JPH04108397A - モノクローナル抗体及びそれを用いたtsh測定法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びそれを用いたtsh測定法Info
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- JPH04108397A JPH04108397A JP2225550A JP22555090A JPH04108397A JP H04108397 A JPH04108397 A JP H04108397A JP 2225550 A JP2225550 A JP 2225550A JP 22555090 A JP22555090 A JP 22555090A JP H04108397 A JPH04108397 A JP H04108397A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はTSH(甲状腺刺激ホルモン)を認識するモノ
クローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体を使用
し、主として臨床検査の分野におけるイムノアッセイに
よるTSHの測定方法に関する。
クローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体を使用
し、主として臨床検査の分野におけるイムノアッセイに
よるTSHの測定方法に関する。
TSHの血中濃度の測定は、フレチン症、原発性甲状腺
機能低下症等の甲状腺疾患や視床下部・下垂体疾患の診
断に利用されている。
機能低下症等の甲状腺疾患や視床下部・下垂体疾患の診
断に利用されている。
ところで、TSHは2種のサブユニットつまりTSH−
α鎖およびTSH−β鎖より成る糖蛋白ホルモンである
。このうちTSH−α鎖は、LH(ヒト黄体形成ホルモ
ン)、HCG(ヒト胎盤性ゴナドトロピン)およびFS
H(ヒト卵胞刺激ホルモン)の各α鎖と共通であり、各
ホルモンの特異性はβ鎖に存在する。このため、HCG
の免疫学的測定においてポリクローナル抗体を用いたT
SH測定法では、他のホルモンとの交差反応が問題とな
る。そこで、抗体の特異性を上げるために従来からアフ
ィニティー精製やHCG等を用いた抗原カラムによる精
製が行われている。ところが、この方法は操作が繁雑で
ある上に非特異抗体を完全に除くことはできない。
α鎖およびTSH−β鎖より成る糖蛋白ホルモンである
。このうちTSH−α鎖は、LH(ヒト黄体形成ホルモ
ン)、HCG(ヒト胎盤性ゴナドトロピン)およびFS
H(ヒト卵胞刺激ホルモン)の各α鎖と共通であり、各
ホルモンの特異性はβ鎖に存在する。このため、HCG
の免疫学的測定においてポリクローナル抗体を用いたT
SH測定法では、他のホルモンとの交差反応が問題とな
る。そこで、抗体の特異性を上げるために従来からアフ
ィニティー精製やHCG等を用いた抗原カラムによる精
製が行われている。ところが、この方法は操作が繁雑で
ある上に非特異抗体を完全に除くことはできない。
他方、上述の各ホルモンの特異性がβ鎖に存在すること
を利用し、TSH−β鎖特異性モノクローナル抗体を用
いたイムノアッセイが行われている。しかしながら、T
SH,LH,HCG、FSHの各々のホルモンの各β鎖
は互いに共通なアミノ酸配列部分を多くもっている。そ
のために、TSH−β鎖特異性モノクローナル抗体を用
いたイムノアッセイであっても、TS)(に対する特異
性は高くない。
を利用し、TSH−β鎖特異性モノクローナル抗体を用
いたイムノアッセイが行われている。しかしながら、T
SH,LH,HCG、FSHの各々のホルモンの各β鎖
は互いに共通なアミノ酸配列部分を多くもっている。そ
のために、TSH−β鎖特異性モノクローナル抗体を用
いたイムノアッセイであっても、TS)(に対する特異
性は高くない。
〔課題を解決するための手段]
本発明者等は、特異性の高い抗TSH抗体を得るために
研究を進めてい(うちに、TSHタンパクの高次構造を
認識する抗体を見出した。この抗体はTSHに対する高
い特異性を持つ抗体で、LH,HCG、FSHに交差反
応性を示さず、TSHにのみ反応するものである。さら
にこの抗体は、単独に分離したTSH−α鎖及びTSH
−β鎖とは反応せず、分離していないTSHとのみ反応
する。
研究を進めてい(うちに、TSHタンパクの高次構造を
認識する抗体を見出した。この抗体はTSHに対する高
い特異性を持つ抗体で、LH,HCG、FSHに交差反
応性を示さず、TSHにのみ反応するものである。さら
にこの抗体は、単独に分離したTSH−α鎖及びTSH
−β鎖とは反応せず、分離していないTSHとのみ反応
する。
イムノアッセイにこの抗体を用いることにより従来より
も特異性が高く、高感度のTSH測定方法が提供される
。
も特異性が高く、高感度のTSH測定方法が提供される
。
さらに、TSHの精製にこの抗体を用いれば、TSH−
α鎖とTSH−β鎖が結合している状態のTSHのみを
得ることができる。
α鎖とTSH−β鎖が結合している状態のTSHのみを
得ることができる。
〔実施例)
実施例1
(モノクローナル抗体の調製)
免疫原としてTSHIO〜100μgを用いた。
これをP B S O,5dに溶解し、アジュバントと
してDIFCO社のF CA O,5R1を加えて、油
中水滴型としたものを基礎免疫用抗原とし、BALB/
Cマウスに腹腔内投与した。これを2〜4週間毎に数回
行った。また、ブースター用抗原としてTSHIQQμ
gをPBS 1ml!に溶かして調製したものを用いた
。
してDIFCO社のF CA O,5R1を加えて、油
中水滴型としたものを基礎免疫用抗原とし、BALB/
Cマウスに腹腔内投与した。これを2〜4週間毎に数回
行った。また、ブースター用抗原としてTSHIQQμ
gをPBS 1ml!に溶かして調製したものを用いた
。
免疫BALB/Cマウスの肺細胞とマウスミエローマ細
胞(P3−X63−Ag8−653)をを10:1の割
合で混合した。50%ポリエチレングリコール液1dを
滴下し、1分間室温で撹拌した。さらに、撹拌を続けな
がら2〜5分間かけて、徐々にMEM培地5〜101d
を加えた。融合した細胞は洗浄後HAT培地に3.5X
106個/l+2となるように浮遊させ、96穴マイク
ロカルチヤープレートに1穴当たり100μlとなるよ
うに分注した0時々ハイブリドーマの増殖を観察し、H
AT培地を加えていった。2週間程度培養した後、増殖
してきたハイプリドーマが目的とする抗体を産生してい
るかどうかをELISA(酵素免疫測定法)により常法
で調べた。
胞(P3−X63−Ag8−653)をを10:1の割
合で混合した。50%ポリエチレングリコール液1dを
滴下し、1分間室温で撹拌した。さらに、撹拌を続けな
がら2〜5分間かけて、徐々にMEM培地5〜101d
を加えた。融合した細胞は洗浄後HAT培地に3.5X
106個/l+2となるように浮遊させ、96穴マイク
ロカルチヤープレートに1穴当たり100μlとなるよ
うに分注した0時々ハイブリドーマの増殖を観察し、H
AT培地を加えていった。2週間程度培養した後、増殖
してきたハイプリドーマが目的とする抗体を産生してい
るかどうかをELISA(酵素免疫測定法)により常法
で調べた。
(抗原特異性測定およびマウスイムノグロブリンサブク
ラスの同定) モノクローナル抗体の特異性は、両鎖に分離されていな
いTSH(TSH(α+β)L TSHα鎖またばTS
I(−β鎖を感作した固相を用いて、EL I SAに
より常法で調べた。本研究者等が得た抗体はTSH(α
+β)感作固相に対して反応したが、TSH−α鎖また
はTSH−β鎖感作固相に対しては反応しなかった。結
果の一例を表1に示す。
ラスの同定) モノクローナル抗体の特異性は、両鎖に分離されていな
いTSH(TSH(α+β)L TSHα鎖またばTS
I(−β鎖を感作した固相を用いて、EL I SAに
より常法で調べた。本研究者等が得た抗体はTSH(α
+β)感作固相に対して反応したが、TSH−α鎖また
はTSH−β鎖感作固相に対しては反応しなかった。結
果の一例を表1に示す。
また、マウスイムノグロブリンサブクラスの同定は、マ
ウスのα、TIS Tzm、Tzb・ γ3・μ・に、
λ鎖に対する抗血清と各クローンの培養上清を用いてオ
フタロニー法で測定を行った。
ウスのα、TIS Tzm、Tzb・ γ3・μ・に、
λ鎖に対する抗血清と各クローンの培養上清を用いてオ
フタロニー法で測定を行った。
実施例2
本発明者等が開発した抗TSH特異性モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ細胞の腹水から精製したモノクロ
ーナル抗体を用いてELISAにおいて、実際に使用し
、感度を調べた。
体産生ハイブリドーマ細胞の腹水から精製したモノクロ
ーナル抗体を用いてELISAにおいて、実際に使用し
、感度を調べた。
上記で調製したクローンNo、 1を固相とし、EL
ISAを行った。先ず、所定濃度に調整したTSHI準
液20μ2とBSA入りPB、5100μlを、クロー
ンN011の産生ずるモノクローナル抗体を常法により
固定化したマイクロモジュールウェルに入れ、室温で1
時間反応させ、0,05%tween20人りPBSで
3回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼで標識したTS
H−β鎖特異性モノクローナル抗体100μlを入れ、
室温で30分間反応させ、0.05%tween20入
りPBSで5回洗浄した。さらに、0.1Mのクエン酸
緩衝液(pH5,0) 10d中に333 mMHzO
,120tt I!および0−フェニレンジアミン20
mgを含むことからなる基質液の100μlを添加し、
暗所にて室温で30分間反応さ廿、2N−硫酸100I
Jfを加え反応を停止し波長492nmで測定した。
ISAを行った。先ず、所定濃度に調整したTSHI準
液20μ2とBSA入りPB、5100μlを、クロー
ンN011の産生ずるモノクローナル抗体を常法により
固定化したマイクロモジュールウェルに入れ、室温で1
時間反応させ、0,05%tween20人りPBSで
3回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼで標識したTS
H−β鎖特異性モノクローナル抗体100μlを入れ、
室温で30分間反応させ、0.05%tween20入
りPBSで5回洗浄した。さらに、0.1Mのクエン酸
緩衝液(pH5,0) 10d中に333 mMHzO
,120tt I!および0−フェニレンジアミン20
mgを含むことからなる基質液の100μlを添加し、
暗所にて室温で30分間反応さ廿、2N−硫酸100I
Jfを加え反応を停止し波長492nmで測定した。
喋光度とホルモン濃度との関係をプロ、トし、第1回の
結果を得た。
結果を得た。
実施例3
臨床検査の分野においてTSHのイムノアッセイを行う
際に、交差反応が問題となるTSHとα鎖同一であるホ
ルモン(LH,HCG) と(D反応性を、実施例1と
同様に行い、表2の結果を得た。
際に、交差反応が問題となるTSHとα鎖同一であるホ
ルモン(LH,HCG) と(D反応性を、実施例1と
同様に行い、表2の結果を得た。
表2に示すように、本発明のTSH測定法はTSHに対
して特異性の高いアッセイ系であることがわかる。
して特異性の高いアッセイ系であることがわかる。
本発明のTSH(甲状H刺激ホルモン)を認識するモノ
クローナル抗体は、単独に分離したTSH−α鎖及びT
SH−β鎖とは反応せず、分離していないTSHとのみ
反応するものである。よって他のホルモンに交差反応性
は示さず、TSHのみに対して高い特異性を有する抗体
が旋供される。
クローナル抗体は、単独に分離したTSH−α鎖及びT
SH−β鎖とは反応せず、分離していないTSHとのみ
反応するものである。よって他のホルモンに交差反応性
は示さず、TSHのみに対して高い特異性を有する抗体
が旋供される。
またこのモノクローナル抗体は、EIA法のみならず、
tA法やその他のイムノアッセイにおいても十分適応で
き、高感度、高特異性で、しかも短時間で操作の簡単な
T’SHの測定法を捉供するものである。
tA法やその他のイムノアッセイにおいても十分適応で
き、高感度、高特異性で、しかも短時間で操作の簡単な
T’SHの測定法を捉供するものである。
表1
モノクローナル抗体の特異性
ELISAによる各抗原怒作固相との反応性No、I
No、2
培養液2)
TSH(α+β) TSH−α TSH−β0.85
” 0.00 0.01 TSH(α
+β)0.80 0.00 0.00 TS
H(α+β)0.02 0.02 0.
00吸光度(492nm/ 690nm) マウスミエローマ細胞(P3−X63−Age−653
>の培養上清
” 0.00 0.01 TSH(α
+β)0.80 0.00 0.00 TS
H(α+β)0.02 0.02 0.
00吸光度(492nm/ 690nm) マウスミエローマ細胞(P3−X63−Age−653
>の培養上清
第1図は、本発明の抗TSH特異性モノクローナル抗体
を用いてTSH濃度をEIA法で測定したときの検量線
を示したものである。 表2 交差反応 固相 No、1” No、2” 標識抗体 No、3” No、3 200m1U/醜l o、oo” 0.00 500mIU/ml 25μU/mlO,011,2
1 0,021,60 箪1百の続き (C12P 2110R C12R1:91)
を用いてTSH濃度をEIA法で測定したときの検量線
を示したものである。 表2 交差反応 固相 No、1” No、2” 標識抗体 No、3” No、3 200m1U/醜l o、oo” 0.00 500mIU/ml 25μU/mlO,011,2
1 0,021,60 箪1百の続き (C12P 2110R C12R1:91)
Claims (2)
- (1)分離したTSH−α鎖、TSH−β鎖とは反応せ
ず、両鎖に分離されていないTSHと反応する、TSH
特異性モノクローナル抗体。 - (2)上記TSH特異性モノクローナル抗体を使用する
ことを特徴とする、イムノアッセイによるTSHの測定
方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2225550A JPH04108397A (ja) | 1990-08-27 | 1990-08-27 | モノクローナル抗体及びそれを用いたtsh測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2225550A JPH04108397A (ja) | 1990-08-27 | 1990-08-27 | モノクローナル抗体及びそれを用いたtsh測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04108397A true JPH04108397A (ja) | 1992-04-09 |
Family
ID=16831054
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2225550A Pending JPH04108397A (ja) | 1990-08-27 | 1990-08-27 | モノクローナル抗体及びそれを用いたtsh測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH04108397A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994009814A1 (en) * | 1992-11-05 | 1994-05-11 | B.R.A.H.M.S Diagnostica Gmbh | Purified tsh preparation, process for its production and its use for the production of tsh tracers for tsh receptor assays and in tsh receptor assays |
WO1996027129A1 (en) * | 1995-02-28 | 1996-09-06 | Ehrenkranz Joel R L | Rapid, self-performing tsh immunoassay |
CN104880414A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-09-02 | 广州华弘生物科技有限公司 | Tsh免疫层析试剂盒及其制备方法 |
-
1990
- 1990-08-27 JP JP2225550A patent/JPH04108397A/ja active Pending
Cited By (4)
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