DK161095B - Fremgangsmaade til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon og peptid-enzym-konjugat til brug ved denne fremgangsmaade - Google Patents
Fremgangsmaade til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon og peptid-enzym-konjugat til brug ved denne fremgangsmaade Download PDFInfo
- Publication number
- DK161095B DK161095B DK360379A DK360379A DK161095B DK 161095 B DK161095 B DK 161095B DK 360379 A DK360379 A DK 360379A DK 360379 A DK360379 A DK 360379A DK 161095 B DK161095 B DK 161095B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- peptide
- conjugate
- asp
- arg
- gln
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 69
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 title claims description 59
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 title claims description 59
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 title claims description 56
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 title claims description 56
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 133
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 78
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 78
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 55
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 15
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 14
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 11
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 8
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 8
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 97
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 87
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 87
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 76
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 51
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 40
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 37
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 28
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 23
- -1 Gin-Asp Chemical compound 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N n-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide Chemical compound C1=CC2CC1C1C2C(=O)N(O)C1=O ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 17
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 12
- SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxo-4-phenylmethoxybutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 11
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 11
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 10
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 10
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 9
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 7
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010531 catalytic reduction reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 6
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 5
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical group CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000002946 anti-pancreatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- ZIOCIQJXEKFHJO-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C ZIOCIQJXEKFHJO-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 3
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- FVSDTYGQCVACMH-ISJKBYAMSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-methylsulfinylbutanoic acid Chemical compound CS(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C FVSDTYGQCVACMH-ISJKBYAMSA-N 0.000 description 2
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010027490 Antagosan Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 2
- 101710173663 Glucagon-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710173664 Glucagon-2 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-N'-(2-(4-morpholinyl)ethyl)carbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NCCN1CCOCC1 XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 2
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006266 etherification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N (2s)-3-hydroxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- RRONHWAVOYADJL-HNNXBMFYSA-N (2s)-3-phenyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RRONHWAVOYADJL-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- VVNYDCGZZSTUBC-LURJTMIESA-N (2s)-5-amino-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O VVNYDCGZZSTUBC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JIMLDJNLXLMGLX-JTQLQIEISA-N (2s)-5-amino-5-oxo-2-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 JIMLDJNLXLMGLX-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 2-Methylbenzenesulfonic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- MWOOKDULMBMMPN-UHFFFAOYSA-N 3-(2-ethyl-1,2-oxazol-2-ium-5-yl)benzenesulfonate Chemical compound O1[N+](CC)=CC=C1C1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 MWOOKDULMBMMPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 4-methylumbelliferyl beta-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKJBKNVQHBZUIX-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKJBKNVQHBZUIX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100008041 Arabidopsis thaliana CURT1B gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- PCSMJKASWLYICJ-UHFFFAOYSA-N Succinic aldehyde Chemical compound O=CCCC=O PCSMJKASWLYICJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N [(3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxyoxan-3-yl] acetate Chemical compound CC(=O)O[C@@H]1CO[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O MJOQJPYNENPSSS-XQHKEYJVSA-N 0.000 description 1
- VXLCKSFMONBCLQ-UHFFFAOYSA-N [Na]CC[Na] Chemical group [Na]CC[Na] VXLCKSFMONBCLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- TYQYRKDGHAPZRF-INIZCTEOSA-N benzyl (2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoate Chemical compound O=C([C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)OCC1=CC=CC=C1 TYQYRKDGHAPZRF-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- FHOGXXUNJQGWOP-YPMHNXCESA-N benzyl (2s,3r)-3-hydroxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 FHOGXXUNJQGWOP-YPMHNXCESA-N 0.000 description 1
- RXUBZLMIGSAPEJ-UHFFFAOYSA-N benzyl n-aminocarbamate Chemical compound NNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 RXUBZLMIGSAPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 238000011208 chromatographic data Methods 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 239000012024 dehydrating agents Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000020021 gose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- WHQSYGRFZMUQGQ-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;hydrate Chemical compound O.CN(C)C=O WHQSYGRFZMUQGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- LVSJDHGRKAEGLX-UHFFFAOYSA-N oxolane;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound C1CCOC1.OC(=O)C(F)(F)F LVSJDHGRKAEGLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000001557 phthalyl group Chemical group C(=O)(O)C1=C(C(=O)*)C=CC=C1 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 161095 B
Den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåde til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon (H-His-Ser-Gln-Gly-Tilr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-G?n-Asp-Phe-Val-Gln-Trj5-Leu-Met-Asn-Tfir-OH). Opfin-5 delsen angår tillige et peptid-enzym-konjugat til brug ved denne fremgangsmåde.
Pankreatisk glucagon, der i det følgende også vil blive betegnet PG, er et hormon der spiller en vigtig rolle ved kontrollen med blodsukkerniveauet hos dyr, og til belysning 10 af forstyrrelser i sukkerstofskiftet er det væsentligt at have indsigt i dynamikken med PG-sekretion. Det er derfor ønskeligt at tilvejebringe en praktisk, stærkt følsom og specifik fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse eller analyse af dette hormon, og nu om stunder bruger man udstrakt radioimmunanaly-15 seprocesser, i det følgende for korthedens skyld betegnet RIA, til dette formål.
Som bekendt indebærer RIA imidlertid brug af en radioisotop som et væsentligt analyseredskab, og dette medfører risiko for at påvirke menneskelegemet og for at bevirke for-20 urening af omgivelserne. Radioisotopmetoden har derudover den ulempe at forskellige love, regler og forskrifter gør det nødvendigt at bruge specielt udstyr såvel som kvalificeret personale og eventuelt kontrolpersonale kvalificeret til betjening af sådant udstyr. Som fremgangsmåde til at overvin-25 de disse ulemper ved RIA er det hensigtsmæssigt at bruge den såkaldte enzym-immunanalysemetode (i det følgende for kortheds skyld betegnet EIA), idet en sådan metode er let at udøve og giver overordentligt pålidelige kvantitative resultater.
30 De principper der ligger til grund for EIA ligner dem der ligger til grund for RIA, men eftersom der bruges et enzym som mærkningsmiddel, kan EIA hensigtsmæssigt og uden problemer gennemføres i almindelige forskningslaboratorier eller kliniske laboratorier. Da imidlertid koncentrationen af pan- 35 kreatisk glucagon i blodet er meget lav, har de konventionel- ί ! le EIA-processer ikke hidtil givet tilfredsstillende data i 1 kliniske tilfælde, idet sådanne.fremgangsmåder har ringere følsomhed end RIA.
DK 161095 B
2 På denne tekniske baggrund er der som led i forebere-delserne til den foreliggende opfindelse blevet syntetiseret forskellige peptider og gennemført undersøgelser med henblik på at bruge dem i en tilstand hvor de er mærket med enzymer 5 til udvikling af en EIA-proces som kan tillade specifik kvantitativ bestemmelse af pankreatisk glucagon i en legemsvæske med en følsomhed og nøjagtighed, der i det mindste står på højde med følsomheden og nøjagtigheden af RIA. Disse undersøgelser har vist at et konjugeret produkt af et mærknings-10 enzym med et peptid som ikke er det samme som det peptid der bruges til fremstilling af PG-specifikt antistof, er særdeles værdifuldt til formålet. Denne konstatering blev efterfulgt af yderligere undersøgelser som mundede ud i den foreliggende opfindelse.
15 I overensstemmelse hermed angår opfindelsen et peptid- enzym-konjugat som er ejendommeligt ved det i krav 1's kendetegnende del angivne.
Som nævnt angår opfindelsen også en fremgangsmåde til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon under anvendelse 20 af et peptid-enzym-konjugat som analysereagens, og denne fremgangsmåde er ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del angivne.
Konjugatet og fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende forklares mere udførligt lige som de peptider 25 der indgår i det pågældende konjugat.
I de ovennævnte formler kan der som eksempler på R^, der jo angår et peptidfragment bestående af 1-10 aminosyre-rester i den nævnte sekvens (3-Ala-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, indbefattende Asp i 10-stillingen i denne se-30 kvens, kan nævnes Asp, Gin-Asp, Ala-Gln-Asp, Arg-Ala-Gln-Asp, Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp og β-Ala-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp.
35 Som et af de foretrukne peptid-enzym-konjugater kan der nævnes et konjugat vundet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med formlen 3
DK 161095 B
3
H-R^-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
hvor R er et peptidfragment bestående af 1-7 aminosyrere-ster i sekvensen Asp-slr-A^g-Arg-AlI-GlÉ-Asp, incl. Asp i 7-stillingen.
5 Som peptid der kan indgå i det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte konjugat kan nævnes et peptid med formlen
H-R1-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-R2-Asn-Thr-OH
10 1 2 hvor R og R har de ovenfor angivne betydninger og peptidet med formlen
H-R^-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-R2-Asn-Thr-OH
15 hvor R2 betegner Met eller Nle og R^ betegner enten Asp eller Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp eller (3-Ala-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp.
I nærværende beskrivelse med tilhørende krav er, når aminosyrer, peptider, beskyttelsesgrupper, reaktive grupper 20 etc. er gengivet ved forkortelser, disse forkortelser enten dem der er anvendt i henhold til IUPAC-IUB Commission on Biological Nomenclature eller dem der rutinemæssigt anvendes på dette område af teknikken. De vigtigste af disse forkortelser er vist nedenfor. I denne sammenhæng skal det nævnes at 25 når der er involveret optisk isomeri ved aminosyrer etc., menes der normalt L-formerne med mindre andet er angivet.
Arg: arginin
Trp: tryptofan
Asn: asparagin 30 Asp: asparaginsyre
Thr: threonin
Ser: serin
Glu: glutaminsyre
Gin: glutamin 35 Ala: alanin
Val: valin
Met: metionin
Met(O):metioninsulfoxyd Leu: leucin
DK 161095 B
4
Tyr: tyrosin β-Ala: β-alanin Nle: norleucin
Phe: fenylalanin 5 Z: karbobenzoxy
Boc: t-butyloxykarbonyl OBut: t-butylester OBzl: benzylester ONB: N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidester 10 MBS: p-metoxybenzensulfonyl HONB: N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid DCC: N, N'-dicyklohexylkarbodi imid DCU: N,N'-dicyklohexylurinstof DMF: N ,N-dime tyl formamid 15 NMP: N-metyl-2-pyrrolidon TFA: trifluoreddikesyre THF: tetrahydrofuran TEA: triætylamin DCHA: dicyklohexylamin 20 CMC: karboxymetylcellulose ECDI: l-ætyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karboaiimid CMCT: 1-cyklohexyl-3-(2-morfolinoætyl)-karbodiimido-meto-p- toluensulfonat GLA: glutaraldehyd 2 5 m-MBHS: meta-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimidester p-MCHS s para-maleimidometylcyklohexan-l-karboxyl-N-hydroxy-succinimidester
EDTA: dinatr ium-æty lendiamintetraacetat, 2H2O
HSA: humant serumalbumin 25 BSA: okse-serumalbumin
De forskellige peptider, som er nyttige i forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan fremstilles med processer der i og for sig er kendt ved peptidsyntese. Således kan man bruge både fastfase- og væskefasemetoder, men væskefase-30 metoderne er fordelagtige i mange tilfælde. Sådanne metoder til peptidsyntese kan findes i litteraturen, fx Schroder og Lubke: The Peptides, Vol. 1 (1966), Academic Press, New
DK 161095 B
5
York, USA; Izumiya et al: Peptide Gose (Peptide Synthesis), Maruzen Inc., Japan (1975); M. Bodansky og M.A. Ondetti:
Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; og F.M.
Finn og K. Hofman: The Proteins, bind 2, redigeret af Η.
5 Nenrath, R.L. Hill, Academic Press Inc., New York 1976. Således kan der nævnes azidmetoden, kloridmetoden, syreanhy-dridmetoden, den blandede syreanhydridmetode, DCC-metoden, den aktive estermetode, den metode der indebærer anvendelse af Woodward's reagens K, karbodiimidazolmetoden, reduktions-10 oxydationsmetoden, DCC/additiv (fx HONB, HOBt, HOSu) etc.
Det peptid der indgår i det foreliggende konju-gat kan fremstilles ved at man kondenserer et udgangsmateriale med en reaktiv karboxylgruppe, der svarer til enten et af de to fragmenter af peptidet som delt i en vilkårlig af pep-15 tidbindingerne, med et korresponderende udgangsmateriale med en aktiv aminogruppe svarende til det andet af de to nævnte fragmenter og på i og for sig konventionel måde, hvorpå man såfremt det resulterende kondensationsprodukt indeholder en eller flere beskyttelsesgrupper fjerner den eller dem på i 20 og for sig kendt måde.
Ved udførelse af reaktionen til fremstilling af peptidet foretrækkes det normalt at Asp i forvejen er beskyttet.
I mange tilfælde vindes det ønskede produkt ved fjernelse i sidste trin af beskyttelsesgrupper fra peptidet som er be-25 skyttet i mindst en af de aminosyrerester som peptidet er sammensat af. Beskyttelsen af de funktionelle grupper, som ikke skal involveres i reaktionen og som kan være sket med grupper som kan være til stede i udgangsmaterialet, beskyttelsesgrupper som er nyttige til sådanne formål og fremgangs-30 måder til fjernelse af sådanne beskyttelsesgrupper samt aktivering af de funktionelle grupper, der skal indgå i selve reaktionen, kan alt sammen udføres ved metoder der er i og for sig konventionelle og som kan vælges blandt kendte grupper og fremgangsmåder.
35 Som eksempler på aminobeskyttelsesgrupper som er vel egnede til beskyttelse af aminogrupperne i udgangsmaterialer- [ i ne kan nævnes karbobenzoxy, t-butyloxykarbonyl, t-amyloxykar-bonyl, isobornyloxykarbonyl, p-metoxybenzyloxykarbonyl, 2-
DK 161095 B
6 klorbenzyloxykarbonyl, adamantyloxykarbonyl, trifluoracetyl, ftalyl, formyl, o-nitrofenylsulfenyl,og difenylfosfinotioyl.
Som eksempler på karboxylbeskyttelsesgrupper kan nævnes sådanne esterdannende grupper som dem der har evne til at give 5 alkylestere (fx metyl-, ætyl-, propyl-, butyl- og t-butyl-estere), en benzylester, p-nitrobenzylester, p-metoxybenzyl-ester, p-klorbenzylester og benzhydrylester, samt hydrazid-dannende grupper såsom dem der har evne til at danne karbo-benzoxyhydrazid, t-butyloxykaibonylhydrazjd eller tritylhy-10 drazid. Som grupper egnet til beskyttelse af guanidingruppen i Arg, kan fx nævnes nitro-, tosyl-, p-metoxybenzensulfonyl-, karbobenzoxy-, isobomyloxykarbonyl- og adamantyloxykarbonyl-gruppen. Guanidingruppen kan også beskyttes i form af et salt med en syre, fx benzensulfonsyre, toluensulfonsyre, saltsyre 15 eller svovlsyre.
Hydroxylgruppen i Thr kan fx beskyttes ved forestring eller forætring. Som eksempler på grupper der egner sig til forestringen kan nævnes små alkanoylgrupper som fx acetyl, aroylgrupper som fx benzoyl og grupper afledet af karbonsyrer, 20 fx benzyloxykarbonyl- eller ætyloxykarbonylgruppen. Som grupper der er egnet til forætring kan fx nævnes benzyl, tetra-hydropyranyl og t-butyl. Hydroxylgruppen i Thr behøver imidlertid ikke nødvendigvis at blive beskyttet. Met kan være beskyttet i forvejen i form af et sulfoxyd. Som eksempler på 25 den aktiverede karboxylgruppe i udgangsmaterialet kan nævnes det tilsvarende syreanhydrid, azid, aktive ester (som fx ester med pantaklorfenol, p-nitrofenol, N-hydroxysuccinimid, N-hydroxybenzotriazol eller N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarb-oximid.
30 Nogle reaktioner til dannelse af peptidbindinger kan gennemføres i nærværelse af et dehydratiseringsmiddel såsom karbodiimidreagenser, fx dicyklohexylkarbodiimid eller karbo-diimidazol. Kondensationsreaktionen til fremstillingen af peptidet kan udføres i nærværelse af et opløsningsmiddel. Op-35 løsningsmidlet kan vælges blandt de opløsningsmidler som er kendt for at være nyttige til peptiddannelses-kondensations-reaktioner. Således kan der fx nævnes tørt eller vandigt dimetylformamid, dimetylsulfoxyd, pyridin, kloroform, dioxan, DK 161095 7 diklormetan, tetrahydrofuran, ætylacetat, N-metylpyrrolidon eller passende blandinger deraf.
Reaktionstemperaturen kan ligge i det område der vides at være hensigtsmæssigt til kondensationsreaktioner til 5 peptiddannelse. Således kan temperaturen normalt ligge inden for området mellem -40 og +60°C, fortrinsvis fra ca. -20°C til ca. 0°C.
Efter kondensationsreaktionen kan den eller de beskyttelsesgrupper der findes på det dannede peptid fjernes på 10 konventionel måde. Som eksempler på sådanne kendte måder kan nævnes reduktive metoder (fx hydrogenering med en katalysator såsom palladium sort eller reduktion med natriummetal i flydende ammoniak) og acidolyse (fx acidolyse med en stærk syre såsom trifluoreddikesyre, hydrogenfluorid eller metan-15 sulfonsyre).
Det peptid der dannes på denne måde kan isoleres fra reaktionsblandingen ved kendte peptidfraskillelsesteknik, fx ekstraktion, fordeling eller søjlekromatografi.
Da peptidet indeholder argininrester, kan det isoleres 20 i form af et salt. Som eksempler på syrer med evne til at danne sådanne salte kan nævnes uorganiske syrer såsom saltsyre, brombrintesyre, salpetersyre, svovlsyre og fosforsyre samt organiske syrer såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, mælkesyre, citronsyre, oxalsyre og maleinsyre.
25 Udgangsmaterialerne til fremstilling af det omhandlede peptid kan også fremstilles ved de ovennævnte konventionelle processer til peptidsyntese, dvs. ved kondensation af aminosyrer i overensstemmelse med aminosyresekvensen i hvert udgangsmateriale .
30 Den foreliggende fremgangsmåde til EIA af pankretisk glucagon er anvendelig til (1) bestemmelse af pankreatisk glucagon i en prøvevæske såsom plasma, bestående i at man tilsætter en kendt mængde peptid-enzym-konjugat og en kendt mængde af et uopløseligt PG-specifikt antistof til en væske 35 indeholdende en ukendt mængde pankreatisk glucagon, hvorpå man bestemmer enzymaktiviteten' af peptid-enzym-konjugatet i væskefasen eller i det omsatte peptid-enzym-konjugat på den faste fase (FEBS Letters 15, 232, 1971; (2) bestemmelse af
DK 161095 B
8 pankreatisk glucagon i en prøvevæske, bestående i at man sætter en kendt mængde af et peptid-enzym-konjugat og en kendt mængde af et opløseligt PG-specifikt antistof til en prøvevæske som indeholder pankreatisk glucagon for at forårsage 5 en konkurrerende bindingsreaktion, hvorefter man tilsætter en kendt mængde af et andet antistof som er uopløseligt i første antistof (dvs. at når fx det PG-specifikke antistof er blevet fremstillet ved hjælp af en kanin, så et anti-ka-nin immunoglobulin G (IgG) antistof), og på samme måde som 10 under (1) bestemmelse af enzymaktiviteten i væskefasen eller på den faste fase (FEBS Letters, loc.cit), og (3) bestemmelse af pankreatisk glucagon i en prøvevæske, bestående i at man sætter en kendt mængde af et peptid-enzym-konjugat og en kendt mængde af et opløseligt PG-specifikt antistof til 15 en prøvevæske indeholdende pankreatisk glucagon, så at man forårsager at en konkurrerende bindingsreaktion finder sted på samme måde som under (2), hvorpå man tilsætter en kendt mængde af et andet antistof og, når det andet antistof er et anti-dyr (fx anti-kanin) IgG antistof, så et normalt dyre-20 serum, fx kaninserum, til at fremkalde en fældningsreaktion, hvorpå man bestemmer enzymaktiviteten i væskefasen eller på den faste fase som beskrevet under (1) (Clinica Chimica Acta 67, 263, 1976). Med en hvilken som helst af disse processer er det fordelagtigt at udføre en aktivitetsbestemmelse på den 25 faste fase, for når man måler væskefasens enzymaktivitet, kan urenheder i prøvevæsken påvirke resultaterne. Ud fra synspunkter med ; hensyn til reproducerbarhed og følsomhed er det mest ønskeligt at bruge de "dobbelte antistofproces-ser", der muliggør bestemmelse med en ringe mængde PG-speci- 30 fikt antistof, nemlig ovennævnte metoder (2) og p) .
forholder det sig saledes I alle de ovennævnte metoder /ht kun hvis peptid-enzym-konjugatets affinitet til antistoffet kan nedsættes i forhold til det pankreatiske glucagon, kan koblingen af konjugatet til antistoffet ved disse analysesystemer let erstattes med 35 en lille mængde pankreatisk glucagon, med det resultat at selv meget små koncentrationer pankreatisk glucagon kan opdages og bestemmes.
Det enzym der bruges som mærkningsmiddel bør være et 9 DK 161095 B ! som er stabilt og har høj specifik aktivitet. Således kan man bl.a. med fordel bruge peroxydase, β-D-glactosidase, β-D-glucosidase, β-glucuronidase, alkalisk fosfatase, glucoamyla-se, a-amylase, Taka-amylase A, urease eller cholinesterase, 5 men ifølge opfindelsen kan man med særlig fordel bruge β-D-galactosidase eller alkalisk fosfatase.
Ved fremstilling af peptid-enzym-konjugatet ifølge opfindelsen kan man udnytte de substituentgrupper som er til stede i peptidet og enzymet såsom amino-, karboxyl-, hydroxy-10 eller/og sulfhydrylgrupper. Som eksempler på kondensationsmidler kan nævnes (i) vandopløselige karbodiimidreagenser som fx EDCI og CMCT, der er i stand til at forbinde den reaktive aminogruppe i peptidet eller enzymet med den reaktive karboxyl-gruppe i modstykket i et vandigt opløsningsmiddel under eli-15 minering af vand, (ii) N-hydroxysuccinimidester-maleimiderings-reagenser, fx m-MBHS og p-MCHS, der har evne til at maleimide-re den reaktive aminogruppe i peptidet ved en reaktion af sidstnævnte med en aktiveret ester af N-hydroxysuccinimid, hvorefter den maleimidérede aminogruppe får lov til at binde 20 sig til enzymets sulfhydrylgruppe, og (iii) dialdehydreagen-serne, fx ravsyredialdehyd og GLA, der har evne til at bevirke at den reaktive aminogruppe i peptidet eller enzymet forener sig med den reaktive aminogruppe i det andet materiale.
Koblings- eller kondensationsreaktionen mellem peptidet 25 og enzymet kan udføres med et hvilket som helst kondensationsmiddel som egner sig til kondensation af de to materialer, skønt forannævnte karbodiimid-, maleimid- og dialdehydreagen-ser foretrækkes. Kondensationsreaktionen kan udføres i vandigt opløsningsmiddel, der kan vælges blandt de opløsningsmid-30 ler der er kendt for at være egnede til kondensation mellem et peptid og et enzym. Som eksempler på sådanne opløsningsmidler kan nævnes fosfatpuffer i pH-området pH 6 til pH 8 og bo-ratpuffer i området pH 7 til pH 9.
Varigheden af kondensationsreaktionen mellem peptidet 35 og enzymet er normalt et eller andet sted mellem 30 minutter og 20 timer. Af hensyn til enzymets stabilitet er reaktions- : tiden fortrinsvis fra 30 minutter til 3 timer. Ved lav temperatur kan reaktionen imidlertid udføres over en forholdsvis
DK 161095 B
10 langvarig forlænget tid på 2-4 døgn. Normalt kan reaktions-temperaturen ligge fra ca. 4°C til 50°C og fortrinsvis fra omkring 15 til 30°C.
Efter kondensationsreaktionen kan det som produkt 5 fremkomne peptid-enzym-konjugat renses og udvindes ved søjlekromatografi på en passende molekylsigte, fx "Sephadex" ® G100 eller G200, "Sepharose" ® 6B eller 4B (alle fra Pharmacia Fine Chemicals, Sverige) eller lignende molekylsigte-materiale.
10 Som eksempler på et peptid-enzym-konjugat der er egnet i relation til den foreliggende opfindelse, kan følgende kon- jugater nævnes. Til bestemmelse af pankreatisk glucagon med 30K, G21, G7, R517 eller et andet antistof fremstillet ved immunisering af kaniner med pankreatisk glucagon, kan der op- 15 nås et i høj grad følsomt resultat med peptid-enzym-konjuga- tet fremstillet ved kondensation af et enzym med et peptid med formlen H-R^-Pfie-Val-Gln-Trp-Leu-R^-Asn-Tiilr-OH, hvor R^ er et peptidfragment bestående af 1-9 aminosyrerester op til . 2 stilling 21 i pankreatisk glucagon, og R betegner Met eller 20 Nle. Særlig velegnet er konjugatet af et enzym med et peptid med formlen H-AsB-Ser-Arg-Arg-Ala-G?R-Asp-Phe-Val-Gln-T^-Leu-Met-Asn- tR? -OH. Til bestemmelse af pankreatisk glucagon med N6C, N6E eller NI6a antistof opnået ved immunisering af kaniner med et peptid med formlen H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-G?8-25 Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-TfUr-OH eller et peptid med formlen H-3-Ala-Tyr-Leu-As^-Ser-Arg-Arg-Ala-G?R-Asp-Phe-Val-Gln-Trf-Leu-Met-Asn-Tå§-OH kan der opnås et i høj grad følsomt resultat med peptid-enzym-konjugatet fremstillet ved kondensation af et enzym med et peptid med formlen H-R3-pR1-30 Val-Gln-Tr^-Leu-R2-Asn-Tå?-OH, hvor R3 er et peptidfragment bestående af 1-7 aminosyrerester op til stilling 21 i pankrea- 2 tisk glucagon og R er Met eller Nle. Et særlig følsomt resultat kan opnås med konjugatet af et enzym med et peptid med formlen H-Alp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-T§?-OH eller et 35 peptid med formlen H-As^-Ser-Arg-Arg-Ala-G?R-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle-Asn-TÉir-OH.
DK 161095 B
11
Det antistof der skal bruges kan være et hvilket som helst af de antistoffer der er reaktivt over for pankreatisk glucagon og over for peptid-enzym-konjugatet. Således kan man med fordel bruge 5 fx 30K ifølge Unger et al (Diabetes, Vol. 17, 1968, side 321), G21 ifølge Ohneda et al (Diabetes, bind 18, 1969, side 1), G7 ifølge Ohneda et al (Hormone and Metabolic Research, bind 8, 1976, side 170), R517 ifølge Sakurai et al ("Naika Hokan", bind 23, 1975, side 247 eller Japanese 10 Journal of Nuclear Medicine, 10, side 135, 1973) samt det N6C, N6E og N16a PG-specifikke antistof som er anvendt i omstående referenceeksempel 12 og eksempel 13.
Det andet antistof som bruges kan fremstilles ved en multipel injektion af IgG fra en dyreart, 15 fx kanin, som er blevet anvendt til fremstilling af anti-PG-antistoffet i en anden dyreart, fx ged. Immuniseringsprocessen kan være en hvilken som helst af de kendte processer til fremstilling af antistoffer. Således kan der fx vindes et tilfredsstillende antistof ved fire subkutane indgifter 20 på hver ca. 2 mg IgG sammen med Freund's fuldstændige adju-vans med mellemrum på 3 uger. Det kommercielle anti-kanin IgG serum (ged) fra Miles Laboratories, Inc., U.S.A., kan også bruges.
Det uopløselige andet antistof kan vindes ved udsalt-25 ning af det på den ovennævnte måde vundne anti-IgG serum med natriumsulfat eller ammoniumsulfat, udførelse af søjlekromatografi på en ionbytter såsom DEAE-cellulose til dannelse af IgG-fraktionen af anti-IgG-serum og kobling heraf med en fast fase såsom BrCN-aktiveret polysakkarid såsom cellulose eller 30 "Sephadex" ® (FEBS Letters 15, 1971, side 232). Man kan også kontakte ovennævnte IgG-fraktion af antiserum med glasstænger, silikonegummisnore eller polystyrenkugler for fysisk at adsorbere det andet antistof derpå ("Kagaku-to-Seibutsu", Chemistry and Biology 14, 1976, side 741).
35 Det plasma som skal bruges i den her omhandlede EIA- metode kan være et hvilket som helst plasma som er egnet som testplasma. Som eksempler kan nævnes plasmaprøve af menneske eller andre pattedyr, fx rotte, mus eller
DK 161095 B
12 marsvin. Sædvanligvis bruges der imidlertid humant plasma for at undersøge opførslen af pankreatisk glucagon i humant plasma.
Analysemetoden ifølge opfindelsen er af stor praktisk 5 værdi, for den giver i høj grad følsomme og specifikke resultater i sammenligning med den konventionelle EIA af pankreatisk glucagon. Følsomheden er faktisk sammenlignelig med RIA's, og denne kendsgerning betyder at EIA ifølge den foreliggende opfindelse med fordel kan bruges selv i kliniske 10 laboratorier der ikke er udstyret med radioisotop (i det følgende benævnt RI) kontrol i stedet for RIA som indebærer forskellige ulemper der knytter sig til brugen af RI til en praktisk kvantitav bestemmelse af pankreatisk glucagon i blodet. I modsætning til radioisotoper, der har en halveringstid, 15 er peptid-enzym-komplexet ifølge den foreliggende opfindelse så stabilt at det muliggør målinger på et stort antal forsøgsprøver med samme portion, hvorved der opnås resultater med glimrende reproducerbarhed.
Nogle eksempler og referenceeksempler samt tegningen 20 tjener til nærmere belysning af opfindelsen.
På tegningen viser fig. 1 standardkurven for pankreatisk glucagon, fremstillet i henhold til eksempel 15, fig. 2 det ultraviolette absorptionsspektrum for pep-25 tid (I) (15-29)-j3-D-galactosidase-konjugat, fremstillet som beskrevet i eksempel 5, fig. 3 det ultraviolette absorptionsspektrum for peptid I (15-29)-alkalisk fosfat-konjugat, fremstillet som beskrevet i eksempel 9, og 30 fig. 4-6 standardkurver for tarm-glucagon, tarm-glu- cagon I og tarm-glucagon II, fremstillet som beskrevet i eksempel 16.
I fig. 4 er B/Bo procentdelen af bundet enzymaktivitet med og uden tilsat tarm-glucagon, i fig. 5 procentdelen af 35 bundet enzymaktivitet med og uden tilsat tarm-glucagon I og
DK 161095 B
13 i i fig. 6 procentdelen af bundet enzymaktivitet med og uden glucagon II tilsat.
I eksemplerne er tyndtlagskromatografiske data opnået ved anvendelse af silikagelplader 60 ^254 ^ra eller 5 Cellulose Plate Avicel SF fra Funakoshi Yakuhin K.K., Japan og følgende fremkaldelses-opløsningsmiddelsystemers
Rf1 = kloroform/metanol/eddikesyre 9:1:0,5 2
Rf = kloroform/metanol/vand 7:3:0,5 3
Rf = n-butanol/pyridin/eddikesyre/vand 30:20:6:24 10
Eksempel 1 15 2 0 25 H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-
Tffå-OH, i det følgende betegnet "peptid(I)(15-29)"_ jij 1) F£^stillin2_af_Boc-Asn-Thr-OBzl 112 g Boc-Thr-OBzl opløses i 300 ml TFA og opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 20 minutter. Efter tilsætning af 30 ml koncentreret saltsyre koncentreres opløsningen under nedsat tryk. Remanensen opløses i 1 liter THF og under 20 isafkøling neutraliseres opløsningen med 50 ml TEA. Til denne
DK 161095 B
14 opløsning sættes der 76,7 g Boc-Asn-OH, 64,5 g HONB og 74,3 g DCC, efterfulgt af omrøring i 15 timer. Det udfældede DCU fra-filtreres, opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk og remanensen opløses i 1 liter ætylacetat. Opløsningen va-5 skes med 3 x 300 ml 10%s vandig citronsyre, 3 x 300 ml mættet vandigt natriumhydrogenkarbonat og 3 x 300 ml vand i nævnte rækkefølge og tørres derefter over vandfrit natriumsulfat. Opløsningemidlet afdestilleres under nedsat tryk og remanensen behandles med 1 liter diætylæter. De resulterende pulve-10 re opsamles ved filtrering og omkrystalliseres fra acetoni- tril. Udbytte 105,1 g (75,2%), smp. 165-166°C; [a]£1 = -13,9° (c = 0,9 i DMF); Rf1 = 0,51.
Beregnet for C 56,75 H 6,90 N 9,92
Fundet: C 57,01 H 6,89 N 9,94%.
15 2) Fremstillin2_af_Boc-Met(cO-Asn-Thr-OBzl
Til 50,0 g Boc-Asn-Thr-OBzl sættes der 170 ml TFA og blandingen rystes ved stuetemperatur i 30 minutter. Opløsningen koncentreres og behandles med 500 ml diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og tørres. Det op-20 løses i 400 ml THF og under isafkøling tilsættes der 20 ml TEA. Til denne opløsning sættes der Boc-Met(0)-0NB (fremstillet ved opløsning af 31,3 g Boc-Met(O).OH og 23,3 g HONB i 200 ml THF, tilsætning af 26,8 g DCC under isafkøling og omrøring af blandingen i 4 timer). Blandingen omrøres i 15 ti-25 mer hvorefter opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk. Til remanensen sættes der 200 ml ætylacetat og 200 ml æter og de resulterende pulvere opsamles ved filtrering og genudfældes fra acetonitril. Udbytte 48,5 g (72,0%), smp. 145-147°C, [<x]£1 = -6,5° (c = 1,1 i DMF), Rf1 = 0,19.
30 Beregnet for C25H3g09N4S: C 52,62 H 6,71 N 9,82 S 5,62
Fundet: C 52,44 H6,73 N 9,60 S 5,15%.
Til 15,0 g Boc-Met(0)-Asn-Thr-0Bzl sættes der 45 ml TFA og blandingen rystes ved stuetemperatur i 45 minutter.
35 Derefter koncentreres blandingen og udfældes med 100 ml æter.
Fremstilling^af_Boc-Leu2Met_(0)_-Asn-Thr-OBzl i
DK 161095 B
15
Det resulterende pulver opsamles ved filtering, tørres og opløses i 50 ml DMF. Opløsningen afkøles med is og efter tilsætning <af 5,7 ml TEA tilsættes der Boc-Leu-ONB (fremstillet ud fra 6,69 g Boc-Leu-OH, 5,70 g HONB og 6,56 g DCC). Deref-5 ter omrøres blandingen i 15 timer og ved afslutningen af denne periode afdestilleres opløsningsmidlet under nedsat tryk. Til remanensen sættes der 200 ml ætylacetat og det resulterende pulver opsamles ved filtering og genudfældes fra acetonitril/ætylacetat. Udbytte 15,0 g (83,4%), smp. 134-10 136°C, [a]^4 =-15,1° (c = 1,0 i DMF), Rf1 = 0,25.
Beregnet for c3iH49°ioN5S: c 54/45 H 7,22 N 10,24 S 4,69
Fundet: C 54,62 H 7,60 N 9,89 S 3,95%.
4) FremstillingafZ-Gln-Trp-OBzl 50,0 g H-Trp-OBzl, p-toluensulfonat opløses i 500 ml 15 THF og under isafkøling tilsættes der 15,4 ml TEA, 28,0 g Z-Gln-OH, 19,7 g HONB og 22,7 g DCC. Blandingen omrøres i 15 timer. Det udfældede DCU frafiltreres, filtratet koncentreres og remanensen opløses i 300 ml ætylacetat. Opløsningen vaskes med 2 x 150 ml mættet vandig natriumhydrogenkarbonat, 20 2 x 150 ml 10%s vandig citronsyre og 2 x 150 ml vand i nævnte rækkefølge. Opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk, remanensen opløses i 300 ml THF og uopløselige stoffer frafiltreres. Filtratet koncentreres og der fældes med 500 ml diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering 25 og omkrystalliseres fra acetonitril. Udbytte 46,1 g (82,8%), [cx]33 = +5,8° (c = 1,0 i DMF), Rf1 = 0,60.
Beregnet for C 66,89 H 5,80 N 10,07
Fundet: C 66,79 H 5,71 N 10,20%.
5) Fremstillin2_af_Z-Val-Gln-Trg-0H
i 30 50,0 g Z-Gln-Trp-OBzl opløses i 700 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i 5 timer med palladium-sort som katalysator. Det krystallinske bundfald opsamles ved filtrering og suspenderes i 300 ml DMF. Suspensionen opløses ved tilsætning af 13 ml TEA og katalysatoren frafiltreres. Til 35 filtratet sættes der 37,0 g Z-Val-ONB, og efter 10 timers om-
DK 161095B
16 røring neutraliseres blandingen med 100 ml IN saltsyre efterfulgt af tilsætning af 500 ml vand. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og vaskes godt med metanol. Udbytte 43,0 g (84,7%), smp. 246-247°C, [a]33 = +12,4° (c = 0,9 i 5 DMF), Rf1 = 0,14.
Beregnet for ^29^35^7^51 ^/58 H 6,24 N 12,38
Fundet: C 61,86 H 6,30 N 12,36%.
6) Fr^stillin2_af_Z-Phe-Val-Gln-Trp-0H
5,1 g Z-Val-Gln-Trp-OH opløses i 100 ml eddikesyre og 10 der udføres katalytisk reduktion i 3 timer. Katalysatoren fra-filtreres og filtratet koncentreres og suspenderes i 200 ml DMF. Til denne suspension sættes der 2 ml TEA, og desuden tilsættes Z-Phe-ONB som er fremstillet ud fra 2,70 g Z-Phe-OH. Blandingen omrøres i 7 timer. Opløsningsmidlet afdestil-15 leres derefter under nedsat tryk, der sættes vandig eddikesyre til remanensen og den resulterende gel opsamles ved filtrering og genudfældes fra metanol. Udbytte 5,50 g (84,5%), smp. 240°C, [a]34 = +4,1° (c = 1,0 i DMF), Rf1 = 0,15.
Beregnet for C38H440QN6,1/2H20: C 63,23 H 6,28 N 11,64 20 Fundet: C 63,11 H 6,29 N 11,80%.
7) Fremstillin2_af_Boc2Asp-(OBzl)_-Phe-Val-Gln-Trp-OH
I en blanding af 150 ml DMF og 50 ml eddikesyre opløses der 8,5 g Z-Phe-Val-Gln-Trp-OH og der udføres katalytisk reduktion i 5 timer. Katalysatoren frafiltreres, filtratet kon-25 centreres og remanensen udfældes med 100 ml metanol. De derved vundne krystaller suspenderes i 200 ml DMF hvorpå der tilsættes 3,0 ml TEA og Boc-Asp(OBzl)-ONB fremstillet ud fra 3,9 g Boc-Asp(OBzl)-OH, 2,4 g HONB og 2,7 g DCC. Blandingen omrøres i 10 timer og ved slutningen af denne periode afde-30 stilleres opløsningemidlet under nedsat tryk. Til remanensen sættes der vandig eddikesyre og den resulterende gel opsamles ved filtrering og genudfældes fra DMF-vand. Udbytte 6,3 g (58,1%), smp. 191-192°C (sønderdeling), [a]^4 = -6,2° (c = 1,1 i DMF), Rf1 = 0,11.
i
DK 161095 B
17
Beregnet for ,3/2^0: C 60,64 H 6,63 N 10,76
Fundet: C 60,30 H 6,48 N 11,34%.
8) Fremstillin2_af_Bgc-Gln2As£^OBzl)_-Phe-Val-Gln-Tr2-OH
Til 6,0 g Boc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH sættes der 5 50 ml TFA i en strøm af nitrogengas og efter rystning i 10 minutter koncentreres blandingen og behandles med diætylæter.
Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 100 ml DMF, efterfulgt af tilsætning af 20 ml TEA og Boc-Gln-ONB fremstillet ud fra 1,76 g Boc-Gln-OH, 1,34 g HONB 10 og 1,54 g DCC. Blandingen omrøres i 15 timer og efter slutningen af denne periode tilsættes der vandig eddikesyre.
Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og genudfældes fra acetonitril-vand. Udbytte 5,50 g (82,6%), smp. 210-212°C (sønderdeling), [a]^4 = -10,1° (c = 1,1 i DMF), Rf1 = 15 0,09.
Beregnet for 05χΗ65°ΐ3Ν9: C 60,52 H 6,47 N 12,46 Fundet: C 60,19 H 6,37 N 12,23%.
9) Fremstillin2_af_Z-Ar2jMBS).3Ala-OBu^ t 31,0 g Z-Ala-OBu opløses i 300 ml metanol og der ud- 20 føres katalytisk reduktion i 5 timer. Katalysatoren frafil- treres og filtratet koncentreres. Særskilt suspenderes 53,0 g Z-Arg(MBS)-OH,DOHA i 500 ml ætylacetat og rystes med 200 ml 10%s citronsyre. Opløsningen vaskes med vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og opløses i 500 ml THF. Til denne op- t 25 løsning sættes der H-Ala-OBu , hvis fremstilling er beskrevet ovenfor, efterfulgt af tilsætning af 14,9 g HONB. Under isafkøling tilsættes der 17,1 g DCC og blandingen omrøres i 10 timer. Det udfældede DCU frafiltreres og filtratet koncentreres og opløses i 500 ml ætylacetat. Opløsningen vaskes 30 med 3 x 200 ml 10%s vandig citronsyre, 3 x 200 ml mættet vandigt natriumhydrogenkarbonat og 3 x 200 ml vand og tørres over vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk, der sættes 300 ml diætylæter til remanensen og det resulterende pulver udvindes ved filtrering. Ud-35 bytte 44,5 g (66,8%), smp. 126-1-27°C, [a]£5 = -6,0° (c = 1,0
DK 161095 B
18 1 DMF), Rf1 = 0,62.
Beregnet for C^gHggOgNgS: C 55,52 H 6,49 N 11,56 S 5,27 Fundet: C 55,71 H 6,49 N 11,81 S 5,29%.
10) Fremstillin2_Z-Ar2^MBS)_-Ar2_(MBS)_-Ala-OBu^ 5 43 g Z-Arg(MBS)-Ala-OBu^ opløses ± 5Q0 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i 5 timer. Reaktionsblandingen koncentreres og remanensen opløses i 200 ml DMF. Til denne opløsning sættes der Z-Arg(MBS)-OH (fremstillet ud fra 49,7 g Z —Arg(MBS)—OH,DCHA) og 14,0 g HONB. Derpå tilsættes 10 der under isafkøling 16,1 g DCC og blandingen omrøres i 15 timer. Det udfældede DCU frafiltreres, filtratet koncentreres og remanensen opløses i 500 ml kloroform. Opløsningen vaskes med 3 x 300 ml 10%s vandig citronsyre, 3 x 300 ml mættet vandigt natriumhydrogenkarbonat og 3 x 300 ml vand i nævnte 15 rækkefølge og tørres over magniumsulfat. Opløsningsmidlet af-destilleres under nedsat tryk og der tilsættes 300 ml metanol. De resulterende krystaller Udvindes ved filtrering og omkrystalliseres fra metanol. Udbytte 52,4 g (79,2%), smp. 116-118°C, [a]p5 =-8,8° (c = 1,0 i DMF), Rf1 = 0,42.
20 Beregnet for C^H^O^NgS^I^O: C 50,86 H 6,35 N 13,02 S 6,62
Fundet: C 51,05 H 6,08 N 13,11 S 6,62%.
11) Fremstilling^af_Boc-Ser-Ar2XMBS^-Arg (.MBS^-Ala-OBu^ 30,0 g Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OBu^ opløses i en blanding af 80 ml DMF og 300 ml metanol og der udføres katalytisk 25 reduktion i 7 timer. Katalysatoren frafiltreres, metanolen af-destilleres under nedsat tryk og der tilsættes 7,3 g Boc-Ser-OH og 6,3 g HONB. Under isafkøling tilsættes der 7,3 g DCC og blandingen omrøres i 10 timer. Det udfældede DCU frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk og 30 remanensen opløses i 500 ml kloroform. Opløsningen vaskes med 2 x 300 ml mættet natriumhydrogenkarbonat og 2 x 300 ml vand efterfulgt af tørring over magniumsulfat. Opløsningsmidlet af-destilleres under nedsat tryk og remanensen opløses i 30 ml kloroform og overføres til en kolonne af 400 g silikagel.
35 Kromatogrammet fremkaldes med et opløsningsmiddelsystem af DK 161095 B i 19 [ kloroform/metanol/eddikesyre 9:0,7:0,35, og fraktionerne mellem 800 ml og 2 liter slås sammen, koncentreres og udfældes med diætylæter til frembringelse af et pulver. Udbytte 25,5 g (79,0%), smp. 85-88°C, [a]^6 = -20,9° (c = 1,0 i me-5 tanol), Rf1 = 0,33.
Beregnet for C4iH64O14N10S2/H2O: c 49*09 H 6»63 N 13»96 s 6,39 Fundet: C 48,96 H 6,55 N 13,70 S 5,84%.
12) Fremstillin2_.af_Boc3AspX0B2l)^-Ser-Arg_(MBS)_-Ar2-(MBS)_-Ala-0H
Til 10,5 g Boc-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OBu*" sættes 10 der 50 ml TFA og blandingen rystes ved stuetemperatur i 60 minutter og koncentreres derefter. Koncentratet behandles med 300 ml æter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 50 ml DMF. Til denne opløsning sættes der 4,1 ml TEA og Boc-Asp(OBzl)-ONB (fremstillet ud fra 15 3,40 g Boc-Asp(OBzl),OH, 1,97 g HONB og 2,27 g DCC), og blan dingen omrøres i 15 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk, der sættes vandig eddikesyre til remanensen og det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og genudfældes fra acetonitril/æter. Udbytte 6,0 g (51,5%), 20 smp. 126-130°C, [a]£4 = +3,5° (c = 1,0 i DMF), Rf1 = 0,17.
Beregnet for C 49,26 H 6,12 N 13,17 S 5,48
Fundet: C 49,62 H 5,84 N 13,00 S 5,03%.
13) Fremstilling af Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- £?§l:i9!l£sn-Thr-OBzl_______________ 25 Til 3,25 g Boc-Leu-Met(0)-Asn-Thr-OBzl sættes der 25 ml TFA og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 minutter hvorefter den koncentreres. Til remanensen sættes der 100 ml diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og tørres. Pulveret opløses i 10 ml NMP, opløsningen rystes i 30 godt med 2 ml TEA og der tilsættes 100 ml diætylæter. Det resulterende pulver udvindes igen ved filtrering og opløses i 100 ml DMF. I denne opløsning opløses der desuden 4,80 g Boc-Gln-Asp-(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH og 2,70 g HONB. Under isafkøling tilsættes der 1,55 g DCC og blandingen omrøres i 35 58 timer. Fra den resulterende gel afdestilleres opløsningsmid-
DK 161095 B
20 let under nedsat tryk og remanensen vaskes grundigt med vandigt acetonitril. Udbytte 5,75 g (76,8%), smp. 234°c (sønderdeling), [a]26 = -15,8° (c = 0,4 i eddikesyre), Rf2 = 0,63. Beregnet for C 58,61 H 6,64 N 12,43 S 2,03 5 Fundet: C 59,13 H 6,96 N 12,40 S 1,70%.
14) Fremstilling af Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-
Til 5,20 g Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OBzl sættes der 1 ml anisol og under en nitro-10 gengasstrøm tilsættes der 35 ml TFA. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 15 minutter hvorefter den koncentreres. Til remanensen sættes der 100 ml diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 20 ml NMP. Til denne opløsning sættes der 2,77 ml TEA og efter grundig ryst-15 ning tilsættes der 200 ml diætylæter. Det resulterende pulver udvindes ved filtrering og opløses i 150 ml DMF. Til denne opløsning sættes der 3,66 g Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OH og 2,36 g HONB, og under afkøling med is-NaCl til -10°C tilsættes der 1,02 g DCC. Reaktionsblandingen om-20 røres ved 0°C i 10 timer og ved stuetemperatur i 24 timer.
Det udfældede DCU frafiltreres og opløsningsmidlet afdestille-res under nedsat tryk. Til remanensen sættes der 50 ml vand og det resulterende pulver udvindes ved filtrering og vaskes godt med vandigt acetonitril. Udbytte 5,3 g (61,1%), smp.
25 237°C (sønderdeling), [a]26 = -7,1° (c = 0,9 i eddikesyre),
Rf2 = 0,63.
Beregnet for C120H161°34N25S3'2H2O: C 54,82 H 6,32 N 13,32 S 3,57 Fundet: C 54,47 H 6,16 N 13,07 S 3,47%.
30 15) Fremstilling af H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val- EEIL2HI^et^o )^Asn-Thr-OH________________________
Til 400 mg Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-Gln-Asp (OBzl)_-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(0) -Asn-Thr-OBzl sættes der 0,25 ral anisol efterfulgt af 5 ml metansulfonsyre. Blan-35 dingen omrøres ved stuetemperatur i 60 minutter, og ved af-
DK 161095 B
21 | slutningen af denne periode tilsættes der 100 ml diætylæter hvorpå der dannes et olieagtigt bundfald. Diætylæteren kasseres ved dekantering og remanensen opløses i 10 ml vand. Opløsningen føres gennem en kolonne på 1 x 10 cm af "Amberlite^ 5 IRA-410 (acetatform), eluatet (50 ml) afkøles med is, der til sættes 10 ml 8N ammoniakvand og blandingen omrøres ved 0°C i 30 minutter hvorefter den frysetørres.
Lyofilisatet opløses i 30 ml vand og overføres til en kolonne på 2,2 x 18 cm af CMC, hvorefter der udføres eluering 10 ved den lineære gradientmetode med 500 ml vand til 500 ml 0,2M vandigt ammoniumacetat. Fraktionerne fra 150 ml til 195 ml forenes og frysetørres. Udbytte 150 mg. Lyofilisatet opløses i 20 ml vand og overføres til en kolonne på 1,6 x 5 cm af "Amberlite" ® XAD-2, og elueringen udføres ved den lineære 15 gradientmetode med 200 ml vand til 200 ml 80%s ætanol. Fraktionerne fra 180 ml til 225 ml forenes, ætanolen afdestille- 24 o res og remanensen frysetørres. Udbytte 115 mg, [α]β = -33,6 (c = 0,6 i 50%s vandig eddikesyre), Rf3 = 0,54 ("Avicel"); aminosyreanalyse (hydrolyseres med 5,7N HC1 i nærværelse af 20 4% tioglykolsyre)i Arg 2,03 (2), Trp 0,87 (1), Asp 3,03 (3),
Thr 0,97 (1), Ser 0,73 (1), Glu 2,13 (2), Ala 1,00 (1), Val 1,03 (1), Met 1,00 (1), Leu 1,03 (1), Phe 1,03 (1); peptidindhold 85,7%.
16) Fremstilling af H-As^-Ser-Arg-Arg-Ala-G?S-Asp-Phe-Val-25 _____ 225 mg H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(O)-Asn-Thr-OH opløses i 20 ml 5%s vandig tioglykolsyre og opløsningen henstår ved 50°C i 20 timer, hvorefter der udskiller sig en gel. Vandet afdestilleres under nedsat 30 tryk, remanensen opløses i 5 ml 50%s vandig eddikesyre og opløsningen føres gennem en kolonne på 2,3 x 118 cm af "Sephadex" ® G-25, og der udføres eluering med 50%s vandig eddikesyre. Fraktionerne fra 180 ml til 240 ml slås sammen og frysetørres. Udbytte 220 mg, [a]jr^ = -30,0° (c = 0,3 i 50%s
3 U
35 eddikesyre), Rf =0,59 (Avicel), aminosyreanalyse efter hydrolyse med 5,7N HCl i nærværelse af 4% tioglykolsyre: Arg 2,15 (2), Trp 0,91 (1), Asp 3,13 (3), Thr 0,99 (1), Ser 0,87 (1), Glu 2,20 (2), Ala 1,05 (1), Val 0,96 (1), Met 1,00 (1), Leu 1,07 (1), Phe 1,07 (1); peptidindhold 79,3%.
DK 161095 B
22
Eksempel 2 5 H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-G?S-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle-Asn-t|| -OH (i det følgende betegnet "peptid (XX) (15-29)11) 1) Fremstilling_af^Boc-Nle^Asn-Thr-OBz1 3,10 9 Boc-Asn-Thr-OBzl opløses i 30 ml TFA og opløsningen rystes ved stuetemperatur i 10 minutter hvorefter 10 den koncentreres. Koncentratet bringes til fældning med 100 ml diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og tørres. Derefter opløses deti 30 ml DMF og under isafkøling tilsættes der 1,5 ml TEA og derefter Boc-Nle-ONB, fremstillet ud fra 1,69 g Boc-Nle-OH, 1,50 g HONB og 1,73 g DCC.
15 Blandingen omrøres i 15 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk, remanensen behandles med 50 ml vand og det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og vaskes godt med diætylæter. Udbytte 3,80 g (96,7%), smp. 160-163°C, [a]^1'5 = -13,6° (c = 0,8 i DMF), Rf1 = 0,58.
20 Beregnet for C26H40°8^4: C 58,19 H 7,51 N 10,44
Fundet: C 58,40 H 7,60 N 10,37%.
2) Fremstillin2_af_Boc-Leu-Nle-Asn-Thr-OBzl 3,50 g Boc-Nle-Asn-Thr-OBzl opløses i 30 ml TFA og opløsningen rystes ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter 25 koncentreres den og bringes til fældning med 150 ml diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og opløses i 30 ml DMF. Under isafkøling tilsættes der 1,2 ml TEA og derefter Boc-Leu-ONB, fremstillet ud fra 1,66 g Boc-Leu-OH, 1,41 g HONB og 1,63 g DCC. Blandingen omrøres i 15 30 timer hvorefter opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk. Remanensen behandles med 50 ml vand og det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og vaskes grundigt med
_ O T K
ætylacetat. Udbytte 3,60 g (83,8%), smp. 200-201 C, [a]D ' = -22,7° (c = 0,8 i DMF), Rf1 = 0,60.
DK 161095 B
23
Beregnet for C^Hg^OgNg,1/2^0: C 58,34 H 7/96 N 10,63 Fundet: C 58,06 H 7,99 N 11,02 3) Fremstilling af Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle-
Asn-Thr-OBzl^____________________________________________ 5 2,00 g Boc-Leu-Nle-Asn-Thr-OBzl opløses i 20 ml TFA og opløsningen rystes ved stuetemperatur i 10 minutter, hvorefter den koncentreres og behandles med 70 ml æter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og opløses i 10 ml DMF. Derpå tilsættes der under isafkøling 1,3 ml TEA 10 og blandingen rystes godt og behandles med 100 ml diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 40 ml DMF. Til denne opløsning sættes 3,00 g Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH og 2,20 g HONB, efterfulgt af tilsætning af 1,27 g DCC under isafkøling. Blandingen omrøres i 48 ti-15 mer. Opløsningsmidlet sidestilleres derefter under nedsat tryk, remanensen behandles med 50 ml vand og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og vaskes godt med vandigt acetonitril. Udbytte 3,30 g, smp. 210-214°C (sønderdeling), [a]^1'1 2 - -11,8° (c = 0,6 i NMP), Rf3 = 0,66.
20 Beregnet for C78Hio6°19N14: C 60/68 H 6/92 N 12,73 Fundet: C 60,92 H 7,30 N 12,76
Fremstilling af H-As^-Ser-Arg-Arg-Ala-G?8-Asp-Phe-Val-Gln- _____________
Til 3,0 g Boc-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Nle-25 Asn-Thr-OBzl sættes der 0,2 ml ætanditiol og 25 ml TFA, og 2 efter rystning ved stuetemperatur i 10 minutter koncentreres blandingen og behandles med diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og opløses i 15 ml NMP. Opløsningen afkøles med is, rystes med 0,8 ml TEA og behand-30 les med diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 50 ml DMF, efterfulgt af tilsætning af 2,1 g Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-OH og 0,71 g HONB. Efter afkøling med is-NaCl tilsættes der 0,60 g DCC og blandingen omrøres i 24 timer. Det udfældede DCU frafiltreres, 35 filtratet koncentreres, remanensen behandles med ætylacetat
DK 161095 B
24 og det resulterende pulver opsamles ved filtrering. Udbytte 3,8 g. Til 1,0 g af det resulterende beskyttede peptid sættes 1 ml anisol og efter tilsætning af 10 ml vandfrit hydrogenfluorid omrøres blandingen ved 0°C i 60 minutter, hvoref-5 ter den koncentreres under nedsat tryk. Koncentratet opløses i 50 ml vand, vaskes med diætylæter og føres gennem en kolonne på 1 x 10 cm af "Amberiite"® IRA-410 (acetatform). Elua-tet frysetørres. Lyofilisatet opløses i 10 ml 50%s eddike- (K) syre og overføres på en kolonne på 2,2 x 110 cm af "Sephadex" w 10 LH-20, idet der udføres eluering med 50%s eddikesyre. Frak tionerne fra 125 ml til 180 ml slås sammen og frysetørres. Lyofilisatet opløses herefter i 50 ml vand og overføres til en kolonne på 2,2 x 20 cm af CMC, og eluering udføres ved den lineære gradientmetode med 500 ml 0,005M vandigt ammonium-15 acetat til 500 ml 0,2M vandigt ammoniumacetat. Fraktionerne fra 265 ml til 440 ml forenes og frysetørres. Udbytte 145 mg, [a]^ = -30,9° (c = 0,3 i 50%s eddikesyre), Rf3 = 0,60 (Avicel), aminosyreanalyse (efter hydrolyse med 5,7N HC1 i nærværelse af 4% tioglykolsyre): Arg 2,11 (2), Trp 0,97 (1), 20 Asp 3,40 (3), Thr 0,93 (1), Ser 0,83 (1), Glu 2,10 (2), Ala 1,00 (1), Val 1,04 (1), Leu 0,91 (1), Phe 0,84 (1), Nle 1,06 (1); peptidindhold 74%.
Eksempel 3 H-Asp-Phe-Val-Gln-Trf-Leu-Met-Asn-T^§-OH (i det følgende be- 25 nævnt "peptid (III) (21-29)")......
1,0 g Boc-Leu-Met(0)-Asn-Thr-0Bzl opløses i 10 ml TFA og opløsningen rystes ved stuetemperatur i 10 minutter hvorefter den koncentreres og behandles med 50 ml diætylæter.
Det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og op-30 løses i 10 ml DMF. Under isafkøling rystes opløsningen godt med 1,1 ml TEA og derefter behandles den med 100 ml diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 20 ml DMF. Til opløsningen sættes der 1,33 g Boc-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-OH og 520 mg HONB, og efter afkø-35 ling med is tilsættes der 450 mg DCC og blandingen omrøres i 48 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk,
DK 161095 B
25 der sættes 50 ml vand til remanensen og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og vaskes med vandigt acetonitril. Udbytte 1,72 g. Til 1,0 g af dette beskyttede peptid sættes der 0,5 ml anisol efterfulgt af 10 ml metansulfonsyre. Blan-5 dingen omrøres ved stuetemperatur i 10 minutter hvorefter der tilsættes 100 ml diætylæter hvorved der udfælder sig et olieagtigt bundfald. Ætylæteren afdekanteres, remanensen opløses i 20 ml 30%s eddikesyre og opløsningen overføres til en kolonne på 1 x 10 cm af "Amberlite" ®IRA-410 (acetatfor-10 men) og effluenten frysetørres. Lyofilisatet opløses i 5 ml 50%s eddikesyre og overføres til en kolonne på 2,4 x 110 cm af "Sephadex" ®LH-20, hvorpå eluering udføres med 50%s eddikesyre. Fraktionerne fra 195 ml til 235 ml forenes og frysetørres. Udbytte 550 mg. 150 mg af dette peptid udtages og 15 opløses i 5 ml 50%s eddikesyre, og med tilsætning af 0,3 ml tioglykolsyre udføres der reduktion ved 45°C i 16 timer. Reaktionsblandingen føres gennem en kolonne på 3 x 135 cm af "Sephadex" ®LH-20, og der udføres eluering med 30%s eddikesyre. Fraktionerne fra 510 ml til 580 ml forenes og lyofili- 20 seres. Udbytte 64 mg, [a]^ = ”26,0° (c = 0,2 i 80%s eddike-3 u syre), Rf =0,76 (Avicel); aminosyreanalyse efter hydrolyse med 5,7N HCl i nærværelse af 4% tioglykolsyre: Trp 1,07 (1),
Asp 2,06 (2), Thr 0,98 (1), Glu 1,06 (1), Val 0,97 (1), Met 1,00 (1)., Leu 1,04 (1), Phe 1,11 (1); peptidindhold 73%.
25 Eksempel 4 H-3-Ala-Ty^-Leu-As^-Ser-Arg-Arg-Ala-G?8-Asp-Phe-Val-Gln-T^-Leu-Met-Asn- Tå? -OH (i det følgende betegnet "peptid (IV) (13-29) ")_ 1) Fr§mstillin2_af_Z-g-Ala-Tyr-Leu-OMe 30 10,2 g Boc-Tyr-Leu-OMe opløses i 100 ml TFA og opløs ningen rystes ved stuetemperatur i 15 minutter. Opløsningen koncentreres og behandles med 100 ml diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering, tørres og opløses i 150 ml THF. Opløsningen isafkøles, der tilsættes 4,0 ml TEA 35 og desuden 8,5 g Ζ-β-Ala-ONB. Blandingen omrøres i 15 timer, og efter afslutningen af denne periode afdestilleres opløs-
DK 161095 B
26 ningsmidlet under nedsat tryk. Remanensen opløses i 300 ml ætylacetat, vaskes med 3 x 200 ml mættet vandigt natriumhy-drogenkarbonat, 2 x 200 ml 10%s vandig citronsyre og 3 x 200 ml vand i den nævnte rækkefølge og tørres over vandfrit natrium-5 sulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen behandles med petroleumsæter og pulveret opsamles ved filtrering og genudfældes fra ætylacetat/petroleumsæter. Udbytte 10,7 g (83,3%), smp. 112-113°C, [a]^1'1 2 3 = -12,8° (c = 0,8 i DMF). Beregnet for C27H3507N3: C 63,14 H 6,87 N 8,18 10 Fundet: C 62,97 H 6,91 N 8,09%.
2) Fremstilling_af_Z-g-Ala-Tyr2Leu-0H
5,0 g Ζ-β-Ala-Tyr-Leu-OMe opløses i 40 ml metanol og efter isafkøling tilsættes der 12 ml 2N vandigt natriumhydro-xyd. Blandingen omrøres derefter ved stuetemperatur i 90 mi-15 nutter. Opløsningen afkøles med is og neutraliseres med 24 ml IN HCl. Opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk. Remanensen opløses i 200 ml ætylacetat, skylles med 2 x 200 ml yand og tørres over vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres og de resulterende krystaller vaskes med diætyl-20 æter og udvindes ved filtrering. Udbytte 4,4 g (90,5%), smp. 144-145°C, [α]^1/5 = -5,7° (c = 0,9 i DMF).
Beregnet for C2gH3307N3: C 62,50 H 6,66 N 8,41 Fundet: C 62,27 H 6,58 N 8,82%.
Fremstilling af H-3-Ala-Ty^-Leu-As^-Ser-Arg-Arg-Ala-G?R- 2 25 Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Tå^-OH^(peptid jlVj X13-29I) 3
Til 4,6 g Boc-Asp(OBzl)-Ser-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Ala-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met(0)-Asn-Thr-OBzl sættes der 0,5 ml anisol og derpå tilsættes 35 ml TFA under nitrogengasstrøm og efter rystning ved stuetemperatur i 15 minutter kon-30 centreres blandingen og behandles med diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 20 ml NMP. Opløsningen afkøles med is og rystes godt med 0,8 ml TEA hvorefter der tilsættes diætylæter. Det resulterende pulver opsamles ved filtrering og opløses i 50 ml DMF. Til denne op-35 løsning sættes der 0,90 g Ζ-β-Ala-Tyr-Leu-OH og 0,64 g HONB.
DK 161095 B
27
Under afkøling med is og natriumklorid tilsættes der 0,55 g DCC og blandingen omrøres i 15 timer. Det udfældede DCU fra-filtreres, opløsningsmidlet afdestilleres under nedsat tryk og der sættes 70 ml ætylacetat til remanensen. Det resulte-5 rende pulver opsamles ved filtrering. Udbytte 4,3 g. Til 1 g af det på denne måde vundne beskyttede peptid sættes der 1.5 g anisol efterfulgt af tilsætning af 10 ml vandfrit hydrogenfluorid. Blandingen omrøres ved 0°C i 60 minutter, koncentreres og opløses i 50 ml vand. Opløsningen vaskes med 1 g 50 ml diætylæter. Den føres gennem en kolonne på 1 x 10 cm af "Amberlite" ®IRA-410 (acetatformen) og frysetørres. Lyo-filisatet opløses i 100 ml vand og overføres til en kolonne på 2,2 x 23 cm af CMC, og der foretages eluering ved den lineære gradientmetode med 0,005M vandigt ammoniumacetat 15 (500ml)/0,2M vandigt ammoniumacetat (500 ml). Fraktionerne fra 220 ml til 360 ml slås sammen og frysetørres. Lyofilisa-tet opløses i 5 ml 50%s eddikesyre og føres gennem en kolonne på 2,4 x 118 cm af "Sephadex" ®LH-20, og elueringen foretages med 50%s eddikesyre. Fraktionerne fra 130 ml til 2Q 166 ml forenes og frysetørres. Udbytte 80 mg.
En portion på 70 mg af dette peptid opløses i 7 ml 50%s eddikesyre og efter tilsætning af 0,35 ml tioglykolsyre henstår opløsningen ved 45°C i 12 timer. Efter tilsætning af yderligere 0,35 ml tioglykolsyre henstår opløsningen ved 45°C
i 24 timer hvorefter reaktionen er fuldført. Reaktionsbian-25 (r) dingen føres gennem en kolonne på 2,4 x 120 cm af "Sephadex" ^ G-25, og der foretages eluering med 50%s eddikesyre. Fraktionerne fra 160 ml til 220 ml forenes og frysetørres. Udbytte 66 mg, [a]^1'5 = -29,3° (c = 0,4 i 50%s eddikesyre), Rf3 = 3Q 0,61 (Avicel); aminosyreanalyse (hydrolyseret med 5,7 N HC1 i nærværelse af 4% tioglykolsyre): Arg 2,19 (2), Trp 0,92 (1), Asp 3,44 (3), Thr 0,91 (1), Ser 0,69 (1), Glu 2,32 (2),
Ala 1,12 (1), Val 1,14 (1), Met 1,00 (1), Leu 2,02 (2), Tyr 1.05 (1), Phe 1,05 (1), 3Ala 1,13 (1); peptidindhold 81%.
35
DK 161095 B
28
Referenceeksempel 1
Produktion af peptid (I). (15-29)“BSA-konjugat (1) I 4 ml 0,2M fosfatpuffer (pH 7,3) opløses der 10 mg peptid (I) (15-291 fremstillet i overensstemmelse med eksem-5 pel 1 samt 20 mg BSA. Til denne opløsning sættes der 4 ml af en 5%s opløsning af GLA og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 3 timer hvorefter den dialyseres (4x2 liter vand) ved 4°C og frysetørres til dannelse af det i overskriften angivne konjugat. Udbytte 38 mg.
10 Referenceeksempel 2
Fremstilling af peptid (T) (15-29)-BSA-konjugat (2)
Til 10 ml af en 0,2%s vandig opløsning af BSA sættes der 2 mg fast ravsyreanhydrid i små portioner og reaktionen udføres mens pH holdes på 7,0-8,0 ved hjælp af 0,1N NaOH, 15 hvorved BSA succinyleres. Efter fuldførelse af reaktionen dialyseres reaktionsblandingen (4x2 liter vand) ved 4°C og frysetørres. Til dette succinylerede BSA sættes der 10 mg peptid (I) (15-29) ifølge eksempel 1, og blandingen opløses i 10 ml 0,05M fosfatpuffer (pH 6,5). Derefter tilsættes grad-20 vis 10 mg ECDI og reaktionen udføres ved 4°C i 2 døgn under forsigtig omrøring. Efter at reaktionen er fuldført dialyseres reaktionsblandingen (4x2 liter vand) og frysetørres til dannelse af det i overskriften angivne konjugat. Udbytte 39 mg.
2 5 Referenceeksempel 3
Fremstilling af peptid (IV) (13-29)-BSA-konjugat
Fremgangsmåden ifølge referenceeksempel 1 gentages med den forskel at der bruges 10 mg peptid (IV) (13-29) i stedet for 10 mg peptid (I) (15-29) til frembringelse af det ovenfor 30 angivne BSA-konjugat. Udbytte 39 mg.
Referenceeksempel 4 Fremstilling af antistoffet
DK 161095 B
29 1 1 ml fysiologisk kogsaltopløsning opløses der 2 mg af konjugatet af BSA med det ønskede peptid fremstillet som angivet i referenceeksempel 1, 2 eller 3, og opløsningen blandes godt med 1 ml af Freund's fuldstændige adjuvans. Den re- 5 suiterende emulsion injiceres intramuskulært i begge lår og subkutant på mange steder langs rygsiden af en kanin. Denne behandling gentages 5 gange med mellemrum på 2 uger, og der udtages en blodprøve 1 uge efter den sluttelig immunisering til en prøvebestemmelse. På denne måde dannes der er gluca- 10 gon-antistof som ikke reagerer med pankreatisk glucagon og som en som bruges/fortynding pa 100.000-500.000 gange.
Eksempel 5
Peptid (I) (15-29)-β-D-galactosidase-konjugat 2 mg af peptid (I) (15-29) fremstillet ifølge eksempel 15 1 suspenderes i 2 ml Q,1M fosfatpuffer (pH 6,3) og derefter tilsættes 0,5 ml af en 0,5%s opløsning af m-MBHS i THF. Reaktionen gennemføres ved 30°C i 1/2 time. Reaktionsblandingen føres gennem en kolonne på 0,9 x 53 cm af "Sephadex" ®G-25 ækvilibreret med 0,1M fosfatpuffer for at skille den melaimi-20 derede peptidfraktion fra overskydende reagens. Til 1 ml af den på denne måde vundne maleimiderede peptidfraktion sættes der 0,1 ml β-D-galactosidaseopløsning (5 mg/ml) og reaktionen udføres ved stuetemperatur i 2 timer under lejlighedsvis rystning. Efter reaktionen er fuldført renses blandingen ved 25 "Sepharose" ® 6B søjlekromatografi med 0,01M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1% BSA, 0,1% NaN^, 0,1M NaCl og 1 mmol MgC^· Den enzymatiske aktive fraktion fraskilles på denne måde til udvinding af peptid-enzym-konjugatet. Dette konjugats egenskaber er som følger: 30 1) Konjugatet nedbryder o-nitrofenyl-|3-D-galactopyranosid og 4-metylumbelliferyl-|3-D-galactopyranosid, der er syntetiske substrater for EIA, til frigivelse af henholdsvis o-nitrofenol og 4-metylumbelliferon.
2) Den optimale pH for enzymatisk aktivitet er 7,0 til 7,7. 35 3) Mere end ca. 90% af dette enzymatisk aktive konjugat er reaktivt over for anti-pankreatisk glucagon-antistof, og
DK 161095B
30 dets immunologiske aktivitet såvel som enzymatiske aktivitet er stabile under køleskabsbetingelser i mere end 6 måneder.
4) Konjugatet har en molekylvægt på ca. 550.000, og molforholdet mellem peptid (I) og enzym er ca. 7.
5 5) Konjugatet er letopløseligt i vandige opløsningsmid ler mellem pH 5 og pH 9.
6). Det ultraviolette ab sorptions spektrum for konjugatet er vist i fig. 2, hvor abscissen angiver bølgelængden i nm og ordinaten absorptionen. Xmax = 283 nm.
10 7) En aminosyreanalyse af konjugatet er anført i tabel 5.
8) Andre egenskaber af konjugatet ligner egenskaberne af β-D-galactosidase (Boyer, The Enzymes, bind 7 (1972), side 617, Academic Press, New York-London).
Eksempel 6 15 Peptid (III (15—29)-β-D-galactosidase-konjugat
Den i eksempel 5 beskrevne proces gentages med den forskel at der bruges 2 mg peptid (II) ifølge eksempel 2 i stedet for 2 mg peptid (I) (15-29) til fremstilling af et pep-tid-3-D-galactosidase-konjugat.
20 Bortset fra de nedenfor anførte egenskaber 3) og 4), er dette konjugats egenskaber lige som de egenskaber under 1), 2) , 5), 6) og 8) for konjugatet ifølge eksempel 5.
3) Mere end ca. 80% af dette enzymatisk aktive konjugat er reaktivt over for anti-PG-antistof, og dets immunologiske 25 aktivitet såvel som enzymatiske aktivitet er stabile under køleskabsbetingelser i mere end 6 måneder.
4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 550.000, og molforholdet mellem peptid (II) og enzym er ca. 6.
Eksempel 7 30 Peptid (III) (21-29)-β-D-galactosidase-konjugat
Fremgangsmåden i eksempel 5 gentages med den forskel at der bruges 1,2 mg peptid (III) (21-29) ifølge eksempel 3 i stedet for 2 mg peptid (I) (15-29) til fremstilling af et peptid-3-D-galactosidase-konjugat.
DK 161095 31
Undtagen med hensyn t±l nedenstående egenskab 4), ligner egenskaberne af dette konjugat egenskaber 1):, 2)., 3), 5)., 6) og 8) af konjugatet ifølge eksempel 5, 4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 550.000, og 5 molforholdet mellem peptid (XII) og enzymet er ca. 8.
Eksempel 8
Peptid (IV) (13-29)-β-D-galactosidase-konjugat
Fremgangsmåden i eksempel 5 gentages med den forskel at der bruges 2,4 mg peptid (IV) (13-29) ifølge eksempel 4 10 i stedet for 2 mg peptid (I) (15-29) til fremstilling af et peptid-p-D-galactosidase-konjugat.
Med undtagelse af egenskaberne 3), 4) og 7), ligner dette konjugats egenskaber egenskaberne 1), 2), 5), 6) og 8) af konjugatet ifølge eksempel 5.
15 3) Mere end ca. 75% af dette enzymatisk aktive konjugat er reaktivt over for anti-pankreatisk glucagon-antistof, og dets immunologiske aktivitet såvel som dets enzymatiske aktivitet er stabile under køleskabsbetingelser i mere end 6 måneder.
20 4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 550.000 og molforholet mellem peptid (IV) og enzym er ca. 5.
7) En aminosyreanalyse af dette konjugat er anført i tabel 6.
Eksempel 9 25 Peptid (I) (15-29)-alkalisk fosfatase-konjugat 0,2 ml af en suspension af alkalisk fosfatase (5 mg/ml) centrifugeres og det resulterende bundfald opløses i 0,1 ml 0,1M fosfatpuffer (pH 6,8). For sig selv opløses 1 mg peptid (I) (15-29) ifølge eksempel 1 i 1 ml af samme puffer som oven-30 for anført, og derefter tilsættes den foran beskrevne enzymopløsning. Derpå tilsættes der 0,1 ml 2%s GLA-opløsning og reaktionen gennemføres ved stuetemperatur i 2 timer; ved afslutning af denne periode dialyseres reaktionsblandingen mod samme fosfatpuffer ved ca. 5°C natten over. Dialysatet renses yder-
DK 161095 B
32 (r) ligere ved hjælp af "Sephadex" ^ GlOO-søjlekromatografi med fosfatpuffer (pH 6/8) indeholdende 0,1M NaCl. De enzymatisk aktive fraktioner forenes til udvinding af et peptid-enzym-konjugat.
5 Dette konjugats egenskaber er som følger.
1) Konjugatet nedbryder fenylfosfat og p-nitrofenylfosfat, der er syntetiske substrater for EIA, til dannelse af henholdsvis fenol og p-nitrofenol.
2) Den optimale pH for enzymatisk aktivitet er 9,5 til 10 10,5.
3) Mere end 90% af dette enzymatisk aktive konjugat er reaktivt over for anti-pankreatisk glucagon-antistof, og detes immunologiske aktivitet såvel som dets enzymatiske aktivitet er stabile under køleskabsbetingelser i mere end 3 15 måneder.
4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 140.000, og molforholdet mellem peptid (I) og enzym er ca. 20.
5) Konjugatet er letopløseligt i vandige opløsningsmidler med pH 6 og pH 11.
20 6). Det ultraviolette absorptions spektrum for dette konju gat er vist i fig. 3, hvor abscissen angiver bølgelængden i nm og ordinaten absorptionen. lmax = 281 nm.
7) Med hensyn til aminosyreanalyse for konjugatet henvises til tabel 7.
.25 8) Andre egenskaber ligner egenskaberne af alkalisk fosfa tase (Boyer, The Enzymes, bind 4 (1971), side 417, Acadmic Press, New York-London).
Eksempel 10
Peptid (II) (15-29)-alkalisk fosfatase-konjugat 30 Fremgangsmåden i eksempel 9 gentages med den forskel at der bruges 1 mg peptid (li)(15-29) ifølge eksempel 2 i stedet for 1 mg peptid (I) (15-29) til dannelse af et peptid-alkalisk fosfatase-konjugat.
Egenskab nr. 4) afviger, mens egenskaberne af dette 35 konjugat er lige som egenskaberne 1), 2), 3), 5), 6) og 8) beskrevet i eksempel 9.
DK 161095 B
33 4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 140.000, og molforholdet mellem peptid (II) og enzym er ca. 20.
Eksempel 11
Peptid (III) (21-29)-alkalisk fosfatase-konjugat 5 Fremgangsmåden i eksempel 9 gentages med den forskel at der bruges 0/6 mg peptid (III) (21-29) ifølge eksempel 3 i stedet for 1 mg peptid (I) (15-29) til dannelse af et peptid-alkalisk fosfatase-konjugat.
Egenskaberne af dette konjugat ligner egenskaberne 1), 10 2), 3)/ 5)/ 6) og 8) af konjugatet ifølge eksempel 9, men af viger med hensyn til nedenstående egenskab 4).
4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 130.000/ og molforholdet mellem peptid (III) og enzym er ca. 23.
Eksempel 12 15 Peptid (IV) (13-29)-alkalisk fosfatase-konjugat
Fremgangsmåden i eksempel 9 gentages med den forskel at der bruges 1,2 mg peptid (IV) (13-29) ifølge eksempel 4 1 stedet for 1 mg peptid (I) (15-29) til frembringelse af et peptid-alkalisk fosfatase-konjugat.
20 Dette konjugats egenskaber er lige som egenskaberne nr. 1), 2), 3)/ 5), 6) og 8) af konjugatet ifølge eksempel 9, men afviger fra dette med hensyn til nedenstående egenskaber 4) og 7) .
4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 140.000 og 25 et molforhold mellem peptid (IV) og enzym på ca. 16.
7) Med hensyn til aminosyreanalyse af dette enzym henvises til tabel 8.
Referenceeksempel 5
Fremstilling af pankreatisk glucagon (l-29)-fi-D-galactosidase- 30 konjugat................
Fremgangsmåden i eksempel 5 gentages med den forskel at der bruges 4 mg pankreatisk glucaton (1-29) i stedet for 2 mg peptid (I) (15-29) til dannelse af et peptid-ft-D-galacto- 34
DK 16109 5 B
sidase-konjugat.
Dette konjugats egenskaber nr. I}, 2)_, 5), 6) og 8} er som egenskaberne af konjugatet ifølge eksempel 5, mens nedenstående egenskaber 3) og 4) afviger derfra.
5 3) Mere end 65% af dette konjugat er reaktivt over for anti-pankreatisk glucagon-antistof, og det immunologiske aktivitet såvel som enzymatiske aktivitet er stabile under køleskabsbetingelser i mere end 3 måneder.
4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 550.000 og 10 molforholdet mellem pankreatisk glucagon og enzym er ca. 3.
Referenceeksempel 6
Fremstilling af pankreatisk glucagon (1—29)-alkalisk fosfa- tase-konjugat_ ' ' ' ' ' .......... .
Fremgangsmåden i eksempel 9 gentages med den forskel 15 at der bruges 2 mg pankreatisk glucagon (1-29) i stedet for 1 mg peptid (I) (15-29) til dannelse af et peptid-alkalisk fosfatase-konjugat.
Egenskaberne nr. 1), 2), 3), 5), 6) og 8) af dette konjugat er lige som de tilsvarende egenskaber af konjugatet 20 ifølge eksempel 5, mens der er forskel med hensyn til egenskab 4) som vist nedenfor.
4) Dette konjugat har en molekylvægt på ca. 150.000, og molforholdet mellem pankreatisk glucagon og enzym er ca. 13.
Eksempel 13 25 Ved et indledningsforsøg fremstilles der prøver inde holdende forskellige fortyndinger af antiserum (0,2 ml puffer, 0,1 ml peptid-3-D-galactosidase-komplex og 0,1 ml antiserum, fortyndet fra 100 gange til 1 million gange) for hvert af antiserumerne 30K, Nl6a og N6c, og hver prøve henstår ved 30 5°C i 24 timer, hvorved den enzymatisk aktive fraktion af hvert peptid-p-D-galactosidase-konjugat (med en passende forudbestemt koncentration på ca. 10 μϋ/ml) bindes til antiserumet. Derefter tilsættes der 0,1 ml anti-kanin IgG-serum (10 ganges fortynding af kommercielt antiserum) og 0,1 ml puffer indehol-
DK 161095 B
35
dende 1% normalt kaninserum. Den resulterende blanding henstår ved 5°C natten over og centrifugeres. Bundfaldet vaskes og suspenderes i 0,5 ml af en substratopløsning (20 yg/ml 4-me-tylumbelliferyl-p-D-galactopyranosid opløst i 0,01M fosfat-5 puffer (pH 7,Q) indeholdende 0,1% BSA, 0,1% NaN^, 0,1M
NaCl og 1 mmol MgCl2). Reaktionen gennemføres ved 37°C i 2 timer. Efter at reaktionen er fuldført, måles fluorescens-intensiteten af det 4-metylumbelliferon, der er frigivet ved enzymatisk spaltning, ved en excitation-bølgelængde på 365 nm 10 og en fluorescens-bølgelængde på 450 nm.
Derefter sættes der med henblik på kvantitativ bestemmelse af pankreatisk glucagon i en prøvevæske 0,1 ml af anti-serumet med fortyndingsfaktor som bestemt ovenfor, og af pep-tid-|3-D-galactosidase-konjugatet til en blanding af 0,1 ml 15 af prøvevæsken og 0,1 ml af pufferopløsningen. Derefter følges samme analyseprocedure som beskrevet ovenfor. Resultaterne fremgår af tabel 1-3.
Det vil ses af tabel 1 at ved anvendelse i kombination med peptid (I)!-enzym-konjugatet eller peptid (Il)-enzym-kon-20 jugatet giver 3OK antiserum resultater med udtalt forbedret følsomhed i sammenligning med den analyse som bruger samme antiserum i kombination med det konventionelle PG-enzym-kon-jugat et homologt system.
På lignende måde giver antisera N16a (tabel 2) og N6c 25 (tabel 3) også forbedret følsomhed ved lave koncentrationer af pankreatisk glucagon, navnlig ved anvendelse i kombination med peptid (II)-enzym-konjugatet eller peptid (Ill)-enzym-konjugatet i et heterologt analysesystem ifølge den foreliggende opfindelse.
30 Det vil ses at der opnås meget høje følsomheder i en- zym-immunanalysen af pankreatisk glucagon når konjugatet af et mærkningsenzym med et peptid, som er et andet end det peptid der bruges til fremstilling af et analyse-PG-antistof, bruges i kombination med nævnte antistof (dvs. i et heterologt 35 analysesystem).
36 ΓΊ Η DK 161095 Β Η Η &ι — Ο ι—1 Τ3 σι ο Η CN Μ ο οο ^ +ι ι ο ο γ-» ftiH -Ρ Η φ CM φ ft) ·*- ,β____ *<—Ν Η Η tn ^ 0 γΗ
Td σι ο Η CN μ ο ο ο +> ι φ ο ιη η ϋ am -PH fti φ Η φ ft) w Λ ‘w _____Φ Ο Λ Οι · σ> Φ β οι *>» w m 0 I Η tn Η Φ Ή Η '-'Ο -φ -Ρ ^ Η Ρ Ρ Φ Ό σι ο φ g -Η β -Η cm Ρ ο οο ο > > Ο 0 -Ρ 1 φ ο ιο οο Ρ φ Ο tn ft)in -Ρ Η φ β 03 Φ Φ Η Φ β Μ-Ι 03 Ο ft) ^ XI (< β Ή -Η Η ----- Φ tn Φ Φ 0) φ 03 03 Ο Μ Οι Φ Φ -Ρ 03 β ^ m m ο -Η Φ > 03 -Ρ tn Η tn -Ρ -Ρ Η Φ ο 03 03 · φ Ο —Ν Η Φ Φ β Η
Ρ ^ Ο >ϋ σι Ο HH Μ-) Φ CM
^4 ro ο ·Η οι Ρ ο Η Η p-ι ro β« ·Ρ I Φ ΟΟ'Ψ β β Φ Φ Ο Ο ft)0O -Ρ Η φ φ Ρ) Φ ft« ro -ιη φ Η Φ 'Ο Η ft) ^ ,β ιΗ ι—1 g -Η Ή ·Η φ 03 Η ------Ρ -Ρ β Φ β Λ · -Ρ -Ρ Φ *-« Φ φ φ φ t n «3
Eh t n οι φ φ ιο — Ο φ β β 03 σι σι , η οογο *d β β φ Η <Ν ο οοοιο ·Η Λ Λ X ·“ I g Η 03 Φ Ο Η 0 Ο ·Ρ -Ρ Ε-ι C"' ft) — ,β -Ρ Φ Φ Η ο +> -ρ m φ -η -φ ο τι ________Η > > β “Τ' Φ ·Η Ή !>ι ·Η t n -Ρ -Ρ -Ρ Λ ι ι λ: ·η I I Β Ω Φ Φ 03 g m g >ι t n ι Ρ m Φ φφνο α: αχ φ φ φ Φ Ρ g Ρβ -Ρ β οι χ μ ;> +> Μ-t β t n 4-3 Φ g Φ Ο ·Η 03 03 03 ·Η Φ Ρ β I β tn ·Η 4J φ -Η -ri β Λ β φ •Η 'Ο’Φ Ρβ -ΡΦ -Ρ-Ρ-ΡΡΦ φ 03 Ό φ ·Η φ ·η Φ φ tn Φ Φ -Η.
>-Η β > -Ρ 03 β ΡΡβ β g g Φ Ω -Ρ >ι Ο) ·Η Ο -Ρ Λ! Ο — Ρ>)>)Ρ 4-ΐβ -Ρ -ΡΦ -ΡΛ! ββ tnH Λ Ν Ν 4Η ·* •β Φ Ρ β ft) β| φφφgooo ββ Ρ β Ο β Φ g Ό Ρ)0\ Ο Ο g Φ Φ -Ρ β Φ ρ p Φ ρ ^ >ι β β t n η m ^ Φ-Ρ >Φ > Φ Η Ρ Ν ΟΡΗ Ρ) Ν β β Ρ Φ β g tn g β Φβ «Φ tnw β Φ φ μη ρ Φίηβ-ΗβΦίη-Ρ Φ φ Ω Ω Φ φ β ρ η ρ β Φ t n ι - Μ -Ρ
β ·Η φ Φ Φ β ·Η tn β β —> g .r03+J
-HH 03 -Ρ 03 HH β ·Η ·Η CN 0 ·· Ο β ·Η -pH ·Η -Ρ Η -Ρ Η -ι—ι Η -Ρ Ο CQ ffl Ω < Ω ft)-Η -Ρ β -Ρ fti-H β £3 ft) Ω ~ Φ-Ρ β Ηβ Φ-ΡΟ ΟΦ X <*> ~ ~ — ft) 03 < CQ Φ ft] 03 ,¾ ft) Μ w _ Η CM 00
37 DK 161095 B
H
H
H tr> — o r-1
Ό σι O
H CM Μ O Η (Ti +j I o) o oo m
ftH 4-> H
φ CM <D
cm-' rα___
H
H 01
— O
.—- r—I
iø σι O o ro oo -H CM M O 00 lo
-P I Φ H
ftin +> QJ i—t 0) CM Λ »»—s H 0>
<n “'O
CM <->> H
I Tø (Tv O o oo o ro H om Ρ o σι oo H 4-1 I <U 1-4 w 0) CM m 4-) tn uh o) — β ft — Λ > id ___—--- H O» o CM Ό * o t> · H ro O H 1-1 H 4-> td . —
<D CM ° O1 H
n 0) i—i o <x3 σ v O ^,.¾ (0 cm z CM H CM Η Οι-ΗγΜΛ tj 4J I O o o oo td
^ 0,00 g Η Η -P
(1) H O
_fi____1 - s ? σι P Ci rM Η o o σι -ri I 1¾ o o r~- β
OH φ HH 4J
CM rø P
^ H "tf (0 _____ i—I O' -.-- —--" ————— - -ri 0 4-> oo I H ,
i i S P
g »w g & Oi M ti V
S nj§N0C!in oh
Lig ρ β -ΡΟΗ > ft IH d DI MM 0) g fd H -P H g d β | β Di 4J β O' <1) Ό0) -H 13¾ H 3 |d Η 52 0) co ij <1)-H <D -η Ρ Ρ β
>-H β > -P W β ·Ρ^! _ O
-p >i Pi -Η O ββ tun g © jj β Jj 4J φ -Ρ >ί Η ιί Ιί E O O O 00 Ό β ^ Si T 2 S ram c π d id s fi d t n η ίο φ Q) IH m 0) Ή >( mm >(ø > lin m n W β 0>w Q) o β g en g β β β _—- ti (3&ι3-Η3βεη4-) 0 ~ £ β p HP β β bi ι ™ Μ Ό-ΗΟΙΦΦΤίΗΟιβΌ'- _ HHW4JW-HH3H-HCM m2
4JHH4J-H4JHT1H-P Ο 0W
ft-Η 4J Ρ -Ρ ft Η β Λ ft CQ
044 β i Η β 0)4-10 ΟΦ > <* ~ ~ ft ω rij j CQ β ft Μ .*4 !*ί ft I Μ ___— Η 00 38
_DK 161095 B
Η Η Η tn ^ Ο ^ ιΗ Ό σι ο ο ο ο
Η CM Μ Ο CO 1C
-ft I Φ Η ftr-l -Ρ 0)(Μ φ ft) — Λ Η Η tn W 0 '—- I—1 φ σι ο ο οο ^ Η cm Μ ο h in •P I Φ Η ftiin -μ Φ Η φ ft) ^ Si Η W— tn λ τ) σι ο σ\ Η cm η CM -Ρ I Ο Ο Μ* Ο i 0)ir> g ο ο co LO φ i—1 0 Η Η
Η φ ft) w ,G
— &> C i---------‘ td h tn — o > ·
Ό O H tn H
H -—' O v—’ 0
-p CO · <—«. i—I H
ft) o o rø σ> ο Φ CO φ V0 Ο H CM Μ O CM If) .ft P)S +J I φ OOP- (0
H ft)CO -Ρ Η H -P
φ ΦΗ Φ Λ ft) — Si *3 td _______Φ
Eh S
tn 0 Φ η m
Ο H
σι Μ ο ο σι φ CM Φ OOP' fft
* I -Ρ Η H G
OH φ H <* ft) --- si Λ _________P tn
0 0 H
I—I
I -H
i i a g m g >t tn -Ρ Φ φ φφνολ: φ η
Mg MG -PGM >0) in 3 tn Η Φ g Cd OH ‘Mg M G I 3 Cn ·Η+) tn Φ
ΤΙΦ ·Η τ) Ό Μ 3 -Ρ <d GM
Φ ω ό φ -Η φ-ηιΰφ rd ,¾ >·Η G > -Ρ Μ G Μ Μ G Φ -Ρ >ι ft HO -PrMO'-' ο ο ο go -PG -Ρ -ΡΦ -Ρ ^4 G G tnH ο ο 0 ϋ
Ord Μ tJftj Gi Φ td td g Hin MG
G OG td g O ft) O \ Φ
ΦΗ Η Φ H ~ >i G 3 tn MM
> id |>fdH HN OHHftj ΦΦ
G gtngG td G tø G tn~ H
td tn 3 h 3 td tn-P Φ . —-—*-—“ ^ Φ
GMHM Gdtni cm M
Ό Η φ ΦΦ Ό H tn G'd-' Η Η Μ -G Μ Η H 3 Η H CM tn Φ
-pH H -PH 4J Η ·η Η -P O OM
ftiH -P G -P ftjH G Λ ft) ffl ^ Φ -P G HG Φ-ΡΟ 0Φ "S. <JP — — ft) Μ < M td ft) M A=i tø ftij PQ ^___ H co
Eksempel 14 39
DK 161Q95B
Plasma-PG-titere af flere stammer rotter bestemmes ved den ovenfor beskrevne enzym-immunanalyseproces under anvendelse af 30K antiserum og peptid (I) (15-29)-β-D-galacto-5 sidase-konjugat og resultaterne sammenlignes med resultaterne af konventionelle radioimmunanalyser med samme 3OK antiserum.
Resultaterne fremgår af tabel 4.
Som det ses i tabel 4 frembragte EIA-metoden i henhold 10 til den foreliggende opfindelse til kvantitativ bestemmelse af pankreatisk glucagon resultater der var i god overensstemmelse med resultaterne af den konventionelle RIA med anvendelse af 30K antiserum, der betragtes som en af de mest pålidelige analyseprocesser. Det er således klart at EIA-metoden 15 ifølge den foreliggende opfindelse muliggør hurtig bestemmelse af PG i forskellige plasmaprøver med høj følsomhed og pålidelighed.
Tabel 4
Testplasma Koncentration af PG (ng/ml) on EIA ifølge
u _ opfindelsen RIA
1 0,42 0,50 2 0,27 0,23 3 0,27 0,28 4 0,64 0,57 25 5 0,39 0,42 6 0,40 0,47
Eksempel 15 På samme måde som i eksempel 13 lader man prøver indeholdende forskellige fortyndinger af 30K antiserum (0,2 ml 30 puffer, 0,1 ml peptid (X)-alkalisk fosfatase-konjugat eller peptid (Il)-alkalisk fosfatase-konjugat og 0,1 ml antiserum, fortyndet 10Q gange til 100.000 gange) henstå ved 5°C i 24 timer, hvorved den enzymatisk aktive fraktion af hvert peptid-alkalisk fosfatase-konjugat (med en forudbestemt passende
DK 161095 B
40 koncentration på omkring 4 mU/mi) kobles til antiserumet.
Derpå tilsættes der 0,1 ml anti-kanin-IgG-serum (en 10 ganges fortynding af kommercielt antiserum) og 0,1 ml puffer indeholdende 1% normalt kaninserum, og den resulterende blan-5 ding henstår ved 5°C natten over. Derpå centrifugeres blandingen og bundfaldet vaskes og suspenderes i 0,5 ml substratopløsning (2 mg/ml p-nitrofenylfosfat opløst i 0,05M natriumkarbonatpuffer (pH 9,8) indeholdende 1 mmol MgC^J · Reaktionen får lov at forløbe ved 37°C natten over. Når reaktionen 10 er fuldført måles absorptionsintensiteten af p-nitrofenol, som frigivet ved enzymatisk spaltning, ved 405 nm.
Derpå sættes der med henblik på analyse af PG i en prøvevæske 0,1 ml af 30K-antiserumet ved den ovenfor nævnte forudbestemte fortynding, og 0,1 ml af peptid-alkalisk fosfa-15 tase-konjugatet til en blanding af 0,1 ml af prøvevæsken og 0,1 ml af pufferen. Derefter følges den ovenfor beskrevne analyseprocedure. Analyseresultaterne er vist i fig. 1, hvor abscissen angiver mængden af pankreatisk glucagon i ng/ml og ordinaten absorptionen ved 405 nm.
20 I fig. 1 angiver den fuldt optrukne kurve med fyldte cirkler resultaterne for peptid (Ii-enzyim-konjugatet, den brudte kurve med krydser angiver resultaterne for peptid (II)-enzym-konjugatet og den fuldt optrukne linje med åbne cirkler angiver resultater for PG-enzym-konjugatet.
25 Fig. 1 viser standardkurven for pankreatisk glucagon.
30K-antiserum giver den maximale følsomhed når den bruges i kombination med peptid (I)-alkalisk fosfatase-konju-gatet ifølge eksempel 9 (heterologt analysesystem), mens det konventionelle homologe analysesystem med anvendelse af PG-30 alkalisk fosfatase-konjugatet kun giver lav følsomhed.
Antal af mol af hver aminosyre pr. 100 mol glycin.
Tabel 5
DK 161095 B
41
Aminosyre Peptid (I)-β-D-galactosidase- konjugat 5 Lys (lysin) 50
His (histidin) 42
Arg 115
Asp 166
Thr 78 10 Ser 77
Glu 158
Pro (prolin) 93
Gly (glycin) 100
Ala 102 15 Val 82
Met 18
Ile (isoleucin) 53
Leu 123
Tyr 35 20 Phe 54 β-Ala
DK 161095B
Tabel 6
Antal mol af hver aminosyre pr. 100 mol glycin.
42
Aminosyre Peptid (IV)-|3-D- galactosidase-konjugat 5 Lys(lysin) 57
His (histidin) 34
Arg 120
Asp 177
Thr 80 10 Ser 80
Glu 158
Pro (prolin) 91
Gly (glycin) 100
Ala 116 15 .Val 77
Met 16
Ile (isoleucin) 51
Leu 128
Tyr 32 20 Phe 51 (3-Ala
Tabel 7
Antal mol af hver aminosyre pr. 100 mol glycin.
DK 161095 B
43
Aminosyre Peptid (I)-alkalisk fosfatase-konjugat 5 Lys (lysin) 49
His (histidin) 19
Arg 81
Asp 138
Thr 92 10 Ser 80
Glu 132
Pro (prolin) 66
Gly (glycin) 100
Ala 116 15 Val 88
Met
Ile (isoleucin) 34
Leu 89
Tyr 20 Phe 40 8-Al a
Antal mol af hver aminosyre pr. 100 mol glycin.
DK 161095 B
44
Tabel 8
Aminosyre Peptid (IV)-alkalisk fosfatase-konjugat 5 Lys (lysin) 54
His (histidin) 13
Arg 73
Asp 137
Thr 92 10 Ser 84
Glu 132
Pro (prolin) 68
Gly (glycin) 10Q
Ala 117 15 Val 90
Met
Ile (isoleucin) 36
Leu 99
Tyr 20 Phe 39 y β-Ala 8
Eksempel 16
Ved et indledningsforsøg holdes en blanding bestående af 100 μliter af varierende fortynding af forskellige antise-25 ra (30K, G21, G7, R517 og N6E), 100 yliter peptid-fi-D-galac^ tosidase-konjugat, 50 yliter "Antagosan" (et i Danmark ikke indregistreret varemærke for et produkt fra Hoechst; 10.000 enheder/ml) og 250 yliter analysepuffer (0,02M fosfatpuffer (pH 7,3) indeholdende 0,5% HSA, 0,5% EDTA, 0,1% NaN^ og 30 0,1M NaCl) på 5°C i 96 timer, hvorved den enzymatisk aktive fraktion af det tilsvarende peptid-p-D-galactosidase-konjugat, der har en forudbestemt passende enzymatisk aktivitet på ca.
10 yU/ml; bindes til antiserumet. Derefter tilsættes der 100 yliter af en suspension af 5%s anti-kanin IgG-antistof-cellu-35 losekomplex og reaktionen udføres ved 30°C i 4 timer. Denne
DK 161095 B
45 blanding centrifugeres og bundfaldet vaskes og suspenderes i 500 yliter substratopløsning (20 yg/ml 4-metylumbelliferyl-3-D-galactopyranosid opløst i 0,01M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1% BSA, 0,1% NaNg/ 0,1M NaCl og lmmol MgCl2).
5 Reaktionen udføres ved stuetemperatur natten over. Efter at reaktionen er fuldført måles fluorescens-intensiteren af 4-metylumbelliferon som frigivet ved enzymatisk spaltning ved en excitations-bølgelængde på 365 nm og en fluorescens-bølgelængde på 450 nm.
10 Derefter sættes der henblik på analyse af PG i prøve væsken 100 pliter af den ovennævnte forudbestemte fortynding af antiserum og 100 ml peptid-3-D-galactosidase-konjugatet til en blanding af 50 yliter af prøvevæsken, 5Q yliter "Anta-gosan" og 200 yliter analysepuffer. Derefter følges den samme 15 analyseprocedure som beskrevet ovenfor.
Resultaterne af disse analyser fremgår af fig. 4-6, hvor abscissen angiver indholdet af tarm-glucagon i yg/ml og ordinaten forholdet B/Bo i procent.
I fig. 4-6 angiver de fuldt optrukne kurver med lukkede 20 cirkler resultaterne for peptid (I)-enzym-konjugatet, de fuldt optrukne kurver med krydser resultater for peptid (III)-enzym-^ konjugatet og de fuldt optrukne kurver med åbne cirkler resultater for PG-enzym-konjugatet.
Idet der først refereres til fig. 4 blev antiserum 25 R517, vundet ved immunisering af en kanin med PG, omsat med tarm-glucagon ekstraheret fra en hunds tyndtarms slimhinde. Dette antiserum viser en konkurrerende bindingsaffinitet til tarm-glucagon ved anvendelse i kombination med et konjugat af PG selv (i det følgende betegnet "PG (1-29)") med enzymet, 30 men viser ikke nogen signifikant konkurrerende bindingsaffinitet, selv ved en høj koncentration af tarm-glucagon, ved anvendelse i kombination med peptid (I) (15-29)-enzym-konjugat. Det er derfor klart at det analysesystem som indebærer anvendelse af R517 antiserum og peptid (I)-enzym-konjugat er spe-35 cifikt for pankreatisk glucagon.
I de tilfælde der repræsenteres af fig. 5 og 6 blev antiserum G7, vundet ved immunisering af en kanin med pankreatisk glucagon, bragt til reaktion med tarm-glucagon. Her er
DK 161095 B
46 den ovennævnte ekstrakt af hunde-tyndtarmsslimhinden yderligere renset ved gelfiltrerings-søjlekromatografi på "Sepha-dex" ®G50, og de resulterende to tarmglucagoner med forskellige molekylvægte (I anslået molekylvægt ca, 10.000; II anslå-5 et molekylvægt ca. 2.000 til 4.000) (Hormone and Metabolic
Research, bind 8, side 170 (1976)) er anvendt ved undersøgelse af krydsreaktiviteten af ovennævnte antiserum med tarmglu-cagon. Anvendelse af antiserum i kombination med peptid (i) (15-29).-enzym-konjugat eller peptid (III) (21-29)-enzym-kon-10 jugat viser ikke så stor konkurrerende bindingsreaktion med noget af de to tarmglucagoner som den der blev iagttaget når samme antiserum blev brugt i forbindelse med PG (1-29)[-enzymkon jugatet. Således bliver G7 PG-uspecifikt antiserum lige som R517 antiserum åbenbart specifikt over for PG når det an-15 vendes i kombination med peptid (I)-enzymet eller peptid (III)-enzym-konjugatet.
Eksempel 17
Humant plasma fraktioneres ved gelfiltrerings-kolonne-kromatografi i stort plasmaglucagon (i det følgende betegnet 20 "BPG") og pankreatisteglucagon (PG)-fraktioner, og ved den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 16 bestemmes PG-niveauer. Resultaterne sammenlignes med resultaterne af den konventionelle enzym-immunanalyse med PG-antiserum og PG (1-29)-enzym-konjugat.
25 Resultaterne er anført i tabel 9. Det vil ses i tabel 9 at det heterologe analysesystem ifølge den foreliggende opfindelse ikke afslører nogen signifikant afvigelse af resultaterne for PG-fraktionen, men gav meget lave PG-niveauer for BPG-fraktionen. Det er derfor klart at for så vidt angår 30 antisera 30K og G21, vundet ved immunisering af kaniner med PG, resulterer brugen., af sådanne sera i kombination med peptid (I) (15-29)-enzym-konjugat i en reduktion i den konkurrerende bindingsreaktion med BPG eller af graden af inhiberende virkning af BPG på antigen-antistof-reaktionen, således at 35 det bliver muligt at bestemme PG-niveauet i plasma mere specifikt end ved en analyse med anvendelse af PG (1-29)-enzym-
DK 161095 B
47 konjugatet. Når N6E-antiserum vundet ved immunisering af en kanin med peptid (I) (15-29) bruges i kombination med peptid (III) (21-29)-enzym-konjugat, giver BPG-fraktionen en endnu lavere PG-værdi, hvilket viser at analysesystemet er endnu 5 mere specifikt over for pankreatisk glucagon.
48 DK 161095 B
<n cn cm
CM I
I H
tn cm
H ^ G G
0 0 ~ t n tn ^ h cd nj
HH O O
Η H tn i fl ·~· ''—' O I—i 1—1 in h t n t n Ό Η Ό o (ti •P to -H p o o o oo n to g ,¾ •PS -P ti) cm to ^ t" tn cn ft ft -P co ^ ro cn td ·ρ
d) 0) 0) Η -P
ft ft Λ to ft tO
— 0)
----H----P P
g n ϋ
tn \ O G
h o in -P (ti H ft M ft Ό O ~ •H p o o o oo o in ·· -P 0)-PcMcoror^r^o o·· ft ^ II Ol IS ID CM H ft ø O O -P W ft — ft Λ ·Η >
•P O
h +» in cm tn A! i O O td o o o ro o o O ·
HtUOHCOOHH G
O P CM (O O H H Pi O
SS·· tn O O D ro H s id
ft Λ g !*} O
^ g 0) 3
cn ------P---rtf H
cm i (0 · tn i tn G Λ ^ Η H O O ft oo · cn ^ Htnooocoo'tf 0) to — tn ’’d Oiticocncocotot© w <n<n -h
HØ ·Ρ P O O CM 'tf CM s Η Ό -P
O) ft -P d) D · cn td
Λ ft -P H i—I Ό H <D
(0 00)0 OH'-'P
É-t ft £ g cm M
— · CO H G
oo ----O -P (ti w tn o o o ft t n td Μ Ό Ό O O ti Λ Ή ti fl ro h oootoo'tf-Ptti tn tn o ø O oHinoiocntnft g ft g iH ro m H ro 0 *·*>
O · -P O t" oo -P
.G "tf OG HH G
(ti G 0)
Η 0 Ό Ό H
--------(ti H G G (ti tn o -p -H > I I Μ Λ Λ ·Η I I ε Q > ε g >i t n i G w tn · ,y
o Ονο ta φ o a 'ί !B
p ε p g -p -p -p
(HD (HQ) g (ti 0)¾ QJCDHP
p i 3tn— ωω,οΛοα) Ό 0) Ό Ό P D cm -Pg (ti (ti ft 0) in 0) -P 0) -ro G tn -P -P g g
>-H > -P tn G O Din Ω Q d) O
•p ft-HO-H PO) tntn •pg +> <d -p ,¾ -p ,qtn ·· ·· x Ό(ΰ fl ft G I G P P 0) 0) G G (tig DØ 0 0 gd) D D 0) Ό o) m dim-' >i Pftøftøftø i* p -P-Potn
> (ti >(tiH (UN hfflftfflftWft N (ti (C G G
G g G DG G (ti P P ti) § (ti tn 3 (ti tn-P 0) ----0) g d) 0) p g G P G (ti tn i in-P-PO)
nD-P0)rd-PtnGtO(ti g (ti -P -P H G
P H tø -P H D Η H g OH -P -P 0) 0) •PH-P-PH-l-lH-P 10 H CM ro U) ft HHftP ft-P -P ft-P G rQ ft (ti d)-P G 0) -P O Od) H —· ^ Λ ^ Λ ft t n | ft in ,¾ | & ft | ft___ h cm ro <f m to
Claims (11)
1. Pepetid-enzym-konjugat til brug ved enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon, kendetegnet ved at det er dannet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med formlen
5 H-R1-Phe-Val-Gln-Trp“Leu-R2-Asn-Thr-OH hvor R1 er et peptidfragment bestående af 1-1Q aminosyrerester, 1 2 3 4 5 inci. Asp i 10-st±llingen, i sekvensen β-Ala-Tyr-Leu-Asp-Ser-6 7 8 9 io 2 Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, og hvor R betegner Met eller Nle.
2. Peptid-enzym-konjugat ifølge krav 1, kendete g-10 net ved at det er dannet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med formlen H-R -Phe-Va 1 -GI n-Trp-Leu-Me t-Asn-Thr-OH 3 hvor R er et peptidfragment bestående af 1-7 aminosyrerester, incl. Asp i 7-stillingen, i sekvensen Alp-sir-Arg-Arg-A^a-Gfn-15 Asp.
3. Peptid-enzym-konjugat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at mærkningsenzymet er β-galactosidase eller alkalisk fosfatase.
4. Peptid-enzym-konjugat ifølge krav 2, kendete g-20 net ved at det er dannet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med sammensætningen H-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH eller H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH.
5. Peptid-enzym-konjugat ifølge krav 4, kendete g-25 net ved at mærkningsenzymet er β-galactosidase eller alkalisk fosfatase.
6. Fremgangsmåde til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon under anvendelse af et peptid-enzym-konjugat som analysereagens, kendetegnet ved at der som peptid- 30 enzym-konjugat anvendes det i krav 1 angivne konjugat dannet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med sammensæt- 1 2 1 ningen H-R -Phe-Val-Gln-Trp-Leu-R -Asn-Thr-OH hvor R er et peptidfragment bestående af 1-10 aminosyrerester i sekvensen β-Alå-Tyr-Leu-Asp-sår-A^g-Arg-Alå-Gln-As^ incl. Asp i 10- 2 DK 161095 B stillingen, og hvor R er Met eller Nle.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6,kendetegnet ved at der anvendes et konjugat dannet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med formlen
5 H-R3-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-QH, 3 hvor R er et peptidfragment bestående af 1-7 aminosyrerester i sekvensen Aisp-Ser-A?g-Arg-Alå-Gln-Alp incl. Asp i denne sekvens' 7-stilling. 1 g 8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved at der anvendes et konjugat dannet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med formlen H-R4-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-R2-Asn-Thr-OH 15 2 4 hvor R betegner Nle eller fortrinsvis Met og R betegner Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp eller fortrinsvis Asp eller Ø-Ala-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, kendet eg-20 net ved at der bruges et konjugat hvor mærkningsenzymet er β-D-glactosidase eller alkalisk fosfatase.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved at der bruges et peptid-enzym-konjugat dannet ved kobling af et mærkningsenzym med et peptid med sammensætningen H-Asp- 2^ Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH eller H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10682878A JPS5539702A (en) | 1978-08-30 | 1978-08-30 | Method of measuring enzyme immunity of pancreas glucagon |
| JP10682878 | 1978-08-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK360379A DK360379A (da) | 1980-03-01 |
| DK161095B true DK161095B (da) | 1991-05-27 |
| DK161095C DK161095C (da) | 1991-11-04 |
Family
ID=14443617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK360379A DK161095C (da) | 1978-08-30 | 1979-08-29 | Fremgangsmaade til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon og peptid-enzym-konjugat til brug ved denne fremgangsmaade |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4312943A (da) |
| EP (1) | EP0009147B1 (da) |
| JP (1) | JPS5539702A (da) |
| DE (1) | DE2963813D1 (da) |
| DK (1) | DK161095C (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5657753A (en) * | 1979-10-16 | 1981-05-20 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel glucagon fragment, and its use |
| EP0111216A3 (en) * | 1980-03-31 | 1985-01-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for enzyme immunoassay and peptide-enzyme conjugate, its lyophilizate, antibody and kit therefor |
| JPS5681450A (en) * | 1980-10-23 | 1981-07-03 | Toyo Jozo Co Ltd | Determination method for glucagon |
| CA2091544A1 (en) * | 1992-03-26 | 1993-09-27 | Shing F. Kwan | Stabilization of functional proteins |
| CN100346834C (zh) * | 2003-01-10 | 2007-11-07 | 株式会社新潟Tlo | 基因治疗用载体以及利用该基因治疗用载体在哺乳动物中或培养细胞中进行目的蛋白定量的方法 |
| US9453073B2 (en) | 2011-12-02 | 2016-09-27 | Eli Lilly And Company | Anti-glucagon antibodies and uses thereof |
| WO2019197313A1 (en) | 2018-04-09 | 2019-10-17 | Svar Life Science Ab | Glucagon Assay |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3975342A (en) * | 1972-05-15 | 1976-08-17 | Biological Developments, Inc. | Tyrosyl-class antigenic conjugates, their preparation and antibodies raised thereto |
| US4002532A (en) * | 1974-10-21 | 1977-01-11 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates |
| GB1572220A (en) * | 1976-10-07 | 1980-07-30 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemical process of measuring physiologically active substances |
| US4075194A (en) * | 1976-12-09 | 1978-02-21 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Novel synthetic undecapeptide and clinical assay |
| JPS5836308B2 (ja) * | 1977-02-10 | 1983-08-08 | 大塚製薬株式会社 | 抗体の製造方法 |
| US4206199A (en) * | 1977-07-22 | 1980-06-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel glucagon fragment and its derivatives |
| US4220722A (en) * | 1978-02-10 | 1980-09-02 | Syva Company | Method for conjugating to polyamino compounds employing haloacyl groups and compositions prepared thereby |
| US4218539A (en) * | 1978-03-24 | 1980-08-19 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates and method of preparation and use |
-
1978
- 1978-08-30 JP JP10682878A patent/JPS5539702A/ja active Granted
-
1979
- 1979-08-24 US US06/069,180 patent/US4312943A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-08-29 DK DK360379A patent/DK161095C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-08-29 EP EP79103196A patent/EP0009147B1/en not_active Expired
- 1979-08-29 DE DE7979103196T patent/DE2963813D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6311626B2 (da) | 1988-03-15 |
| JPS5539702A (en) | 1980-03-19 |
| EP0009147B1 (en) | 1982-10-06 |
| DK161095C (da) | 1991-11-04 |
| DE2963813D1 (en) | 1982-11-11 |
| DK360379A (da) | 1980-03-01 |
| EP0009147A3 (en) | 1980-04-30 |
| US4312943A (en) | 1982-01-26 |
| EP0009147A2 (en) | 1980-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4474754A (en) | Human interferon-related peptides, antigens, antibodies and process for preparing the same | |
| Piot et al. | Isolation and characterization of two opioid peptides from a bovine hemoglobin peptic hydrolysate | |
| Blombäck et al. | Human fibrinopeptides isolation, characterization and structure | |
| Hurley et al. | Development of radioimmunoassays for free tetra-L-aspartyl-L-lysine trypsinogen activation peptides (TAP) | |
| US4423034A (en) | Process for the preparation of antibodies | |
| JPH0753752B2 (ja) | 酵素抵抗性免疫変調ペプチド | |
| JPH01501148A (ja) | 悪性‐ＰＴＨｒＰの液性過カルシウム血症において活性なタンパク | |
| Scott et al. | Purification and characterization of porcine corticotrophin-like intermediate lobe peptide | |
| US5230999A (en) | Monoclonal antibody to endothelin-3 or precursor thereof and use thereof | |
| US4407965A (en) | Process for preparing antibody | |
| DK161095B (da) | Fremgangsmaade til enzym-immunanalyse af pankreatisk glucagon og peptid-enzym-konjugat til brug ved denne fremgangsmaade | |
| GB2062644A (en) | Glucagon fragment and utility hereof | |
| DK168710B1 (da) | Monoklont antistof eller fragment deraf, immunogen, immunanalysefremgangsmåde til bestemmelse af glycosyleret nativt humant albumin, peptid samt immunanalysesæt | |
| US4327075A (en) | Synthetic antigenically-active polypeptide and a process for its preparation | |
| JP4258271B2 (ja) | ポリアミノ酸担体 | |
| CA2038030C (en) | Synthetic peptides which contain sequences from factor viia, and the use thereof | |
| JPH06157592A (ja) | ペプチドもしくはその誘導体、それらとタンパク質との結合体、及びこれらを免疫源とする抗エンドセリン−１抗体の製造方法 | |
| Radford et al. | Antibodies against an inter‐domain segment of polypeptide chain inhibit active‐site coupling in the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex | |
| JP2648855B2 (ja) | ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 | |
| JP3194762B2 (ja) | モノクローナル抗体、その製造法および用途 | |
| JP3419746B2 (ja) | エンドセリン−３前駆体に対するモノクローナル抗体およびその用途 | |
| JP3167024B2 (ja) | エンドセリン―３あるいはエンドセリン―３前駆体に対するモノクローナル抗体およびその用途 | |
| JP2628336B2 (ja) | ブラジキニン誘導体およびその定量 | |
| JP2980991B2 (ja) | 癌遺伝子Ｋ−ｓａｍの遺伝子産物に対する抗体、その用途およびペプチド | |
| JPH02104595A (ja) | 非ペプチドのペプチド相当物及びそのデザイン方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |