KR100257507B1 - 단일클론항체의 등전점에 따른 항체 결합 라텍스 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 항-황체형성호르몬-단일클론 항체(anti-Luteinizing Hormone-Monoclonal antibody, 이하 “anti-LH-MAb”라 한다)가 결합된 라텍스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 anti-LH-MAb의 등전점 범위내의 pH를 갖는 완충용액상에서 anti-LH-MAb 및 소혈청알부민을 혼합한 다음, 이 혼합물에 라텍스를 가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 anti-LH-MAb가 결합된 라텍스의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 항-황체형성호르몬-단일클론 항체(anti-Luteinizlng Hormone-Monoclonal antibody, 이하 “anti-LH-MAb″라 한다)가 결합된 라텍스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 anti-LH-MAb의 등전점 범위내의 pH를 갖는 완충용액상에서 anti-LH-MAb 및 소혈청알부민을 혼합한 다음, 이 혼합물에 라텍스를 가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 anti-LH-MAb가 결합된 라텍스의 제조방법에 관한 것이다.
anti-LH-MAb은 배란에 관계하는 황체형성 호르몬 (Luteinizing Hormone, 이하 “LH”라 한다)에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 말한다.
배란은 몇가지 호르몬의 관여에 의해서 일어나게 된다. 즉, 난포자극 호르몬(follicle Stimulating Hormone)에 의하여 난포가 성장함과 동시에 에스트로젠(Estrogen)이 분비되고 에스트로젠과 난포자극 호르몬에 의해 보통 농도를 유지하던 LH의 농도가 급증하여 (LH surge) 난포의 급성장을 유도하게 되며, LH surge후 12∼36시간후에 난포가 파괴되어 난자가 배출되게 된다. 따라서, 배란 12∼36시간전에 급증하는 LH를 감지함으로써 배란을 진단할 수 있다.
LH는 분자량 30,000의 당단백 호르몬으로 92개의 아미노산을 갖는 α-서브유니트와 121개의 아미노산으로 구성된 β-서브유니트로 구성되어 있으며, 임신중 영양막 세포에 의해 생성되는 당단백 호르몬인 융모성선자극 호르몬 (Human Choronic Gonadotropin : HCG)와 매우 유사한 구조를 갖고 있다.
배란진단은 주로 항원 항체 반응을 이용한 면역학적 방법이 이용되며, 최근들어, 고상 면역크로마토그래피 법이 개발되어 가정 용으로 간편하게 사용할 수 있게 되었다. 고상 면역크로마토그래피 법이란 항원에 대한 단일클론항체 하나를 박층고상에 공유 또는 비공유 결합으로 고정시키고 항원 인식부위가 다른 또다른 하나의 단일클론항체를 유색의 입자에 결합시킨 다음 시료를 혼합하여 박층고상에 전개시키면 시료에 포함된 항원을 매개로 박층고상에 고정된 항체와 유색의 입자에 결합된 항체가 반응하여 박층고상에 색이 출현하계게으로써 색의 출현여부로 항원을 감지 하는 진단법이다.
이러한 고상 면역크로마토그라피법을 이용하여 낮은 농도의 LH를 감지하기 위하여는 유색의 라텍스 입자에 anti-LH-MAb를 결합시키는 방법이 중요한 요인으로 작용한다.
그러나, 유색의 라텍스 입자와 anti-LH-MAb를 결합시키는 방법을 개시하고 있는 종래기술은 현재까지 공지되어 있지 아니하며, 임신진단에 사용되는 항-융모성선자극호르몬-모노클로날 항체 (anti-human Choronic gonadotropin-monoclonal antibody)를 라텍스에 결합시키는 방법이 일부 공지되어 있을 따름이다 (미국특허 제4,003,988호). 본 발명자들도 또한 항-음모성선자극호르몬-모노클로날 항체를 유색의 라텍스입자에 결합시키는 개선된 방법을 개발하여 특허출원을 완료한 바 있다(대한민국 특허공개 제96-10019호).
따라서, 본 발명자들은 융모성선자극호르몬이 LH와 구조적으로 유사하다는 사실에 착안하여 본 발명자들이 대한민국 특허공개 제96-10019호에서 개시한 제조 방법을 적용하여 유색의 라텍스 입자와 anti-LH-HAb와의 결합을 시도하였으나, 항-융모성선자극호르몬-모노클로날 항체의 경우와 달리 anti-L7-MAb의 경우는 높은 항원결합성을 유지하지 못하는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 anti-LH-MAb를 라텍스에 효과적으로 결합시켜 라텍스의 응집을 최소화할 뿐 아니라 높은 항원결합성을 유지할 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, anti-LH-MAb의 등전점 범위내의 pH를 갖는 완충용액상에서 anti-LH-MAb 및 소혈청알부민을 혼합한 다음 라텍스를 가하여 반응시켰을 경우, 라텍스와 단일클론항체의 응집이 최소화되어 높은 항원결합성을 유지할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 anti-LH-MAb와 라텍스를 접촉시켜 anti-LH-MAb가 결합된 라텍스를 제조하는 방법에 있어서, anti-LH-MAb의 등전점 범위내의 PH를 갖는 완충용액상에서 anti-LH-MAb 및 소혈청알부민을 혼합한 다음, 이 혼합물에 라텍스를 가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 항-황체형성호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 제조방법에서 사용되는 anti-LH-MAb 는 상업적으로 시판되는 것(MAb6210, Chemicon 사)을 사용하거나 anti-LH-MAb를 생산하는 세포주를 배양하여 얻어진 것을 사용할 수 있다. 또한 공지의 하이브리도마 제조방법(Endocrinology 119, 1887-1894 (1986))에 따라 LH에 대한 단일클론항체를 생산하는 세포주를 얻고 이를 무혈청 배지에서 배양한 후 배양액을 원심분리하여 목적하는 단일클론항체를 정제하여 사용할 수 있다.
한편, LH는 융모성선자극호르몬과 구조적으로 유사하기 때문에 이들의 교차반응성을 없애기 위하여는 박층고상을 따라 이동하는 단일클론항체는 융모성선자극호르몬과 비교적 특이성을 유지하는 LH의 베타서브유니트에 대한 단일클론항체를 사용하는 것이 바람직하며, 따라서 라텍스에 결합되는 anti-LH-MAb는 베타-서브유니트에 대한 단일클론항체를 사용하는 것이 바람직하고, 박층고상에 고정시키는 단일클론항체는 알파-서브유니트에 대한 단일클론항체가 바람직하다.
본 발명에 따른 제조방법에서도 본 발명자들이 대한민국 특허공개 제96-10019호에서 개시한 바와 같이 소혈청알부민 존재하에 anti-LH-MAb와 라텍스를 결합하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 사용가능한 라텍스는 고상면역크로마토그래피 분야에서 공지되어 사용가능한 라텍스를 사용할 수 있으며, 예를들면, 화학적 결합을 유도할 수 있는 카복실레이트 폴리스티렌 라텍스 또는 폴리아크릴아미드 라텍스, 또는 물리적 결합을 유도할 수 있는 폴리스티렌 라텍스를 사용할 수 있으며, 이중 폴리스티렌 라텍스가 강한 소수성을 유지하여 항체와의 소수성 결합에 유리하기 때문에 더욱 바람직하며, 입자크기는 0.05㎛∼5㎛가 바람직하다.
평상시 LH의 뇨중농도는 10∼40mIU/㎖이나 LH 가 급증할 경우(LH Surge) 뇨중농도는 50∼150mIU/㎖로 분비되기 때문에 뇨중 LH농도가 40mIU/㎖ 일 경우에는 항원반응성이 없어야 하며, 뇨중 LH농도가 최소한 50mIU/㎖에서 항원반응성을 지녀야 한다. 따라서, 베타-서브유니트에 대한 anti-LH-MAb와 라텍스를 효과적으로 결합시켜 적절한 항원반응성을 유지시키기 위하여는 적절한 pH 즉, 등전점 범위내의 pH를 갖는 완충용액의 사용이 필수적이다. 즉, 시험 예에서 확인할 수 있는 바와 같이 등전점 5.5∼6.0을 갖는 anti-LH-MAb의 완충용액의 pH는 pH5.5∼pH6.7이 바람직하며, 등전점이 6.0∼6.5인 시판되는 anti-LH-MAb의 완충용액의 pH는 PH6.0∼pH6.5, 등전점이 6.5∼7.0인 anti-LH-MAb의 완충용액의 pH는 pH6.5∼pH7.0이 바람직하다.
anti-LH-MAb의 등전점의 pH를 갖는 완층용액상에서 소혈청알부민 존재하에 항-황체형성호르몬-단일클론 항체와 라텍스를 결합시킬 때, 각 농노비에 따라 라텍스응집이 형성되거나 항원반응성이 저하될 수 있기 때문에, anti-LH-MAb ; 소혈청알부민 : 라텍스 의 비율은 1 : 10-80 : 40-120중량비가 바람직하다.
본 발명의 제조방법에 따른 단일클론항체를 라텍스에 결합시키는 방법을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
anti-LH-MAb의 등전점을 측정하여 완충용액의 pH를 얻은 다음, 유색의 라텍스 입자를 등전점의 pH를 갖는 MES 완충용액 (2-(M-Morpholino) ethanesulfonic acid buffer)에 가하여 제조한 용액(1), 등전점의 pH를 갖는 MES 완충용액에 anti-LH-MAb를 가하여 제조한 용액(2), 등전점의 pH를 갖는 MES 완충용액에 소혈청알부민을 가하여 제조한 용액(3)을 준비한 후, (2)와 (3)의 용액을 혼합한 후 (1)의 용액을 서서히 가한다. 상온에서 2시간 이상 교반하면서 반응시킨 후 고속원심분리하여 침전물을 인산염 완충액으로 세척하여 단일클로항체가 결합된 라텍스를 효과적으로 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이것이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
[anti-LH-MAb 제조 및 등전점 측정]
공지의 방법 (Endocrinology 119,1889-1894 (1986))에 따라 베타서브유니트에 대한 anti-LH-MAb를 생산하는 세포주 2개((LH-MAb 1 , LH-MAbll)를 하이브리도마 기법으로 제조하고 이 세포들을 각각 무혈청배지에서 배양하였다.
무혈청 배지에서 배양한 배양액을 원심분리하여 얻고 이 배양액을 단백질 A-세파로스 CL-4B 칼럼을 통해 단일클론항체만을 순수 정제한 후 인산염 완충액으로 투석하였다.
이렇게 하여 얻은 각각의 단일클론항체 (anti-LH-MAb I, anti-LH-MAb II)를 아이소일렉트릭 포커싱(Isoelectric focusing)으로 등전점을 측정하였다. 그 결과, anti-LH-MAb I의 등전점은 5.5∼6.0이었으며, anti-LH-MAbll의 등전점은 6.5∼7.0 이었다.
또한 시판되고 있는 anti-LH-MAb(MAb6210, Chemicon사)에 대하여도 상기와 같이 등전점을 측정하였으며, 그 등전점은 6.0∼6.5 이었다.
[실시예 2]
실시예 1에서 제조한 단일를론항체 anti-LH-MAb 1을 pH별로 준비된 MES 완충액 (pH5.0, pH5.5, pH6.0, pH6.5)으로 희석하여, 각각 1000㎍/㎖이 되도록 하였다. 같은 방법으로 소혈청알부민을 pH 별로 준비된 MES 완충액으로 용해시켜 40㎍/㎖이 되도록 준비한다. 유색의 폴리스틸렌 라텍스 입자 (직경 0.05㎛∼0.5㎛)를 50mM MES (pH5.0, pH5.5, pH6.0, pH6.5) 완충용액을 각각 사용하여 원심분리하여 세척한 후 최종 입자함량이 2% 되도록 하였다. 이렇게 준비된 라텍스 용액 300㎛에 대하여 소혈청 알부민 1007㎛와 단일클론항체 (anti-LH-MAb I)100㎕를 혼합하여, 25℃∼30℃에서 2시간동안 반응시킨 다음 22,000g으로 원심분리하여 인산염 완충액으로 3회 세척하고 최종 입자량 1%가 되도록 동일 완충액으로 희석하였다.
[실시예 3]
pH별로 준비된 MES 완충액 (pH6.0, pH6.5, pH 7.7, pH7.5)상에서 실시예 1에서 제조한 anti-LH-7Ab II, 라텍스 및 소혈청 알부민을 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 반응시켜 anti-LH-MAb II가 결합된 라텍스를 제조하였다.
[실시예 4]
Chemicon사에서 구입한 anti-LH-MAb를 pH별로 준비한 MES 완충액 (pH5.5, pH6.0, pH6.5, pH7.0)으로 투석하여 1㎎/1㎖이 되도록 준비한 다음 실시예 2에서와 동일한 방법으로 반응시켜 anti-LH-MAb가 결합된 라텍스를 제조하였다.
[시험예 1]
[라텍스에 결합된 anti-LH-MAb의 항원 결합성 (민감도) 측정]
라텍스에 결합된 황체형성 호르몬에 대한 단일클론항체의 항원 결합성(민감도)는 고상면역크로마토그라피법으로 측정하였다. 고상면역크로마토그라피법을 사용하기 위해 박층고상에 고정시키는 항체는 라텍스에 결합된 단일클론항체와는 다른결합부위(에피토우프)를 갖는 항 α-LH 단일클론항체를 사용하였다. 항 α-LH 단일 콜론항체를 0.5∼2㎎/㎖의 농도가 되게 준비한 다음 나이트로셀를로우스 박층고상(1cmx5cm)의 하단 2cm부분에 27㎕를 점적하여 비공유결합으로 고정시킨 다음 박층고상의 나머지 부분을 카제인 또는 소혈청 알부민으로 결합시켜 항체 결합 라텍스와의 비특이적 결합을 막았다.
이렇게 제조된 박층고상을 건조하여 준비하고 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4에서 pH별로 반응시켜 준비한 1% 항체 결합 라텍스를 10㎕를 취하여 분주한 다음 WHO 기준 1st IRP-68/40 황체형성 호르몬을 인산염 완충액으로 녹여 50mIU/㎖, 100mIU/㎖, 200mIU/㎖, 570mIU/㎖이 되도록 준비하였다.
이렇게 준비된 황체형성호르몬 용액 10㎛와 분주된 항체결합라텍스 10㎕를 혼합하여 7분간 반응시킨 뒤 10㎛를 취해 미리 준비된 박층고상을따라 전개시켜 항 α-LH 단일를론항체 고정부위에서 색을 띤 라텍스가 출현하는 것을 관찰하였다.
다음의 표 1은 실시예 2, 3, 4에서 pH별로 제조된 anti-LH-MAb I, anti-LH-MAb II 및 시판되는 anti-LH-MAb (MAb6210, Chemicon사)의 항원 결합성(민감도)에 대한 실험결과이다.
[표 1]
상기 표 1의 실험결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 등전점이 5.5∼6.0의 anti-LH-MAb I은 반응 완충액의 pH가 5.5∼0.7일 때 기타 pH 조건에서보다 항원결합성(민감도)이 우수하였으며 등전점이 6.5∼7.0의 anti-LH-MAbll는 반응 완충액의 pH가 6.5∼7.7일 때 기타의 PH 조건에서보다 항원결합성(민감도)이 우수하였다. 또한 등전점이 6.0∼6.5인 시판 단일클론항체는 반응 완충액의 pH가 6.0∼6.5일 때 항원결 합성이 우수하였다. 이것은 단일클론항체의 등전점에 따라 라텍스에 결합시키는 반응액의 pH에 영향을 받으며 반응액의 pH는 항체의 등전점 근처에서 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
Claims (3)
- 항-황체형성호르몬-단일클론 항체(anti-Luteinizlng Hormone-Monoclonal antibody)와 라텍스를 접촉시켜 항-황체형성호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스를 제조하는 방법에 있어서, 항-황체형성호르몬-단일클론 항체의 등전점 범위내의 pH를 갖는 완충용액상에서 항-황체형성호르몬-단일클론 항체 및 소혈청알부민을 혼합한 다음, 이 혼합물에 라텍스를 가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 항-황체형성호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 항-황체형성호르몬-단일클론 항체, 소혈청알부민, 및 라텍스의 비율이 1 : 10-80 : 40-120 중량비임을 특징으로 하는 항-황체형성호르몬-단일클론항체가 결합된 라텍스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 라텍스가 0.05㎛∼57㎛의 입자크기를 갖는 폴리스티렌임을 특징으로 하는 항-황체형성호르몬-단일클론 항체가 결합된 라텍스의 제조방법.
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