KR0134292B1 - 단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법 - Google Patents

단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법

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Abstract

본 발명은 항-융모 성선 자극 호르몬 -단일클론 항체 (ANTI-HUMAN CHRIONIC GONADOTROPIN-MONOCLONAL ANTIBODY)와 라텍스를 접촉시켜 항-융모성선자극 호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 항-융모성선자극호르몬-단일클론 항체와 소혈철알부민을 1:5내지 1:40중량비의비율로 혼합하고 이 혼합물에 라택스를 가야여 반응시키므로써 항-융모성선자극 호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스를 제조한다. 본발명의 방법에 의하여 제조된 단일클론 항체 결합 라택스는 항원결합성 또는 민감도가 향상 되었기 때문에 고상 면역 크로마토 그래피를 이용한 임신진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법
제1도는 실시예1에서 제조 및 정제된 MAb보여 주는 크로마토 그래피 사진이다. 밴드 (1)은 MAb의 Heaby chain을 나타내고, 밴드 (2)는 MAb의 light chain 을 나타낸다.
제1도는 본발명의 방법에 따라 제조한 단일클론 항체 결합 라텍스를 이용하여 실시예3에서 실시한 임신 여부 진단의 결과를 보여 주는 사진이다. A는 음성반응(-)을 나타내는 경우의 결과이고, B 는 양성반응(+)를 나타내는 경우의 결과이다.
본 발명은 항-융모성선자극호르몬-단일 클론 항체 (anti-Human Chorionic Gonadotropin-monoclonal antibody, 이하 anti-HCG-MAb 라 한다.) 가 결합된 라텍스의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 anti-HCG-MAb과 라택스와의 결합 반응을 소혈청알부민(Bovine serum albumin)의 존재하에 실시함을 특징으로 하는 anti-HCG-MAb 가 결합된 라택스의 제조 방법에 관한 것이다.
임산부 뇨에 존재하는 융모 성선 자극 호르몬 (HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN:HCG)은 임진중 영양막 세포에 의해 생성되는 당단백 호르몬으로 92개의 아미노산을 갖는 α-서브유니트와 145개의 아미노산으로 구성된 β-서브유니트가 비공유 결합으로 결합되어 생리적 활성을 나타내며 여성의 임신여부의진단에 사용될 수 있는 호르몬으로 알려져 있다.(J.B.C. 250,5247-5258(1975))
과거에는 임신여부를 진단하기 위한 목적으로 융모성선 자극 호르몬 존재를 확인하기 위해 래트에 시료를 피하 주사한후 난소 무게의 증감여부를 판단하였으나 근래에는 면역학적 측정방법을 사용하고 있다.
면역학적 방법을 이용한 초기 HCG 측정방법은 라택스 응집억제 반응으로(USP4,600,698호), 이방법에 따르면 항원인 HCG를 결합 신킨 일정한 크기의 라텍스 입자를 항원인 HCG를 토끼에 주사하여 얻은 다클론 항체와 반응시켜 응집 반응의 유뮤를 확인한다. 이때 시료중 HCG가 다클론 항체화 먼저 반응하면 응집원 HCG결합 라텍스가 비응집 상태로 되어 HCG 존재 여부를 판단 할수 있게 된다.
그러나 위와 같은 라텍스 응집 억제 반응에 사용된 다클론 항체는 HCG에 반응할 뿐만 아니라 황체화 호르몬 (HL), 난포 자극 호르몬 (FSH), 및 갑성선 자극 호르몬(TSH)과의 특이성이 높은 HCG의 β-서브 유니트에 대한 단일클론 항체를 얻을수 있게 되었고(ENDOCRINOLOGY 119,1887-1894(1986)), 이러한 단일클론 항체를 이용하여 HCG를 감지함으로서 교차반응성의 문제점을 해결하게 되었다. 또한 단일클론 항체의 생성세포 선별과정중 항원 결합성이 높은 단일클론 항체를 선택 사용하여 낮은 농도의 HCG를 감지 할수 있게 되었다.
단일클론 항체를 이용한 면역학적 정성및 정량분석 방법은 항체에 결합된 표지 물질이 어떠한 것인가에 따라 방사선 면역측정법(RadioImmuno Assay; RIA), 효소면역측정법(EnzymeImmuno Assay; EIA)으로 분류될수 있으며, 이 방법은 항원(HCG)에 대한 결합부위가 다른 두가지 이상의 단일클론 항체를 이용한 샌드위치 방법에 의한 측정 방법이다. 즉, 첫번째 단일클론 항체를 고체에 결합 시킨뒤 HCG가 포함된 시료를 넣어 일정기간 반응시키고, 이어 적장한 완충액으로 항체 -HCG결합체를 제외한 나머지 시료를 세척한후 방사선 물질 또는 효소로 표지된 두번째 단일클론 항체를 넣어 일정시간동안 반응시키고, 동일한 방법으로 세척하고 표지물의 활성을 측정함으로서 HCG를 정량적으로 분석할 수 있다. (Clin.Chem.38,263-270(1992))
최근에는 항체에 방사선 물질이나 효소를 표지하지 않고 유색의 폴리스티렌 입자를 결합시켜 HCG를 감지하는 고상면역 크로마토 그라피법이 등장하게 되었는데, 이것은 첫번째 anti-HCG-MAb를 박층고상에 공유 또는 비공유 결합으로 고정시키고 첫번째 항체가 결합하는 부위와는 다른 부위에서 항원과 결합하는 두번째 anti-HCG-MAb를 박충고상을 따라 이동할수 있는 유색의 미세한 폴리스티렌 입자에 결합시킨 다음, 항원(HCG)이 포함된 시료를 혼합하여 박층고상에 전개시키면 박층고상에 고정된 첫번째 anti-HCG-MAb와 HCG를 매개로 유색의 폴리스티렌 입자가 고정되어 색이 출현되게 하고 이색의 출현 여부로 HCG의 존재 여부를 판단하는 방법이다.(ANAL.BIOCHEM ,206,168-171(1992))
이 방법은 두가지 이상의 단일클론 항체를 이용한 방법으로 특이성이 높고 낮은 농도의 HCG도 감지할 수 있어 조기 임신진단에 매우 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다. 이러한 고상 면역 크로마토그라피 법을 이용하여 낮은 농도의 HCG를 감지하기 위해서는 유색의 라텍스 입자에 항체를 결합시키는 방법이 매우 중요한 요인으로 작용한다.
미국특허 제 4,003,988호에서는 라텍스와 다클론 항체를 접촉시켜 다클론 항체가 결합된 라텍스를 제조한 후 원심분리에 의해 라텍스에 결합되지 않은 유리 다클론 항체를 제거하고, 이어 소혈청 알부민으로 처리하여 라텍스의 미결합 부위를 차단하는 과정에 의해 다클론 항체가 결합된 라텍스를 제조하고 있다. 이 방법에서 항체와 라텍스와의 반응 후에 소혈청 알부민으로 처리하는 것은 시료 중의 항원이 라텍스중 항체와 결합되지 않은 부분과 비특이적으로 반응하는 것을 차단하기 위해서이다. 그러나 상기 특허에 기재된 방법에 따르면, 항체의 Fc부분이 라텍스에 결합되어야만 최종적으로 얻어진 항체-결합 라텍스의 항체의 Fab(항원결합부위)가 시료중의 항원과 결합할 수 있음에도 불구하고 , 많은 항원이 그의 Fab부분이 라텍스에 결합되기 때문에 항원 결합성 또는 민감도가 저하되는 문제점이 있다. 또한 이방법에서는 항체를 라택스에 결합시키기 위해 완충액이 소수성을 가져야 하지만 반면 완충액내에서 항체가 안정성을 유지하기 위하여는 완충액이 친수성을 갖는 것이어야 하는 모순점이 있다. 만약 완충액이 소수성인 경우에는 항체가 응집 또는 변성되는 문제점이 있으며, 완충액이 친수성인 경우에는 라텍스가 손실되어 결과적으로 항원 결합성 또는 민감도가 저하되는 문제점이 있다.
최근 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 항체를 pH2.0로 처리한후 라텍스 입자에 결합시킴으로 라텍스 입자의 응집을 감소 시키고 항원 결합성을 높이려는 시도가 있었다. (j.Immunologycal Methods, 152,191-199(1992)) 그러나 항체를 pH2.0으로 처리한 후 다시 중성 pH로 조절한 후 라텍스 입자를 결합시켜야 하므로 중성 pH로 조절하는 동안 단일클론 항체 자체의 응집이 일어나기 때문에 응집된 단일클론 항체는 높은 항원결합성을 유지하지 못하는 점이 문제점으로 지적되고 있다.
이에 본 발명자들은 단일클론 항체를 라텍스에 효과적으로 결합시켜 라텍스의 응집을 최소화할 뿐 아니라 단일클론 항체의 응집도 억제하며 높은 항원 결합성을 유지할 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 단일 클론 항체를 소혈청 알부민의 존재하에 라텍스 입자에 결합시킬 경우 라텍스와 단일클론 항체의 응집이 최소화되어 높은 항원 결합성을 유지할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체를 라텍스에 결합시켜 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론항체가 결합된 라텍스를 제조하는 방법에 있어서, 상기 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론 항체와 라텍스와의 반응을 소혈청 알부민의 존재하에 실시함을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 항-융모성선 자극 호르몬-단일클론항체와소혈청 알부민을 1:5내지 1:40 중량비의 비율로 혼합하고 라텍스를 가하는 것을 특징으로 하는 항-융모 성선자극 호르몬-단일클론항체가 결합된 라텍스의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본발명의 다른 목적 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명으로 부터 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명에 사용되는 단일클론 항체인 anti-HCG-MAb는 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고 , 공지의 단일클론 항체 제조 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면 Zymed사에서 판매하는 Cat.No.03-1900을 구입하여 사용할 수도 있고, 또는 단일클론 항체를 생산하는 세포주인 ATCC No.HB8095를 분양받아 이를 배양하여 목적 단일클론 항체를 생산할 수도 있다. 또는 공지된 방법(Endocrinology 119,1887-1894(1986))에 기재된 단일클론 항체-생산 세포제조 방법에 따라 용이하게 세포주를 얻은 후 이를 예를 들면 무혈청 배지에서 배양한 후 배양액을 원심분리하여 목적 단일클론 항체를 얻을 수 있다.
단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조를 위해 소혈청 알부민을 사용하는 기술은 이미 상술한 대로 간행물에 기재되어 있지만, 본 발명은 상기 선행기술의 방법과 비교하여 소혈청 알부민을 첨가하는 시기에 있어서 상이하며, 이러한 차이에 의해 선행 기술에서 달성할수 없었던 효과를 얻고 있다. 즉, 선행기술에서는 먼저 항체와 라텍스를 결합시킨 후에, 라텍스의 미결합부위를 차단하기 위한 목적으로 소혈청 알부민을 사용하는 반면에 본 발명에서는 라택스의 응집을 최소화하고 민감도를 향상시키기 위하여먼저 단일클론 항체와 소혈청 알부민을 혼합한 후 이어 이 혼합물에 라텍스를 가하여 반응시키는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 본 발명의 방법으로 anti-HCG-MAb를 라텍스 입자에 결합시킬 경우 후술하는 대로 선행기술에 비하여 anti-HCG-MAb가 라텍스에 효과적으로 결합되어 라텍스의 응집이 최소화할 뿐 아니라 단일클론 항체의 응집도 억제하게 되어 높은 항원결합성을 유지할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 방법으로 anti-HCG-MAb를 라텍스 입자에 결합시킬 경우높은 항원 결합성이 유지되는 이유는 아직 확실히 밝혀진 것은 아니지만, 본 발명자들이 추측컨데 소혈청 알부민의 첨가에 의해 anti-HCG-MAb용액의 소수성(hydrophobicity)이 증가하게 되고 이로 인하여 항원 결합부위의 소수성이 상대적으로 감소하기 때문에 anti-HCG-MAb 의 Fc 부위(Fc region)와 소수성 라텍스와의 결합가능성이 높아지기 때문이라 생각된다.
또한 anti-HCG-MAb가 소혈청 알부민에 비해 소수성이 크기 때문에 anti-HCG-MAb는 반응초기에 상대적으로 빠른 속도로 라텍스에 결합되고 소혈청 알부민은 반응시간에 의존적으로 천천히 라텍스에 결합되므로 추후에 차단 과정이 불필요하게 되고 따라서 선행기술의 공정과 비교하여 제조공정이 간단한 장점이 있다. 본발명에 따른 단일클론 항체와 라텍스의 결합에 사용되는 소혈청 알부민의 양은 단일클론 항체 단위중량에 대하여 5 내지 40배이며, 바람직하게는 10 내지 30배이다.
본 발명에서 사용가능한 라택스는 고상면역 크로마토 그라피에 공지되어 사용가능한 라텍스를 제한없이 사용할수 있으며, 예를 들면 화학적 결합을 유도할수 있는 카복실레이티드 폴리스티렌 라텍스 또는 폴리아크릴아미드라텍스, 또는 물리적 결합을 유도할 수 있는 폴리스티렌 라텍스를 들 수 있고, 이중 폴리스티렌 라텍스는 강한 소수성을 유지하여 항체와의 소수성 결합에 유리하기 때문에 바람직하게 사용된다.
본 발명에서 사용가능한 라텍스의 입자크기는 0.05μm-1.2μm의 범위에 있고, 0.05μm-0.5μm가 고상 면역 크로마토 그래피에 이용하기에 바람직하다. 그 이유는 고상면역 크로마토 그래피의 막위에서 라텍스가 이동하는 메카니즘은 모세관 현상이므로, 라텍스의 입자가 상기 범위의 상한치를 넘어서 너무 크면 이동이 불가능하고 반면 입자가 상기 범위의 하한치보다 작으면 항체의 결합이 적게 되어 감도가 떨어지기 때문이다.
본 발명의 방법에 따라 소혈청알부민의 존재하에 단일클론 항체를 라텍스에 결합시키는 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
유색의 라텍스 입자를 완충액 (pH5-8)에 가하여 제조한 용액(1), 기지농도의 anti-HCG-MAb를 완충액 (pH5-8)에 가하여 제조한 용액(2), 소혈청알부민을 완충액에 가하여 제조한 용액(3)을 준비한후, (2)와(3)의 용액을 혼합한후 (1)의 용액을 서서히 가한다. 이렇게 제조한 혼합용액을 약 25℃근처에서 교반하면서 반응시킨후 원심분리하여 얻은 침전물에 인산염 완충액(pH 7.0∼9.0)을 가한 후, 이같은 과정을 3-6회 반복하여 라텍스 입자에 결합되지 않은 단일클론 항체를 충분히 제거하면 단일클론 항체가 소혈청 알부민과 함께 라텍스 입자에 결합된 것을 얻을수 있다. 이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한하는 것은 아니다.
실시예1
문헌에 공지된 방법(Endocrinology 119, 1887-1894(1986))에 따라 β-HCG에 대하여 특이성이 높은 단일클론 항체를 생산하는 세포를 하이브리도마 기법으로 제조하고 이 세포를 무혈청 배지에서 배양하였다. 무혈청배지에서 배양한 배양액을 원심 분리하여 얻고 이 배양액에 암모늄 설페이트 45% 용액을 가하여 항체를 침전시킨 후 원심 분리하여 침전물을 얻고 이 침전물을 인산염에 투석하였다. 완전히 투석된 항체를 단백질 A-세파로스 CL-4B컬럼을 통해 순수정제 한후 0.1M MES 완충액에 투석하였다. 정제된 단일클론 항체의 농도 결정은 브렛포드 방법(M, Bradford, Biochem, 72, 248(1976))으로 실시하여 최종농도가 1mg/㎖ 이 되게 조절 하였다.
비교예1
USP4,003,988호에 기재된 방법에 따라 단일클론 항체가 결합된 라텍스를 제조하기 위하여 다음과 같이 실시 하였다. 실시예1에서 제조한 anti-HCG-MAb를 MES 완충액(2-(N-mophorino)ethane sulfonic acibiffer)에 가하여 단일클론 항체 250㎍/600㎕ MES가 되도록 준비하였다. 한편 직경 0.1μm인 폴리스티렌을 MES에 완충액에 가한 2% 라텍스용액 200㎕를 제조하고, 이 라텍스 용액을 상기 단일클론 항체에 서서히 첨가하여 25oC에서 2.5시간 반응시킨후 22,000ｇ로 원심분리하여 결합되지 않은 단일클론 항체를 제고하고 4% 소혈청 알부민이 포함된 인산염 완충액(pH7.2)으로 침전물을 풀어 주었다. 이상태로 25oC에서 2시간 이상 반응시켜 라텍스에 항체가 결합되지 않는 부위를 소혈청알부민으로 결합시킨 다음 22,000ｇ로 원심 분리하여 인산염 완충액으로 세척하였다. 세척한 라텍스를 최종함량 1%가 되게 인산염 완충액으로 희석하였다.
실시예2
실시예 1에서 준비된 단일클론 항체를 2mg의 소혈청 알부민이 포함된 MES완충액 600㎕에 넣어 항체의 최종 농도가 100μg이 되게 준비하였다. 준비된 소혈청 알부민, 단일클론 항체 용액에 2% 라텍스 용액 200㎕을 서서히 첨가하여 25oC에서 2시간 이상 반응시킨 다음 22,000g으로 원심분리하여 인산염 완충액으로 4회 세척하고 최종입자량 1%가 되게 인산염 완충액으로 희석하였다.
실시예3 : 라텍스에 결합된 항 β-HCG 단일클론 항체의 항원 결합성(민감도)측정
라텍스에 결합된 항 β-HCG 단일클론 항체의 항원결합성은 고상 면역 크로마토 그라피법으로 측정하였다. 고상 면역 크로마토 그라피법을 사용하기 위해 박층고상에 고정시키는 항체는 라텍스에 결합된 β-HCG 항체와 다른 결합부위(에피토우프)를 갖는 항 β-HCG단일클론 항체 또는 항 α-HCG 단일클론 항체를 사용할 수 있는데 임신부 뇨에 존재하는 온전한 HCG를 감지하기 위해서는 항 α-HCG단일클론 항체를 고정시키는것이 유리하다.
항 α-HCG 단일클론 항체를 1mg/㎖의 농도가 되게 준비한 다음 나이트로셀룰로오스 박층고상(1cm×5cm)의 하단 3cm부분에 2μm점적하여 비공유결합으로 고정시킨다음 박층고상의 나머지 부분을 카제인 또는 소혈청알부민으로 결합시켜 항체 결합 라텍스와의 비특이적 결합을 막았다. 이렇게 제조된 박층고상을 충분히 건조하여 준비하여 두었다. 비교예 1과 실시예2에서 제조된 1%항체 결합 라텍스 10μm씩을 취하여 분주하고 WHO기준 HCG를 인산염 완충액에 녹여 25mIU/㎖, 50mIU/㎖, 100mIU/㎖, 200mIU/㎖, 500mIU/㎖, 1000mIU/㎖, 10IU/㎖이 되게 준비 하였다. 이렇게 준비된 HCG용액 10㎕과 항체 결합 라텍스 10㎕를 혼합하여 1분간 반응시킨뒤 10㎕를 취해 미리 준비된 박층고상을 따라 전개시켜 항 α-HCG단일클론 항체 고정부위에서 색을띤 라텍스가 출현하는 것을 관찰하였다.
다음의 표1에는 비교예1과 실시예2에서 제조된 항 β-HCG항체 결합라텍스의 항원결합성(민감도)에 대한 실험결과를 나타내었다.
상기표 1의 실험 결과에서 알수 있듯이, 단일클론 항체를 먼저 소혈청 알부민과 혼합한 후 이 혼합물에 라텍스를 가하여 반응시키므로써 제조한 본 발명의 단일클론항체결합 라텍스는 단일클론항체를 라텍스에 결합시킨후 라텍스의 미결합 부위를 소혈청 알부민으로 차단하는 방법에 의해 제조된 종래의 단일클론 항체 결합라텍스에 비하여 항원 결합성이 매우 우수하다.

Claims (4)

  1. 항-융모성선자극호르몬-단일클론 항체(anti-Human Chrionic Gonadotropin -Monoclonal antibody) 와 라텍스를 접촉시켜 항-융모성선자극 호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스를 제조하는 방법에 있어서, 항-융모성선자극호르몬-단일클론 항체와 소혈청 알부민을 혼합하고, 이 혼합물에 라텍스를 가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 항-융모성선자극호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 소혈청 알부민과 항-융모성선자극 호르몬-단일클론 항체의 비율은 1:5-40중량비임을 특징으로 하는 항-융모성선자극 호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 라텍스가 폴리스티렌인것을 특징으로 하는 항-융모성선자극호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법.
  4. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 라텍스의 입자크기가 0.05-0.5μm인것을 특징으로 하는 항-융모성선자극 호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조 방법.
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