およびN6E）について、種々の希釈度の抗
血清100μ、ペプチド−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ縮合体100μ、アンタゴサン（ヘキスト社
製、10000単位／ml）50μ、アツセイ用緩衝液
〔0.5％人血清アルブミン（以下、HSAと略称す
ることもある）、0.5％エチレンジアミン・テトラ
アセテート・ジソジウム・2H2O（以下、EDTA
と略称することもある）、0.1％NaN3および0.1M
NaClを含む0.02Mリン酸緩衝液（PH7.3）〕250μ
の混合液を５℃で４昼夜保つことにより、各々
のペプチド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ縮合体
〔予め決定しておいた適当な酵素活性（約10μU／
ml）を有する。〕の酵素活性をもつ部分を抗血清
に結合させる〔抗血清G7は、大根田らホルモ
ン・アンド・メタボリツク・リサーチ
（Hormone and Metabolic Research）第８巻
170頁（1976年）参照〕。次に５％の抗ウサギIgG
抗体結合セルロース懸濁液100μを加え更に30
℃で４時間反応させる。この混合物を遠心分離し
てから沈澱物を洗浄し、酵素基質液〔0.1％BSA、
0.1％NaN3、0.1M NaClおよび１ｍＭ MgCl2
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した
20μｇ／mlの４−メチルウンベリフエリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド〕500μに懸濁し、室
温で一夜反応させる。反応終了後、励機波長
365nｍ、螢光波長450nｍで酵素分解の結果遊離
した４−メチルウンベリフエロンの螢光強度を測
定した。 次に検液中の膵グルカゴンの定量の場合には、
上記のごとく定めた一定の希釈度の抗血清とペプ
チド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ縮合体とのそれ
ぞれ100μを、検液50μ、アンタゴサン50μ
およびアツセイ用緩衝液200μとの混合物に添
加して、以後上記のごとく定量した。 得られた結果は第９〜11表に示す。
実施例 12 予備試験において各抗血清（30K、G21、G7、
R517およびN6E）について、種々の希釈度の抗
血清100μ、ペプチド−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ縮合体100μ、アンタゴサン（ヘキスト社
製、10000単位／ml）50μ、アツセイ用緩衝液
〔0.5％人血清アルブミン（以下、HSAと略称す
ることもある）、0.5％エチレンジアミン・テトラ
アセテート・ジソジウム・2H2O（以下、EDTA
と略称することもある）、0.1％NaN3および0.1M
NaClを含む0.02Mリン酸緩衝液（PH7.3）〕250μ
の混合液を５℃で４昼夜保つことにより、各々
のペプチド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ縮合体
〔予め決定しておいた適当な酵素活性（約10μU／
ml）を有する。〕の酵素活性をもつ部分を抗血清
に結合させる〔抗血清G7は、大根田らホルモ
ン・アンド・メタボリツク・リサーチ
（Hormone and Metabolic Research）第８巻
170頁（1976年）参照〕。次に５％の抗ウサギIgG
抗体結合セルロース懸濁液100μを加え更に30
℃で４時間反応させる。この混合物を遠心分離し
てから沈澱物を洗浄し、酵素基質液〔0.1％BSA、
0.1％NaN3、0.1M NaClおよび１ｍＭ MgCl2
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した
20μｇ／mlの４−メチルウンベリフエリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド〕500μに懸濁し、室
温で一夜反応させる。反応終了後、励機波長
365nｍ、螢光波長450nｍで酵素分解の結果遊離
した４−メチルウンベリフエロンの螢光強度を測
定した。 次に検液中の膵グルカゴンの定量の場合には、
上記のごとく定めた一定の希釈度の抗血清とペプ
チド−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ縮合体とのそれ
ぞれ100μを、検液50μ、アンタゴサン50μ
およびアツセイ用緩衝液200μとの混合物に添
加して、以後上記のごとく定量した。 得られた結果は第９〜11表に示す。
【表】
【表】
【表】
第９表では、膵グルカゴンでウサギを免疫して
得た抗血清R517とイヌ小腸粘膜より抽出した腸
管グルカゴンとの反応をみた。該抗血清は膵グル
カゴン（１−29）−酵素縮合体との組み合せでは
腸管グルカゴンと競争的に結合反応するが、ペプ
チド（）（15−29）−酵素縮合体と組み合せて用
いられる時は高濃度の腸管グルカゴンに対しても
有意に競争的な結合反応をしないことが分る。即
ちR517抗血清とペプチド（）−酵素縮合体とを
用いるアツセイ系は膵グルカゴンに特異的である
と分る。 第10表および第11表では同様に膵グルカゴンで
ウサギを免疫して得た抗血清G7と腸管グルカゴ
ンとの反応をみた。ここでは前記のイヌ小腸粘膜
抽出物を更にセフアデツクスG50のゲルロ過カラ
ムクロマトグラフイーで分離・精製して得た分子
量の異なる２種の腸管グルカゴン（：推定分子
量約10000、：推定分子量約2000〜4000）
〔“Hormone and Metabolic Research”、第８
巻第170頁（1976年）〕を用いた。該抗血清の腸管
グルカゴンに対する交叉反応性において、ペプチ
ド（）（15−29）−酵素縮合体あるいはペプチド
（）（21−29）−酵素縮合体との組み合せで用い
られる時は膵グルカゴン（１−29）−酵素縮合体
との組み合せにおけるよりも、およびいずれ
も腸管グルカゴンとも競争結合しないことが分
る。即ちG7膵グルカゴン非特異抗血清はR517抗
血清と同様にペプチド（）−もしくはペプチド
（）−酵素縮合体と組み合せて用いれば、見かけ
上膵グルカゴンに特異的となることが分る。 実施例 13 実施例12に示した操作法に従つたEIAで、予め
ゲルロ過クロマトグラフイーでビツグプラズマグ
ルカゴン（BPG）と膵グルカゴン（PG）画分と
に分離したヒト血漿中の膵グルカゴン濃度を測定
し、従来実施されている膵グルカゴン抗血清と膵
グルカゴン（１−29）−酵素縮合体との組み合せ
を用いるEIAでの結果と比較した。 結果は第12表に示す。
得た抗血清R517とイヌ小腸粘膜より抽出した腸
管グルカゴンとの反応をみた。該抗血清は膵グル
カゴン（１−29）−酵素縮合体との組み合せでは
腸管グルカゴンと競争的に結合反応するが、ペプ
チド（）（15−29）−酵素縮合体と組み合せて用
いられる時は高濃度の腸管グルカゴンに対しても
有意に競争的な結合反応をしないことが分る。即
ちR517抗血清とペプチド（）−酵素縮合体とを
用いるアツセイ系は膵グルカゴンに特異的である
と分る。 第10表および第11表では同様に膵グルカゴンで
ウサギを免疫して得た抗血清G7と腸管グルカゴ
ンとの反応をみた。ここでは前記のイヌ小腸粘膜
抽出物を更にセフアデツクスG50のゲルロ過カラ
ムクロマトグラフイーで分離・精製して得た分子
量の異なる２種の腸管グルカゴン（：推定分子
量約10000、：推定分子量約2000〜4000）
〔“Hormone and Metabolic Research”、第８
巻第170頁（1976年）〕を用いた。該抗血清の腸管
グルカゴンに対する交叉反応性において、ペプチ
ド（）（15−29）−酵素縮合体あるいはペプチド
（）（21−29）−酵素縮合体との組み合せで用い
られる時は膵グルカゴン（１−29）−酵素縮合体
との組み合せにおけるよりも、およびいずれ
も腸管グルカゴンとも競争結合しないことが分
る。即ちG7膵グルカゴン非特異抗血清はR517抗
血清と同様にペプチド（）−もしくはペプチド
（）−酵素縮合体と組み合せて用いれば、見かけ
上膵グルカゴンに特異的となることが分る。 実施例 13 実施例12に示した操作法に従つたEIAで、予め
ゲルロ過クロマトグラフイーでビツグプラズマグ
ルカゴン（BPG）と膵グルカゴン（PG）画分と
に分離したヒト血漿中の膵グルカゴン濃度を測定
し、従来実施されている膵グルカゴン抗血清と膵
グルカゴン（１−29）−酵素縮合体との組み合せ
を用いるEIAでの結果と比較した。 結果は第12表に示す。
【表】
第12表に示されるように、本発明方法の測定シ
ステム（heterologousなアツセイ系）ではPG画
分の測定値に関しては有意な差を示すことなく、
BPG画分の測定値が顕著に減少した。即ち膵グ
ルカゴンでウサギを免疫して得た抗血清30Kや
G21ではペプチド（）（15−29）−酵素縮合体と
の組み合せで用いる時、BPGとの競争結合反応
もしくはBPGによる抗原−抗体反応の阻害度が
減少し、膵グルカゴン（１−29）−酵素縮合体と
の組み合せで測定するより特異的に血漿中の膵グ
ルカゴンを測定できることが分る。ペプチド
（）（15−29）を用いてウサギを免疫して得た
N6E抗血清とペプチド（）（21−29）−酵素縮
合体との組み合せでは、更にBPGを低値に評価
し、膵グルカゴンに対しより特異性の高い測定法
を与えることが分る。
ステム（heterologousなアツセイ系）ではPG画
分の測定値に関しては有意な差を示すことなく、
BPG画分の測定値が顕著に減少した。即ち膵グ
ルカゴンでウサギを免疫して得た抗血清30Kや
G21ではペプチド（）（15−29）−酵素縮合体と
の組み合せで用いる時、BPGとの競争結合反応
もしくはBPGによる抗原−抗体反応の阻害度が
減少し、膵グルカゴン（１−29）−酵素縮合体と
の組み合せで測定するより特異的に血漿中の膵グ
ルカゴンを測定できることが分る。ペプチド
（）（15−29）を用いてウサギを免疫して得た
N6E抗血清とペプチド（）（21−29）−酵素縮
合体との組み合せでは、更にBPGを低値に評価
し、膵グルカゴンに対しより特異性の高い測定法
を与えることが分る。
第１図は、ペプチド（）−アルカリホスフア
ターゼ縮合体、ペプチド（）−アルカリホスフ
アターゼ縮合体および膵グルカゴン−アルカリホ
スフアターゼ縮合体を用いて膵グルカゴンを定量
した結果を示す。第２図は、ペプチド（）−ガ
ラクトシダーゼ縮合体の紫外吸収スペクトルを、
第３図はペプチド（）−アルカリホスフアター
ゼ縮合体の紫外吸収スペクトルを、それぞれ表わ
す。
ターゼ縮合体、ペプチド（）−アルカリホスフ
アターゼ縮合体および膵グルカゴン−アルカリホ
スフアターゼ縮合体を用いて膵グルカゴンを定量
した結果を示す。第２図は、ペプチド（）−ガ
ラクトシダーゼ縮合体の紫外吸収スペクトルを、
第３図はペプチド（）−アルカリホスフアター
ゼ縮合体の紫外吸収スペクトルを、それぞれ表わ
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式 Ｈ−R1−Phe−Val−Gln−Trp −Leu−R2−Asn−Thr−OH 〔式中、R1は で示されるペプチドの10位のAspを含む１〜10個
の部分ペプチド鎖を、R2はMetまたはNleを、そ
れぞれ表わす。〕で表わされるペプチドと標識酵
素とを縮合して得られるペプチド−酵素縮合体。 ２ ペプチド−酵素複合体を試薬の一種として用
いる膵グルカゴンの酵素免疫測定法において、該
ペプチド−酵素複合体として一般式 Ｈ−R1−Phe−Val−Gln−Trp −Leu−R2−Asn−Thr−OH 〔式中、R1は で示されるペプチドの10位のAspを含む１〜10個
の部分ペプチド鎖を、R2はMetまたはNleを、そ
れぞれ表わす。〕で表わされるペプチドと標識酵
素とを縮合して得られるペプチド−酵素縮合体を
用いることを特徴とする膵グルカゴンの酵素免疫
測定法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10682878A JPS5539702A (en) | 1978-08-30 | 1978-08-30 | Method of measuring enzyme immunity of pancreas glucagon |
| US06/069,180 US4312943A (en) | 1978-08-30 | 1979-08-24 | Method for enzyme immunoassay of pancreatic glucagon |
| EP79103196A EP0009147B1 (en) | 1978-08-30 | 1979-08-29 | A method for enzyme immunoassay of pancreatic glucagon and a peptide-enzyme conjugate usable for the method |
| DK360379A DK161095C (da) | 1978-08-30 | 1979-08-29 | Fremgangsmaade til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon og peptid-enzym-konjugat til brug ved denne fremgangsmaade |
| DE7979103196T DE2963813D1 (en) | 1978-08-30 | 1979-08-29 | A method for enzyme immunoassay of pancreatic glucagon and a peptide-enzyme conjugate usable for the method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10682878A JPS5539702A (en) | 1978-08-30 | 1978-08-30 | Method of measuring enzyme immunity of pancreas glucagon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5539702A JPS5539702A (en) | 1980-03-19 |
| JPS6311626B2 true JPS6311626B2 (ja) | 1988-03-15 |
Family
ID=14443617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10682878A Granted JPS5539702A (en) | 1978-08-30 | 1978-08-30 | Method of measuring enzyme immunity of pancreas glucagon |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4312943A (ja) |
| EP (1) | EP0009147B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5539702A (ja) |
| DE (1) | DE2963813D1 (ja) |
| DK (1) | DK161095C (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5657753A (en) * | 1979-10-16 | 1981-05-20 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel glucagon fragment, and its use |
| EP0111216A3 (en) * | 1980-03-31 | 1985-01-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for enzyme immunoassay and peptide-enzyme conjugate, its lyophilizate, antibody and kit therefor |
| JPS5681450A (en) * | 1980-10-23 | 1981-07-03 | Toyo Jozo Co Ltd | Determination method for glucagon |
| CA2091544A1 (en) * | 1992-03-26 | 1993-09-27 | Shing F. Kwan | Stabilization of functional proteins |
| JP3974619B2 (ja) * | 2003-01-10 | 2007-09-12 | 株式会社新潟ティーエルオー | 遺伝子治療用ベクター及び該遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物中又は培養細胞中の目的タンパク質の定量方法 |
| JP2015505828A (ja) | 2011-12-02 | 2015-02-26 | イーライ リリー アンド カンパニー | 抗グルカゴン抗体およびその使用 |
| WO2019197313A1 (en) | 2018-04-09 | 2019-10-17 | Svar Life Science Ab | Glucagon Assay |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3975342A (en) * | 1972-05-15 | 1976-08-17 | Biological Developments, Inc. | Tyrosyl-class antigenic conjugates, their preparation and antibodies raised thereto |
| US4002532A (en) * | 1974-10-21 | 1977-01-11 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates |
| GB1572220A (en) * | 1976-10-07 | 1980-07-30 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemical process of measuring physiologically active substances |
| US4075194A (en) * | 1976-12-09 | 1978-02-21 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Novel synthetic undecapeptide and clinical assay |
| JPS5836308B2 (ja) * | 1977-02-10 | 1983-08-08 | 大塚製薬株式会社 | 抗体の製造方法 |
| US4206199A (en) * | 1977-07-22 | 1980-06-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel glucagon fragment and its derivatives |
| US4220722A (en) * | 1978-02-10 | 1980-09-02 | Syva Company | Method for conjugating to polyamino compounds employing haloacyl groups and compositions prepared thereby |
| US4218539A (en) * | 1978-03-24 | 1980-08-19 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates and method of preparation and use |
-
1978
- 1978-08-30 JP JP10682878A patent/JPS5539702A/ja active Granted
-
1979
- 1979-08-24 US US06/069,180 patent/US4312943A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-08-29 DE DE7979103196T patent/DE2963813D1/de not_active Expired
- 1979-08-29 DK DK360379A patent/DK161095C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-08-29 EP EP79103196A patent/EP0009147B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2963813D1 (en) | 1982-11-11 |
| EP0009147A3 (en) | 1980-04-30 |
| DK161095C (da) | 1991-11-04 |
| US4312943A (en) | 1982-01-26 |
| JPS5539702A (en) | 1980-03-19 |
| DK161095B (da) | 1991-05-27 |
| DK360379A (da) | 1980-03-01 |
| EP0009147B1 (en) | 1982-10-06 |
| EP0009147A2 (en) | 1980-04-02 |
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