JPH08145998A - インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キット - Google Patents
インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 生体試料中のインスリン様成長因子を免疫学
的に測定する方法であって、免疫学的測定に先立ち、生
体試料を酸溶液で処理することによりインスリン様成長
因子結合蛋白質からインスリン様成長因子を遊離させ、
次いで当該生体試料を再結合阻害剤を含有する中和緩衝
液で中和することを特徴とするインスリン様成長因子の
免疫学的測定方法。 【効果】 本発明によれば、煩雑な操作や多くの器具を
必要とせずに大量の生体試料の処理が可能であり、より
簡便かつ経済的に高い精度でインスリン様成長因子の測
定を行うことができる。
的に測定する方法であって、免疫学的測定に先立ち、生
体試料を酸溶液で処理することによりインスリン様成長
因子結合蛋白質からインスリン様成長因子を遊離させ、
次いで当該生体試料を再結合阻害剤を含有する中和緩衝
液で中和することを特徴とするインスリン様成長因子の
免疫学的測定方法。 【効果】 本発明によれば、煩雑な操作や多くの器具を
必要とせずに大量の生体試料の処理が可能であり、より
簡便かつ経済的に高い精度でインスリン様成長因子の測
定を行うことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体試料中のインスリ
ン様成長因子の測定方法に関し、さらに詳細には、成長
不全、成長ホルモン異常等の成長不全疾患の医学的診断
において有用な情報をもたらす総インスリン様成長因子
Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）量および総インスリン様成長因子ＩＩ
（ＩＧＦ−ＩＩ）量の免疫学的測定方法およびそのため
のキットに関する。
ン様成長因子の測定方法に関し、さらに詳細には、成長
不全、成長ホルモン異常等の成長不全疾患の医学的診断
において有用な情報をもたらす総インスリン様成長因子
Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）量および総インスリン様成長因子ＩＩ
（ＩＧＦ−ＩＩ）量の免疫学的測定方法およびそのため
のキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】成長不全、成長ホルモン異常等の成長不
全疾患の医学的診断において従来用いられてきた成長ホ
ルモン量の測定は、その血中濃度の変動が大きいため、
診断に利用するのは難しい面が多かった。 一方、骨の
成長などにおいて成長ホルモンと共同で作用し、かつそ
の血中濃度の変動が緩和なＩＧＦ−Ｉは、成長不全疾患
の診断に高い臨床的有用性を持つ事が知られており、成
長ホルモン量に代えてこのＩＧＦ−Ｉを測定することが
行われている。また、ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−Ｉと同
様に血液や骨組織中に広く存在している事が知られ、そ
の生体内における存在意義の解明が強く待ち望まれてお
り、そのために該因子の正確な測定が求められていた。
全疾患の医学的診断において従来用いられてきた成長ホ
ルモン量の測定は、その血中濃度の変動が大きいため、
診断に利用するのは難しい面が多かった。 一方、骨の
成長などにおいて成長ホルモンと共同で作用し、かつそ
の血中濃度の変動が緩和なＩＧＦ−Ｉは、成長不全疾患
の診断に高い臨床的有用性を持つ事が知られており、成
長ホルモン量に代えてこのＩＧＦ−Ｉを測定することが
行われている。また、ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−Ｉと同
様に血液や骨組織中に広く存在している事が知られ、そ
の生体内における存在意義の解明が強く待ち望まれてお
り、そのために該因子の正確な測定が求められていた。
【０００３】従来のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）の
測定法としては、次の方法が知られている。まず、ＩＧ
Ｆの標的細胞に対する生理的結合活性の発現を直接測定
する、放射受容体測定法( R N. Marshall, Journal of
Clinical Endocrinology andMetabolism. Vol.39. pp.2
38-292.; W H.Daughaday,Journal of Clinical Endocri
nology and Metabolism. Vol.53. pp.282-288.; R C. B
axter, Journal ofClinical Endocrinology. Vol.24. p
p.267-278.)が知られている。しかし、測定に用いる受
容体の均一性を得る事の困難さや技術的に複雑で反応に
長時間かかる事から、しばしば判定に難しい結果を生じ
た。このため、この放射受容体測定法は、臨床検査で日
常的に用いるための実用性に欠けるものとされていた。
測定法としては、次の方法が知られている。まず、ＩＧ
Ｆの標的細胞に対する生理的結合活性の発現を直接測定
する、放射受容体測定法( R N. Marshall, Journal of
Clinical Endocrinology andMetabolism. Vol.39. pp.2
38-292.; W H.Daughaday,Journal of Clinical Endocri
nology and Metabolism. Vol.53. pp.282-288.; R C. B
axter, Journal ofClinical Endocrinology. Vol.24. p
p.267-278.)が知られている。しかし、測定に用いる受
容体の均一性を得る事の困難さや技術的に複雑で反応に
長時間かかる事から、しばしば判定に難しい結果を生じ
た。このため、この放射受容体測定法は、臨床検査で日
常的に用いるための実用性に欠けるものとされていた。
【０００４】また、競合的免疫測定法( Furlanetto, Jo
urnal of Clinical Investigation.Vol.60. pp.648-65
7.)も知られており、この方法は、インスリン様成長因
子（ＩＧＦ）に特異的で高感度なポリクローナル性抗血
清を作製し、測定対象であるＩＧＦと125Ｉ標識ＩＧＦ
およびポリクローナル性抗血清を適当な濃度で反応させ
て、125Ｉ標識ＩＧＦとＩＧＦとにポリクローナル性抗
血清の結合部位を競合させる測定法である。しかしこの
方法は多くの段階と長い反応時間を要する上に、Ｂ／Ｆ
分離方法の煩雑さを伴うため、大量検体を迅速処理する
臨床検査における普及を難しくしていた。
urnal of Clinical Investigation.Vol.60. pp.648-65
7.)も知られており、この方法は、インスリン様成長因
子（ＩＧＦ）に特異的で高感度なポリクローナル性抗血
清を作製し、測定対象であるＩＧＦと125Ｉ標識ＩＧＦ
およびポリクローナル性抗血清を適当な濃度で反応させ
て、125Ｉ標識ＩＧＦとＩＧＦとにポリクローナル性抗
血清の結合部位を競合させる測定法である。しかしこの
方法は多くの段階と長い反応時間を要する上に、Ｂ／Ｆ
分離方法の煩雑さを伴うため、大量検体を迅速処理する
臨床検査における普及を難しくしていた。
【０００５】一方、近年免疫感作させた抗体産生細胞と
ミエローマ細胞を生体外で融合させてハイブリドーマを
作成する事により単クローン性抗体を得る技術が開発さ
れてきた( Nature Vol.256. pp.495-497. 1975)。 そ
して、この技術を応用する事によりＩＧＦに対し特異的
でかつ単一な抗体蛋白を大量に得る事が可能になり、こ
の単クローン性抗体を用いて特異性が高くかつ迅速な反
応の放射免疫測定法の開発が研究された（特開昭64-356
1号）。
ミエローマ細胞を生体外で融合させてハイブリドーマを
作成する事により単クローン性抗体を得る技術が開発さ
れてきた( Nature Vol.256. pp.495-497. 1975)。 そ
して、この技術を応用する事によりＩＧＦに対し特異的
でかつ単一な抗体蛋白を大量に得る事が可能になり、こ
の単クローン性抗体を用いて特異性が高くかつ迅速な反
応の放射免疫測定法の開発が研究された（特開昭64-356
1号）。
【０００６】ところで、血清中には、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧ
Ｆ−ＩＩの保護や制御に深く関与するインスリン様成長
因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ；以下、単に「結合蛋白
質」ということもある）が存在し、ＩＧＦと複合体を形
成している事が知られている。これらの結合蛋白質は、
正確な総ＩＧＦ量を放射免疫測定する際に大きな障害と
なるため、測定に先立ち、前処理としてＩＧＦと結合蛋
白質を分離する必要がある。 この前処理方法として
は、酸性下ゲルクロマトグラフィー、固相抽出（Ｓｅｐ
-Ｐａｋ抽出）、酸エタノール抽出などの方法が従来用
いられてきた。
Ｆ−ＩＩの保護や制御に深く関与するインスリン様成長
因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ；以下、単に「結合蛋白
質」ということもある）が存在し、ＩＧＦと複合体を形
成している事が知られている。これらの結合蛋白質は、
正確な総ＩＧＦ量を放射免疫測定する際に大きな障害と
なるため、測定に先立ち、前処理としてＩＧＦと結合蛋
白質を分離する必要がある。 この前処理方法として
は、酸性下ゲルクロマトグラフィー、固相抽出（Ｓｅｐ
-Ｐａｋ抽出）、酸エタノール抽出などの方法が従来用
いられてきた。
【０００７】このうち、酸性下ゲルクロマトグラフィ−
法( J.Zapf, Journal of ClinicalInvestigation. Vol.
68. pp.1321-1330. 1981.; R L, Hintz, Journal of Cl
inical Endocrinology and Metabolism. 1977. Vol.45.
pp.988-995.; DR.Powell,Journal of Clinical Endocr
inology and Metabolism. 1986. Vol.63. pp.1186-119
2.)は、分子量の違いにより結合蛋白質とＩＧＦをカラ
ムを用いて解離させ、その分離溶出液を中和測定する方
法であるが、大量検体処理が難しくカラムを設置する設
備が必要で、日常の臨床検査に向かない方法である。
法( J.Zapf, Journal of ClinicalInvestigation. Vol.
68. pp.1321-1330. 1981.; R L, Hintz, Journal of Cl
inical Endocrinology and Metabolism. 1977. Vol.45.
pp.988-995.; DR.Powell,Journal of Clinical Endocr
inology and Metabolism. 1986. Vol.63. pp.1186-119
2.)は、分子量の違いにより結合蛋白質とＩＧＦをカラ
ムを用いて解離させ、その分離溶出液を中和測定する方
法であるが、大量検体処理が難しくカラムを設置する設
備が必要で、日常の臨床検査に向かない方法である。
【０００８】また、固相抽出（Ｓｅｐ-Ｐａｋ）法(W H.
Daughaday, Journal of LaboratoryClinical Medicine.
1987. Vol. 109. pp.355-363.)は、市販されているＩ
ＧＦ吸着性のあるゲルを詰めた小型カラム（Ｓｅｐ-Ｐ
ａｋ）を用いてＩＧＦを分離定量する方法であるが、や
はり煩雑な操作が残る上、コストが高く検体の多数処理
には無理がある。
Daughaday, Journal of LaboratoryClinical Medicine.
1987. Vol. 109. pp.355-363.)は、市販されているＩ
ＧＦ吸着性のあるゲルを詰めた小型カラム（Ｓｅｐ-Ｐ
ａｋ）を用いてＩＧＦを分離定量する方法であるが、や
はり煩雑な操作が残る上、コストが高く検体の多数処理
には無理がある。
【０００９】また、前処理方法のうち、最もよく使用さ
れている方法としては、酸エタノール抽出法( W H. Dau
ghaday, Journal of Clinical Endocrinology and Meta
bolism. 1980. Vol.51. pp.781-788.)を挙げることがで
きる。 この方法は、初めに血清を塩酸−エタノール混
合液と混合し、酸によりＩＧＦと結合蛋白を分離せしめ
た後、一定濃度のエタノールにより結合蛋白質を沈殿さ
せ、次に遠心分離操作で上清を分離採取し、得られた上
清のエタノール濃度を下げ、強酸を緩衝するために中和
緩衝液で上清中の酸を完全に中和希釈し、その希釈液を
試料として免疫学的に測定するものである。
れている方法としては、酸エタノール抽出法( W H. Dau
ghaday, Journal of Clinical Endocrinology and Meta
bolism. 1980. Vol.51. pp.781-788.)を挙げることがで
きる。 この方法は、初めに血清を塩酸−エタノール混
合液と混合し、酸によりＩＧＦと結合蛋白を分離せしめ
た後、一定濃度のエタノールにより結合蛋白質を沈殿さ
せ、次に遠心分離操作で上清を分離採取し、得られた上
清のエタノール濃度を下げ、強酸を緩衝するために中和
緩衝液で上清中の酸を完全に中和希釈し、その希釈液を
試料として免疫学的に測定するものである。
【００１０】この酸エタノール法における結合蛋白質と
ＩＧＦの解離では、酸ｐＨを引き下げる事による効果が
大きい事が一つの特徴であり、また、この方法における
エタノールは、酸解離後のＩＧＦのみを溶解抽出して水
溶液中に残存する結合蛋白質を分離沈殿せしめ、ＩＧＦ
と結合蛋白質の複合体の再結合を妨げる作用を持つと考
えられる。
ＩＧＦの解離では、酸ｐＨを引き下げる事による効果が
大きい事が一つの特徴であり、また、この方法における
エタノールは、酸解離後のＩＧＦのみを溶解抽出して水
溶液中に残存する結合蛋白質を分離沈殿せしめ、ＩＧＦ
と結合蛋白質の複合体の再結合を妨げる作用を持つと考
えられる。
【００１１】酸エタノール抽出法は、現在最も普及して
いる方法でもあり、特にこの方法によるＩＧＦ-Ｉの測
定値は公的機関による成長不良疾患の診断および治療に
おける重要な判断情報の一つとされている。
いる方法でもあり、特にこの方法によるＩＧＦ-Ｉの測
定値は公的機関による成長不良疾患の診断および治療に
おける重要な判断情報の一つとされている。
【００１２】しかし、酸エタノール抽出法は、遠心分離
を伴う煩雑な処理操作がある上に、その上清の中和操作
が必要で、煩雑な手間と各操作に各々別の試験管が必要
なため、検体の大量処理に向かないという欠点があっ
た。 また、この方法におけるもう一つの別の欠点とし
ては、遠心分離後の上清の酸エタノール液をピペットで
吸い上げる操作において、エタノールと水溶液との液性
の違いに伴う液量の誤差が測定値に少なからず影響を与
え、かつ、この上清を採る操作に大きな時間を要する事
が挙げられる。さらに、抽出に用いる有機溶媒エタノー
ルの免疫測定法への影響や検体により結合蛋白質が抽出
液に残存する事による測定値減少などの影響が報告さ
れ、問題とされている。
を伴う煩雑な処理操作がある上に、その上清の中和操作
が必要で、煩雑な手間と各操作に各々別の試験管が必要
なため、検体の大量処理に向かないという欠点があっ
た。 また、この方法におけるもう一つの別の欠点とし
ては、遠心分離後の上清の酸エタノール液をピペットで
吸い上げる操作において、エタノールと水溶液との液性
の違いに伴う液量の誤差が測定値に少なからず影響を与
え、かつ、この上清を採る操作に大きな時間を要する事
が挙げられる。さらに、抽出に用いる有機溶媒エタノー
ルの免疫測定法への影響や検体により結合蛋白質が抽出
液に残存する事による測定値減少などの影響が報告さ
れ、問題とされている。
【００１３】また、ブルムら(W F. Blum, Acta Endocri
nologica. 1988. Vol.118. pp.374-380.; W F.Blum, 19
94. Third International Symposium on Insulin-like
Growth Factors. pp.11-19.)は、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−
ＩＩが共に結合蛋白上の同様の部位に結合する事に着目
して、検体の酸処理（ｐＨ３.１以下）の後、中和する
緩衝液中に結合蛋白質との再結合を防ぐ目的でＩＧＦ−
ＩＩアッセイ系には過剰のＩＧＦ−Ｉ（１００倍以上）
を、ＩＧＦ−Ｉアッセイ系には過剰のＩＧＦ−ＩＩを添
加することで、血清中のＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩを抽
出操作無しで同中和緩衝液中で免疫測定できる事を報告
している。すなわち、この方法は、いわゆる類似ＩＧＦ
を添加して結合蛋白質の結合を阻害する方法である。
nologica. 1988. Vol.118. pp.374-380.; W F.Blum, 19
94. Third International Symposium on Insulin-like
Growth Factors. pp.11-19.)は、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−
ＩＩが共に結合蛋白上の同様の部位に結合する事に着目
して、検体の酸処理（ｐＨ３.１以下）の後、中和する
緩衝液中に結合蛋白質との再結合を防ぐ目的でＩＧＦ−
ＩＩアッセイ系には過剰のＩＧＦ−Ｉ（１００倍以上）
を、ＩＧＦ−Ｉアッセイ系には過剰のＩＧＦ−ＩＩを添
加することで、血清中のＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩを抽
出操作無しで同中和緩衝液中で免疫測定できる事を報告
している。すなわち、この方法は、いわゆる類似ＩＧＦ
を添加して結合蛋白質の結合を阻害する方法である。
【００１４】しかし、このアッセイ方法では、使用する
抗体として、ＩＧＦ−Ｉ測定ではＩＧＦ−ＩＩに、ＩＧ
Ｆ−ＩＩ測定ではＩＧＦ−Ｉに交差反応性の無い特異性
の高い抗体を選択する必要があり、サンドイッチ法にお
ける一次抗体（捕捉抗体）にも類似ＩＧＦに交差しない
特異性の高い抗体が不可欠である事など、抗体の選択に
著しく制約が生じる結果になる。 また、中和緩衝液に
添加するＩＧＦ−Ｉ、−ＩＩを大量に準備する必要があ
り、商業的にキット化する際にはコストを著しく高く引
き上げる事に成りかねず、安価な普及性の高い方法とは
なり得ない。
抗体として、ＩＧＦ−Ｉ測定ではＩＧＦ−ＩＩに、ＩＧ
Ｆ−ＩＩ測定ではＩＧＦ−Ｉに交差反応性の無い特異性
の高い抗体を選択する必要があり、サンドイッチ法にお
ける一次抗体（捕捉抗体）にも類似ＩＧＦに交差しない
特異性の高い抗体が不可欠である事など、抗体の選択に
著しく制約が生じる結果になる。 また、中和緩衝液に
添加するＩＧＦ−Ｉ、−ＩＩを大量に準備する必要があ
り、商業的にキット化する際にはコストを著しく高く引
き上げる事に成りかねず、安価な普及性の高い方法とは
なり得ない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】従って、煩雑な操作や
多くの器具を必要とせずに大量の検体処理が可能で、よ
り簡便かつ経済的なインスリン様成長因子の測定方法の
開発が望まれていた。
多くの器具を必要とせずに大量の検体処理が可能で、よ
り簡便かつ経済的なインスリン様成長因子の測定方法の
開発が望まれていた。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記実情に
鑑み、インスリン様成長因子の測定について鋭意研究を
行った結果、生体試料を酸溶液で処理し、インスリン様
結合蛋白質からインスリン様成長因子を遊離させた後
に、特定の物質を共存する中和緩衝液を用いることによ
りインスリン様結合蛋白質との再結合が阻害でき、しか
も得られた試料はそのまま免疫測定に利用可能なことを
見出し本発明を完成した。
鑑み、インスリン様成長因子の測定について鋭意研究を
行った結果、生体試料を酸溶液で処理し、インスリン様
結合蛋白質からインスリン様成長因子を遊離させた後
に、特定の物質を共存する中和緩衝液を用いることによ
りインスリン様結合蛋白質との再結合が阻害でき、しか
も得られた試料はそのまま免疫測定に利用可能なことを
見出し本発明を完成した。
【００１７】すなわち、本発明の目的は、生体試料中の
インスリン様成長因子を免疫学的に測定する方法であっ
て、免疫学的測定に先立ち、生体試料を酸溶液で処理す
ることによりインスリン様成長因子結合蛋白質からイン
スリン様成長因子を遊離させ、次いで当該生体試料を再
結合阻害剤を含有する中和緩衝液で中和することを特徴
とするインスリン様成長因子の免疫学的測定方法を提供
することである。
インスリン様成長因子を免疫学的に測定する方法であっ
て、免疫学的測定に先立ち、生体試料を酸溶液で処理す
ることによりインスリン様成長因子結合蛋白質からイン
スリン様成長因子を遊離させ、次いで当該生体試料を再
結合阻害剤を含有する中和緩衝液で中和することを特徴
とするインスリン様成長因子の免疫学的測定方法を提供
することである。
【００１８】また、本発明の他の目的は、上記方法に用
いる生体試料中のインスリン様成長因子測定用キットを
提供することである。
いる生体試料中のインスリン様成長因子測定用キットを
提供することである。
【００１９】本発明方法を実施するには、測定対象であ
る生体試料を酸溶液で処理し、ＩＧＦから結合蛋白質を
遊離させた後、再結合阻害剤を含む中和緩衝液で中和
し、以下は常法に従ってＩＧＦの免疫測定を行えばよ
い。
る生体試料を酸溶液で処理し、ＩＧＦから結合蛋白質を
遊離させた後、再結合阻害剤を含む中和緩衝液で中和
し、以下は常法に従ってＩＧＦの免疫測定を行えばよ
い。
【００２０】本発明でＩＧＦの総量を免疫学的に測定す
る系として用いられる生体試料としては、ＩＧＦを含有
する生体液、例えば、血清、血漿、尿、腹水、胸水、乳
清、羊水、脊髄液、抽出液、さん出液などを挙げること
ができる。
る系として用いられる生体試料としては、ＩＧＦを含有
する生体液、例えば、血清、血漿、尿、腹水、胸水、乳
清、羊水、脊髄液、抽出液、さん出液などを挙げること
ができる。
【００２１】結合蛋白質を遊離させるために用いる酸溶
液としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、蟻酸、トリフ
ロロ酢酸、トリクロロ酢酸等の溶液、またはそれらと例
えばグリシン、クエン酸、酢酸、サリチル酸等からなる
緩衝液を挙げることができる。
液としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、蟻酸、トリフ
ロロ酢酸、トリクロロ酢酸等の溶液、またはそれらと例
えばグリシン、クエン酸、酢酸、サリチル酸等からなる
緩衝液を挙げることができる。
【００２２】この酸溶液は生体試料に対し、５〜１００
倍量を用いればよく、酸処理後の生体試料のｐＨは３.
５以下、特に３.０以下にすることが好ましい。
倍量を用いればよく、酸処理後の生体試料のｐＨは３.
５以下、特に３.０以下にすることが好ましい。
【００２３】中和緩衝液に添加する再結合阻害剤として
は、ＩＧＦ結合蛋白質と親和性を有する物質であれば特
に限定はなく利用でき、好ましくは８−アニリノ−１−
ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、サリチル酸、ＳＤ
Ｓ、ヘパリンまたはその塩等を挙げることができる。こ
れら再結合阻害剤は、それぞれ単独でも効果を有する
が、適当な組み合わせにより用いた方がより効果的であ
る。好ましい組み合わせの例としては、ＡＮＳとサリチ
ル酸の組み合わせが選択される。
は、ＩＧＦ結合蛋白質と親和性を有する物質であれば特
に限定はなく利用でき、好ましくは８−アニリノ−１−
ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、サリチル酸、ＳＤ
Ｓ、ヘパリンまたはその塩等を挙げることができる。こ
れら再結合阻害剤は、それぞれ単独でも効果を有する
が、適当な組み合わせにより用いた方がより効果的であ
る。好ましい組み合わせの例としては、ＡＮＳとサリチ
ル酸の組み合わせが選択される。
【００２４】また、本発明の中和緩衝液はｐＨ６.０〜
１０.０の範囲の緩衝液であり、例えばリン酸緩衝液、
炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビタール緩衝液、ト
リス緩衝液、ビストリス緩衝液等の緩衝液を用いること
ができる。緩衝液の濃度および量は上記酸希釈処理され
た生体試料を十分に中和出来る程度に調製すればよい。
１０.０の範囲の緩衝液であり、例えばリン酸緩衝液、
炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビタール緩衝液、ト
リス緩衝液、ビストリス緩衝液等の緩衝液を用いること
ができる。緩衝液の濃度および量は上記酸希釈処理され
た生体試料を十分に中和出来る程度に調製すればよい。
【００２５】中和緩衝液に添加する再結合阻害剤の量は
その種類によって異なるが、例えばＡＮＳ-Ｍｇや他の
ＡＮＳ塩を用いる場合には中和緩衝液に対し ０.０１％
〜０.３０％、サリチル酸Ｎａを用いる場合には中和緩
衝液に対し ０.１〜３.０％、ＳＤＳを用いる場合には
中和緩衝液に対し ０.００１％〜０.０２％、ヘパリン
を用いる場合には中和緩衝液に対し １〜５０Ｕ／ｍｌ
程度とすることが好ましい。 なお、再結合阻害剤は、
用時に中和緩衝液に加えてもよいが、予め中和緩衝液に
加えた組成物としておく方が作業の効率化を図る上で有
利である。
その種類によって異なるが、例えばＡＮＳ-Ｍｇや他の
ＡＮＳ塩を用いる場合には中和緩衝液に対し ０.０１％
〜０.３０％、サリチル酸Ｎａを用いる場合には中和緩
衝液に対し ０.１〜３.０％、ＳＤＳを用いる場合には
中和緩衝液に対し ０.００１％〜０.０２％、ヘパリン
を用いる場合には中和緩衝液に対し １〜５０Ｕ／ｍｌ
程度とすることが好ましい。 なお、再結合阻害剤は、
用時に中和緩衝液に加えてもよいが、予め中和緩衝液に
加えた組成物としておく方が作業の効率化を図る上で有
利である。
【００２６】本発明では再結合阻害剤を含む中和された
試料は、そのまま免疫測定に利用することができる。
用いられる免疫測定の方法としては特に制限はなく、例
えば競合的測定法や二種抗体による挟み込み測定法（サ
ンドイッチ法）を用いた放射免疫測定法、酵素免疫測定
法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法などの種々の
標識方法を用いる免疫学的測定法を採用する事が出来
る。これらの免疫学的測定法は常法に従って行うことが
できる。
試料は、そのまま免疫測定に利用することができる。
用いられる免疫測定の方法としては特に制限はなく、例
えば競合的測定法や二種抗体による挟み込み測定法（サ
ンドイッチ法）を用いた放射免疫測定法、酵素免疫測定
法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法などの種々の
標識方法を用いる免疫学的測定法を採用する事が出来
る。これらの免疫学的測定法は常法に従って行うことが
できる。
【００２７】上記免疫測定法のうち、サンドイッチ法を
採用した場合、液相標識抗体と固相抗体、液相標識抗体
と液相抗体の何れの組合せも用いることがきるが、操作
上は液相標識抗体と固相抗体を用いる方が好ましい。ま
た、標識はクロラミンＴ等の酸化剤を用い、125Ｉ等の
放射性同位元素で標識する方法、ヒンジ法等によりアル
カリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素で標
識する方法、さらにはユーロピウム等の蛍光物質やアク
リジニウムエステル等の発光物質で直接標識する方法等
を利用することができる。
採用した場合、液相標識抗体と固相抗体、液相標識抗体
と液相抗体の何れの組合せも用いることがきるが、操作
上は液相標識抗体と固相抗体を用いる方が好ましい。ま
た、標識はクロラミンＴ等の酸化剤を用い、125Ｉ等の
放射性同位元素で標識する方法、ヒンジ法等によりアル
カリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素で標
識する方法、さらにはユーロピウム等の蛍光物質やアク
リジニウムエステル等の発光物質で直接標識する方法等
を利用することができる。
【００２８】上記した本発明のＩＧＦの測定方法を有利
に実施するためには、例えば以下に示すようなＩＧＦ測
定用キットを利用することができる。 （ａ）再結合阻害剤を含有する中和緩衝液 （ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体 （ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体
に実施するためには、例えば以下に示すようなＩＧＦ測
定用キットを利用することができる。 （ａ）再結合阻害剤を含有する中和緩衝液 （ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体 （ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体
【００２９】このうち、（ａ）成分は、用時に水を加え
る凍結乾燥品であってもよい。また、（ｂ）成分の標識
には、公知の放射性アイソトープ、酵素、蛍光物質、化
学発光物質を利用することができる。更に（ｃ）成分の
固相化には、ガラス、プラスチック、微粒子、磁性微粒
子等の不溶性物質を利用することができ、その形状もチ
ューブ等の器壁、ビーズ、蛋白性微粒子、鉄製微粒子等
とすることができる。
る凍結乾燥品であってもよい。また、（ｂ）成分の標識
には、公知の放射性アイソトープ、酵素、蛍光物質、化
学発光物質を利用することができる。更に（ｃ）成分の
固相化には、ガラス、プラスチック、微粒子、磁性微粒
子等の不溶性物質を利用することができ、その形状もチ
ューブ等の器壁、ビーズ、蛋白性微粒子、鉄製微粒子等
とすることができる。
【００３０】本発明の上記キットには、更に、ＩＧＦか
ら結合蛋白質を遊離させるための酸溶液を加えることも
できる。
ら結合蛋白質を遊離させるための酸溶液を加えることも
できる。
【００３１】
【作用】本発明において、酸溶液が果たしている役割
は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ
Ｉ）とインスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ−
１〜６）との複合体の結合を弱め、これによりＩＧＦを
結合蛋白質から解離させることにある。
は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ
Ｉ）とインスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ−
１〜６）との複合体の結合を弱め、これによりＩＧＦを
結合蛋白質から解離させることにある。
【００３２】しかし、酸溶液で処理した試料を単に緩衝
液で中和するだけだと、ＩＧＦが結合蛋白質と複合体を
再構成することになるが、この中和の過程を、本発明の
ようにＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘパリン等の再結
合阻害剤の存在下で行うことにより、再結合阻害剤が結
合蛋白質のＩＧＦ結合部位と結合し、または、それらの
立体的な障害を利用して結合蛋白群とＩＧＦとの再結合
が防止でき、正確なＩＧＦの測定が可能となるのであ
る。
液で中和するだけだと、ＩＧＦが結合蛋白質と複合体を
再構成することになるが、この中和の過程を、本発明の
ようにＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘパリン等の再結
合阻害剤の存在下で行うことにより、再結合阻害剤が結
合蛋白質のＩＧＦ結合部位と結合し、または、それらの
立体的な障害を利用して結合蛋白群とＩＧＦとの再結合
が防止でき、正確なＩＧＦの測定が可能となるのであ
る。
【００３３】即ち、生体試料を酸性条件下で処理した後
に再結合阻害剤としてＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘ
パリン等を含有する中和緩衝液を添加して中和すること
により、免疫学的測定に適した試料が調製されるのであ
る。
に再結合阻害剤としてＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘ
パリン等を含有する中和緩衝液を添加して中和すること
により、免疫学的測定に適した試料が調製されるのであ
る。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、煩雑な操作や多くの器
具を必要とせずに大量の生体試料の処理が可能で、より
簡便かつ経済的に高い精度でインスリン様成長因子の測
定を行うことができる。
具を必要とせずに大量の生体試料の処理が可能で、より
簡便かつ経済的に高い精度でインスリン様成長因子の測
定を行うことができる。
【００３５】即ち、本発明では有機溶媒であるエタノー
ルを用いずに生体試料を調製するため、免疫測定系に精
度やバウンドの低下などの悪影響を与えることがなく、
従来の酸エタノール抽出法に比べ明らかに有利である。
しかも、ＩＧＦと結合蛋白質を混在させている水溶液
の状態での免疫測定が可能である事は、従来の酸エタノ
ール抽出法におけるＩＧＦと結合蛋白質を分離後測定す
る方法に比べ操作を大幅に簡略化できる。また、ガラス
試験管等の使用を強制されることなく、しかも遠心分離
操作を必要としないため、大量検体の処理が可能であ
り、臨床検査における設備軽減にも役立つ。
ルを用いずに生体試料を調製するため、免疫測定系に精
度やバウンドの低下などの悪影響を与えることがなく、
従来の酸エタノール抽出法に比べ明らかに有利である。
しかも、ＩＧＦと結合蛋白質を混在させている水溶液
の状態での免疫測定が可能である事は、従来の酸エタノ
ール抽出法におけるＩＧＦと結合蛋白質を分離後測定す
る方法に比べ操作を大幅に簡略化できる。また、ガラス
試験管等の使用を強制されることなく、しかも遠心分離
操作を必要としないため、大量検体の処理が可能であ
り、臨床検査における設備軽減にも役立つ。
【００３６】さらに、本発明の再結合阻害剤であるＡＮ
Ｓ等は安価であり、他に高価な試薬を必要としないばか
りか、抗体選択における制約が小さいという利点を有す
る。またさらに、従来の酸エタノール抽出測定法におい
て抽出率が低いと考えられてきた一部の検体が本発明を
用いた免疫測定法で高値になる事は、本発明の測定法に
おける高抽出率がもたらした成果であり、より正確に総
ＩＧＦを抽出し測定できる方法である事実を証明してい
る。
Ｓ等は安価であり、他に高価な試薬を必要としないばか
りか、抗体選択における制約が小さいという利点を有す
る。またさらに、従来の酸エタノール抽出測定法におい
て抽出率が低いと考えられてきた一部の検体が本発明を
用いた免疫測定法で高値になる事は、本発明の測定法に
おける高抽出率がもたらした成果であり、より正確に総
ＩＧＦを抽出し測定できる方法である事実を証明してい
る。
【００３７】
【実施例】次に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるも
のでない。
明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるも
のでない。
【００３８】実 施 例 １ ＩＧＦ−ＩＩの放射免疫測定試薬の製造および放射免疫
学的定量： （１）ＩＧＦ−ＩＩ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−ＩＩ結合物を免疫源とし、常法により
マウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−ＩＩ抗体を種
々作製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィ
ニティーなクローンとして１Ｄ５、６Ｂの２種類を選定
した。
学的定量： （１）ＩＧＦ−ＩＩ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−ＩＩ結合物を免疫源とし、常法により
マウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−ＩＩ抗体を種
々作製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィ
ニティーなクローンとして１Ｄ５、６Ｂの２種類を選定
した。
【００３９】この２種類のクローンは、マウス腹水にて
製造し、飽和硫安にて塩析後ゲル濾過（ＴＳＫＧ３００
０ ＳＷＸＬ、０.０５Ｍ−ＮａＰＯ4／０.１Ｍ−Ｎａ2
ＰＯ4 、ｐＨ６.４）にて抗体分画を得、イオン交換（モ
ノＱ、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ８.０）にて精製し、リ
ン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７.４）で濃縮透析した。
これらの最終濃度は、１Ｄ５で８.７ｍｇ／ｍｌ、６Ｂ
で２.６ｍｇ／ｍｌに調製した。
製造し、飽和硫安にて塩析後ゲル濾過（ＴＳＫＧ３００
０ ＳＷＸＬ、０.０５Ｍ−ＮａＰＯ4／０.１Ｍ−Ｎａ2
ＰＯ4 、ｐＨ６.４）にて抗体分画を得、イオン交換（モ
ノＱ、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ８.０）にて精製し、リ
ン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７.４）で濃縮透析した。
これらの最終濃度は、１Ｄ５で８.７ｍｇ／ｍｌ、６Ｂ
で２.６ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００４０】この抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体の
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは、１Ｄ５が
０.９×１０8Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが２×１０9
Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは、１Ｄ５が
０.９×１０8Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが２×１０9
Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
【００４１】（２）125Ｉ標識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体の調
製 ＮＥＮ製Ｎａ125Ｉ２.６ｍＣｉをシリコンコートガラス
チューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗ＩＧＦ−
ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ-６Ｂ）溶液１９６μｌ（５００μ
ｇ）を入れ、クロラミンＴ３０μｇ／１０μｌ（Ｈ
2Ｏ）を加えて、２０秒間攪拌反応後、メタ重亜硫酸ナ
トリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ2Ｏ）を加えて反応
を停止した。
製 ＮＥＮ製Ｎａ125Ｉ２.６ｍＣｉをシリコンコートガラス
チューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗ＩＧＦ−
ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ-６Ｂ）溶液１９６μｌ（５００μ
ｇ）を入れ、クロラミンＴ３０μｇ／１０μｌ（Ｈ
2Ｏ）を加えて、２０秒間攪拌反応後、メタ重亜硫酸ナ
トリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ2Ｏ）を加えて反応
を停止した。
【００４２】次いで、反応液を０.５％ＢＳＡおよび０.
１％ＮａＮ3を含む０.１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.
４）にて充分に平衡化したセファクリルＳ−３００カラ
ム（Ф1.0cm×45cm）に添加し、カラムからの溶出液を
１ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ溶出させて放射能濃
度の高いピーク位置の各フラクションの免疫活性を測定
して目的標識物の位置を確認しつつ精製反応液としてプ
ールした。
１％ＮａＮ3を含む０.１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.
４）にて充分に平衡化したセファクリルＳ−３００カラ
ム（Ф1.0cm×45cm）に添加し、カラムからの溶出液を
１ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ溶出させて放射能濃
度の高いピーク位置の各フラクションの免疫活性を測定
して目的標識物の位置を確認しつつ精製反応液としてプ
ールした。
【００４３】なお、反応液のペーパークロマトグラフィ
ーにより求めた標識率は９０％であり、従って比放射能
は５.９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ×０.９
０÷５００÷０.８＝５.９μＣｉ／μｇ、０.８は計数
器の計数効率）。精製反応液は、０.１％ゼラチンおよ
び０.１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１００ｍ
Ｍ、ｐＨ７.４）にて希釈し、最終放射能濃度を約１４.
３ｋＢｑ（０.３９μＣｉ／ｍｌ）の125Ｉ標識抗ＩＧＦ
−ＩＩ抗体試薬として調製した（ただし、アッセイに使
用する量は、約２.９ｋＢｑ／２００μｌ／チューブで
ある）。
ーにより求めた標識率は９０％であり、従って比放射能
は５.９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ×０.９
０÷５００÷０.８＝５.９μＣｉ／μｇ、０.８は計数
器の計数効率）。精製反応液は、０.１％ゼラチンおよ
び０.１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１００ｍ
Ｍ、ｐＨ７.４）にて希釈し、最終放射能濃度を約１４.
３ｋＢｑ（０.３９μＣｉ／ｍｌ）の125Ｉ標識抗ＩＧＦ
−ＩＩ抗体試薬として調製した（ただし、アッセイに使
用する量は、約２.９ｋＢｑ／２００μｌ／チューブで
ある）。
【００４４】（３）抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体コートビーズの
調製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０.４ｍｌの５％の洗剤液を加えて、ス
ターラーバーにて攪拌しビーズ表面の削り屑を除去し、
ビーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去する。
このビーズに、５μｇ／０.２ｍｌ／ビーズの２Ｄモノ
クローナル抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ-２Ｄ）を含
む１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５.９を加えて、２５℃で一
晩緩やかに攪拌し、抗体を吸着させた。 各ビーズを脱
イオン水で２回洗浄後、０.２Ｍ硫酸マグネシウム（７
水塩）、０.５ＭＮａＣｌ、０.５％ＢＳＡを含む２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を０.２ｍｌ／ビーズに加
えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一晩乾燥後、抗
体ビーズとした。
調製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０.４ｍｌの５％の洗剤液を加えて、ス
ターラーバーにて攪拌しビーズ表面の削り屑を除去し、
ビーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去する。
このビーズに、５μｇ／０.２ｍｌ／ビーズの２Ｄモノ
クローナル抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ-２Ｄ）を含
む１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５.９を加えて、２５℃で一
晩緩やかに攪拌し、抗体を吸着させた。 各ビーズを脱
イオン水で２回洗浄後、０.２Ｍ硫酸マグネシウム（７
水塩）、０.５ＭＮａＣｌ、０.５％ＢＳＡを含む２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を０.２ｍｌ／ビーズに加
えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一晩乾燥後、抗
体ビーズとした。
【００４５】（４）標準ＩＧＦ−ＩＩ、前処理液および
中和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−ＩＩは、組み替えＤＮＡを用いたリコンビ
ナントＩＧＦ−ＩＩ（第一製薬社製）を、０.１％Ｎａ
Ｎ3、０.１％ＥＤＴＡ２Ｎａおよび０.５％ＢＳＡを含
む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）にて適当な濃
度に調製した。前処理液は、２５ｍＭグリシン塩酸（ｐ
Ｈ１.５）の酸性溶液を用いた。また、中和緩衝液は、
ＡＮＳ-Ｍｇ（８-Anilino-1-NaphtaleneSulfonic Hemim
agnesium）０.０８％、ゼラチン０.５％、ツイ−ン＃２
０ ０.１％およびＮａＮ3 ０.１％を含む２００ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を調製準備した。
中和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−ＩＩは、組み替えＤＮＡを用いたリコンビ
ナントＩＧＦ−ＩＩ（第一製薬社製）を、０.１％Ｎａ
Ｎ3、０.１％ＥＤＴＡ２Ｎａおよび０.５％ＢＳＡを含
む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）にて適当な濃
度に調製した。前処理液は、２５ｍＭグリシン塩酸（ｐ
Ｈ１.５）の酸性溶液を用いた。また、中和緩衝液は、
ＡＮＳ-Ｍｇ（８-Anilino-1-NaphtaleneSulfonic Hemim
agnesium）０.０８％、ゼラチン０.５％、ツイ−ン＃２
０ ０.１％およびＮａＮ3 ０.１％を含む２００ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を調製準備した。
【００４６】（５）血清ＩＧＦ-ＩＩの総量の測定方法
と結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被検検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１.０
ｍｌを加え、よく攪拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ-ＩＩ ５０μｌを採り、それぞれ新たに準備し
たポリスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３０
０μｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を
加えて室温で２時間振騰した。
と結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被検検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１.０
ｍｌを加え、よく攪拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ-ＩＩ ５０μｌを採り、それぞれ新たに準備し
たポリスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３０
０μｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を
加えて室温で２時間振騰した。
【００４７】１次反応終了後、反応液を吸引除去し、生
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２回洗浄する。125Ｉ標
識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体溶液を０.２ｍｌ／チューブ添加
し、さらに室温で１時間振騰し、反応終了後、反応液を
吸引除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した
後、各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際
に標準ＩＧＦ−ＩＩの放射能量とその実濃度を検体の希
釈倍率である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づい
て作製された標準曲線を用い（表１および図１）、希釈
検体の放射能量からＩＧＦ−ＩＩの濃度を読みとった。
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２回洗浄する。125Ｉ標
識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体溶液を０.２ｍｌ／チューブ添加
し、さらに室温で１時間振騰し、反応終了後、反応液を
吸引除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した
後、各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際
に標準ＩＧＦ−ＩＩの放射能量とその実濃度を検体の希
釈倍率である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づい
て作製された標準曲線を用い（表１および図１）、希釈
検体の放射能量からＩＧＦ−ＩＩの濃度を読みとった。
【００４８】比較方法は、同じ検体（検体番号〜）
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表２に示す。
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表２に示す。
【００４９】
【００５０】 ＊ 比較方法は酸エタノール抽出法による測定結果
【００５１】実 施 例 ２ ＩＧＦ−Ｉの放射免疫測定試薬の製造および放射免疫学
的定量： （１）ＩＧＦ−Ｉ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−Ｉ結合物を免疫源とし、常法によりマ
ウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−Ｉ抗体を種々作
製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィニテ
ィーなクローンとして２Ｄ、６Ｂの２種類を選定した。
この２種類のクローンは、マウス腹水にて製造し、飽和
硫安にて塩析後ゲル濾過（ＴＳＫＧ３０００ ＳＷＸ
Ｌ、０.０５Ｍ−ＮａＰＯ4／０.１Ｍ−Ｎａ2ＰＯ4 、ｐ
Ｈ６.４）にて抗体分画を得、イオン交換（モノＱ、２
０ｍＭ−トリス、ｐＨ８.０）にて精製し、リン酸緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ７.４）で濃縮透析した。これらの
最終濃度は、２Ｄで７.５ｍｇ／ｍｌ、６Ｂで２.６ｍｇ
／ｍｌに調製した。
的定量： （１）ＩＧＦ−Ｉ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−Ｉ結合物を免疫源とし、常法によりマ
ウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−Ｉ抗体を種々作
製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィニテ
ィーなクローンとして２Ｄ、６Ｂの２種類を選定した。
この２種類のクローンは、マウス腹水にて製造し、飽和
硫安にて塩析後ゲル濾過（ＴＳＫＧ３０００ ＳＷＸ
Ｌ、０.０５Ｍ−ＮａＰＯ4／０.１Ｍ−Ｎａ2ＰＯ4 、ｐ
Ｈ６.４）にて抗体分画を得、イオン交換（モノＱ、２
０ｍＭ−トリス、ｐＨ８.０）にて精製し、リン酸緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ７.４）で濃縮透析した。これらの
最終濃度は、２Ｄで７.５ｍｇ／ｍｌ、６Ｂで２.６ｍｇ
／ｍｌに調製した。
【００５２】この抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体の
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは２Ｄが７.２
×１０8Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが３.２×１０9Ｌ
／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは２Ｄが７.２
×１０8Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが３.２×１０9Ｌ
／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
【００５３】（２）125Ｉ標識抗ＩＧＦ−Ｉ抗体の調製 ＮＥＮ製Ｎａ125Ｉ ２.６ｍＣｉをシリコンコートガラ
スチューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗ＩＧＦ
−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ-６Ｂ）溶液１９６μｌ（５００μ
ｇ）を入れ、クロラミンＴ３０μｇ／１０μｌ（Ｈ
2Ｏ）を加えて、２０秒間攪拌反応後、メタ重亜硫酸ナ
トリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ2Ｏ）を加えて反応
を停止した。
スチューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗ＩＧＦ
−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ-６Ｂ）溶液１９６μｌ（５００μ
ｇ）を入れ、クロラミンＴ３０μｇ／１０μｌ（Ｈ
2Ｏ）を加えて、２０秒間攪拌反応後、メタ重亜硫酸ナ
トリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ2Ｏ）を加えて反応
を停止した。
【００５４】次いで、反応液を０.５％ＢＳＡ、０.１％
ＮａＮ3を含む０.１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）
にて充分に平衡化したセファクリルＳ−３００カラム
（Ф1.0cm×45cm）に添加し、カラムからの溶出液を１
ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ溶出させて放射能濃度
の高いピーク位置の各フラクションの免疫活性を測定し
て目的標識物の位置を確認しつつ精製反応液としてプー
ルした。なお、反応液のペーパークロマトグラフィーに
より求めた標識率は９０％であり、従って比放射能は
５.９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ×０.９０
÷５００÷０.８＝５.９μＣｉ／μｇ、０.８は計数器
の計数効率）。
ＮａＮ3を含む０.１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）
にて充分に平衡化したセファクリルＳ−３００カラム
（Ф1.0cm×45cm）に添加し、カラムからの溶出液を１
ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ溶出させて放射能濃度
の高いピーク位置の各フラクションの免疫活性を測定し
て目的標識物の位置を確認しつつ精製反応液としてプー
ルした。なお、反応液のペーパークロマトグラフィーに
より求めた標識率は９０％であり、従って比放射能は
５.９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ×０.９０
÷５００÷０.８＝５.９μＣｉ／μｇ、０.８は計数器
の計数効率）。
【００５５】精製反応液は、０.１％ゼラチンおよび０.
１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１００ｍＭ、
ｐＨ７.４）にて希釈し、最終放射能濃度を約１４.３ｋ
Ｂｑ（０.３９μＣｉ／ｍｌ）の125Ｉ標識抗ＩＧＦ−Ｉ
抗体試薬として調製した（ただし、アッセイに使用する
量は、約２.９ｋＢｑ／２００μｌ／チューブであ
る）。
１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１００ｍＭ、
ｐＨ７.４）にて希釈し、最終放射能濃度を約１４.３ｋ
Ｂｑ（０.３９μＣｉ／ｍｌ）の125Ｉ標識抗ＩＧＦ−Ｉ
抗体試薬として調製した（ただし、アッセイに使用する
量は、約２.９ｋＢｑ／２００μｌ／チューブであ
る）。
【００５６】（３）抗ＩＧＦ−Ｉ抗体コートビーズの調
製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０.４ｍｌの５％の洗剤液を加え、スタ
ーラーバーにて攪拌してビーズ表面の削り屑を除去し、
ビーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去した。
このビーズに、５μｇ／０.２ｍｌ／ビーズの２Ｄモノ
クローナル抗ＩＧＦ−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ-２Ｄ）を含む
１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５.９を加えて、２５℃で一晩
緩やかに攪拌し、抗体を吸着させた。各ビーズを脱イオ
ン水で２回洗浄後、０.２Ｍ硫酸マグネシウム（７水
塩）、０.５ＭＮａＣｌおよび０.５％ＢＳＡを含む２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を０.２ｍｌ／ビーズに
加えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一晩乾燥後、
抗体ビーズとした。
製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０.４ｍｌの５％の洗剤液を加え、スタ
ーラーバーにて攪拌してビーズ表面の削り屑を除去し、
ビーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去した。
このビーズに、５μｇ／０.２ｍｌ／ビーズの２Ｄモノ
クローナル抗ＩＧＦ−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ-２Ｄ）を含む
１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５.９を加えて、２５℃で一晩
緩やかに攪拌し、抗体を吸着させた。各ビーズを脱イオ
ン水で２回洗浄後、０.２Ｍ硫酸マグネシウム（７水
塩）、０.５ＭＮａＣｌおよび０.５％ＢＳＡを含む２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を０.２ｍｌ／ビーズに
加えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一晩乾燥後、
抗体ビーズとした。
【００５７】（４）標準ＩＧＦ−Ｉ、前処理液および中
和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−Ｉは、組み替えＤＮＡを用いたリコンビナ
ントＩＧＦ−Ｉ（東洋紡社製）を０.１％ＮａＮ3および
０.５％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６.０）にて適当な濃度に調製した。前処理液は、２
５ｍＭグリシン塩酸（ｐＨ１.５）の酸性溶液を用い
た。
和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−Ｉは、組み替えＤＮＡを用いたリコンビナ
ントＩＧＦ−Ｉ（東洋紡社製）を０.１％ＮａＮ3および
０.５％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６.０）にて適当な濃度に調製した。前処理液は、２
５ｍＭグリシン塩酸（ｐＨ１.５）の酸性溶液を用い
た。
【００５８】また、中和緩衝液は、ＡＮＳ-Ｍｇ（８-An
ilino-1-NaphtaleneSulfonic Hemimagnesium）０.１２
％、サリチル酸ナトリウム １.０％、ゼラチン０.５
％、ツイ−ン＃２０ ０.１％およびＮａＮ3 ０.１％を
含む２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）を調製
準備した。
ilino-1-NaphtaleneSulfonic Hemimagnesium）０.１２
％、サリチル酸ナトリウム １.０％、ゼラチン０.５
％、ツイ−ン＃２０ ０.１％およびＮａＮ3 ０.１％を
含む２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）を調製
準備した。
【００５９】（５）血清ＩＧＦ−Ｉの総量の測定方法と
結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被験検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１.０
ｍｌを加え、よく攪拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ-Ｉ５０μｌを採り、それぞれ新たに準備したポ
リスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３００μ
ｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を加え
て室温で２時間振騰した。
結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被験検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１.０
ｍｌを加え、よく攪拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ-Ｉ５０μｌを採り、それぞれ新たに準備したポ
リスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３００μ
ｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を加え
て室温で２時間振騰した。
【００６０】１次反応終了後、反応液を吸引除去し、生
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２回洗浄した。125Ｉ標
識抗ＩＧＦ-Ｉ抗体溶液を０.２ｍｌ／チューブ添加し、
さらに室温で１時間振騰し、反応終了後、反応液を吸引
除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した後、
各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際に標
準ＩＧＦ−Ｉの放射能量とその実濃度を検体の希釈倍率
である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づいて作製
された標準曲線を用い（表３および図２）、希釈検体の
放射能量からＩＧＦ−Ｉの濃度を読みとった。
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２回洗浄した。125Ｉ標
識抗ＩＧＦ-Ｉ抗体溶液を０.２ｍｌ／チューブ添加し、
さらに室温で１時間振騰し、反応終了後、反応液を吸引
除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した後、
各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際に標
準ＩＧＦ−Ｉの放射能量とその実濃度を検体の希釈倍率
である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づいて作製
された標準曲線を用い（表３および図２）、希釈検体の
放射能量からＩＧＦ−Ｉの濃度を読みとった。
【００６１】比較方法は、同じ検体（検体番号〜）
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表４に示す。
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表４に示す。
【００６２】
【００６３】 ＊ 比較方法は酸エタノール抽出法による測定結果
【図１】 ＩＧＦ−ＩＩについて、本発明方法で得た標
準曲線を示す図面。
準曲線を示す図面。
【図２】 ＩＧＦ−Ｉについて、本発明方法で得た標準
曲線を示す図面。 以 上
曲線を示す図面。 以 上
【手続補正書】
【提出日】平成７年２月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体試料中のインスリ
ン様成長因子の測定方法に関し、さらに詳細には、成長
不全、成長ホルモン異常等の成長不全疾患の医学的診断
において有用な情報をもたらす総インスリン様成長因子
Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）量および総インスリン様成長因子ＩＩ
（ＩＧＦ−ＩＩ）量の免疫学的測定方法およびそのため
のキットに関する。
ン様成長因子の測定方法に関し、さらに詳細には、成長
不全、成長ホルモン異常等の成長不全疾患の医学的診断
において有用な情報をもたらす総インスリン様成長因子
Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）量および総インスリン様成長因子ＩＩ
（ＩＧＦ−ＩＩ）量の免疫学的測定方法およびそのため
のキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】成長不全、成長ホルモン異常等の成長不
全疾患の医学的診断において従来用いられてきた成長ホ
ルモン量の測定は、その血中濃度の変動が大きいため、
診断に利用するのは難しい面が多かった。一方、骨の成
長などにおいて成長ホルモンと共同で作用し、かつその
血中濃度の変動が緩和なＩＧＦ−Ｉは、成長不全疾患の
診断に高い臨床的有用性を持つ事が知られており、成長
ホルモン量に代えてこのＩＧＦ−Ｉを測定することが行
われている。また、ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−Ｉと同様
に血液や骨組織中に広く存在している事が知られ、その
生体内における存在意義の解明が強く待ち望まれてお
り、そのために該因子の正確な測定が求められていた。
全疾患の医学的診断において従来用いられてきた成長ホ
ルモン量の測定は、その血中濃度の変動が大きいため、
診断に利用するのは難しい面が多かった。一方、骨の成
長などにおいて成長ホルモンと共同で作用し、かつその
血中濃度の変動が緩和なＩＧＦ−Ｉは、成長不全疾患の
診断に高い臨床的有用性を持つ事が知られており、成長
ホルモン量に代えてこのＩＧＦ−Ｉを測定することが行
われている。また、ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−Ｉと同様
に血液や骨組織中に広く存在している事が知られ、その
生体内における存在意義の解明が強く待ち望まれてお
り、そのために該因子の正確な測定が求められていた。
【０００３】従来のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）の
測定法としては、次の方法が知られている。まず、ＩＧ
Ｆの標的細胞に対する生理的結合活性の発現を直接測定
する、放射受容体測定法（Ｒ Ｎ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｖ
ｏｌ．３９．ｐｐ．２３８−２９２．；Ｗ Ｈ．Ｄａｕ
ｇｈａｄａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｓｍ．Ｖｏｌ．５３．ｐｐ．２８２−２８８．；
Ｒ Ｃ．Ｂａｘｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２
４．ｐｐ．２６７−２７８．）が知られている。しかし
側定に用いる受容体の均一性を得る事の困難さや技術的
に複雑で反応に長時間かかる事から、しばしば判定に難
しい結果を生じた。このため、この放射受容体測定法
は、臨床検査で日常的に用いるための実用性に欠けるも
のとされていた。
測定法としては、次の方法が知られている。まず、ＩＧ
Ｆの標的細胞に対する生理的結合活性の発現を直接測定
する、放射受容体測定法（Ｒ Ｎ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｖ
ｏｌ．３９．ｐｐ．２３８−２９２．；Ｗ Ｈ．Ｄａｕ
ｇｈａｄａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｓｍ．Ｖｏｌ．５３．ｐｐ．２８２−２８８．；
Ｒ Ｃ．Ｂａｘｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２
４．ｐｐ．２６７−２７８．）が知られている。しかし
側定に用いる受容体の均一性を得る事の困難さや技術的
に複雑で反応に長時間かかる事から、しばしば判定に難
しい結果を生じた。このため、この放射受容体測定法
は、臨床検査で日常的に用いるための実用性に欠けるも
のとされていた。
【０００４】また、競合的免疫測定法（Ｆｕｒｌａｎｅ
ｔｔｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉ
ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．６０．ｐｐ．６４
８−６５７．）も知られており、この方法は、インスリ
ン様成長因子（ＩＧＦ）に特異的で高感度なポリクロー
ナル性抗血清を作製し、測定対象であるＩＧＦと１２５
Ｉ標識ＩＧＦおよびポリクローナル性抗血清を適当な濃
度で反応させて、１２５Ｉ標識ＩＧＦとＩＧＦとにポリ
クローナル性抗血清の結合部位を競合させる測定法であ
る。しかしこの方法は多くの段階と長い反応時間を要す
る上に、Ｂ／Ｆ分離方法の煩雑さを伴うため、大量検体
を迅速処理する臨床検査における普及を難しくしてい
た。
ｔｔｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉ
ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．６０．ｐｐ．６４
８−６５７．）も知られており、この方法は、インスリ
ン様成長因子（ＩＧＦ）に特異的で高感度なポリクロー
ナル性抗血清を作製し、測定対象であるＩＧＦと１２５
Ｉ標識ＩＧＦおよびポリクローナル性抗血清を適当な濃
度で反応させて、１２５Ｉ標識ＩＧＦとＩＧＦとにポリ
クローナル性抗血清の結合部位を競合させる測定法であ
る。しかしこの方法は多くの段階と長い反応時間を要す
る上に、Ｂ／Ｆ分離方法の煩雑さを伴うため、大量検体
を迅速処理する臨床検査における普及を難しくしてい
た。
【０００５】一方、近年免疫感作させた抗体産生細胞と
ミエローマ細胞を生体外で融合させてハイブリドーマを
作成する事により単クローン性抗体を得る技術が開発さ
れてきた（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．２５６．ｐｐ．４９
５−４９７．１９７５）。そして、この技術を応用する
事によりＩＧＦに対し特異的でかつ単一な抗体蛋白を大
量に得る事が可能になり、この単クローン性抗体を用い
て特異性が高くかつ迅速な反応の放射免疫測定法の開発
が研究された（特開昭６４−３５６１号）。
ミエローマ細胞を生体外で融合させてハイブリドーマを
作成する事により単クローン性抗体を得る技術が開発さ
れてきた（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．２５６．ｐｐ．４９
５−４９７．１９７５）。そして、この技術を応用する
事によりＩＧＦに対し特異的でかつ単一な抗体蛋白を大
量に得る事が可能になり、この単クローン性抗体を用い
て特異性が高くかつ迅速な反応の放射免疫測定法の開発
が研究された（特開昭６４−３５６１号）。
【０００６】ところで、血清中には、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧ
Ｆ−ＩＩの保護や制御に深く関与するインスリン様成長
因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ；以下、単に「結合蛋白
質」ということもある）が存在し、ＩＧＦと複合体を形
成している事が知られている。これらの結合蛋白質は、
正確な総ＩＧＦ量を放射免疫測定する際に大きな障害と
なるため、測定に先立ち、前処理としてＩＧＦと結合蛋
白質を分離する必要がある。この前処理方法としては、
酸性下ゲルクロマトグラフィー、固相抽出（Ｓｅｐ−Ｐ
ａｋ抽出）、酸エタノール抽出などの方法が従来用いら
れてきた。
Ｆ−ＩＩの保護や制御に深く関与するインスリン様成長
因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ；以下、単に「結合蛋白
質」ということもある）が存在し、ＩＧＦと複合体を形
成している事が知られている。これらの結合蛋白質は、
正確な総ＩＧＦ量を放射免疫測定する際に大きな障害と
なるため、測定に先立ち、前処理としてＩＧＦと結合蛋
白質を分離する必要がある。この前処理方法としては、
酸性下ゲルクロマトグラフィー、固相抽出（Ｓｅｐ−Ｐ
ａｋ抽出）、酸エタノール抽出などの方法が従来用いら
れてきた。
【０００７】このうち、酸性下ゲルクロマトグラフィー
法（Ｊ．Ｚａｐｆ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．６８．ｐ
ｐ．１３２１−１３３０．１９８１．；Ｒ Ｌ，Ｈｉｎ
ｔｚ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ．１９７７．Ｖｏｌ．４５．ｐｐ．９８８−９９
５．；ＤＲ．Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．１９８６．Ｖｏｌ．６３．ｐ
ｐ．１１８６−１１９２．）は、分子量の違いにより結
合蛋白質とＩＧＦをカラムを用いて解離させ、その分離
溶出液を中和測定する方法であるが、大量検体処理が難
しくカラムを設置する設備が必要で、日常の臨床検査に
向かない方法である。
法（Ｊ．Ｚａｐｆ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．６８．ｐ
ｐ．１３２１−１３３０．１９８１．；Ｒ Ｌ，Ｈｉｎ
ｔｚ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ．１９７７．Ｖｏｌ．４５．ｐｐ．９８８−９９
５．；ＤＲ．Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．１９８６．Ｖｏｌ．６３．ｐ
ｐ．１１８６−１１９２．）は、分子量の違いにより結
合蛋白質とＩＧＦをカラムを用いて解離させ、その分離
溶出液を中和測定する方法であるが、大量検体処理が難
しくカラムを設置する設備が必要で、日常の臨床検査に
向かない方法である。
【０００８】また、固相抽出（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）法（Ｗ
Ｈ．Ｄａｕｇｈａｄａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ．１９８７．Ｖｏｌ．１０９．ｐｐ．３５５−３６
３．）は、市販されているＩＧＦ吸着性のあるケルを詰
めた小型カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）を用いてＩＧＦを分
離定量する方法であるが、やはり煩雑な操作が残る上、
コストが高く検体の多数処理には無理がある。
Ｈ．Ｄａｕｇｈａｄａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ．１９８７．Ｖｏｌ．１０９．ｐｐ．３５５−３６
３．）は、市販されているＩＧＦ吸着性のあるケルを詰
めた小型カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）を用いてＩＧＦを分
離定量する方法であるが、やはり煩雑な操作が残る上、
コストが高く検体の多数処理には無理がある。
【０００９】また、前処理方法のうち、最もよく使用さ
れている方法としては、酸エタノール抽出法（Ｗ Ｈ．
Ｄａｕｇｈａｄａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｓｍ．１９８０．Ｖｏｌ．５１．ｐｐ．７
８１−７８８．）を挙げることができる。この方法は、
初めに血清を塩酸−エタノール混合液と混合し、酸によ
りＩＧＦと結合蛋白を分離せしめた後、一定濃度のエタ
ノールにより結合蛋白質を沈殿させ、次に速心分離操作
で上清を分離採取し、得られた上清のエタノール濃度を
下げ、強酸を緩衝するために中和緩衝液で上清中の酸を
完全に中和希釈し、その希釈液を試料として免疫学的に
測定するものである。
れている方法としては、酸エタノール抽出法（Ｗ Ｈ．
Ｄａｕｇｈａｄａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｓｍ．１９８０．Ｖｏｌ．５１．ｐｐ．７
８１−７８８．）を挙げることができる。この方法は、
初めに血清を塩酸−エタノール混合液と混合し、酸によ
りＩＧＦと結合蛋白を分離せしめた後、一定濃度のエタ
ノールにより結合蛋白質を沈殿させ、次に速心分離操作
で上清を分離採取し、得られた上清のエタノール濃度を
下げ、強酸を緩衝するために中和緩衝液で上清中の酸を
完全に中和希釈し、その希釈液を試料として免疫学的に
測定するものである。
【００１０】この酸エタノール法における結合蛋白質と
ＩＧＦの解離では、酸ｐＨを引き下げる事による効果が
大きい事が一つの特徴であり、また、この方法における
エタノールは、酸解離後のＩＧＦのみを溶解抽出して水
溶液中に残存する結合蛋白質を分離沈殿せしめ、ＩＧＦ
と結合蛋白質の複合体の再結合を妨げる作用を持つと考
えられる。
ＩＧＦの解離では、酸ｐＨを引き下げる事による効果が
大きい事が一つの特徴であり、また、この方法における
エタノールは、酸解離後のＩＧＦのみを溶解抽出して水
溶液中に残存する結合蛋白質を分離沈殿せしめ、ＩＧＦ
と結合蛋白質の複合体の再結合を妨げる作用を持つと考
えられる。
【００１１】酸エタノール抽出法は、現在最も普及して
いる方法でもあり、特にこの方法にるＩＧＦ−Ｉの測定
値は公的機関による成長不良疾患の診断および治療にお
ける重要な判断情報の一つとされている。
いる方法でもあり、特にこの方法にるＩＧＦ−Ｉの測定
値は公的機関による成長不良疾患の診断および治療にお
ける重要な判断情報の一つとされている。
【００１２】しかし、酸エタノール抽出法は、遠心分離
を伴う煩雑な処理操作がある上に、その上清の中和操作
が必要で、煩雑な手間と各操作に各々別の試験管が必要
なため、検体の大量処理に向かないという欠点があっ
た。また、この方法におけるもう一つの別の欠点として
は、遠心分離後の上清の酸エタノール液をピペットで吸
い上げる操作において、エタノールと水溶液との液性の
違いに伴う液量の誤差が測定値に少なからず影響を与
え、かつ、この上清を採る操作に大きな時間を要する事
が挙げられる。さらに、抽出に用いる有機溶媒エタノー
ルの免疫測定法への影響や検体により結合蛋白質が抽出
液に残存する事による測定値減少などの影響が報告さ
れ、問題とされている。
を伴う煩雑な処理操作がある上に、その上清の中和操作
が必要で、煩雑な手間と各操作に各々別の試験管が必要
なため、検体の大量処理に向かないという欠点があっ
た。また、この方法におけるもう一つの別の欠点として
は、遠心分離後の上清の酸エタノール液をピペットで吸
い上げる操作において、エタノールと水溶液との液性の
違いに伴う液量の誤差が測定値に少なからず影響を与
え、かつ、この上清を採る操作に大きな時間を要する事
が挙げられる。さらに、抽出に用いる有機溶媒エタノー
ルの免疫測定法への影響や検体により結合蛋白質が抽出
液に残存する事による測定値減少などの影響が報告さ
れ、問題とされている。
【００１３】また、ブルムら（Ｗ Ｆ．Ｂｌｕｍ，Ａｃ
ｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ．１９８８．Ｖ
ｏｌ．１１８．ｐｐ．３７４−３８０．；Ｗ Ｆ．Ｂｌ
ｕｍ，１９９４．Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉ
ｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．ｐｐ．１１−１
９．）は、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩが共に結合蛋白上
の同様の部位に結合する事に着目して、検体の酸処理
（ｐＨ３．１以下）の後、中和する緩衝液中に結合蛋白
質との再結合を防ぐ目的でＩＧＦ−ＩＩアッセイ系には
過剰のＩＧＦ−Ｉ（１００倍以上）を、ＩＧＦ−Ｉアッ
セイ系には過剰のＩＧＦ−ＩＩを添加することで、血清
中のＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩを抽出操作無しで同中和
緩衝液中で免疫測定できる事を報告している。すなわ
ち、この方法は、いわゆる類似ＩＧＦを添加して結合蛋
白質の結合を阻害する方法である。
ｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ．１９８８．Ｖ
ｏｌ．１１８．ｐｐ．３７４−３８０．；Ｗ Ｆ．Ｂｌ
ｕｍ，１９９４．Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉ
ｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．ｐｐ．１１−１
９．）は、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩが共に結合蛋白上
の同様の部位に結合する事に着目して、検体の酸処理
（ｐＨ３．１以下）の後、中和する緩衝液中に結合蛋白
質との再結合を防ぐ目的でＩＧＦ−ＩＩアッセイ系には
過剰のＩＧＦ−Ｉ（１００倍以上）を、ＩＧＦ−Ｉアッ
セイ系には過剰のＩＧＦ−ＩＩを添加することで、血清
中のＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩを抽出操作無しで同中和
緩衝液中で免疫測定できる事を報告している。すなわ
ち、この方法は、いわゆる類似ＩＧＦを添加して結合蛋
白質の結合を阻害する方法である。
【００１４】しかし、このアッセイ方法では、使用する
抗体として、ＩＧＦ−Ｉ測定ではＩＧＦ−ＩＩに、ＩＧ
Ｆ−ＩＩ測定ではＩＧＦ−Ｉに交差反応性の無い特異性
の高い抗体を選択する必要があり、サンドイッチ法にお
ける一次抗体（捕捉抗体）にも類似ＩＧＦに交差しない
特異性の高い抗体が不可欠である事など、抗体の選択に
著しく制約が生じる結果になる。また、中和緩衝液に添
加するＩＧＦ−Ｉ、−ＩＩを大量に準備する必要があ
り、商業的にキット化する際にはコストを著しく高く引
き上げる事に成りかねず、安価な普及性の高い方法とは
なり得ない。
抗体として、ＩＧＦ−Ｉ測定ではＩＧＦ−ＩＩに、ＩＧ
Ｆ−ＩＩ測定ではＩＧＦ−Ｉに交差反応性の無い特異性
の高い抗体を選択する必要があり、サンドイッチ法にお
ける一次抗体（捕捉抗体）にも類似ＩＧＦに交差しない
特異性の高い抗体が不可欠である事など、抗体の選択に
著しく制約が生じる結果になる。また、中和緩衝液に添
加するＩＧＦ−Ｉ、−ＩＩを大量に準備する必要があ
り、商業的にキット化する際にはコストを著しく高く引
き上げる事に成りかねず、安価な普及性の高い方法とは
なり得ない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】従って、煩雑な操作や
多くの器具を必要とせずに大量の検体処理が可能で、よ
り簡便かつ経済的なインスリン様成長因子の測定方法の
開発が望まれていた。
多くの器具を必要とせずに大量の検体処理が可能で、よ
り簡便かつ経済的なインスリン様成長因子の測定方法の
開発が望まれていた。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記実情に
鑑み、インスリン様成長因子の測定について鋭意研究を
行った結果、生体試料を酸溶液で処理し、インスリン様
結合蛋白質からインスリン様成長因子を遊離させた後
に、特定の物質を共存する中和緩衝液を用いることによ
りインスリン様結合蛋白質との再結合が阻害でき、しか
も得られた試料はそのまま免疫測定に利用可能なことを
見出し本発明を完成した。
鑑み、インスリン様成長因子の測定について鋭意研究を
行った結果、生体試料を酸溶液で処理し、インスリン様
結合蛋白質からインスリン様成長因子を遊離させた後
に、特定の物質を共存する中和緩衝液を用いることによ
りインスリン様結合蛋白質との再結合が阻害でき、しか
も得られた試料はそのまま免疫測定に利用可能なことを
見出し本発明を完成した。
【００１７】すなわち、本発明の目的は、生体試料中の
インスリン様成長因子を免疫学的に測定する方法であっ
て、免疫学的測定に先立ち、生体試料を酸溶液で処理す
ることによりインスリン様成長因子結合蛋白質からイン
スリン様成長因子を遊離させ、次いで当該生体試料を再
結合阻害剤を含有する中和緩衝液で中和することを特徴
とするインスリン様成長因子の免疫学的測定方法を提供
することである。
インスリン様成長因子を免疫学的に測定する方法であっ
て、免疫学的測定に先立ち、生体試料を酸溶液で処理す
ることによりインスリン様成長因子結合蛋白質からイン
スリン様成長因子を遊離させ、次いで当該生体試料を再
結合阻害剤を含有する中和緩衝液で中和することを特徴
とするインスリン様成長因子の免疫学的測定方法を提供
することである。
【００１８】また、本発明の他の目的は、上記方法に用
いる生体試料中のインスリン様成長因子測定用キットを
提供することである。
いる生体試料中のインスリン様成長因子測定用キットを
提供することである。
【００１９】本発明方法を実施するには、測定対象であ
る生体試料を酸溶液で処理し、ＩＧＦから結合蛋白質を
遊離させた後、再結合阻害剤を含む中和緩衝液で中和
し、以下は常法に従ってＩＧＦの免疫測定を行えばよ
い。
る生体試料を酸溶液で処理し、ＩＧＦから結合蛋白質を
遊離させた後、再結合阻害剤を含む中和緩衝液で中和
し、以下は常法に従ってＩＧＦの免疫測定を行えばよ
い。
【００２０】本発明でＩＧＦの総量を免疫学的に測定す
る系として用いられる生体試料としては、ＩＧＦを含有
する生体液、例えば、血清、血漿、尿、腹水、胸水、乳
清、羊水、脊髄液、抽出液、さん出液などを挙げること
ができる。
る系として用いられる生体試料としては、ＩＧＦを含有
する生体液、例えば、血清、血漿、尿、腹水、胸水、乳
清、羊水、脊髄液、抽出液、さん出液などを挙げること
ができる。
【００２１】結合蛋白質を遊離させるために用いる酸溶
液としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、蟻酸、トリフ
ロロ酢酸、トリクロロ酢酸等の溶液、またはそれらと例
えばグリシン、クエン酸、酢酸、サリチル酸等からなる
緩衝液を挙げることができる。
液としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、蟻酸、トリフ
ロロ酢酸、トリクロロ酢酸等の溶液、またはそれらと例
えばグリシン、クエン酸、酢酸、サリチル酸等からなる
緩衝液を挙げることができる。
【００２２】この酸溶液は生体試料に対し、５〜１００
倍量を用いればよく、酸処理後の生体試料のｐＨは３．
５以下、特に３．０以下にすることが好ましい。
倍量を用いればよく、酸処理後の生体試料のｐＨは３．
５以下、特に３．０以下にすることが好ましい。
【００２３】中和緩衝液に添加する再結合阻害剤として
は、ＩＧＦ結合蛋白質と親和性を有する物質であれば特
に限定はなく利用でき、好ましくは８−アニリノ−１−
ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、サリチル酸、ラウリ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヘパリンまたはその塩等
を挙げることができる。これら再結合阻害剤は、それぞ
れ単独でも効果を有するが、適当な組み合わせにより用
いた方がより効果的である。好ましい組み合わせの例と
しては、ＡＮＳとサリチル酸の組み合わせが選択され
る。
は、ＩＧＦ結合蛋白質と親和性を有する物質であれば特
に限定はなく利用でき、好ましくは８−アニリノ−１−
ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、サリチル酸、ラウリ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヘパリンまたはその塩等
を挙げることができる。これら再結合阻害剤は、それぞ
れ単独でも効果を有するが、適当な組み合わせにより用
いた方がより効果的である。好ましい組み合わせの例と
しては、ＡＮＳとサリチル酸の組み合わせが選択され
る。
【００２４】また、本発明の中相緩衝液はｐＨ６．０〜
１０の範囲の緩衝液であり、例えばリン酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン緩衝液、バルビタール緩衝液、トリス
緩衝液、ビストリス緩衝液等の緩衝液を用いることがで
きる。緩衝液の濃度および量は上記酸希釈処理された生
体試料を十分に中和出来る程度に調製すればよい。
１０の範囲の緩衝液であり、例えばリン酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン緩衝液、バルビタール緩衝液、トリス
緩衝液、ビストリス緩衝液等の緩衝液を用いることがで
きる。緩衝液の濃度および量は上記酸希釈処理された生
体試料を十分に中和出来る程度に調製すればよい。
【００２５】中和緩衝液に添加する再結合阻害剤の量は
その種類によって異なるが、例えばＡＮＳ−Ｍｇや他の
ＡＮＳ塩を用いる場合には中和緩衝液に対し０．０１％
〜０．３０％、サリチル酸ナトリウムを用いる場合には
中和緩衝液に対し０．１〜３．０％、ＳＤＳを用いる場
合には中和緩衝液に対し０．００１％〜０．０２％、ヘ
パリンを用いる場合には中和緩衝液に対し１〜５０Ｕ／
ｍｌ程度とすることが好ましい。なお、再結合阻害剤
は、用時に中和緩衝液に加えてもよいが、予め中和緩衝
液に加えた組成物としておく方が作業の効率化を図る上
で有利である。
その種類によって異なるが、例えばＡＮＳ−Ｍｇや他の
ＡＮＳ塩を用いる場合には中和緩衝液に対し０．０１％
〜０．３０％、サリチル酸ナトリウムを用いる場合には
中和緩衝液に対し０．１〜３．０％、ＳＤＳを用いる場
合には中和緩衝液に対し０．００１％〜０．０２％、ヘ
パリンを用いる場合には中和緩衝液に対し１〜５０Ｕ／
ｍｌ程度とすることが好ましい。なお、再結合阻害剤
は、用時に中和緩衝液に加えてもよいが、予め中和緩衝
液に加えた組成物としておく方が作業の効率化を図る上
で有利である。
【００２６】本発明では再結合阻害剤を含む中和された
試料は、そのまま免疫測定に利用することができる。用
いられる免疫測定の方法としては特に制限はなく、例え
ば競合的測定法や二種抗体による挟み込み測定法（サン
ドイッチ法）を用いた放射免疫測定法、酵素免疫測定
法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法などの種々の
標識方法を用いる免疫学的測定法を採用する事ができ
る。これらの免疫学的測定法は常法に従って行うことが
できる。
試料は、そのまま免疫測定に利用することができる。用
いられる免疫測定の方法としては特に制限はなく、例え
ば競合的測定法や二種抗体による挟み込み測定法（サン
ドイッチ法）を用いた放射免疫測定法、酵素免疫測定
法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法などの種々の
標識方法を用いる免疫学的測定法を採用する事ができ
る。これらの免疫学的測定法は常法に従って行うことが
できる。
【００２７】上記免疫測定法のうち、サンドイッチ法を
採用した場合、液相標識抗体と固相抗体、液相標識抗体
と液相抗体の何れの組合せも用いることがきるが、操作
上は液相標識抗体と固相抗体を用いる方が好ましい。ま
た、標識はクロラミンＴ等の酸化剤を用い、１２５Ｉ等
の放射性同位元素で標識する方法、ヒンジ法等によりア
ルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素で
標識する方法、さらにはユーロピウム等の蛍光物質やア
クリジニウムエステル等の発光物質で直接標識する方法
等を利用することができる。
採用した場合、液相標識抗体と固相抗体、液相標識抗体
と液相抗体の何れの組合せも用いることがきるが、操作
上は液相標識抗体と固相抗体を用いる方が好ましい。ま
た、標識はクロラミンＴ等の酸化剤を用い、１２５Ｉ等
の放射性同位元素で標識する方法、ヒンジ法等によりア
ルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素で
標識する方法、さらにはユーロピウム等の蛍光物質やア
クリジニウムエステル等の発光物質で直接標識する方法
等を利用することができる。
【００２８】上記した本発明のＩＧＦの測定方法を有利
に実施するためには、例えば以下に示すようなＩＧＦ測
定用キットを利用することができる。 （ａ）再結合阻害剤を含有する中和緩衝液 （ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体 （ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体
に実施するためには、例えば以下に示すようなＩＧＦ測
定用キットを利用することができる。 （ａ）再結合阻害剤を含有する中和緩衝液 （ｂ）標識抗ＩＧＦ抗体 （ｃ）固相化抗ＩＧＦ抗体
【００２９】このうち、（ａ）成分は、用時に水を加え
る凍結乾燥品であってもよい。また、（ｂ）成分の標識
には、公知の放射性アイソトープ、酵素、蛍光物質、化
学発光物質を利用することができる。更に（ｃ）成分の
固相化には、ガラス、プラスチック、微粒子、磁性微粒
子等の不溶性物質を利用することができ、その形状もチ
ューブ等の器壁、ビーズ、蛋白性微粒子、鉄製微粒子等
とすることができる。
る凍結乾燥品であってもよい。また、（ｂ）成分の標識
には、公知の放射性アイソトープ、酵素、蛍光物質、化
学発光物質を利用することができる。更に（ｃ）成分の
固相化には、ガラス、プラスチック、微粒子、磁性微粒
子等の不溶性物質を利用することができ、その形状もチ
ューブ等の器壁、ビーズ、蛋白性微粒子、鉄製微粒子等
とすることができる。
【００３０】本発明の上記キットには、更に、ＩＧＦか
ら結合蛋白質を遊離させるための酸溶液を加えることも
できる。
ら結合蛋白質を遊離させるための酸溶液を加えることも
できる。
【００３１】
【作用】本発明において、酸溶液が果たしている役割
は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ
Ｉ）とインスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ−
１〜６）との複合体の結合を弱め、これによりＩＧＦを
結合蛋白質から解離させることにある。
は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｉ
Ｉ）とインスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ−
１〜６）との複合体の結合を弱め、これによりＩＧＦを
結合蛋白質から解離させることにある。
【００３２】しかし、酸溶液で処理した試料を単に緩衝
液で中和するだけだと、ＩＧＦが結合蛋白質と複合体を
再構成することになるが、この中和の過程を、本発明の
ようにＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘパリン等の再結
合阻害剤の存在下で行うことにより、再結合阻害剤が結
合蛋白質のＩＧＦ結合部位と結合し、または、それらの
立体的な障害を利用して結合蛋白群とＩＧＦとの再結合
が防止でき、正確なＩＧＦの測定が可能となるのであ
る。
液で中和するだけだと、ＩＧＦが結合蛋白質と複合体を
再構成することになるが、この中和の過程を、本発明の
ようにＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘパリン等の再結
合阻害剤の存在下で行うことにより、再結合阻害剤が結
合蛋白質のＩＧＦ結合部位と結合し、または、それらの
立体的な障害を利用して結合蛋白群とＩＧＦとの再結合
が防止でき、正確なＩＧＦの測定が可能となるのであ
る。
【００３３】即ち、生体試料を酸性条件下で処理した後
に再結合阻害剤としてＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘ
パリン等を含有する中和緩衝液を添加して中和すること
により、免疫学的測定に適した試料が調製されるのであ
る。
に再結合阻害剤としてＡＮＳ、サリチル酸、ＳＤＳ、ヘ
パリン等を含有する中和緩衝液を添加して中和すること
により、免疫学的測定に適した試料が調製されるのであ
る。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、煩雑な操作や多くの器
具を必要とせずに大量の生体試料の処理が可能で、より
簡便かつ経済的に高い精度でインスリン様成長因子の測
定を行うことができる。
具を必要とせずに大量の生体試料の処理が可能で、より
簡便かつ経済的に高い精度でインスリン様成長因子の測
定を行うことができる。
【００３５】即ち、本発明では有機溶媒であるエタノー
ルを用いずに生体試料を調製するため、免疫測定系に精
度やバウンドの低下などの悪影響を与えることがなく、
従来の酸エタノール抽出法に比べ明らかに有利である。
しかも、ＩＧＦと結合蛋白質を混在させている水溶液の
状態での免疫測定が可能である事は、従来の酸エタノー
ル抽出法におけるＩＧＦと結合蛋白質を分離後測定する
方法に比べ操作を大幅に簡略化できる。また、ガラス試
験管等の使用を強制されることなく、しかも遠心分離操
作を必要としないため、大量検体の処理が可能であり、
臨床検査における設備軽減にも役立つ。
ルを用いずに生体試料を調製するため、免疫測定系に精
度やバウンドの低下などの悪影響を与えることがなく、
従来の酸エタノール抽出法に比べ明らかに有利である。
しかも、ＩＧＦと結合蛋白質を混在させている水溶液の
状態での免疫測定が可能である事は、従来の酸エタノー
ル抽出法におけるＩＧＦと結合蛋白質を分離後測定する
方法に比べ操作を大幅に簡略化できる。また、ガラス試
験管等の使用を強制されることなく、しかも遠心分離操
作を必要としないため、大量検体の処理が可能であり、
臨床検査における設備軽減にも役立つ。
【００３６】さらに、本発明の再結合阻害剤であるＡＮ
Ｓ等は安価であり、他に高価な試薬を必要としないばか
りか、抗体選択における制約が小さいという利点を有す
る。またさらに、従来の酸エタノール抽出測定法におい
て抽出率が低いと考えられてきた一部の検体が本発明を
用いた免疫測定法で高値になる事は、本発明の測定法に
おける高抽出率がもたらした成果であり、より正確に総
ＩＧＦを抽出し測定できる方法である事実を証明してい
る。
Ｓ等は安価であり、他に高価な試薬を必要としないばか
りか、抗体選択における制約が小さいという利点を有す
る。またさらに、従来の酸エタノール抽出測定法におい
て抽出率が低いと考えられてきた一部の検体が本発明を
用いた免疫測定法で高値になる事は、本発明の測定法に
おける高抽出率がもたらした成果であり、より正確に総
ＩＧＦを抽出し測定できる方法である事実を証明してい
る。
【００３７】
【実施例】次に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるも
のでない。
明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるも
のでない。
【００３８】実施例 １ ＩＧＦ−ＩＩの放射免疫測定試薬の製造および放射免疫
学的定量： （１）ＩＧＦ−ＩＩ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−ＩＩ結合物を免疫源とし、常法により
マウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−ＩＩ抗体を種
々作製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィ
ニティーなクローンとして６Ｂを選定した。また、同様
に作製されたハイブリドーマ１Ｄ５（特開平５−２５２
９８７号）を第一製薬株式会社より入手、使用した。
学的定量： （１）ＩＧＦ−ＩＩ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−ＩＩ結合物を免疫源とし、常法により
マウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−ＩＩ抗体を種
々作製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィ
ニティーなクローンとして６Ｂを選定した。また、同様
に作製されたハイブリドーマ１Ｄ５（特開平５−２５２
９８７号）を第一製薬株式会社より入手、使用した。
【００３９】この２種類のクローンは、マウス腹水にて
製造し、飽和硫安にて塩析後ゲル濾過（ＴＳＫＧ３００
０ ＳＷＸＬ、０．０５Ｍ−ＮａＰＯ４／０．１Ｍ−Ｎ
ａ２ＰＯ４、ｐＨ６．４）にて抗体分画を得、イオン交
換（モノＱ、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０）にて精製
し、リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）で濃縮透析
した。これらの最終濃度は、１Ｄ５で８．７ｍｇ／ｍ
ｌ、６Ｂで２．６ｍｇ／ｍｌに調製した。
製造し、飽和硫安にて塩析後ゲル濾過（ＴＳＫＧ３００
０ ＳＷＸＬ、０．０５Ｍ−ＮａＰＯ４／０．１Ｍ−Ｎ
ａ２ＰＯ４、ｐＨ６．４）にて抗体分画を得、イオン交
換（モノＱ、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０）にて精製
し、リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）で濃縮透析
した。これらの最終濃度は、１Ｄ５で８．７ｍｇ／ｍ
ｌ、６Ｂで２．６ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００４０】この抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体の
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは、１Ｄ５が
０．９×１０８Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが２×１０
９Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは、１Ｄ５が
０．９×１０８Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが２×１０
９Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
【００４１】（２）１２５Ｉ標識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体の
調製 ＮＥＮ製Ｎａ１２５Ｉ ２．６ｍＣｉをシリコンコート
ガラスチューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗Ｉ
ＧＦ−ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ−６Ｂ）溶液１９６μｌ（５
００μｇ）を入れ、クロラミンＴ ３０μｇ／１０μｌ
（Ｈ２Ｏ）を加えて、２０秒間撹拌反応後、メタ重亜硫
酸ナトリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ２Ｏ）を加えて
反応を停止した。
調製 ＮＥＮ製Ｎａ１２５Ｉ ２．６ｍＣｉをシリコンコート
ガラスチューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗Ｉ
ＧＦ−ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ−６Ｂ）溶液１９６μｌ（５
００μｇ）を入れ、クロラミンＴ ３０μｇ／１０μｌ
（Ｈ２Ｏ）を加えて、２０秒間撹拌反応後、メタ重亜硫
酸ナトリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ２Ｏ）を加えて
反応を停止した。
【００４２】次いで、反応液を０．５％ＢＳＡおよび
０．１％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）にて充分に平衡化したセファクリルＳ−
３００カラム（φ１．０ｃｍ×４５ｃｍ）に添加し、カ
ラムからの溶出液を１ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ
溶出させて放射能濃度の高いピーク位置の各フラクショ
ンの免疫活性を測定して目的標識物の位置を確認しつつ
精製反応液としてプールした。
０．１％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）にて充分に平衡化したセファクリルＳ−
３００カラム（φ１．０ｃｍ×４５ｃｍ）に添加し、カ
ラムからの溶出液を１ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ
溶出させて放射能濃度の高いピーク位置の各フラクショ
ンの免疫活性を測定して目的標識物の位置を確認しつつ
精製反応液としてプールした。
【００４３】なお、反応液のペーパークロマトグラフィ
ーにより求めた標識率は９０％であり、従って比放射能
は５．９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ×０．
９０÷５００＋０．８＝５．９μＣｉ／μｇ、０．８は
計数器の計数効率）。精製反応液は、０．１％ゼラチン
および０．１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１
００ｍＭ、ｐＨ７．４）にて希釈し、最終放射能濃度を
約１４．３ｋＢｑ（０．３９μＣｉ／ｍｌ）の１２５Ｉ
標識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体試薬として調製した（ただし、
アッセイに使用する量は、約２．９ｋＢｑ／２００μｌ
／チューブである）。
ーにより求めた標識率は９０％であり、従って比放射能
は５．９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ×０．
９０÷５００＋０．８＝５．９μＣｉ／μｇ、０．８は
計数器の計数効率）。精製反応液は、０．１％ゼラチン
および０．１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１
００ｍＭ、ｐＨ７．４）にて希釈し、最終放射能濃度を
約１４．３ｋＢｑ（０．３９μＣｉ／ｍｌ）の１２５Ｉ
標識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体試薬として調製した（ただし、
アッセイに使用する量は、約２．９ｋＢｑ／２００μｌ
／チューブである）。
【００４４】（３）抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体コートビーズの
調製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０．４ｍｌの５％の洗剤液を加え、スタ
ーラーバーで撹拌してビーズ表面の削り屑を除去し、ビ
ーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去する。こ
のビーズに、５μｇ／０．２ｍｌ／ビーズの１Ｄ５モノ
クローナル抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ−１Ｄ５）を
含む１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．９）を加えて、２５
℃で一晩緩やかに撹拌し、抗体を吸着させた。各ビーズ
を脱イオン水で２回洗浄後、０．２Ｍ硫酸マグネシウム
（７水塩）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡを含
む２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．２ｍｌ
／ビーズに加えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一
晩乾燥後、抗体ビーズとした。
調製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０．４ｍｌの５％の洗剤液を加え、スタ
ーラーバーで撹拌してビーズ表面の削り屑を除去し、ビ
ーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去する。こ
のビーズに、５μｇ／０．２ｍｌ／ビーズの１Ｄ５モノ
クローナル抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体（ＭｏＡｂ−１Ｄ５）を
含む１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．９）を加えて、２５
℃で一晩緩やかに撹拌し、抗体を吸着させた。各ビーズ
を脱イオン水で２回洗浄後、０．２Ｍ硫酸マグネシウム
（７水塩）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡを含
む２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．２ｍｌ
／ビーズに加えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一
晩乾燥後、抗体ビーズとした。
【００４５】（４）標準ＩＧＦ−ＩＩ、前処理液および
中和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−ＩＩは、組み替えＤＮＡを用いたリコンピ
ナントＩＧＦ−ＩＩ（第一製薬株式会社製）を、０．１
％ＮａＮ３、０．１％ＥＤＴＡ２Ｎａおよび０．５％Ｂ
ＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて
適当な濃度に調製した。前処理液は、２５ｍＭ グリシ
ン塩酸（ｐＨ１．５）の酸性溶液を用いた。また、中和
緩衝液は、ＡＮＳ−Ｍｇ（８−Ａｎｉｌｉｎｏ−１−Ｎ
ａｐｈｔａｌｅｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ｈｅｍｉｍａ
ｇｎｅｓｉｕｍ）０．０８％、ゼラチン０．５％、ツイ
ーン＃２０ ０．１％及びＮａＮ３０．１％を含む２０
０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製準備し
た。
中和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−ＩＩは、組み替えＤＮＡを用いたリコンピ
ナントＩＧＦ−ＩＩ（第一製薬株式会社製）を、０．１
％ＮａＮ３、０．１％ＥＤＴＡ２Ｎａおよび０．５％Ｂ
ＳＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて
適当な濃度に調製した。前処理液は、２５ｍＭ グリシ
ン塩酸（ｐＨ１．５）の酸性溶液を用いた。また、中和
緩衝液は、ＡＮＳ−Ｍｇ（８−Ａｎｉｌｉｎｏ−１−Ｎ
ａｐｈｔａｌｅｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ｈｅｍｉｍａ
ｇｎｅｓｉｕｍ）０．０８％、ゼラチン０．５％、ツイ
ーン＃２０ ０．１％及びＮａＮ３０．１％を含む２０
０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製準備し
た。
【００４６】（５）血清ＩＧＦ−ＩＩの総量の測定方法
と結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被検検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１．０
ｍｌを加え、よく撹拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ−ＩＩ ５０μｌを採り、それぞれ新たに準備し
たポリスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３０
０μｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を
加えて室温で２時間振盪した。
と結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被検検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１．０
ｍｌを加え、よく撹拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ−ＩＩ ５０μｌを採り、それぞれ新たに準備し
たポリスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３０
０μｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を
加えて室温で２時間振盪した。
【００４７】１次反応終了後、反応液を吸引除去し、生
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２洗浄する。１２５Ｉ標
識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体溶液を０．２ｍｌ／チューブ添加
し、さらに室温で１時間振盪し、反応終了後、反応液を
吸引除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した
後、各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際
に標準ＩＧＦ−ＩＩの放射能量とその実濃度を検体の希
釈倍率である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づい
て作製された標準曲線を用い（表１および図１）、希釈
検体の放射能量からＩＧＦ−ＩＩの濃度を読みとった。
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２洗浄する。１２５Ｉ標
識抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体溶液を０．２ｍｌ／チューブ添加
し、さらに室温で１時間振盪し、反応終了後、反応液を
吸引除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した
後、各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際
に標準ＩＧＦ−ＩＩの放射能量とその実濃度を検体の希
釈倍率である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づい
て作製された標準曲線を用い（表１および図１）、希釈
検体の放射能量からＩＧＦ−ＩＩの濃度を読みとった。
【００４８】比較方法は、同じ検体（検体番号〜）
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表２に示す。
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表２に示す。
【００４９】
【００５０】
【００５１】実施例 ２ ＩＧＦ−Ｉの放射免疫測定試薬の製造および放射免疫学
的定量： （１）ＩＧＦ−Ｉ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−Ｉ結合物を免疫源とし、常法によりマ
ウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−Ｉ抗体を種々作
製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィニテ
ィーなクローンとして２Ｄ、６Ｂの２種類を選定した。
この２種類のクローンは、マウス腹水にて製造し、飽和
硫安にて塩析後グル濾過（ＴＳＫＧ３０００ ＳＷＸ
Ｌ、０．０５Ｍ−ＮａＰＯ４／０．１Ｍ−Ｎａ２Ｐ
Ｏ４、ｐＨ６．４）にて抗体分画を得、イオン交換（モ
ノＱ、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０）にて精製し、リ
ン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）で濃縮透析した。
これらの最終濃度は、２Ｄで７．５ｍｇ／ｍｌ、６Ｂで
２．６ｍｇ／ｍｌに調製した。
的定量： （１）ＩＧＦ−Ｉ抗体の確保 ＢＳＡ−ＩＧＦ−Ｉ結合物を免疫源とし、常法によりマ
ウスハイブリドーマに由来するＩＧＦ−Ｉ抗体を種々作
製し、常法の抗原抗体反応を利用して最も高アフィニテ
ィーなクローンとして２Ｄ、６Ｂの２種類を選定した。
この２種類のクローンは、マウス腹水にて製造し、飽和
硫安にて塩析後グル濾過（ＴＳＫＧ３０００ ＳＷＸ
Ｌ、０．０５Ｍ−ＮａＰＯ４／０．１Ｍ−Ｎａ２Ｐ
Ｏ４、ｐＨ６．４）にて抗体分画を得、イオン交換（モ
ノＱ、２０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０）にて精製し、リ
ン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）で濃縮透析した。
これらの最終濃度は、２Ｄで７．５ｍｇ／ｍｌ、６Ｂで
２．６ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００５２】この抗ＩＧＦ−ＩＩモノクローナル抗体の
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは２Ｄが７．２
×１０８Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが３．２×１０９
Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
抗体純度は、ＨＰＬＣで９５％以上であり、スキャッチ
ャード分析による親和定数とサブタイプは２Ｄが７．２
×１０８Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ１、６Ｂが３．２×１０９
Ｌ／ＭｏｌとＩｇＧ２ａであった。
【００５３】（２）１２５Ｉ標識抗ＩＧＦ−Ｉ抗体の調
製 ＮＥＮ製Ｎａ１２５Ｉ ２．６ｍＣｉをシリコンコート
ガラスチューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗Ｉ
ＧＦ−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ−６Ｂ）溶液１９６μｌ（５０
０μｇ）を入れ、クロラミンＴ３０μｇ／１０μｌ（Ｈ
２Ｏ）を加えて、２０秒間撹拌反応後、メタ重亜硫酸ナ
トリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ２Ｏ）を加えて反応
を停止した。
製 ＮＥＮ製Ｎａ１２５Ｉ ２．６ｍＣｉをシリコンコート
ガラスチューブに採り、上記の６Ｂモノクローナル抗Ｉ
ＧＦ−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ−６Ｂ）溶液１９６μｌ（５０
０μｇ）を入れ、クロラミンＴ３０μｇ／１０μｌ（Ｈ
２Ｏ）を加えて、２０秒間撹拌反応後、メタ重亜硫酸ナ
トリウムを６０μｇ／２０μｌ（Ｈ２Ｏ）を加えて反応
を停止した。
【００５４】次いで、反応液を０．５％ＢＳＡ、０．１
％ＮａＮ３を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）にて充分に平衡化したセファクリルＳ−３００カラ
ム（φ１．０ｃｍ×４５ｃｍ）に添加し、カラムからの
溶出液を１ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ溶出させて
放射能濃度の高いピーク位置の各フラクションの免疫活
性を測定して目的標識物の位置を確認しつつ精製反応液
としてプールした。なお、反応液のペーパークロマトグ
ラフィーにより求めた標識率は９０％であり、従って比
放射能は５．９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ
×０．９０÷５００÷０．８＝５．９μＣｉ／μｇ、
０．８は計数器の計数効率）。
％ＮａＮ３を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）にて充分に平衡化したセファクリルＳ−３００カラ
ム（φ１．０ｃｍ×４５ｃｍ）に添加し、カラムからの
溶出液を１ｍｌづつ分取し、２０〜２２ｍｌ溶出させて
放射能濃度の高いピーク位置の各フラクションの免疫活
性を測定して目的標識物の位置を確認しつつ精製反応液
としてプールした。なお、反応液のペーパークロマトグ
ラフィーにより求めた標識率は９０％であり、従って比
放射能は５．９μＣｉ／μｇであった（２６２０μＣｉ
×０．９０÷５００÷０．８＝５．９μＣｉ／μｇ、
０．８は計数器の計数効率）。
【００５５】精製反応液は、０．１％ゼラチンおよび
０．１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１００ｍ
Ｍ、ｐＨ７．４）にて希釈し、最終放射能濃度を約１
４．３ｋＢｑ（０．３９μＣｉ／ｍｌ）の１２５Ｉ標識
抗ＩＧＦ−Ｉ抗体試薬として調製した（ただし、アッセ
イに使用する量は、約２．９ｋＢｑ／２００μｌ／チュ
ーブである）。
０．１％ツイーン＃２０を含むリン酸緩衝液（１００ｍ
Ｍ、ｐＨ７．４）にて希釈し、最終放射能濃度を約１
４．３ｋＢｑ（０．３９μＣｉ／ｍｌ）の１２５Ｉ標識
抗ＩＧＦ−Ｉ抗体試薬として調製した（ただし、アッセ
イに使用する量は、約２．９ｋＢｑ／２００μｌ／チュ
ーブである）。
【００５６】（３）抗ＩＧＦ−Ｉ抗体コートビーズの調
製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０．４ｍｌの５％の洗剤液を加え、スタ
ーラーバーにて撹拌してビーズ表面の削り屑を除去し、
ビーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去した。
このビーズに、５μｇ／０．２ｍｌ／ビーズの２Ｄモノ
クローナル抗ＩＧＦ−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ−２Ｄ）を含む
１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５．９を加えて、２５℃で一晩
緩やかに撹拌し、抗体を吸着させた。各ビーズを脱イオ
ン水で２回洗浄後、０．２Ｍ硫酸マグネシウム（７水
塩）、０．５ＭＮａＣｌおよび０．５％ＢＳＡを含む２
５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．２ｍｌ／ビー
ズに加えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一晩乾燥
後、抗体ビーズとした。
製 ガラスビーカーに６ｍｍ直径ポリスチレンビーズ球とビ
ーズ１個あたり０．４ｍｌの５％の洗剤液を加え、スタ
ーラーバーにて撹拌してビーズ表面の削り屑を除去し、
ビーズを脱イオン水で５回洗浄して洗剤液を除去した。
このビーズに、５μｇ／０．２ｍｌ／ビーズの２Ｄモノ
クローナル抗ＩＧＦ−Ｉ抗体（ＭｏＡｂ−２Ｄ）を含む
１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５．９を加えて、２５℃で一晩
緩やかに撹拌し、抗体を吸着させた。各ビーズを脱イオ
ン水で２回洗浄後、０．２Ｍ硫酸マグネシウム（７水
塩）、０．５ＭＮａＣｌおよび０．５％ＢＳＡを含む２
５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．２ｍｌ／ビー
ズに加えて３時間静置し、同緩衝液を除去して一晩乾燥
後、抗体ビーズとした。
【００５７】（４）標準ＩＧＦ−Ｉ、前処理液および中
和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−Ｉは、組み替えＤＮＡを用いたリコンビナ
ントＩＧＦ−Ｉ（東洋紡社製）を０．１％ＮａＮ３およ
び０．５％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ６．０）にて適当な濃度に調製した。前処理液
は、２５ｍＭグリシン塩酸（ｐＨ１．５）の酸性溶液を
用いた。
和緩衝液の調製 標準ＩＧＦ−Ｉは、組み替えＤＮＡを用いたリコンビナ
ントＩＧＦ−Ｉ（東洋紡社製）を０．１％ＮａＮ３およ
び０．５％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ６．０）にて適当な濃度に調製した。前処理液
は、２５ｍＭグリシン塩酸（ｐＨ１．５）の酸性溶液を
用いた。
【００５８】また、中和緩衝液は、ＡＮＳ−Ｍｇ（８−
Ａｎｉｌｉｎｏ−１−ＮａｐｈｔａｌｅｎｅＳｕｌｆｏ
ｎｉｃ Ｈｅｍｉｍａｇｎｅｓｉｕｍ）０．１２％、サ
リチル酸ナトリウム１．０％、ゼラチン０．５％、ツイ
ーン＃２０ ０．１％およびＮａＮ３ ０．１％を含む
２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を調製準備
した。
Ａｎｉｌｉｎｏ−１−ＮａｐｈｔａｌｅｎｅＳｕｌｆｏ
ｎｉｃ Ｈｅｍｉｍａｇｎｅｓｉｕｍ）０．１２％、サ
リチル酸ナトリウム１．０％、ゼラチン０．５％、ツイ
ーン＃２０ ０．１％およびＮａＮ３ ０．１％を含む
２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を調製準備
した。
【００５９】（５）血清ＩＧＦ−Ｉの総量の測定方法と
結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被験検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１．０
ｍｌを加え、よく撹拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ−１５０μｌを採り、それぞれ新たに準備したポ
リスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３００μ
ｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を加え
て室温で２時間振盪した。
結果 ガラス試験管あるいは、ポリスチレン試験管に被験検体
の血清（検体番号〜）を２５μｌに前処理液１．０
ｍｌを加え、よく撹拌後静置した。前処理液で処理した
酸希釈検体５０μｌ、または適当な濃度に調製した標準
ＩＧＦ−１５０μｌを採り、それぞれ新たに準備したポ
リスチレンチューブに加え、さらに中和緩衝液３００μ
ｌを加えて酸を中和緩衝した後、抗体ビーズ１個を加え
て室温で２時間振盪した。
【００６０】１次反応終了後、反応液を吸引除去し、生
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２回洗浄した。１２５Ｉ
標識抗ＩＧＦ−Ｉ抗体溶液を０．２ｍｌ／チューブ添加
し、さらに室温で１時間振盪し、反応終了後、反応液を
吸引除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した
後、各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際
に標準ＩＧＦ−Ｉの放射能量とその実濃度を検体の希釈
倍率である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づいて
作製された標準曲線を用い（表３および図２）、希釈検
体の放射能量からＩＧＦ−Ｉの濃度を読みとった。
理食塩水を２ｍｌ／チューブで２回洗浄した。１２５Ｉ
標識抗ＩＧＦ−Ｉ抗体溶液を０．２ｍｌ／チューブ添加
し、さらに室温で１時間振盪し、反応終了後、反応液を
吸引除去し生理食塩水２ｍｌ／チューブで２回洗浄した
後、各チューブの放射能量を測定した。なお、測定の際
に標準ＩＧＦ−Ｉの放射能量とその実濃度を検体の希釈
倍率である４１倍で掛けた濃度（換算濃度）に基づいて
作製された標準曲線を用い（表３および図２）、希釈検
体の放射能量からＩＧＦ−Ｉの濃度を読みとった。
【００６１】比較方法は、同じ検体（検体番号〜）
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表４に示す。
について、酸エタノール抽出法を用いる以外は同様の方
法で行った。この結果を表４に示す。
【００６２】
【００６３】
Claims (10)
- 【請求項１】 生体試料中のインスリン様成長因子を免
疫学的に測定する方法であって、免疫学的測定に先立
ち、生体試料を酸溶液で処理することによりインスリン
様成長因子結合蛋白質からインスリン様成長因子を遊離
させ、次いで当該生体試料を再結合阻害剤を含有する中
和緩衝液で中和することを特徴とするインスリン様成長
因子の免疫学的測定方法。 - 【請求項２】 酸溶液が塩酸、硫酸、リン酸、蟻酸、ト
リフロロ酢酸もしくはトリクロロ酢酸、またはそれらと
グリシン、クエン酸、酢酸もしくはサリチル酸との緩衝
液である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 再結合阻害剤がＡＮＳ、サリチル酸、Ｓ
ＤＳ、ヘパリンまたはその塩である請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 中和緩衝液がリン酸緩衝液、炭酸緩衝
液、グリシン緩衝液、バルビタール緩衝液、トリス緩衝
液またはビストリス緩衝液である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 生体試料が血清、血漿、尿、腹水、胸
水、乳清、羊水、脊髄液、抽出液またはさん出液である
請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 免疫学的測定法が、競合的測定法および
二種抗体による挟み込みによるサンドイッチ法を用いた
放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法また
は化学発光測定法である請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 インスリン様成長因子がインスリン様成
長因子−Ｉまたはインスリン様成長因子−ＩＩである請
求項１記載の方法。 - 【請求項８】 少なくとも次の試薬（ａ）〜（ｃ）、 （ａ）再結合阻害剤を含有する中和緩衝液 （ｂ）標識抗インスリン様成長因子抗体 （ｃ）固相化抗インスリン様成長因子抗体 を含有する生体試料中のインスリン様成長因子測定用キ
ット。 - 【請求項９】 さらに酸溶液を含有する請求項第８項記
載の生体内のインスリン様成長因子測定用キット。 - 【請求項１０】 生体試料を酸溶液で処理することによ
りインスリン様成長因子結合蛋白質からインスリン様成
長因子を遊離させ、次いでこれを再結合阻害剤の存在下
で中和することを特徴とする生体試料の調製方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6304234A JP2789306B2 (ja) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キット |
| US08/556,397 US5691150A (en) | 1994-11-15 | 1995-11-09 | Immunoassay for insulin-like growth factors |
| EP95308078A EP0713096B1 (en) | 1994-11-15 | 1995-11-10 | Immunoassay and kit for insulin-like growth factors |
| DE69525901T DE69525901T2 (de) | 1994-11-15 | 1995-11-10 | Immunoassay und Reagenzsatz zum Nachweis von insulinähnlichen Wachstumsfaktoren |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6304234A JP2789306B2 (ja) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08145998A true JPH08145998A (ja) | 1996-06-07 |
| JP2789306B2 JP2789306B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=17930623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6304234A Expired - Lifetime JP2789306B2 (ja) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | インスリン様成長因子の免疫学的測定方法ならびにインスリン様成長因子測定用キット |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5691150A (ja) |
| EP (1) | EP0713096B1 (ja) |
| JP (1) | JP2789306B2 (ja) |
| DE (1) | DE69525901T2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000007021A1 (fr) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Procede d'analyse d'un composant physiologiquement actif |
| JP2006258673A (ja) * | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Fisheries Research Agency | 魚類のｉｇｆ−ｉ濃度の測定方法及びその方法に用いる測定キット |
| WO2007000832A1 (ja) * | 2005-06-29 | 2007-01-04 | Shibayagi Co., Ltd. | 検体中の内分泌物質測定方法。 |
| JP2009288149A (ja) * | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Tosoh Corp | Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原又はそれに対する抗体の測定方法 |
| WO2018212221A1 (ja) * | 2017-05-17 | 2018-11-22 | 富士レビオ株式会社 | インスリンの測定方法及び測定試薬 |
Families Citing this family (16)
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|---|---|---|---|---|
| US20080064044A9 (en) * | 1995-05-23 | 2008-03-13 | Nelson Randall W | Analysis of insulin-like growth factors from biological fluids by the use of affinity-based mass spectrometric methods |
| US6066464A (en) * | 1996-12-10 | 2000-05-23 | Diagnostic Systems Laboratories, Inc. | Immunoassay of IGF family of peptides, their binding proteins and related molecules in dried whole blood filter paper spots |
| DE19719001C2 (de) * | 1997-05-06 | 2001-05-10 | Schuetzdeller Angelika | Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-Like Growth Factor Binding Proteine oder löslicher Insulin-Like Growth Factor - Rezeptoren im Immunoassay |
| AU6059299A (en) * | 1998-09-25 | 2000-04-17 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Biological assay compositions containing non-interfering, foam-inhibiting and foam-collapsing agents |
| US7658959B2 (en) | 2003-06-12 | 2010-02-09 | Cargill, Incorporated | Antimicrobial salt solutions for food safety applications |
| US7090882B2 (en) | 2003-06-12 | 2006-08-15 | Cargill, Incorporated | Antimicrobial salt solutions for food safety applications |
| US7588696B2 (en) | 2003-06-12 | 2009-09-15 | Cargill, Incorporated | Antimicrobial water softener salt and solutions |
| US7883732B2 (en) | 2003-06-12 | 2011-02-08 | Cargill, Incorporated | Antimicrobial salt solutions for cheese processing applications |
| US8486472B2 (en) | 2006-01-18 | 2013-07-16 | Cargill, Incorporated | Antimicrobial salt solutions for food safety applications |
| EP2749883A4 (en) * | 2011-08-25 | 2015-05-27 | Lsi Medience Corp | METHOD FOR DETERMINING GLP-1 (GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1), AND KIT FOR USE THEREIN |
| CN102759518A (zh) * | 2012-07-31 | 2012-10-31 | 中国人民解放军第三军医大学 | 肝素钠的共振光散射检测方法 |
| ES2740851T3 (es) | 2013-12-13 | 2020-02-06 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc | Agente de tratamiento previo en ensayos sin aglutinación |
| CN104697829B (zh) * | 2015-02-10 | 2018-05-04 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 用于igf-ⅰ化学发光免疫检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法 |
| CN114112599B (zh) * | 2021-12-10 | 2024-02-13 | 泰州泽成生物技术有限公司 | 一种胰岛素样生长因子-i解离液 |
| CN114544978A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-05-27 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种igf-1检测试剂盒及其制备方法和检测方法 |
| CN117783389B (zh) * | 2023-12-28 | 2024-06-18 | 广州金域医学检验中心有限公司 | Igf-1及其变异体的质控品的制备方法 |
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