JPH07198720A - フィブリンの定量方法 - Google Patents
フィブリンの定量方法Info
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- JPH07198720A JPH07198720A JP4256707A JP25670792A JPH07198720A JP H07198720 A JPH07198720 A JP H07198720A JP 4256707 A JP4256707 A JP 4256707A JP 25670792 A JP25670792 A JP 25670792A JP H07198720 A JPH07198720 A JP H07198720A
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、実際のフィブリン定量前に、含フィブリン試
料溶液をチオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシ
ウムイオンまたは／およびグアニジニウムイオンの存在
下でインキュベートすることから成る、体液中のフィブ
リンの改善された定量方法に関するものである。
料溶液をチオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシ
ウムイオンまたは／およびグアニジニウムイオンの存在
下でインキュベートすることから成る、体液中のフィブ
リンの改善された定量方法に関するものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フィブリン含有溶液の
処理方法に関するものであり、該方法はフィブリン特異
性モノクローナル抗体を用いる、不均質なサンドイッチ
免疫測定法により、体液中のフィブリンのより信頼性の
高い定量、とりわけ、改良された免疫学的フィブリン定
量を可能にするものである。
処理方法に関するものであり、該方法はフィブリン特異
性モノクローナル抗体を用いる、不均質なサンドイッチ
免疫測定法により、体液中のフィブリンのより信頼性の
高い定量、とりわけ、改良された免疫学的フィブリン定
量を可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】活性トロンビンのフィブリノーゲンに対
する作用によって血液凝固系が活性化された場合、フィ
ブリンが形成される。フィブリノーゲン分子は２対の
α、β、及びγ鎖から成り、それらは、多数のジスルフ
ィド結合（特にＮ末端のＥ領域）で結合している。フィ
ブリノーゲンのＮ末端で、トロンビンは二つのα鎖から
フィブリノペプチドＡを切断する。それに引き続いて、
更にβ鎖から二つのフィブリノペプチドＢを切断する。
それ故生成されたフィブリンモノマーは、各々、デスＡ
Ａ（des-ＡＡ）フィブリンまたはフィブリンＩ、及びデ
スＡＡＢＢ（des-ＡＡＢＢ）フィブリンまたはフィブリ
ンＩＩと呼ばれる。次いで、これらのフィブリンモノマ
ーは凝集・架橋し、フィブリン血餅を形成する。通常、
可溶性フィブリンは、血液中に存在しない。対照的に、
種々の凝固障害（殊に消費性凝固障害）の場合に、可溶
性フィブリンが検出されることがある。従って、臨床化
学の分野では、フィブリノーゲンの存在下で、これら二
つの形態のフィブリンを、信頼できる精度で検出可能で
あることが重要である。
する作用によって血液凝固系が活性化された場合、フィ
ブリンが形成される。フィブリノーゲン分子は２対の
α、β、及びγ鎖から成り、それらは、多数のジスルフ
ィド結合（特にＮ末端のＥ領域）で結合している。フィ
ブリノーゲンのＮ末端で、トロンビンは二つのα鎖から
フィブリノペプチドＡを切断する。それに引き続いて、
更にβ鎖から二つのフィブリノペプチドＢを切断する。
それ故生成されたフィブリンモノマーは、各々、デスＡ
Ａ（des-ＡＡ）フィブリンまたはフィブリンＩ、及びデ
スＡＡＢＢ（des-ＡＡＢＢ）フィブリンまたはフィブリ
ンＩＩと呼ばれる。次いで、これらのフィブリンモノマ
ーは凝集・架橋し、フィブリン血餅を形成する。通常、
可溶性フィブリンは、血液中に存在しない。対照的に、
種々の凝固障害（殊に消費性凝固障害）の場合に、可溶
性フィブリンが検出されることがある。従って、臨床化
学の分野では、フィブリノーゲンの存在下で、これら二
つの形態のフィブリンを、信頼できる精度で検出可能で
あることが重要である。
【０００３】捕獲抗体としてフィブリン特異性モノクロ
ーナル抗体を用いる、フィブリン検知用サンドイッチ免
疫測定法については、すでに記述されている（Scheefer
s-Borchel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1
985),7091-7095）。フィブリンのα鎖のＮ末端ヘキサペ
プチドで免疫感作させる事によって、捕獲抗体であるフ
ィブリン特異性モノクローナル抗体が得られた。このペ
プチドのアミノ酸配列は Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu で
ある。前述の試験法において、フィブリンとこの抗体と
の結合は、ペルオキシダーゼで標識したポリクローナル
＜フィブリノーゲン＞抗体を使用して検知される。
ーナル抗体を用いる、フィブリン検知用サンドイッチ免
疫測定法については、すでに記述されている（Scheefer
s-Borchel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1
985),7091-7095）。フィブリンのα鎖のＮ末端ヘキサペ
プチドで免疫感作させる事によって、捕獲抗体であるフ
ィブリン特異性モノクローナル抗体が得られた。このペ
プチドのアミノ酸配列は Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu で
ある。前述の試験法において、フィブリンとこの抗体と
の結合は、ペルオキシダーゼで標識したポリクローナル
＜フィブリノーゲン＞抗体を使用して検知される。
【０００４】体液中のフィブリンをこの方法で定量した
場合、別のフィブリン検知法では明瞭にフィブリンの存
在が示されている場合でも、説明ができない程に低濃度
のフィブリン値が比較的高頻度で得られるか、またはフ
ィブリンは全く検知されないという事が今日では、分か
っている。別の問題は、従来技術の方法を用いると、例
えば、正常な血漿のようにフィブリンを含まない試料中
に、フィブリン値が測定される場合も少なくないという
問題である。この方法が事を混乱させているのは、フィ
ブリンが全く存在しないのか、あるいは、極めて低濃度
（即ち１μg ／ml）で存在するのかの識別を困難なもの
にしているからである。このことが自動化された試験装
置に殊更深刻な影響を与えるのは明らかである。正常な
血漿中の（フィブリンの）ブランク値が高いのは、容器
の壁面に吸着したフィブリノーゲンがフィブリン特異性
を持たないＰＯＤ標識抗体によって検知されることによ
る。
場合、別のフィブリン検知法では明瞭にフィブリンの存
在が示されている場合でも、説明ができない程に低濃度
のフィブリン値が比較的高頻度で得られるか、またはフ
ィブリンは全く検知されないという事が今日では、分か
っている。別の問題は、従来技術の方法を用いると、例
えば、正常な血漿のようにフィブリンを含まない試料中
に、フィブリン値が測定される場合も少なくないという
問題である。この方法が事を混乱させているのは、フィ
ブリンが全く存在しないのか、あるいは、極めて低濃度
（即ち１μg ／ml）で存在するのかの識別を困難なもの
にしているからである。このことが自動化された試験装
置に殊更深刻な影響を与えるのは明らかである。正常な
血漿中の（フィブリンの）ブランク値が高いのは、容器
の壁面に吸着したフィブリノーゲンがフィブリン特異性
を持たないＰＯＤ標識抗体によって検知されることによ
る。
【０００５】ＰＯＤ標識抗体用と捕獲抗体用に同一のフ
ィブリン特異的抗体を用い、兼用させる事によって、高
い試料ブランク値を低減させようと試みても、無駄であ
る。この変法を用いてみても、「人工的」フィブリン試
料（フィブリン標準）、即ちフィブリン溶液（例えば、
１ mol/1 NaBr 溶液に溶解させたフィブリン）を添加し
た血漿が検出されるだけである。これとは対照的に、フ
ィブリン値の高い患者からの試料からは、病理学的意味
を持つ値が認められない。それ故、現在の技術水準の方
法では、サンドイッチ検定法に同一のフィブリン特異的
抗体を使う事は不可能である。
ィブリン特異的抗体を用い、兼用させる事によって、高
い試料ブランク値を低減させようと試みても、無駄であ
る。この変法を用いてみても、「人工的」フィブリン試
料（フィブリン標準）、即ちフィブリン溶液（例えば、
１ mol/1 NaBr 溶液に溶解させたフィブリン）を添加し
た血漿が検出されるだけである。これとは対照的に、フ
ィブリン値の高い患者からの試料からは、病理学的意味
を持つ値が認められない。それ故、現在の技術水準の方
法では、サンドイッチ検定法に同一のフィブリン特異的
抗体を使う事は不可能である。
【０００６】高濃度の臭化物及び尿素は、フィブリン凝
固体を溶解できるという事が知られている（Ronby et a
l., Thrombosis Research 27 (1982) 743-749; Perlick
andBergmann, Gerinnungslaboratorium in Klinik und
Praxis, Georg Thieme Verlag Leipzig 1971, p.339;
Donnelly et al., Arch. Biochem. Biophys. 56 (195
5), 369-387) 。しかしながら、これらの方法で処理さ
れたフィブリン溶液の希釈後にフィブリンの定量の改善
は何も見られなかった。
固体を溶解できるという事が知られている（Ronby et a
l., Thrombosis Research 27 (1982) 743-749; Perlick
andBergmann, Gerinnungslaboratorium in Klinik und
Praxis, Georg Thieme Verlag Leipzig 1971, p.339;
Donnelly et al., Arch. Biochem. Biophys. 56 (195
5), 369-387) 。しかしながら、これらの方法で処理さ
れたフィブリン溶液の希釈後にフィブリンの定量の改善
は何も見られなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、現技術水準の方法に於ける難点を、たとえ部分的に
であっても、軽減する方法を供することであり、この方
法により、殊に、フィブリン定量の信頼性及び感度が向
上する。
は、現技術水準の方法に於ける難点を、たとえ部分的に
であっても、軽減する方法を供することであり、この方
法により、殊に、フィブリン定量の信頼性及び感度が向
上する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、チオシ
アン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシウムイオンまた
は／及びグアニジニウムイオンをフィブンリン含有溶液
に添加し、これをインキュベートすることを特徴とする
含フィブリン溶液の処理方法により達成される。前述の
各種イオン濃度の選定は、試料溶液中のフィブリン分子
を免疫学的定量が可能となる形態に、おそらく、複合体
または凝集物を溶解させる事により、非可逆的に変化さ
せ得る程度に、高濃度にする事が望ましい。
アン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシウムイオンまた
は／及びグアニジニウムイオンをフィブンリン含有溶液
に添加し、これをインキュベートすることを特徴とする
含フィブリン溶液の処理方法により達成される。前述の
各種イオン濃度の選定は、試料溶液中のフィブリン分子
を免疫学的定量が可能となる形態に、おそらく、複合体
または凝集物を溶解させる事により、非可逆的に変化さ
せ得る程度に、高濃度にする事が望ましい。
【０００９】驚くべき事に、本発明に従って、含フィブ
リン溶液を処理する事により、かなり信頼性の高い、体
液フィブリンの定量が可能になった。従って、本発明は
さらに、定量前に、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオ
ン、マグネシウムイオンまたは／及びグアニジニウムイ
オンをフィブリン含有試料溶液に添加し、これをインキ
ュベートし、必要ならば、この後希釈を行い、引き続
き、該溶液のフィブリン含有量を定量する事を特徴とす
る体液フィブリンの定量方法に関するものである。
リン溶液を処理する事により、かなり信頼性の高い、体
液フィブリンの定量が可能になった。従って、本発明は
さらに、定量前に、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオ
ン、マグネシウムイオンまたは／及びグアニジニウムイ
オンをフィブリン含有試料溶液に添加し、これをインキ
ュベートし、必要ならば、この後希釈を行い、引き続
き、該溶液のフィブリン含有量を定量する事を特徴とす
る体液フィブリンの定量方法に関するものである。
【００１０】意外にも、含フィブリン試料溶液を、チオ
シアン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシウムイオンま
たは／及びグアニジニウムイオンで処理する事により、
フィブリンの測定精度が相当程度向上した結果、これに
相応して、フィブリン試験の感度向上の達成が可能とな
った。殊更驚くべきことだが、極めて限られた数種の物
質だけが、この目的に適っているのである。例えば、結
局のところ、塩化物、臭化物、アルギニン及び尿素は適
当ではなかった。
シアン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシウムイオンま
たは／及びグアニジニウムイオンで処理する事により、
フィブリンの測定精度が相当程度向上した結果、これに
相応して、フィブリン試験の感度向上の達成が可能とな
った。殊更驚くべきことだが、極めて限られた数種の物
質だけが、この目的に適っているのである。例えば、結
局のところ、塩化物、臭化物、アルギニン及び尿素は適
当ではなかった。
【００１１】Scheefers-Borchel らの公知方法では検知
しないが、第三の方法を用いると、病理学的フィブリン
値が測定された血漿試料において、本発明の定量方法を
実施する場合にも、フィブリンが検知される。この第三
の方法とは、ベーリンガー・マンハイム社のＦＭテスト
である。これは、フィブリン−被覆赤血球を使用する凝
集テストである（Largo et al., Blood 47(1976)、99
1)。フィブリンが試料中に存在すると、赤血球が凝集す
るので、半定量的なフィブリン試験が可能となる。この
試験の感度は≧10μg/mlと比較的低いにもかかわらず、
Scheefers-Borchel の免疫試験ではフィブリン量 0また
は≪10μg/mlとなる試料に対して、この試験を用いると
陽性の結果が得られる事が少なくない。
しないが、第三の方法を用いると、病理学的フィブリン
値が測定された血漿試料において、本発明の定量方法を
実施する場合にも、フィブリンが検知される。この第三
の方法とは、ベーリンガー・マンハイム社のＦＭテスト
である。これは、フィブリン−被覆赤血球を使用する凝
集テストである（Largo et al., Blood 47(1976)、99
1)。フィブリンが試料中に存在すると、赤血球が凝集す
るので、半定量的なフィブリン試験が可能となる。この
試験の感度は≧10μg/mlと比較的低いにもかかわらず、
Scheefers-Borchel の免疫試験ではフィブリン量 0また
は≪10μg/mlとなる試料に対して、この試験を用いると
陽性の結果が得られる事が少なくない。
【００１２】本発明方法でのインキュベーションのため
の時間及び温度は、通常、特に限定的ではないが、イオ
ン物質添加後、該溶液を１０〜４０℃で、好ましくは、
１５〜３０℃で、１〜６０分間、好ましくは、１５〜３
０分間インキュベートするのが、便宜上好ましい。イン
キュベーション温度を低くする場合には、通常、それに
相応した分、インキュベーション時間を長くする必要が
ある。
の時間及び温度は、通常、特に限定的ではないが、イオ
ン物質添加後、該溶液を１０〜４０℃で、好ましくは、
１５〜３０℃で、１〜６０分間、好ましくは、１５〜３
０分間インキュベートするのが、便宜上好ましい。イン
キュベーション温度を低くする場合には、通常、それに
相応した分、インキュベーション時間を長くする必要が
ある。
【００１３】含フィブリン溶液をチオシアン酸イオンと
共にインキュベートする場合、該イオンをアルカリ金属
塩、マグネシウム塩またはアンモニウム塩として試料溶
液に添加するのが好ましい。この為には、試料溶液中の
チオシアン酸イオン濃度を0.5 mol/l より高く、好まし
くは、0.5〜8.5 mol/l 、更に好ましくは、0.7〜7 mol/
l とする事が好都合である。こうする事によって、たと
えチオシアン酸イオンの濃度が高くとも、フィブリノー
ゲンは全く検知されない。即ち、正常な血漿の定量に際
しては、フィブリン値が高く出る事が無い。本発明の方
法を実施するに当たって、チオシアン酸イオンを使用す
る事が特に好ましい。
共にインキュベートする場合、該イオンをアルカリ金属
塩、マグネシウム塩またはアンモニウム塩として試料溶
液に添加するのが好ましい。この為には、試料溶液中の
チオシアン酸イオン濃度を0.5 mol/l より高く、好まし
くは、0.5〜8.5 mol/l 、更に好ましくは、0.7〜7 mol/
l とする事が好都合である。こうする事によって、たと
えチオシアン酸イオンの濃度が高くとも、フィブリノー
ゲンは全く検知されない。即ち、正常な血漿の定量に際
しては、フィブリン値が高く出る事が無い。本発明の方
法を実施するに当たって、チオシアン酸イオンを使用す
る事が特に好ましい。
【００１４】含フィブリン試料溶液をヨウ素イオンと共
にインキュベートする場合は、アルカリ金属ヨウ化物、
ヨウ化マグネシウムまたはヨウ化アンモニウムの溶液と
して添加するのが好ましい。試料中のヨウ素イオン濃度
を1 mol/l より高く、好ましくは、2〜8 mol/l 、更に
好ましくは、2〜4 mol/l とする事が好都合である。更
に、溶液をチオシアン酸イオン及びヨウ素イオンの組合
せで処理すると、相乗効果があることが分かった。即
ち、両イオンの組合せは個々の効果の和を越える事が判
明した。本発明方法による、かかる実施態様において、
チオシアン酸イオン濃度として、0.2〜2 mol/l が好ま
しく、ヨウ素イオン濃度として、2〜8 mol/lが好まし
い。チオシアン酸イオン濃度として、0.5〜1.5 mol/l
が特に好ましく、ヨウ素イオン濃度として、3〜4 mol/l
が特に好ましい。チオシアン酸イオンの濃度範囲とし
ては、0.5〜1.0 mol/l が最も好ましい。
にインキュベートする場合は、アルカリ金属ヨウ化物、
ヨウ化マグネシウムまたはヨウ化アンモニウムの溶液と
して添加するのが好ましい。試料中のヨウ素イオン濃度
を1 mol/l より高く、好ましくは、2〜8 mol/l 、更に
好ましくは、2〜4 mol/l とする事が好都合である。更
に、溶液をチオシアン酸イオン及びヨウ素イオンの組合
せで処理すると、相乗効果があることが分かった。即
ち、両イオンの組合せは個々の効果の和を越える事が判
明した。本発明方法による、かかる実施態様において、
チオシアン酸イオン濃度として、0.2〜2 mol/l が好ま
しく、ヨウ素イオン濃度として、2〜8 mol/lが好まし
い。チオシアン酸イオン濃度として、0.5〜1.5 mol/l
が特に好ましく、ヨウ素イオン濃度として、3〜4 mol/l
が特に好ましい。チオシアン酸イオンの濃度範囲とし
ては、0.5〜1.0 mol/l が最も好ましい。
【００１５】試料溶液をグアニジニウムイオンと共にイ
ンキュベートする場合、これを、グアニジニウムのハロ
ゲン化水素酸塩の溶液として、特に好ましくは、グアニ
ジニウム塩酸塩の溶液として添加する。溶液中のグアニ
ジニウムイオンの濃度は1 mol/l 以下であってはなら
ず、好ましくは、1〜4 mol/l である。含フィブリン試
料溶液をマグネシウムイオンと共にインキュベートする
場合、例えば、ハロゲン化マグネシウムまたは硝酸マグ
ネシウムの様な、可溶性マグネシウム塩として添加する
のが好ましい。試料溶液中のマグネシウムイオン濃度と
しては、0.5 mol/l 以上、好ましくは、1〜3 mol/l 、
更に好ましくは、1〜2 mol/l である。
ンキュベートする場合、これを、グアニジニウムのハロ
ゲン化水素酸塩の溶液として、特に好ましくは、グアニ
ジニウム塩酸塩の溶液として添加する。溶液中のグアニ
ジニウムイオンの濃度は1 mol/l 以下であってはなら
ず、好ましくは、1〜4 mol/l である。含フィブリン試
料溶液をマグネシウムイオンと共にインキュベートする
場合、例えば、ハロゲン化マグネシウムまたは硝酸マグ
ネシウムの様な、可溶性マグネシウム塩として添加する
のが好ましい。試料溶液中のマグネシウムイオン濃度と
しては、0.5 mol/l 以上、好ましくは、1〜3 mol/l 、
更に好ましくは、1〜2 mol/l である。
【００１６】本発明に従って含フィブリン溶液を処理す
ると、後続のフィブリン定量に於ける感度が向上する。
本発明のインキュベーション工程後、定量前に、インキ
ュベーション工程での溶液中の塩濃度が高いため、一般
に、試料溶液を希釈する必要があることが分かった。こ
の為に、適当な緩衝溶液を用いて、好ましくは、試料溶
液：緩衝溶液＝1:5 〜 1:500 特に好ましくは、1:10 〜
1:200 に試料溶液を希釈する。複合体からフィブリン
を放出させる為には、単に、本発明による適切な物質の
希釈溶液を用いるだけでは不十分であり、むしろ、一般
的には、これらの物質は高濃度で試料に作用させる必要
があることに留意すべきである。そうさせた後にこそ、
初めて、希釈処理が可能なものになるのである。
ると、後続のフィブリン定量に於ける感度が向上する。
本発明のインキュベーション工程後、定量前に、インキ
ュベーション工程での溶液中の塩濃度が高いため、一般
に、試料溶液を希釈する必要があることが分かった。こ
の為に、適当な緩衝溶液を用いて、好ましくは、試料溶
液：緩衝溶液＝1:5 〜 1:500 特に好ましくは、1:10 〜
1:200 に試料溶液を希釈する。複合体からフィブリン
を放出させる為には、単に、本発明による適切な物質の
希釈溶液を用いるだけでは不十分であり、むしろ、一般
的には、これらの物質は高濃度で試料に作用させる必要
があることに留意すべきである。そうさせた後にこそ、
初めて、希釈処理が可能なものになるのである。
【００１７】本方法に於いて、本発明によるインキュベ
ーション後、試料溶液のpH値を、5.5 〜 7.5 、好まし
くは、5.8 〜 6.2 の範囲に調整した場合に、フィブリ
ン定量において向上した結果が得られる。インキュベー
ション後、pH値を、特に好ましい値である6.0 に調整し
た試料溶液を、適当な緩衝溶液で希釈した結果、フィブ
リンＩ及びフィブリンＩＩが、どちらも良好に検知され
る。一例として、0.1 mol/lのリン酸緩衝溶液（pH 6.
0）は好適な緩衝溶液である。しかし、酢酸／クエン酸
緩衝溶液を用いても、良好な結果が得られた。従って、
緩衝溶液の作用はリン酸イオンの特異的な効果によるも
のでは無く、pH値が効果を有するのである。
ーション後、試料溶液のpH値を、5.5 〜 7.5 、好まし
くは、5.8 〜 6.2 の範囲に調整した場合に、フィブリ
ン定量において向上した結果が得られる。インキュベー
ション後、pH値を、特に好ましい値である6.0 に調整し
た試料溶液を、適当な緩衝溶液で希釈した結果、フィブ
リンＩ及びフィブリンＩＩが、どちらも良好に検知され
る。一例として、0.1 mol/lのリン酸緩衝溶液（pH 6.
0）は好適な緩衝溶液である。しかし、酢酸／クエン酸
緩衝溶液を用いても、良好な結果が得られた。従って、
緩衝溶液の作用はリン酸イオンの特異的な効果によるも
のでは無く、pH値が効果を有するのである。
【００１８】試料溶液を pH 5.5 〜 6.5 に調整する事
は、原則的に、従来の実験用の酸を用いても達成可能で
あるが、血漿と混合後、その緩衝能が、混合溶液のpH値
を5.5 〜 6.5 、特に、好ましくは、6.0 に確実に達成
できる程充分に強くなければならない緩衝溶液を希釈用
試薬として使用するのがより実際的である。既に、5.5
未満のpH値に於いて、フィブリンを含まない血漿( 例え
ば正常な血漿) 中に、明瞭に高い値、即ち、偽陽性の値
が認められた事もある。
は、原則的に、従来の実験用の酸を用いても達成可能で
あるが、血漿と混合後、その緩衝能が、混合溶液のpH値
を5.5 〜 6.5 、特に、好ましくは、6.0 に確実に達成
できる程充分に強くなければならない緩衝溶液を希釈用
試薬として使用するのがより実際的である。既に、5.5
未満のpH値に於いて、フィブリンを含まない血漿( 例え
ば正常な血漿) 中に、明瞭に高い値、即ち、偽陽性の値
が認められた事もある。
【００１９】体液のフィブリンを定量する為の、本発明
による方法の最終工程は、試料溶液中のフィブリン含有
量の定量である。本工程は好ましくは、１種類以上のフ
ィブリン特異性モノクローナル抗体を使用する免疫学的
方法によって行われる。特に好ましい実施態様では、試
料溶液中のフィブリン含有量は不均質なサンドイッチ検
定によって定量される。この方法に於いては、試料溶液
を固定化したまたは固定化可能なフィブリン特異的第一
抗体及び、フィブリンと第一抗体との複合体に結合でき
かつ既知の方法で標識を測定できる標識第二抗体に接触
させるものである。
による方法の最終工程は、試料溶液中のフィブリン含有
量の定量である。本工程は好ましくは、１種類以上のフ
ィブリン特異性モノクローナル抗体を使用する免疫学的
方法によって行われる。特に好ましい実施態様では、試
料溶液中のフィブリン含有量は不均質なサンドイッチ検
定によって定量される。この方法に於いては、試料溶液
を固定化したまたは固定化可能なフィブリン特異的第一
抗体及び、フィブリンと第一抗体との複合体に結合でき
かつ既知の方法で標識を測定できる標識第二抗体に接触
させるものである。
【００２０】第一の抗体は固定化されているか、または
固定化可能である。即ち、それは、固相に結合して存在
しているか、あるいは、固相結合能力を持った状態にあ
る。固定化抗体の例は、当業者に知られた方法により、
プラスチック担体の様な固相表面に固着させた抗体であ
る。かかる固定化は、例えば、非共有結合性の吸着また
は固相表面の反応性官能基もしくは／及びスペーサー分
子と抗体との共有結合によって実現される。固定化可能
な抗体の一例は、ストレプトアビジンで表面を覆われた
固相に結合する事のできるビオチン化抗体である。ビオ
チン化抗体の調製は、通常、反応性ビオチン誘導体を抗
体のＳＨ基と反応させることによって行われる。この目
的のために、抗体の代わりに、 Ｆ（ａｂ）2 、Ｆａｂ
またはＦａｂ’断片の様な抗体断片を用いる事もできる
（F.Fieber, “Biotinylierung Monoklonaler Antikorp
er in：Monoklonale Antikorper/Herstellung und Cha
rakterisierung", Springer-Verlag Berlin,Heidelber
g,New York(1990) 299-302）。
固定化可能である。即ち、それは、固相に結合して存在
しているか、あるいは、固相結合能力を持った状態にあ
る。固定化抗体の例は、当業者に知られた方法により、
プラスチック担体の様な固相表面に固着させた抗体であ
る。かかる固定化は、例えば、非共有結合性の吸着また
は固相表面の反応性官能基もしくは／及びスペーサー分
子と抗体との共有結合によって実現される。固定化可能
な抗体の一例は、ストレプトアビジンで表面を覆われた
固相に結合する事のできるビオチン化抗体である。ビオ
チン化抗体の調製は、通常、反応性ビオチン誘導体を抗
体のＳＨ基と反応させることによって行われる。この目
的のために、抗体の代わりに、 Ｆ（ａｂ）2 、Ｆａｂ
またはＦａｂ’断片の様な抗体断片を用いる事もできる
（F.Fieber, “Biotinylierung Monoklonaler Antikorp
er in：Monoklonale Antikorper/Herstellung und Cha
rakterisierung", Springer-Verlag Berlin,Heidelber
g,New York(1990) 299-302）。
【００２１】第一の抗体は、フィブリン特異性抗体でな
ければならない。即ち、フィブリノーゲン分子に対する
有意な反応性を、ほんの少しでも持っていてはならな
い。フィブリン特異性モノクローナル抗体は、現在の技
術水準に従って、実験動物をヘキサペプチドGly-Pro-Ar
g-Val-Val-Glu で免疫感作する事によって生産する事が
可能である。本発明の方法に使用可能なフィブリン特異
性モノクローナル抗体の例として、実験動物をヘプタペ
プチド Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg で免疫感作する
事によって得られた抗体2B5 (ECACC 89112802)がある。
免疫感作の際、このペプチドは、既存の方法で、ＫＬＨ
(keyhole limpet hemocyanin) の様な担体タンパク質に
結合させて用いられる（Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78
(1981) 3034）。
ければならない。即ち、フィブリノーゲン分子に対する
有意な反応性を、ほんの少しでも持っていてはならな
い。フィブリン特異性モノクローナル抗体は、現在の技
術水準に従って、実験動物をヘキサペプチドGly-Pro-Ar
g-Val-Val-Glu で免疫感作する事によって生産する事が
可能である。本発明の方法に使用可能なフィブリン特異
性モノクローナル抗体の例として、実験動物をヘプタペ
プチド Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg で免疫感作する
事によって得られた抗体2B5 (ECACC 89112802)がある。
免疫感作の際、このペプチドは、既存の方法で、ＫＬＨ
(keyhole limpet hemocyanin) の様な担体タンパク質に
結合させて用いられる（Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78
(1981) 3034）。
【００２２】第二の抗体は、第一の抗体とフィブリンと
の複合体と反応することができる標識抗体である。この
抗体の標識は、例えば、それぞれ、酵素的、蛍光性、発
光性、放射性またはNMR-活性を持つグループである。こ
の様なマーカーグループは、当該技術分野の専門家には
既知の事柄である。これらの内で、好ましい抗体として
は、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）またはアルカ
リ性ホスファターゼの様な酵素的マーカーグループを持
つ抗体がある。ＰＯＤ標識化は、例えば、Wilson及びNa
kaneの方法によって行われる〔西洋ワサビ・ペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰＯ）を抗体に結合させる過ヨウ素酸法に
於ける最近の進展、in: 免疫蛍光法及び関連染色法(W.K
napp,L.Holubar及びG.Wick編）,Elsevier/North-Hollan
d Biomedical Press, 215-224 頁〕。
の複合体と反応することができる標識抗体である。この
抗体の標識は、例えば、それぞれ、酵素的、蛍光性、発
光性、放射性またはNMR-活性を持つグループである。こ
の様なマーカーグループは、当該技術分野の専門家には
既知の事柄である。これらの内で、好ましい抗体として
は、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）またはアルカ
リ性ホスファターゼの様な酵素的マーカーグループを持
つ抗体がある。ＰＯＤ標識化は、例えば、Wilson及びNa
kaneの方法によって行われる〔西洋ワサビ・ペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰＯ）を抗体に結合させる過ヨウ素酸法に
於ける最近の進展、in: 免疫蛍光法及び関連染色法(W.K
napp,L.Holubar及びG.Wick編）,Elsevier/North-Hollan
d Biomedical Press, 215-224 頁〕。
【００２３】第二の抗体は、第一の抗体と同一であるこ
ともあり得る。即ち、それが、同一の結合部位を持つ場
合もあり得る。一方、第二の抗体は、第一の抗体と異な
ることもあり得る。例えば、フィブリンのみならずフィ
ブリノーゲンをも認識する抗体も第二の抗体として適し
ている。この様な抗体は、例えば、抗体 1.156.317(ECA
CC No. 89060902)である。更に、第二の抗体はまた、ポ
リクローナル抗体または抗体断片であり得る。
ともあり得る。即ち、それが、同一の結合部位を持つ場
合もあり得る。一方、第二の抗体は、第一の抗体と異な
ることもあり得る。例えば、フィブリンのみならずフィ
ブリノーゲンをも認識する抗体も第二の抗体として適し
ている。この様な抗体は、例えば、抗体 1.156.317(ECA
CC No. 89060902)である。更に、第二の抗体はまた、ポ
リクローナル抗体または抗体断片であり得る。
【００２４】本発明の試料調製方法に適切な他の免疫学
的試験法は、ラテックスを用いる試験である。このラテ
ックス試験では、フィブリン特異的抗体を表面に有する
ラテクス粒子がフィブリン (二つの互いに同一なエピト
ープを有する) に付着し、やがて凝固体に成るので、濁
度が測定できる。適切な試験手順は、例えば、J.Clin.
Immunoassay 13 (1990), 127-131及びEP-A 0356 964 に
詳説されている。
的試験法は、ラテックスを用いる試験である。このラテ
ックス試験では、フィブリン特異的抗体を表面に有する
ラテクス粒子がフィブリン (二つの互いに同一なエピト
ープを有する) に付着し、やがて凝固体に成るので、濁
度が測定できる。適切な試験手順は、例えば、J.Clin.
Immunoassay 13 (1990), 127-131及びEP-A 0356 964 に
詳説されている。
【００２５】最後に、次のことも、指摘しておかなけれ
ばならない。即ち、本発明に於ける含フィブリン試料溶
液と、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシウ
ムイオンまたはグアニジニウムイオンとのインキュベー
ションは、ある程度、試料中のフィブリン含有量の後続
の定量方法に左右される。従って、固定化抗体及び標識
抗体として同一のフィブリン特異的抗体を使用する自動
化された試験では、また、ストレプトアビジン／ビオチ
ン法を使用する場合には、試料溶液中 1.5〜6.5mol/lの
チオシアン酸イオン濃度が好適である。4.0 mol/l のチ
オシアン酸イオン濃度が殊に好ましい。フィブリン特異
的固定化抗体及び第二の非特異的標識抗体を、ストレプ
トアビジン／ビオチン無しに使用する場合は、試料中の
濃度範囲が 0.7〜1.5 mol/l のチオシアン酸イオンを用
いるのが好適である。試料のインキュベーションには、
約 1.2 mol/lのチオシアン酸イオンを使用するのが、特
に好ましい。
ばならない。即ち、本発明に於ける含フィブリン試料溶
液と、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、マグネシウ
ムイオンまたはグアニジニウムイオンとのインキュベー
ションは、ある程度、試料中のフィブリン含有量の後続
の定量方法に左右される。従って、固定化抗体及び標識
抗体として同一のフィブリン特異的抗体を使用する自動
化された試験では、また、ストレプトアビジン／ビオチ
ン法を使用する場合には、試料溶液中 1.5〜6.5mol/lの
チオシアン酸イオン濃度が好適である。4.0 mol/l のチ
オシアン酸イオン濃度が殊に好ましい。フィブリン特異
的固定化抗体及び第二の非特異的標識抗体を、ストレプ
トアビジン／ビオチン無しに使用する場合は、試料中の
濃度範囲が 0.7〜1.5 mol/l のチオシアン酸イオンを用
いるのが好適である。試料のインキュベーションには、
約 1.2 mol/lのチオシアン酸イオンを使用するのが、特
に好ましい。
【００２６】更に、本発明は固体または／及び溶液とし
て、チオシアン酸塩、ヨウ化物、マグネシウム塩または
／及びグアニジニウム塩を含む試薬キットに関するもの
である。抗体 2B5及び 1.156.317はブダペスト条約の規
定により、寄託番号 ECACC 89112802 及び ECACC 89060
902 として ECACC (英国ポートンダウン) に寄託され
た。
て、チオシアン酸塩、ヨウ化物、マグネシウム塩または
／及びグアニジニウム塩を含む試薬キットに関するもの
である。抗体 2B5及び 1.156.317はブダペスト条約の規
定により、寄託番号 ECACC 89112802 及び ECACC 89060
902 として ECACC (英国ポートンダウン) に寄託され
た。
【００２７】以下の実施例によって、本発明についてさ
らに詳述する。
らに詳述する。
【００２８】
【実施例】実施例１ 固定化されたフィブリン特異的抗体及び非特異的POD 標
識抗体によるフィブリンの測定 a)一般的な注意：特にことわらない限り、抗体−POD 複
合体を複合体緩衝液で溶解し、80-120mU/ mlペルオキシ
ダーゼ活性の濃度まで調節した。完全IgG を使用せず、
Fab 断片を使用する。
識抗体によるフィブリンの測定 a)一般的な注意：特にことわらない限り、抗体−POD 複
合体を複合体緩衝液で溶解し、80-120mU/ mlペルオキシ
ダーゼ活性の濃度まで調節した。完全IgG を使用せず、
Fab 断片を使用する。
【００２９】b)試験手順（全般） 第一インキュベーション工程で、特異的抗体をプラスチ
ックキャリヤー(NUNCマイクロタイター・プレート) に
固定化する。非特異的結合を防止するため、固相の不飽
和結合部位を再被覆媒体により飽和する。第二インキュ
ベーション工程で、この抗体を試料からのフィブリンに
結合させる（第一免疫反応）。フィブリンは、このため
の二つの抗原決定基を有する。その後のPOD 標識フィブ
リン抗体との免疫反応で、サンドイッチ複合体が生成さ
れる（第二免疫反応）。生成されたサンドイッチ複合体
の量は試料中のフィブリンの濃度の目安である。その後
の洗浄工程（無結合分離）で、非結合POD 複合体を除去
する。クロモゲン(ABTS 商標名) の添加後に、チューブ
壁に結合されたPOD 活性を光度計により測定する。評価
のために夫々の一連の測定について基準曲線を確立す
る。このために、フィブリン標準溶液を試料希釈溶液で
希釈し、そして実施例1dパートa に従って前処理する。
ックキャリヤー(NUNCマイクロタイター・プレート) に
固定化する。非特異的結合を防止するため、固相の不飽
和結合部位を再被覆媒体により飽和する。第二インキュ
ベーション工程で、この抗体を試料からのフィブリンに
結合させる（第一免疫反応）。フィブリンは、このため
の二つの抗原決定基を有する。その後のPOD 標識フィブ
リン抗体との免疫反応で、サンドイッチ複合体が生成さ
れる（第二免疫反応）。生成されたサンドイッチ複合体
の量は試料中のフィブリンの濃度の目安である。その後
の洗浄工程（無結合分離）で、非結合POD 複合体を除去
する。クロモゲン(ABTS 商標名) の添加後に、チューブ
壁に結合されたPOD 活性を光度計により測定する。評価
のために夫々の一連の測定について基準曲線を確立す
る。このために、フィブリン標準溶液を試料希釈溶液で
希釈し、そして実施例1dパートa に従って前処理する。
【００３０】c)試薬 被覆溶液 緩衝液中52μg/mlのMAB 緩衝液 137 ミリモル/lのNaCl、2.68ミリモル/l
のKCl 、8.09ミリモル/lのNa2HPO4 、1.47ミリモル/lの
KH2PO4、pH7.3 洗浄緩衝液 0.05％のトゥイーン（商標名）20を含む
緩衝液 再被覆溶液 緩衝液中１％のカゼイン、３モル/lの尿
素 試料希釈液 0.1 モル/lのリン酸緩衝液、pH6.0 ；0.
05％のトゥイーン（商標名）20 複合体溶液 0.035 モル/lのリン酸ナトリウム、0.15
4 モル/lのNaCl、１％のポリエチレングリコール40000
、0.2 ％のウシ血清アルブミン、0.05％のトゥイーン
（商標名）20、pH7.4中のPOD とMAB 1.156.317 の複合
体(POD活性：0.085U POD/ ml) 基質溶液 0.06モル/lのリン酸水素二ナトリウム、
0.04モル/lのクエン酸、3.3 ミリモル/lの過ホウ酸ナト
リウム、pH4.5中の0.95mgのABTS（商標名)/ml（2,2'-
アジノ- ジ(3- エチルベンゾチアゾリン- スルホネート
-6) 試料インキュベーション溶液：特にことわらない限り、
2.4 モル/lのチオシアン酸カリウム フィブリン標準液 試料希釈液中の100 μg/
mlのフィブリンＩ。試料希釈液で希釈することにより更
に標準希釈液を調製する。 d)試料 試料採取（クエン酸塩血漿） 新たに採取した血液９部を抗凝血物質１部と混合し、続
いて2000g で10分間遠心分離する（通常の実験室用遠心
分離機で約3000rpm)。上澄みをピペットで除去する。
のKCl 、8.09ミリモル/lのNa2HPO4 、1.47ミリモル/lの
KH2PO4、pH7.3 洗浄緩衝液 0.05％のトゥイーン（商標名）20を含む
緩衝液 再被覆溶液 緩衝液中１％のカゼイン、３モル/lの尿
素 試料希釈液 0.1 モル/lのリン酸緩衝液、pH6.0 ；0.
05％のトゥイーン（商標名）20 複合体溶液 0.035 モル/lのリン酸ナトリウム、0.15
4 モル/lのNaCl、１％のポリエチレングリコール40000
、0.2 ％のウシ血清アルブミン、0.05％のトゥイーン
（商標名）20、pH7.4中のPOD とMAB 1.156.317 の複合
体(POD活性：0.085U POD/ ml) 基質溶液 0.06モル/lのリン酸水素二ナトリウム、
0.04モル/lのクエン酸、3.3 ミリモル/lの過ホウ酸ナト
リウム、pH4.5中の0.95mgのABTS（商標名)/ml（2,2'-
アジノ- ジ(3- エチルベンゾチアゾリン- スルホネート
-6) 試料インキュベーション溶液：特にことわらない限り、
2.4 モル/lのチオシアン酸カリウム フィブリン標準液 試料希釈液中の100 μg/
mlのフィブリンＩ。試料希釈液で希釈することにより更
に標準希釈液を調製する。 d)試料 試料採取（クエン酸塩血漿） 新たに採取した血液９部を抗凝血物質１部と混合し、続
いて2000g で10分間遠心分離する（通常の実験室用遠心
分離機で約3000rpm)。上澄みをピペットで除去する。
【００３１】その後の手順は、以下に記載のとおりであ
る： 試料調製 a)上記の塩を使用しない方法：試料１部を試料希釈液10
0 部と混合する。この混合物は、以下、試料溶液と称さ
れる。
る： 試料調製 a)上記の塩を使用しない方法：試料１部を試料希釈液10
0 部と混合する。この混合物は、以下、試料溶液と称さ
れる。
【００３２】b)上記の塩を使用する方法：試料１部を試
料インキュベーション溶液（例えば、KSCN、2.4 モル/
l）１部と混合し、そして室温で30分間インキュベート
する。この混合物は、以下、試料溶液と称される。こう
して、試料インキュベーション溶液中のチオシアン酸イ
オン、ヨウ素イオン、マグネシウムイオン及び／または
グアニジニウムイオンの濃度は、試料溶液の濃度の２倍
である。次に、この溶液１部を試料希釈液（リン酸緩衝
液、pH6.0；1+1 混合物に関して）50部で希釈する。
料インキュベーション溶液（例えば、KSCN、2.4 モル/
l）１部と混合し、そして室温で30分間インキュベート
する。この混合物は、以下、試料溶液と称される。こう
して、試料インキュベーション溶液中のチオシアン酸イ
オン、ヨウ素イオン、マグネシウムイオン及び／または
グアニジニウムイオンの濃度は、試料溶液の濃度の２倍
である。次に、この溶液１部を試料希釈液（リン酸緩衝
液、pH6.0；1+1 混合物に関して）50部で希釈する。
【００３３】e)被覆溶液0.1 mlをマイクロタイター・プ
レートの夫々のウェルに添加する。それを室温で30分間
振とうし、空にし、再被覆溶液0.15mlを添加する。室温
で15分間振とうした後、それを毎回0.3 mlの洗浄緩衝液
で２回洗浄する。実施例１(d) に従って調製した試料0.
1 mlをウェルに添加する。それを室温で30分間振とう
し、毎回0.3 mlの洗浄緩衝液で３回洗浄する。POD 標識
抗体0.1 mlを添加し、室温で15分間振とうし、毎回0.3
mlの洗浄緩衝液で４回洗浄する。基質溶液0.1 mlを添加
し、室温で15分間振とうし、吸光度を410nm で測定す
る。
レートの夫々のウェルに添加する。それを室温で30分間
振とうし、空にし、再被覆溶液0.15mlを添加する。室温
で15分間振とうした後、それを毎回0.3 mlの洗浄緩衝液
で２回洗浄する。実施例１(d) に従って調製した試料0.
1 mlをウェルに添加する。それを室温で30分間振とう
し、毎回0.3 mlの洗浄緩衝液で３回洗浄する。POD 標識
抗体0.1 mlを添加し、室温で15分間振とうし、毎回0.3
mlの洗浄緩衝液で４回洗浄する。基質溶液0.1 mlを添加
し、室温で15分間振とうし、吸光度を410nm で測定す
る。
【００３４】波長： 410nm 基準波長：490nm 測定： 試薬ブランクに対して f)較正曲線の作成 フィブリン標準溶液(100μg/ml) を較正のために使用す
る。
る。
【００３５】混合に関する表： フィブリン標準希釈液の濃度 μg/ml フィブリン 0 10 5 50 75 100 フィブリン - 10μl 25μl 50μl 75μl 100μl 標準溶液 100 μg/ml 試料希釈液 100μl 90μl 75μl 50μl 25μl - 全ての標準希釈液は、試験に使用する前の試料と同様に
前処理または希釈する必要がある。
前処理または希釈する必要がある。
【００３６】g)本発明による試料調製後のフィブリン測
定 フィブリン試験の感度の実質的な増加は試料溶液へのチ
オシアン酸イオンの添加により得られる（表１）。微量
のトロンビン(10 mlの血漿当たり50mUのトロンビン) を
ヒトクエン酸塩血漿に添加し、10分後に、トロンビン活
性を抑制するために血漿１ml当たり2.0USP単位のヘパリ
ンを添加した。初期値を測定するために、トロンビンを
ヘパリンを含む血漿にピペットで入れた（０分値）。次
に試料を実施例1dと同様にして前処理した。
定 フィブリン試験の感度の実質的な増加は試料溶液へのチ
オシアン酸イオンの添加により得られる（表１）。微量
のトロンビン(10 mlの血漿当たり50mUのトロンビン) を
ヒトクエン酸塩血漿に添加し、10分後に、トロンビン活
性を抑制するために血漿１ml当たり2.0USP単位のヘパリ
ンを添加した。初期値を測定するために、トロンビンを
ヘパリンを含む血漿にピペットで入れた（０分値）。次
に試料を実施例1dと同様にして前処理した。
【００３７】
【表１】
【００３８】結果：試料をチオシアン酸塩と共にインキ
ュベートすることは、広い濃度範囲にわたって血漿中の
フィブリン試験の感度の増加をもたらす。また、グアニ
ジニウム塩酸塩による試料の前処理は、フィブリン試験
の感度を改善する（表２）。試料調製及び測定方法を、
チオシアン酸塩を添加した実験と同様にして行った。
ュベートすることは、広い濃度範囲にわたって血漿中の
フィブリン試験の感度の増加をもたらす。また、グアニ
ジニウム塩酸塩による試料の前処理は、フィブリン試験
の感度を改善する（表２）。試料調製及び測定方法を、
チオシアン酸塩を添加した実験と同様にして行った。
【００３９】
【表２】
【００４０】更に別の実験に於いて、最初に抗凝血物質
を添加しないで、血液を健康なヒトから採取した。表３
に示した時間に、抗凝血物質を採取した血液のアリコー
トに添加した（血液９部＋0.11モル/lのクエン酸三ナト
リウム、200 IU/ mlのヘパリン、0.02モル/lのε−アミ
ノカプロン酸、0.33mg/100mlのアプロチニンからなる抗
凝血物質１部）。続いてそれらを遠心分離し、得られた
血漿をフィブリン試験に使用した。抗凝血物質は凝血系
の活性化を防止する。既に存在している凝血プロテアー
ゼ、特にトロンビンはヘパリンにより失活される。こう
して添加後に更に別のフィブリンが生成し得ず、そして
血漿試料はその個々の活性状態で保存される。ε−アミ
ノカプロン酸及びアプロチニンは繊維素溶解系の活性化
を防止し、こうして夫々の時間に既に生成されたフィブ
リンの分解に反作用する。
を添加しないで、血液を健康なヒトから採取した。表３
に示した時間に、抗凝血物質を採取した血液のアリコー
トに添加した（血液９部＋0.11モル/lのクエン酸三ナト
リウム、200 IU/ mlのヘパリン、0.02モル/lのε−アミ
ノカプロン酸、0.33mg/100mlのアプロチニンからなる抗
凝血物質１部）。続いてそれらを遠心分離し、得られた
血漿をフィブリン試験に使用した。抗凝血物質は凝血系
の活性化を防止する。既に存在している凝血プロテアー
ゼ、特にトロンビンはヘパリンにより失活される。こう
して添加後に更に別のフィブリンが生成し得ず、そして
血漿試料はその個々の活性状態で保存される。ε−アミ
ノカプロン酸及びアプロチニンは繊維素溶解系の活性化
を防止し、こうして夫々の時間に既に生成されたフィブ
リンの分解に反作用する。
【００４１】(A) 実施例1d、パートa による試料の希釈 (B) 実施例1d、パートb と同様のチオシアン酸塩による
試料の前処理( 試料インキュベーション溶液中の2.4 モ
ル/lのチオシアン酸カリウム、室温で15分間インキュベ
ーション)
試料の前処理( 試料インキュベーション溶液中の2.4 モ
ル/lのチオシアン酸カリウム、室温で15分間インキュベ
ーション)
【００４２】
【表３】
【００４３】結果：試料へのチオシアン酸塩の添加は試
験シグナルの感度をかなり増加させる。実施例２ 固定化されたビオチニル化フィブリン特異的抗体及びペ
ルオキシダーゼ(POD)標識抗体によるフィブリンの免疫
測定 フィブリン特異的モノクローナル抗体をビオチニル化形
態で使用する。ストレプトアビジンで被覆した反応容器
（欧州特許出願第0269092 号に従って製造した）を使用
する。
験シグナルの感度をかなり増加させる。実施例２ 固定化されたビオチニル化フィブリン特異的抗体及びペ
ルオキシダーゼ(POD)標識抗体によるフィブリンの免疫
測定 フィブリン特異的モノクローナル抗体をビオチニル化形
態で使用する。ストレプトアビジンで被覆した反応容器
（欧州特許出願第0269092 号に従って製造した）を使用
する。
【００４４】試薬 ビオチニル化抗体、処理溶液：0.085 モル/lのリン酸二
水素カリウム、0.015モル/lのリン酸水素二カリウム、
0.5 ％のウシ血清アルブミン、0.05％のトゥイーン（商
標名）20中の抗体2B5 とビオチンの複合体1.3 μg/ml 洗浄液：4.3 ミリモル/lの塩化ナトリウム POD 複合体溶液：0.035 モル/lのリン酸ナトリウム、0.
154 モル/lのNaCl、１％のポリエチレングリコール4000
0 、0.2 ％のウシ血清アルブミン、0.05％のトゥイーン
（商標名）20、pH7.4 中の抗体2B5 とPOD の複合体［PO
D 活性0.139U/ml］ 基質溶液(ABTS(商標名))：0.06モル/lのリン酸水素二ナ
トリウム、0.04モル/lのクエン酸、3.3 ミリモル/lの過
ホウ酸ナトリウム、pH4.5 中の0.95mgのABTS( 商標名)/
ml 測定手順：試料20μl を実施例1dに従って前処理する
（チオシアン酸塩、ヨウ化物またはグアニジニウム塩酸
塩の濃度に関して、表を参照のこと）。ビオチニル化抗
体の処理溶液１mlを添加し、室温で30分間インキュベー
トし、空にした反応容器を洗浄液で２回洗浄する。
水素カリウム、0.015モル/lのリン酸水素二カリウム、
0.5 ％のウシ血清アルブミン、0.05％のトゥイーン（商
標名）20中の抗体2B5 とビオチンの複合体1.3 μg/ml 洗浄液：4.3 ミリモル/lの塩化ナトリウム POD 複合体溶液：0.035 モル/lのリン酸ナトリウム、0.
154 モル/lのNaCl、１％のポリエチレングリコール4000
0 、0.2 ％のウシ血清アルブミン、0.05％のトゥイーン
（商標名）20、pH7.4 中の抗体2B5 とPOD の複合体［PO
D 活性0.139U/ml］ 基質溶液(ABTS(商標名))：0.06モル/lのリン酸水素二ナ
トリウム、0.04モル/lのクエン酸、3.3 ミリモル/lの過
ホウ酸ナトリウム、pH4.5 中の0.95mgのABTS( 商標名)/
ml 測定手順：試料20μl を実施例1dに従って前処理する
（チオシアン酸塩、ヨウ化物またはグアニジニウム塩酸
塩の濃度に関して、表を参照のこと）。ビオチニル化抗
体の処理溶液１mlを添加し、室温で30分間インキュベー
トし、空にした反応容器を洗浄液で２回洗浄する。
【００４５】POD 複合体溶液１mlを添加し、室温で30分
間インキュベートし、空にした反応容器を洗浄液で２回
洗浄する。基質溶液１mlを添加し、室温で30分間インキ
ュベートし、発色を405nm で測定する。
間インキュベートし、空にした反応容器を洗浄液で２回
洗浄する。基質溶液１mlを添加し、室温で30分間インキ
ュベートし、発色を405nm で測定する。
【００４６】
【表４】
【００４７】チオシアン酸塩を添加しない場合、フィブ
リンがフィブリン標準液、即ち、正常の血漿に１モル/l
のNaBr溶液中のフィブリン溶液を補給することにより得
られた試料中にのみ検出される。対照的に、チオシアン
酸塩を試料調製に使用する場合には、フィブリンが患者
試料中に検出される。試料ブランク（正常の血漿）もチ
オシアン酸イオンによる前処理で非常に低い。これは、
試料をチオシアン酸イオンで前処理する場合に、フィブ
リノーゲンも検出されないことを示す。
リンがフィブリン標準液、即ち、正常の血漿に１モル/l
のNaBr溶液中のフィブリン溶液を補給することにより得
られた試料中にのみ検出される。対照的に、チオシアン
酸塩を試料調製に使用する場合には、フィブリンが患者
試料中に検出される。試料ブランク（正常の血漿）もチ
オシアン酸イオンによる前処理で非常に低い。これは、
試料をチオシアン酸イオンで前処理する場合に、フィブ
リノーゲンも検出されないことを示す。
【００４８】
【表５】
【００４９】使用したチオシアン酸イオン濃度では、測
定値は例えばフィブリノーゲンによりゆがめられない。
更に別の実験で、チオシアン酸イオンの濃度は測定値に
誤差を生じないで試料溶液中6.5 モル/lまで増加し得る
ことが実証できた。
定値は例えばフィブリノーゲンによりゆがめられない。
更に別の実験で、チオシアン酸イオンの濃度は測定値に
誤差を生じないで試料溶液中6.5 モル/lまで増加し得る
ことが実証できた。
【００５０】
【表６】
【００５１】フィブリンの測定を既に試料前処理後に短
時間で行うことができるが、チオシアン酸塩溶液の添加
の15〜30分後に行うことが好ましい。これがまた表７に
より示される。
時間で行うことができるが、チオシアン酸塩溶液の添加
の15〜30分後に行うことが好ましい。これがまた表７に
より示される。
【００５２】
【表７】
【００５３】
【表８】
【００５４】活性化した血漿試料は、全血を13分または
16分の期間にわたって放置することにより表３に記載し
た実験の方法と同様にして得た。この実験は、グアニジ
ニウム塩酸塩及びチオシアン酸塩を用いた試料調製がフ
ィブリン試験の改良をもたらすことを示す。更に別の実
験で、血漿中のフィブリン試験の感度に対するマグネシ
ウムイオン添加の効果を調べた。結果を表９に示す。
16分の期間にわたって放置することにより表３に記載し
た実験の方法と同様にして得た。この実験は、グアニジ
ニウム塩酸塩及びチオシアン酸塩を用いた試料調製がフ
ィブリン試験の改良をもたらすことを示す。更に別の実
験で、血漿中のフィブリン試験の感度に対するマグネシ
ウムイオン添加の効果を調べた。結果を表９に示す。
【００５５】
【表９】
【００５６】実施例３ ヨウ化物またはチオシアン酸塩とヨウ化物の組み合わせ
とのインキュベーションによるフィブリン試験の改良 Largo の参考方法で陽性に反応した異常の血漿試料を実
施例1d) に記載したように前処理した。フィブリンの測
定を実施例２に記載したようにして行った。表10はヨウ
化物、チオシアン酸塩及びヨウ化物とチオシアン酸塩の
組み合わせとのインキュベーション後のフィブリンの回
収を示す。
とのインキュベーションによるフィブリン試験の改良 Largo の参考方法で陽性に反応した異常の血漿試料を実
施例1d) に記載したように前処理した。フィブリンの測
定を実施例２に記載したようにして行った。表10はヨウ
化物、チオシアン酸塩及びヨウ化物とチオシアン酸塩の
組み合わせとのインキュベーション後のフィブリンの回
収を示す。
【００５７】
【表１０】
【００５８】表10は、組み合わせに於いて、チオシアン
酸塩とヨウ化物が互いに相乗的に相補することを示す。
この効果は7.5 モル/lのNaI 単独の場合約70％達成され
るにすぎない（表中の数値はフィブリンの値（μg/ml)
を示す) 。（血漿試料１〜13：括弧内の数値（％）は８
モル/lのチオシアン酸イオンによる試料の前処理に対す
るフィブリン（μg/ml) の回収率を示す）。
酸塩とヨウ化物が互いに相乗的に相補することを示す。
この効果は7.5 モル/lのNaI 単独の場合約70％達成され
るにすぎない（表中の数値はフィブリンの値（μg/ml)
を示す) 。（血漿試料１〜13：括弧内の数値（％）は８
モル/lのチオシアン酸イオンによる試料の前処理に対す
るフィブリン（μg/ml) の回収率を示す）。
【００５９】
【表１１】
【００６０】表11は、測定シグナルの増加が5.0 モル/l
のヨウ化ナトリウムと較べて7.5 モル/lのヨウ化ナトリ
ウムで得ることができること（表12を参照のこと) 、及
び0.98モル/lのチオシアン酸塩が顕著な効果を現さない
ことを示す。
のヨウ化ナトリウムと較べて7.5 モル/lのヨウ化ナトリ
ウムで得ることができること（表12を参照のこと) 、及
び0.98モル/lのチオシアン酸塩が顕著な効果を現さない
ことを示す。
【００６１】
【表１２】 両方のイオンの組み合わせが前記の濃度で相乗効果を生
じる。
じる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴェルナー ナゼル ドイツ連邦共和国 Ｗ−8120 ヴァイレン ハイム アム マイステランガー 18 (72)発明者 ビートゥス オフェンロッホ−ヘーンル ドイツ連邦共和国 Ｗ−8121 ハウンショ ーフェン クロイツベルグシュトラーセ １
Claims (5)
- 【請求項１】 チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、マ
グネシウムイオンまたは／及びグアニジニウムイオンを
フィブリン含有試料に添加し、得られた試料溶液をイン
キュベートすることから成るフィブリン含有試料の処理
方法。 - 【請求項２】 該試料をチオシアン酸イオン及びヨウ素
イオンと共にインキュベートすることから成る、請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 定量に先立って、チオシアン酸イオン、
ヨウ素イオン、マグネシウムイオンまたは／及びグアニ
ジニウムイオンをフィブリン含有試料に添加し、インキ
ュベートし、必要ならば、インキュベーション後該試料
を希釈し、続いて、該試料中のフィブリン含有量を定量
することから成る体液中のフィブリンの定量方法。 - 【請求項４】 少なくとも１種のフィブリン特異性モノ
クローナル抗体を用いてフィブリンの定量を行う、請求
項３記載の方法。 - 【請求項５】 ストレプトアビジンを固着させた固相に
対して結合能を持つビオチン化抗体またはビオチン化抗
体の断片を第一抗体として用いる、請求項４記載の方
法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4131953 | 1991-09-25 | ||
| DE4131953:2 | 1991-10-22 | ||
| DE4134833:8 | 1991-10-22 | ||
| DE4134833A DE4134833A1 (de) | 1991-09-25 | 1991-10-22 | Verfahren zur bestimmung von fibrin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07198720A true JPH07198720A (ja) | 1995-08-01 |
| JP2501518B2 JP2501518B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
ID=25907702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4256707A Expired - Lifetime JP2501518B2 (ja) | 1991-09-25 | 1992-09-25 | フィブリンの定量方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5441869A (ja) |
| EP (1) | EP0534444B1 (ja) |
| JP (1) | JP2501518B2 (ja) |
| AT (1) | ATE136122T1 (ja) |
| DE (2) | DE4134833A1 (ja) |
| ES (1) | ES2086038T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5821068A (en) * | 1993-11-02 | 1998-10-13 | Iatron Laboratories, Inc. | Anti-human soluble fibrin antibody, hybridoma, and immunoassaying method |
| DE4434093A1 (de) * | 1994-09-23 | 1996-03-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz |
| US5962340A (en) * | 1994-11-02 | 1999-10-05 | Wako Pure Chemical Industries Ltd. | Homogeneous immunoassay method utilizing 5-300 mM magnesium |
| AU2003220188A1 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-29 | President And Fellows Of Harvard College | Detection and quantification of modified proteins |
| DE10222234A1 (de) * | 2002-05-16 | 2003-11-27 | Roche Diagnostics Gmbh | Kontroll- und Kalibrationsmaterial für Blutgerinnungstests |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3400434A1 (de) * | 1984-01-09 | 1985-09-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Bestimmung von fibrin mit fibrin-spezifischen antikoerpern |
| US4658022A (en) * | 1985-08-08 | 1987-04-14 | Molecular Diagnostics, Inc. | Binding of antibody reagents to denatured protein analytes |
| US4916070A (en) * | 1986-04-14 | 1990-04-10 | The General Hospital Corporation | Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies |
| DE3730059A1 (de) * | 1987-09-08 | 1989-03-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
| US5120834A (en) * | 1988-06-13 | 1992-06-09 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Fibrin-specific monoclonal antibody |
| US5091512A (en) * | 1988-06-13 | 1992-02-25 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Fibrinogen-specific monoclonal antibody |
| DE3829245A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
-
1991
- 1991-10-22 DE DE4134833A patent/DE4134833A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-09-14 US US07/944,691 patent/US5441869A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-24 EP EP92116414A patent/EP0534444B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 AT AT92116414T patent/ATE136122T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 ES ES92116414T patent/ES2086038T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 DE DE59205827T patent/DE59205827D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-25 JP JP4256707A patent/JP2501518B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| DE4134833A1 (de) | 1993-04-01 |
| EP0534444A1 (de) | 1993-03-31 |
| EP0534444B1 (de) | 1996-03-27 |
| DE59205827D1 (de) | 1996-05-02 |
| US5441869A (en) | 1995-08-15 |
| ATE136122T1 (de) | 1996-04-15 |
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| ES2086038T3 (es) | 1996-06-16 |
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