JPH02304365A - エラスターゼ１の測定方法 - Google Patents

エラスターゼ１の測定方法

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JPH02304365A
JPH02304365A JP1126423A JP12642389A JPH02304365A JP H02304365 A JPH02304365 A JP H02304365A JP 1126423 A JP1126423 A JP 1126423A JP 12642389 A JP12642389 A JP 12642389A JP H02304365 A JPH02304365 A JP H02304365A
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Nobuo Yoshida
信男 吉田
Takeshi Inoue
健 井上
Masao Kono
河野　昌雄
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Shionogi and Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 髪呈上歴上月金１ 本発明は、膵臓疾患の診断に有用である、生体液中に含
まれる膵外分泌蛋白分解酵素エラスターゼ１の免疫学的
測定方法、および該測定方法に有用な、下式で示きれる
化合物： （ＣＨ，）、Ｃ０Ｃ０［ＮＨＣＨ（ＣＨ，）Ｃｏコ、Ｃ
Ｈ，Ｃ１（以下、Ｂｏｃ・ＴＡＣＫと略記）で処理した
ヒトエラスターゼ１に関する。
従）ぎυえ畢 膵臓疾患は、近年種々の原因により増加傾向にあり、臨
床上重要な疾患である。しかしながら、膵臓は腹腔内の
最深部に存在し、診断が困難であり、簡便で確実な診断
法の開発が望まれている。
膵疾患の生化学的な診断法としては、患者の体液（主に
血液および尿、その他膵液、胸水、腹水）中のアミラー
ゼを測定する診断法が知られているが、本方法により測
定される血中アミラーゼは唾液腺性および膵臓性の２種
のアミラーゼの総量を表わしているため、アミラーゼ測
定自体は膵臓疾患に特異的な検査法とはみなきれていな
い。また、膵臓疾患発症後、アミラーゼが高値を示す期
間が短く、測定時期を逃すと診断ができない、従って、
Ｓ全疾患診断のための、他の膵臓酵素測定法の開発が望
まれていた。
ヒトの膵臓または膵液にはアミラーゼ以外に繊維状タン
パク質エラスチンを分解する酵素エラスターゼが含まれ
る６本酵素には、酸性に荷電したエラスターゼ１（分子
量２９．０００〜３３．０００　’）と塩基性に荷電し
たエラスターゼ２（分子量２５．０００〜２６゜０００
）が存在し、エラスターゼ１はエラスターゼ２を活性化
する。これらは酵素学的、蛋白学的、免疫学的にも異な
っている。このエラスターゼ１の測定は、膵疾患、とく
に急性膵炎、慢性再発性膵炎、膵癌の診断や経過観察に
有用である。血清エラスターゼ１は急性膵炎時に大きく
上昇するほか、膵癌で他の膵酵素よりも大きく上昇する
ことが知られている。
従来から、エラスターゼ１を酵素活性測定法により測定
する方法は試みられたが、以下の理由から測定は困難で
あった。すなわち、血中のエラスターゼ含量は極めて微
量であり、しかも血中には多量のエラスターゼインヒビ
ター、α、−アンチトリプシンおよびα、−マクログロ
ブリンが存在し、エラスターゼの活性発現を抑えている
。
上記のとおり、エラスターゼは血中のインヒビター、Ｃ
８−アンチトリプシンおよびＣ８−マクログロブリンと
結合して存在する。Ｃ１−アンチトリプシンはエラスタ
ーゼの活性部位に結合するが、エラスターゼの構造自体
はそのまま残るので、免疫活性があり、抗原抗体反応に
関与しうる。一方、α、−マクログロブリンによる阻害
はエラスターゼを包み込むような形で行なわれるので、
エラスターゼの構造は確認できなくなり、免疫学的測定
法でも測定できない。そこで、血中のα、−アンチトリ
プシンと結合したエラスターゼを免疫学的に測定しよう
とする試みがなされた。
しかし、免疫学的測定法では、試料血清中のエラスター
ゼ−インヒビターの量によって、標識エラスターゼの免
疫活性は変動するため、正確なエラスターゼの定量は困
難であった。
これに対して、標識エラスターゼを、エラスターゼの合
成インヒビターであるジイソプロピルフルオロホスフェ
ート　（ＤＦＰ）で前処理すると、血中のエラスターゼ
・インヒビターが結合できなくなることが見出され、こ
のＤＦＰ処理エラスターゼ１を用いたエラスターゼ１の
免疫学的測定法が開発された（特公昭５９−２５１８３
）。また、ＤＦＰ、フェニルメタンスルホニルフルオラ
イド（ＰＭＳＦ）、パラクロロマーキュリ−ベンゾエー
ト　（ＰＣＭＢ）、　；１はＣ１−アンチトリプシンで
処理した標識エラスターゼ１と、抗エラスターゼモノク
ローナル抗体を用いる方法も開発きれている（特開昭６
３−７３１５２）。
上記のとおり、エラスターゼの免疫活性を保持しながら
、血中のインヒビターとの結合を阻害する合成インヒビ
ターとしては、ＤＦＰ、　ＰＭＳＦ、　ＰＣＭＢが知ら
れていた。これに対して、Ｂｏｃ・ＴＡＣＫは豚のエラ
スターゼの酵素活性を阻害することが知られていたが（
ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ５Ｖｏｌ、　６７、１５６−１
６０．　（１９７６））、ヒトエラスターゼ１の酵素活
性を阻害することは知られておらず、また、エラスター
ゼ１とＣ１−アンチトリプシンとの結合を阻害すること
も知られていなかった。
明が解決しようとする課題 従来の免疫学的測定法では、血清検体中のエラスターゼ
インヒビター、Ｃ１−アンチトリプシンおよびαよ一マ
クログロブリンが標識エラスターゼ１と結合するため、
免疫学的活性が阻害きれ、血中エラスターゼ１の正確な
定量は不可能であった。
このα、−アンチトリプシンおよびα、−マクログロブ
リンとエラスターゼ１の結合を防ぐため、ＤＦＰ、　Ｐ
ＭＳＦ、ＰＣＭＢで標識エラスターゼ１の活性基をブロ
ンクする方法が知られている（前述）。しかし、これら
の合成インヒビターのうちＰＭＳＦは、Ｃ１−アンチト
リプシンおよびα、−マクログロブリンとエラスターゼ
１との結合に対する阻害能が弱い。
また、ＤＦＰおよびＰＭＳＦはフッ素を含んでいるため
、これらがエラスターゼｌと結合することによりフッ化
水素が発生するため有毒である。また、ＤＦＰは視神経
障害があるため、使用する際には注意を要する。
また、ＰＣＭＢは水銀を含んでいるため、その使用にあ
たっては、環境汚染などの問題がある。
そこで、血中のインヒビターとエラスターゼ１の結合を
完全に阻害し、なおかつエラスターゼエの免疫学的活性
は阻害せず、ＰＭＳＦやＤＦＰに置き換わり得るもので
フッ素や水銀などの有毒な物質を含まない安全な合成阻
害剤が望まれていた。
課　を　決するための手段 本発明者らは、ＰＭＳＦ＋ＤＦＰに優る、Ｃ１−アンチ
トリプシンおよびα、−マクログロブリンとエラスター
ゼ１の結合をほぼ完全に阻害し、なおかつエラスターゼ
１の免疫学的活性を阻害しない合成阻害剤を探究し、よ
り優れた正確なエラスターゼ１の測定方法を確立すべく
、鋭意研究を行なった結果、合成阻害剤Ｂｏａ−ＴＡＣ
Ｋを用いることを特徴とするエラスターゼ１の免疫学的
測定法を完成するに至った。
本発明で言うＢｏＣ−ＴＡＣＫとは、Ｎ−（Ｎ−ｔ−ブ
ト・キシカルボニルアラニル ３−クロロ−１−メチル−２−オキソプロピル）アラニ
ンアミドの略（　Ｂｏａ　・Ｔｒｉ−＾１ａｎｙｌ　Ｃ
ｈｌｏｒｏ−ｍｅｔｈｙｌ　ｋｅｔｏｎｅ）であり、下
記の構造式で示される。
（ｃＨｎ）ｓｃｏｃＯ［Ｎｏｃｏ（ｃｕ．）ｃｕコ．Ｃ
Ｈ．Ｃ１上記式中のアラニン残基は、Ｌ型であるのが望
ましい。
本発明に用いるヒトエラスターゼ１　　（ＥＣ　３．４
。
２１、１１）　　は、ヒト膵液中から常法、例えば、Ｆ
ｅｉｎｓｔｅｉｎらの方法（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．　４３．　５６９（Ｘ９７４ン）に従って精製
すればよい．得られたヒトエラスターゼ１のｐＪ識剤と
しては、放射性同位元素、酵素、螢光物質あるいは発光
物質などの１１１識剤として通常用いられているものを
使用する．放射性ヨウ素による標識にはクロラミンＴ法
、ラクトペルオキシダーゼ法またはＢｏｌｔｏｎ−）Ｉ
ｕｎｔｅｒ法を用いることができる．放射性ヨウ素とし
ては、１２５■および１３１　１などが用いられる。標
識酵素としては３β−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペ
ルオキシダーゼ（　ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒ
ｏｘｉｄａｓａ）、グルツースオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼおよびグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼなどが用いられる。螢光物質としては、フル
オレスセイン系のフルオレスセイン　イソチオシアネー
トおよびローグミン系のテトラメチル　ローダミン　イ
ンチオシアネートなどが用いられる。本発明においては
、特にクロラミンＴ法によりｌ！′Ｉで標識するのが望
ましい。
得られた標識ヒトエラスターゼ１を、Ｂｏｃ４Ａαで処
理してＢｏｃ・ＴＡＣＫ結合標識ヒトエラスターゼ１を
調製する．これは、９ｏｃ−ＴＡＣＫを含有するリン酸
緩衝液等の適当な緩衝液中に標識ヒトエラスターゼ１を
加え、−夜装置するなどして、ＢＯＣ−ＴＡｃＫを標識
ヒトエラスターゼ１に結合きせることができる。Ｂｏａ
・工ＡＣＫとエラスターゼ１との結合においては、フッ
化水素等の有害な物質が発生しないため、安全である。
抗エラスターゼ１抗体としては、ヒトエラスターゼ１を
、適当な免疫補助剤、たとえばフロイントの完全アジュ
バントなどと共に、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、モルモッ
トなどの哺乳類に投与１．。
て抗血清を得ることができる。また、抗エラスターゼ１
抗体としてモノクローナル抗体を使用してもよい。
本発明によるエラスターゼ１の免疫学的測定法は、上記
で得られたＢｏｃ−ＴＡＣＫで処理した標識ヒトエラス
ターゼ１と、測定すべき、例えば血清中のヒトエラスタ
ーゼ１とを、上記の抗エラスターゼ１抗体に対して競合
反応させることを特徴とする。
競合反応後、常法に従い、抗エラスターゼ１抗体が結合
した標識ヒトエラスターゼ１と、抗体が結合していない
標識ヒトエラスターゼ１を分離し、それらの画分の一方
または両方の標識剤の活性を測定する０通常は、抗体が
結合したものの画分の活性を測定すればよい。
この画分の分離は、固相法、サンドウィッチ法、二抗体
法などの公知の方法によって行なうことができるが、本
実施例においては二抗体法によって行なわれた。二抗体
法による分離に用いる第２抗体としては、抗エラスター
ゼ１抗体としてウサギ血清を用いた場合には、イムノビ
ーズ−ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体を用いればよい。
上記の画分の標識剤の測定値を、濃度既知の標準エラス
ターゼ１について作成した標準曲線と比較して、測定す
べきエラスターゼ１の量を求める。
本発明はさらに上記のようにして得られたＢｏＣ・ＴＡ
ＣＫ処理ヒトエラスターゼ１に関する。後記の実施例に
示すように、本発明のＢｏａ−ＴＡＣＫ処理ヒトエラス
ターゼ１は、Ｃ１−アンチトリプシンおよびα、−マク
ログロブリンと実質的に反応しない。
また、Ｂｏａ−ＴＡＣＫ処理の際には、有害なフッ化水
素は発生せず、さらに有害な水銀なども含まれない。
また、ＤＦＰおよびＰＭＳＦはあらゆるセリン残基に結
合するが、これに対して、Ｂｏａ−ＴＡＣＫはエラスタ
ーゼ１の活性中心に対してより特異的に結合するので、
免疫活性に対する影響が少ないと考えられる。
従って、Ｃ１−アンチトリプシンやα、−マクログロブ
リンが存在する測定系に使用するのに適している。また
、これを酵素、放射性同位元素、螢光物質で標識してお
けば、さらに有用である。
（以下余白） ＷＡ１ 標記トリベブタイド誘導体を下記に従い合成した。以下
、Ｂｏｃ・工ＡＣＫをＢｏａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
−ＣＨｘＣｌと記載する。
）１−Ａｌａ−ＯＢｚｌ ↓　Ｂｏａ−Ａｌａ−Ｏ５ｕ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ　（Ｉｆ　）４　２
０％−ｒ）ＩＦ／ＣＨ，Ｃ１゜ ↓　Ｂｏａ−Ａｌａ−Ｏ５ｕ、　ＤＩＥＡＢｏａ−Ａｌ
ｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ　（ＩＩＩ　）↓　Ｈ，
／Ｐｄ Ｂｏａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ（ＩＶ　）↓　
ＣＩＣ０ｓＣＨ＊ＣＨ（Ｃ１ｌｓ）ｔ、Ｎ−メチルモル
ホリン↓　ＣＨＪｍ／　（Ｃ＊Ｈｓ　）＊０ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＣＩ（Ｎｕ　（Ｖ　
）↓　ＬＭ　ＨＣＩ／Ａｃ０Ｈ Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＣＨ＋Ｃ１（ＶＩ　）↓
　（Ｂｏａ）＊Ｏ／ＤＭＦ Ｂｏａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＣＨｔＣｌ　（Ｉ　
）Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ　（Ｉ［＞Ｈ−Ａ
ｌａ−ＯＢｚｌ　・ｐ−トルエンスルホネート（２，０
ｇ　、　５　、７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（Ｎ、Ｎ−ンメチ
ルホルムアミド）１０ｍｌに溶解して、氷冷する。これ
に等モルのＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）と
Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｏ５ｕ（ＨＯ５ｕコＮ−ハイドロキシ
スクシンイミド）（１，９６ｇ　、　６．８ｍｍｏｌ）
を加える。２５°Ｃで２０時間反応許せた後、溶媒を減
圧留去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、ＩＭＭＣＩ、Ｉ
ＭＮａＨｃＯｓ、Ｈ，Ｏで順次洗浄した後、酢酸エチル
層をＭｇ５Ｏ，で乾燥する。溶媒を留去して得られる結
晶性残渣をシリカゲルカラム（ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　Ｈ
，５０ｇ。
ＣＨＣｌ５　’　ＭｅＯＨ＝　９９：１　）で精製し、
次いでエーテル−石油エーテルから再結晶して化合物■
１８５ｇ（９３％）を得る。
ｍ、ｐ、６５−６７℃ ［α　コ　ム’−２６，９±　０　、７°　　（ｃ＝１
．０．　　ＤＭＦ　）Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
−ＯＢｚｌ　（Ｉ［［）上記で得られた化合物ｎ　（１
，８ｇ　、　５．１ｍｍｏｌ）に２０％ＴＦＡ（ｈリフ
ルオロ酢酸）　／ＣＨ，Ｃ１゜を加え、２５°Ｃで３０
分間反応させる。溶媒を留去した後残渣をＤＭＦ２０ｍ
ｌに溶解し氷冷して、ＤＩＥＡを加えて中和する。これ
にＢｏａ−Ａｌａ−Ｏ５ｕ（１，６５ｇ　、　６．２ｍ
ｍｏｌ）を加えて、２５°Ｃで２０時間反応さぜる。反
応液は上記化合物■の場合と同様に後処理し、得られた
粗生成物をシリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　Ｈ，５０
ｇ、　ＣＨＣｌ５　：　ＭｅＯＨ＝　９８：２）で精製
し、更にエーテルから再結晶して化合物■２゜Ｏｇ（９
３％）を得る。ｍ、ｐ、１４０　１４１°Ｃ［α　コ　
ム″　−３０４±　０　、７　°　　（Ｃｍ１．０．　
　ＤＭＦ）Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎ
　）上記で得られた化合物１［［（２，０ｇ　、　４．
７５ｍｍｏｌ）をメタノール中、パラジウム黒（Ｐｄ　
ｂｌａｃｋ）を触媒として常法通り５時間接触還元する
。（Ｈ１消費量ｃａ。１００ｍ１　）　、溶媒を留去し
て得られる残渣をメタノール−エーテルから再結晶して
化合物■１．５６ｇ（９９％）を得る。
ｍ、ｐ、　２００−２０１℃（分解） ［α］乙’−２０．５±０．６°　（Ｃｍ１．０．　Ｄ
ＭＦ）Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＣＩ（Ｎ＋　
（Ｖ　）上記で得られた化合物ＩＶ（１，０９ｇ　、　
３．３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）
２０ｍｌに溶解し、−１０’Ｃに冷却する。これにＮ−
メチルモルホリン０．３６ｍ１（３，３ｍｍｏｌ）、次
いで、インブデルクロロフオルメイト０．４５ｍ１（３
，３ｍｍｏｌ）を加え、同温度で３０分間攪拌する。こ
こでジアゾメタンのエーテル溶液を加え、３０分間反応
させる。ジアゾメタンの黄色が残存していることを確認
した後、溶媒を減圧留去し、残渣にエーテルを加えて生
じるゲル状沈澱を濾取する。これをシリカゲルカラム（
Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　Ｈ，５０ｇ、　ＣＨＣｌ５：　Ｍ
ａＯＨ＝９８　：　２　）で精製して、更にエーテルか
ら再結晶して化合物Ｖ０．６０ｇ（５１％）を黄色針状
晶として得た。　ｍ、ｐ、１６５℃（分解）Ｉ　　Ｒ：
　　２１０８　　（−ＣＨＮ＊）、１６７６　　（＞Ｃ
−０）　　Ｃｍ−’’　ＨＮ　Ｍ、Ｒ：　６．０３　ｐ
ｐｍ　＜−Ｃｏ−ＣＨＮ＊　）Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｃ）Ｉ　Ｃ１・ＨＣＩＶｒ　）。
上記で得られた化合物Ｖ　（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏ
ｌ）をＩ　Ｍ　ＭＣＩ／ＡｃＯ８５ｍｌに溶解し、０℃
に３０分間、次いで２５℃に６０分間保った後、減圧乾
固する。残渣を５ａｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０のカラム
（４Ｘ３５ｃｎ）上、１−　ＢｕＯＨ−ＡｃＯＨ−Ｅｔ
ＯＨ−Ｈ，Ｏ（２：２：１：１）を溶媒として分配クロ
マトグラフィーを行なった。目的物を含む画分を集めて
溶媒を留去し、粗標品２００ｍｇを得る。薄層クロマト
グラフィー（ＫｉｅｓｅｌｇｅｌＨ，Ａｃ０Ｅｔ−Ａｃ
ＯＨ−ＨｔＯ＝４：１：ｌニンヒドリン呈色）で２スポ
ツトとして得られた。
Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＣＨ，Ｃ１（Ｉ上記
で得られた化合物■（ｃａ、　１００ｍｇ　）をＤＭＦ
２ｍｌに溶解し、ＤＩＥＡで中和する。これに（Ｂｏｃ
）ｊｏ（１００ｍｇ、ｃａ、　０．５ｍｍｏｌ）を加え
、２５℃で３０分間反応させた後溶媒を留去し、残渣を
シリカゲルカラム（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　Ｈ，２０ｇ、
　ＣＨＣ１ｘ’ＭｅＯＨ＝９８＝２）で精製する。目的
物を含む両分を集め溶媒を留去し、エーテルから結晶化
許せて目的化合物Ｉを５１ｍｇ得た。　ｍ、ｐ、２０５
°Ｃ（分解）［α］：”−９０，８±２．６°　（Ｃ＝
０．５．　　ＭｅＯＨ）’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ：　４．３５
　ｐｐｍ　（−Ｃｏ−ＣＨ＊Ｃ１）血液膵エラスターゼ
１（以下、Ｅｌと略記する。
）をラジオイムノアッセイ（競合法）により測定する場
合には、標識抗原（ｌｌｌｘ標識Ｅｌ）が血清中のイン
ヒビター、α、−アンチトリプシンおよびα、−マクロ
グロブリンと結合し、抗原抗体反応が妨害されるため、
血清Ｅ１を正確に測定することができない、これを防ぐ
ため、ＰＭＳＦやＤＩ７などで１１１ＰＪ識Ｅ１の活性
基（結合部位）をブロックする方法が知られている（前
述）。
以下の実施例では、Ｂｏａ−ＴＡＣＫ処理した＋１１１
標ｍＥ１が血清インヒビターとは結合せず、すべてが抗
原抗体反応に関与しうろことを、ゲル濾過法および免疫
学的手法により示すと共に、　Ｂｏｃ・τＡαを用いた
ヒト血清Ｅ１のラジオイムノアッセイの有用性を証明す
る。
■、試　および方 （１）エラスターゼの精製 ヒト膵液４！に硫酸アンモニウム２．８ｋｇ（７０％飽
和）を加え、４℃、１−２日放置する。遠心分離で沈澱
を集め、２００ｍ１の緩衝液１（５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、１０　ｍＭ　ＣａＣ１＊、ｐＨ６，５）に懸濁し、
同緩衝液に２日間透析する（外液５Ｎ、４回交換）、透
析内溶液（７７５ｍｌ）の伝導度を下げるために、緩衝
液１を加え、最終２．ＯＰとする（０．９５ｍｈｏ、ｐ
Ｈ６，４５）　、この溶液を、予め緩衝液１で緩衝化し
た５Ｐ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５（２，５ｘ４１．
Ｏｃ＋ａ）に負荷する。カラムの樹脂の１０倍量の緩衝
液１で洗浄した後、樹脂の１５倍量の緩衝液１を用い、
０→０　、４　Ｍ−ＮａＣ１直線濃度勾配で溶出する。
素通画分にエラスターゼによるエラスチン分解作用、サ
クシニル−トリーアラニン−ｐ−ニドロアニライド（以
下、ＳＡ、ＰＮＡと略す）分解作用が見られたが、トリ
プシンおよびキモトリプシンも混在している事が分かっ
た。そこでこの画分を集め（１２９５ｎ＋１　）、硫酸
アンモニウム９０３ｇ（Ｔ。
％飽和）を加え、４°Ｃ１３日間放置した後、沈澱を集
め、約４０ｍ１の緩衝液１に溶かす、このエラスターゼ
画分を緩衝液１に４日間透析（外液５Ｐ、２回交換）Ｌ
、８２ｍ１とした後、予め緩衝液１で緩衝化した５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　４Ｂ−εＡｍ１ｎｏｃａｐｒｏｙｌ−（
Ａｌａ）ｓ　（１，５Ｘ２４゜Ｏｃｍ　）に負荷する。
混在するトリプシン、キモトリプシンは完全に素通りし
たが、エラスターゼは僅かに吸着する傾向を示した。但
し、エラスターゼ画分には、なおトリプシンおよびわず
かのキモトリプシンが含まれており、これらを除くため
エラスターゼ画分を集め（１４７，０ｍ１）、限外濾過
（Ａｍ１ｃｏｎ、　ＹＭ−１０）で４５ｍ１に濃縮、更
に緩衝液２（１０ｍＭ工ｒｉｓ−ＨＣＩ、２　ｍＭ　Ｃ
ａＣＬ、ｐＨ７，５＞に２日間透析する（外液５１．２
回交換）、最終５７ｍ１となり、予め緩衝液２で緩衝化
した５ｅｐｈａ−ｒｏｓａ　４Ｂ−εＡｍ１ｎｏｃａｐ
ｒｏｙｌ（Ａｌａ）ｎ　（１，５ｘ２４．　Ｏｃｍ）に
負荷する。エラスターゼは僅かに吸着する傾向を示した
ものの、はとんど素通画分の近くに溶出した。キモトリ
プシンはエラスターゼの前に、トリプシンはエラスター
ゼの後ろに溶出し、混在するトリプシン、キモトリプシ
ンをほぼ除去することができた。最終的にエラスターゼ
が５２．８ｍｇ得られた。
（２）エラスターゼの性状 （Ａ）純度 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド、１ｍｍゲル
）、ｐＨ９，４ゲル電気泳動（７，５％アクリルアミド
、ｉｎ＋ｍゲル）、ｐＨ４，０ゲル電気泳動（７，５％
アクリルアミド、１ｍｍゲル）のいずれにおいても均一
であった。
（Ｂ）分子量 Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓ　Ｃａ１ｉｂｒａｔｉｏｎＫｉｔを用い、前述の５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥの移動度から計算すると分子量は３１５０
０となった。エラスターゼ１についてｃＤＮＡから推測
される分子量は２５５９０であり（特開昭６１−１１１
６８８　）、それより大きい値であった。後述するよう
に、アミノ酸組成は特開昭６１−１１１６８８記載のエ
ラスターゼ１と殆ど同じである事から、５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅでの分子量測定ではエラスターゼ分子の特殊性により
正確な分子量が反映されていないのかもしれない。
（Ｃ）アミノ酸分析 エラスターゼを）ＩＰＬＣ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、　Ａｑ
ｕａｐｏｒｅ　ＲＰ−３００ｃｏｌｕｍｎ）で脱塩し、
４Ｍメタンスルホン酸（０，２％　３−（２−アミノエ
チル）インドールを含む）を用いて、１１０℃で２４時
間加水分解した。アミノ酸分析は日立アミノ酸分析機（
Ｍｏｄｅｌ　８３５）を用いて行なった。結果を表１に
示す、今回得たエラスターゼのアミノ酸組成は、ｃＤＮ
Ａから報告されているエラスターゼ１のアミノ酸組成の
値とほぼ一致した。
（以下余白） 表１ アミノ酸　　　　　結果　　　　　　参考１１Ａｓｐ　
　　　　　　２２．０　　　　　　２１τｈｒ　　　　
　　　１２．１３　　　　　　１３Ｓｅｔ　　　　　　
　１９．８　　　　　　１９Ｇｌｕ　　　　　　　１９
．９　　　　　　１９Ｐｒｏ　　　　　　　１５．９　
　　　　　１６Ｇｌｙ　　　　　　　２４．８　　　　
　　２５Ａｌａ　　　　　　　１５．０　　　　　　１
４Ｃｙｓ／２　　　　　　９．６　　　　　　１０Ｖａ
ｌ　　　　　　　１８．４　　　　　　２２とｅヒ　　
　　　　　１．１１ １１ｅ　　　　　　　Ｌｌ、１　　　　　　１３Ｌａｕ
　　　　　　　１７．０　　　　　　１８Ｔｙｒ　　　
　　　　　９．０　　　　　　　９Ｐｈａ　　　　　　
　　７．８　　　　　　　７Ｌｙｓ　　　　　　　　７
．２　　　　　　　９Ｈｉｓ　　　　　　　　５．８　
　　　　　　７Ａｒｇ　　　　　　　　９．　Ｑ　　　
　　　　　８τｒｐ　　　　　　　　８・６１１ 合計　　　　　　　　　　　　　　２４２（特開昭６１
−１１１６８８参照 （Ｄ）酵素作用について エラスチン分解活性はＷ、Ａｒｄｅｌｔａｔ　ａｌの方
法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　３４．１８０．　（
１９７０））、カゼイン分解活性は舒本郷の方法（理研
報且７６３８１．　（１９５８）ン、　ＢＴＥＥ＜ベン
ゾイル−チロシン−エチルエステルル）に対するエステ
ラーゼ作用は、Ｂ．　Ｃ．賢．　Ｍａｍｍａｌの方法（
Ｃａｎ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ　
３７，　１３９３，（１９５９）　）、およびＳＡ　、
ＰＮＡに対する作用は、Ｊ．　Ｂｉｅｔｈらの方法（　
Ｂｉｐｃｈｅｍ．　Ｍａｄ．　１１，　３５０．　（１
９７４）　）で測定し、その結果を表２に示した．比較
として、Ｓｌｇｍａ社のブタエラスターゼ＋　Ｗｏｒｔ
ｈｉｎｇｔｏｎ社のウシキモトリプシン、　ウシトリプ
シンの活性を示した．今回得られたヒトエラスターゼは
ブタエラスターゼに較べ、カゼイン分解活性はほぼ同等
であったが、エラスチン分解活性は相当弱く、約１７１
０〜ｌ／２０程度であった．しかし、５Ａ　、ＰＮＡ分
解活性は若干劣るものの強い作用が認められた．このよ
うな傾向は、一般的にエラスターゼ１について認められ
ており、今回得られたヒトエラスターゼは先に述べたア
ミノ酸組成の一致に加えて酵素作用の面からもエラスタ
ーゼ１であると准定きれる．更に、トリプシンに対する
典型的基質であるＴＡＭＨには作用せず、キモトリプシ
ンの典型的基質ＢＴＥＥには僅かに作用したが、Ｓｉｇ
ｍａ社製ブタエラスターゼに比較すると約１７５程度で
あり、この事からトリプシン、キモトリプシンの混在は
ないものと考えられる。
（以下余白） （３）抗Ｅ１血清の作製 Ｅｌｏ、２５ｍｇを生理食塩液０．２５ｍ１に溶解し、
フロイントの完全アジュバント０．２５ｍ１に混ぜてエ
マルシヨンとし、これを家兎（日本白色種）に３適間隔
で５回投与して、抗血清を作製した。ラジオイムノアッ
セイには、これを１：６５０００に希釈して用いた。
（４）”’［１識Ｅ１の作製 Ｅｌのｌ！Ｊ標識は、クロラミンＴ法により行なった。
８１５８ｇにＮａ”’　Ｉ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）
　１　ｍＣｉおよび０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）　５０μｌを加えて混和した後、０，２％クロラミン
Ｔｍ液１０μｌを加え室温で３０秒間攪拌した。ついで
０．２５％メタ重亜硫酸ナトリウム溶液５０μｌを加え
混和した後、５％ヨウ化カリウムおよび１％牛血清アル
ブミン溶液を１０μｌずつ加えた。
これをゲル濾過［５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０、φ０．
９Ｘ２５　ａｍ、展開液：　０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）　］　して１３６Ｉ標識Ｅ１画分を分取した
。これに後記（７）の測定緩衝液を加え一夜放置してＢ
ｏＣ−ＴＡＣＫを結合させた後、４０００００　ｄｐｍ
／ｍｌに調製してラジオイムノアッセイに用いた。標識
化率は、約５０％で、比放射能は、約８０μＣｉ／μｇ
であった。
（５）第２抗体 イムノビーズ−ヤギ抗ウサギＩ　ｇ　Ｇ　（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ社製）を１００μｇ／ｍｌに調製して用いた。
（６）ゲル濾過 １″ＩＩ標識をヒト血清に添加して、３７℃で３０分間
インキュベーションした後、ゲル濾過［Ｕｌｔｒｏｇｅ
ｌ　ＡｃＡ　４４（ＩＢＦ　Ｂｉｏｔｅｃｈｒ＋Ｌｃｈ
ｓ社製）、φ１゜５Ｘ５５　ｃｍ、展開液：０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，１）コし、その溶出液を１ｍｌず
つ分取して各画分の放射能を測定した。
（７）ラジオイムノアッセイ 測定緩衝液は特記しないかぎり、　０　、１　ｍＭ　Ｂ
ｏａ・ＴＡＣＫ、　　０．９％塩化ナトリウム、０．０
５％アジ化ナトリウムおよび０．２％牛血清アルブミン
を含む０．Ｏ１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いた
。
標準Ｅ１溶液（０，５〜５０ｎｇ／ｍｌ）あるいは、被
検血清１００μｍをポリスチレンチューブにとり、Ｉｔ
Ｊ標識Ｅ１溶液および抗Ｅ１血清各１００μｍを加え混
和後、３７℃で３時間インキュベーションした。ついで
、第二抗体液５００μｍを力口え混和後、３７℃で３０
分間インキュベーションした。室温で遠心分離（３００
０ｒｐｍ、５分間）した後、上清を吸引除去し、沈殿の
放射能を測定した。
（１）ゲル濾過による評価 Ｂｏａ−ＴＡＣＫ未処理の１１６１標識Ｅ１を添加した
ヒト血清をゲル濾過すると、″６Ｉ標識Ｅ１はすべてα
１−アンチトリプシンおよびα、−マクログロブリンと
の複合体画分に溶出した（第１図−ａ）。
これに対し、あらかじめＢｏａ−ＴＡＣＫで処理した１
１４Ｉ標識Ｅ１は、大部分が遊離画分に溶出し、複合体
画分には認められなかった（第１図−ｂ）。
（２）免疫学的方法（ラジオイムノアッセイ）による評
価 標準Ｅ１溶液のかわりに、α、−アンチトリブシンある
いはα、−マクログロブリン溶液を用いてラジオイムノ
アッセイを行ない、それらの結合率に及ぼす影響を調べ
た。測定緩衝液には、前記（７）に記載したもの（Ａ法
）の他にＢｏＣ−ＴＡＣＫを含まないもの（Ｂ法）およ
びＢｏｃ−ＴＡＣＫのかわりにＰＭＳＦを加えたもの（
Ｃ法）を用いた（第２図）。
Ｂ法では、血清インヒビターの増加につれて結合率が徐
々に低下し、Ｃ法でも、これに準する程度の低下が認め
られたが、Ａ法では結合率の変化はほとんど認められず
、高濃度のα８−マクログロブリンでわずかに低下する
程度であった。
■、ヒト血清Ｅ１の測定 （１）標準曲線およびヒト血清の希釈曲線標準曲線は、
第３図に示したように、０３〜５０　ｎｇ／ｍｌの範囲
で良好な競合反応曲線を示し、感度は０　、５　ｎｇ／
ｍｌであった。　Ｅｌの免疫反応性に及ぼすＢｏＣ−Ｔ
ＡＣＫの影響を調べるために、Ｂｏａ・ＴＡＣＫ処理Ｅ
処理米１理Ｅ１につき、標準曲線を作成し、比較したと
ころ、第４図に示したように両者に差はなく、ＥｌにＢ
ｏｃ・工ＡＣＫを結合浮せても免疫反応性には何ら影響
を与えなかった。
また、ヒト血清の希釈曲線は、標準曲線と概ね良好な平
行性を示した（第３図）。
（２）特異性 ラジオイムノアッセイにより、血清インヒビターとＥｌ
の複合体の競合反応曲線を作成し、Ｅｌの標準曲線と対
比して各複合体の交差反応性を調べた（第５図）、α１
−アンチトリプシンおよびα。
−マクログロブリンとＥｌの複合体の交差反応性は、表
３に示したとおり、標準Ｅ１を１００％とするとそれぞ
れ２６％および２％以下で、既報［村田厚夫、他；日消
誌、７訳１９８５〜１９９０　（１９５１）　］のラジ
オイムノアッセイと同様、α１−アンチトリプシンとの
複合体とのみ交差反応性が認められた。
なお、α、−アンチトリプシンあるいはα、−マクログ
ロブリンのみでは、ともに交差しなかった。
また、第６図に示したように種々の動物血清との交差反
応性は認められなかった。
表３ α１−アンチトリプシン（α、−ＡＴ）およびα、−マ
クログロブリン（α、−１（Ｇ）とＥｌの複合体の交差
反応性 （３）ヒト血清Ｅ１の回収率 あらかじめＢｏａ−ＴＡＣＫ処理したＥｌをヒト血清に
添加した試料を測定し、回収率を求めた。平均回収率は
、表４に示したように１００．４±８．９％と良好な結
果を示した。
表４ ヒト血清に添加したＢｏＣ−ＴＡＣＫ処理Ｅ処理米１率
（４）健常人血清Ｅ１ 健康成人６例の血清Ｅ１を測定したところ、平均２．３
８±０　、７２　ｎｇ／ｍｌで、市販のラジオイムノア
ッセイキット（Ｄａｉｎａｂｏｔ社製）の測定値とほぼ
一致した（表５）。
表５ 健常人血清Ｅ１の測定
【図面の簡単な説明】
第１図はヒト血清中のＨｏｅ−ＴＡＣＫ未処理”’　Ｉ
　［ｍＥｌ（ａ）およびＢｏａ−ＴＡＣＫ処理１２５Ｉ
標識Ｅｌ（ｂ）を、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４　
（１，５ｘ　５５　ａｍ）から５０ｍＭ　’）ン酸緩衝
液（ｐＨ７，１）で溶出した結果を示す。 第２図は未処理、ＰＭＳＦまたはＢｏａ−ＴＡＣＫ処理
１２５ＩＥＩと抗Ｅ１血清の結合率に対するα１−アン
チトリプシンおよびα、−マクログロブリンの影響を示
す。 第３図はＥｌの標準曲線とヒト血清の希釈曲線を示す。 第４図はＥｌのＢｏａ−ＴＡＣＫ処理による標準曲線に
及ぼす作用を示す。 第５図はＥｌとα１−アンチトリプシンおよびα、−マ
クログロブリンとの複合体の交差反応性を示す。 第６図は種々の動物血清との交差反応性を示す。 特許出願人　：　塩野義製薬株式会社 代　理　人　：　弁理士　潮１）雄−ｊ　　′し−、 Ｒａｄｉｏａｃｔｔｖｉｔｙ　　　　　ｃｐｍ　Ｘ　　
ｌ凸４ｏ　　　　　＜Ａ　　　　　Ｏφ 図面の浄ｉ 第　　２　　図 ｃＬＩＡＴ　、　、ｕｇ　／ｍ１１ 血清の結合率に対するα、−アンチトリプシンおよびａ
−マクログロブリンの影響 図面の浄書 第　　３　　図 Ｅｌａｓｔａｓｅ　１、ｎｇ７ｍｔｌ Ｅ１の標準曲線とヒト血清の希釈曲線 図面の浄書 第　　４　　図 ＥｌのＢｎｃ−ＴＡＣＫ処理による標準曲線に及ぼす作
用筒　　　５　　　図 ０．５　　　　　　１．５　　　　　　　５　　　　　
　　　Ｉｓ　　　　　　　　Ｓ。 ε１ａｓｔａｓｅ　１’ｆ　ｎｇ／ｍｌ　］Ｅ１とα、
−アンチトリプシンおよびα２−マクログロブリンとの
複合体の交差反応性 図面の浄書 第　　６　　図 ０．５　　＋、５　５．０　１５　５０ＥＪａｓｔａｓ
ｅ　１．ｎｇ／ｍｊｊ 種々の動物血清との交差反応性 ６　補正の対電 手続ネ市正書（方式） １、事件の表示 平成　１年特許願第１２６４２３号 ２、発明の名称 エラスターゼ１の測定方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　大阪府大阪市中央区道修町３丁目１番８号４、代
理人 住所　大阪市福島区鷺洲５丁目１２番４号〒５５３塩野
義製薬株式会社　特許部 （電話　０６−４５８−５８６１） 」　　　　　　　１ 平成　１年　８月２９日（発送日） 図面 ７、補正の内容 図面の第１．２．３．４および６図を添付の図面と差し
替える。 以上

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）Ｂｏｃ・ＴＡＣＫで処理した標識エラスターゼ１
    および測定すべきエラスターゼ１を、抗エラスターゼ１
    抗体と競合反応させることを特徴とするエラスターゼ１
    の免疫学的測定法。
  2. （２）さらに、抗体が結合した標識エラスターゼ１と抗
    体が結合していない標識エラスターゼ１を分離し、それ
    らの画分の一方または両方の標識剤の活性を測定する工
    程を有する請求項１記載の測定方法。
  3. （３）さらに、濃度既知の標準エラスターゼ１について
    作成した標準曲線から測定すべきエラスターゼ１の量を
    求める工程を有する請求項１または２記載の測定方法。
  4. （４）抗エラスターゼ１抗体として抗エラスターゼ１血
    清を用いる請求項１記載の測定方法。
  5. （５）標識剤が放射性同位元素である請求項１記載の測
    定方法。
  6. （６）抗体が結合した標識エラスターゼ１と抗体が結合
    していない標識エラスターゼ１の分離を二抗体法により
    行なう請求項２記載の測定方法。
  7. （７）第二抗体としてイムノビーズ−ヤギ抗ウサギＩｇ
    Ｇを用いる請求項６記載の測定方法。
  8. （８）測定すべきエラスターゼ１が血中のエラスターゼ
    １である請求項１記載の測定方法。
  9. （９）ヒトエラスターゼ１をＢｏｃ・ＴＡＣＫで処理し
    て得られるＢｏｃ・ＴＡＣＫ処理ヒトエラスターゼ１。
  10. （１０）標識ヒトエラスターゼ１をＢｏｃ・ＴＡＣＫで
    処理して得られるＢｏｃ−ＴＡＣＫ処理標識ヒトエラス
    ターゼ１。
  11. （１１）該標識が放射性同位元素でなされる請求項１０
    に記載のＢｏｃ・ＴＡＣＫ処理標識ヒトエラスターゼ１
    。
  12. （１２）該放射性同位元素が＾１＾２＾６Ｉである請求
    項１１に記載のＢｏｃ・ＴＡＣＫ処理標識ヒトエラスタ
    ーゼ１。
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