JP2000162213A - 免疫検定法における干渉を減らすためのシステム - Google Patents
免疫検定法における干渉を減らすためのシステムInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 干渉体の影響の少ない免疫検定法の提供。
【解決手段】 分析対象物と特異的に結合する少なくと
も２種の免疫反応体（ここで、免疫反応体の一方は、酵
素で標識されており、免疫反応体と酵素とのポリマー又
はオリゴマーの形態にある）とサンプルとを接触させる
工程を含む、生物学的流体のサンプル中の分析対象物を
測定するための方法において、該生物学的流体のサンプ
ルを、該免疫反応体を標識するために使用される該酵素
と、異なる水溶性タンパク質又は非タンパク質系の天
然、合成もしくは半合成ポリマーもしくはオリゴマーと
の架橋ポリマー結合体と合わせる工程を含むことを特徴
とする方法。
も２種の免疫反応体（ここで、免疫反応体の一方は、酵
素で標識されており、免疫反応体と酵素とのポリマー又
はオリゴマーの形態にある）とサンプルとを接触させる
工程を含む、生物学的流体のサンプル中の分析対象物を
測定するための方法において、該生物学的流体のサンプ
ルを、該免疫反応体を標識するために使用される該酵素
と、異なる水溶性タンパク質又は非タンパク質系の天
然、合成もしくは半合成ポリマーもしくはオリゴマーと
の架橋ポリマー結合体と合わせる工程を含むことを特徴
とする方法。
Description
【０００１】
【従来の技術】免疫検定法は、その特に高い特異性及び
感度のため、医療や診断のための血清、血漿、尿又は他
の体液サンプル中のタンパク質の検出にしばしば使用さ
れる。種々の分析対象物、たとえば甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、トロポニン、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）
又は心臓ホルモンがサンドイッチ型免疫検定法によって
高感度で検出可能であるが、多くの分析対象物に関し
て、分析及び機能感度の要件はますます厳しくなってい
る。これは、ＴＳＨの場合に特に当てはまる。理由は、
低レベルのＴＳＨ（約０．１μIU/ml）は、非常に低レ
ベルのＴＳＨ（約０．０１μIU/ml）の場合とは異なる
疾患によって生じることがあるからである。そのため、
ＴＳＨ測定値に基づいて異なる治療方法が選択されるか
もしれない。これは、報告されるＴＳＨ結果が免疫検定
の下限値の誤差によって歪曲されてはならないことを要
求する。
感度のため、医療や診断のための血清、血漿、尿又は他
の体液サンプル中のタンパク質の検出にしばしば使用さ
れる。種々の分析対象物、たとえば甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、トロポニン、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）
又は心臓ホルモンがサンドイッチ型免疫検定法によって
高感度で検出可能であるが、多くの分析対象物に関し
て、分析及び機能感度の要件はますます厳しくなってい
る。これは、ＴＳＨの場合に特に当てはまる。理由は、
低レベルのＴＳＨ（約０．１μIU/ml）は、非常に低レ
ベルのＴＳＨ（約０．０１μIU/ml）の場合とは異なる
疾患によって生じることがあるからである。そのため、
ＴＳＨ測定値に基づいて異なる治療方法が選択されるか
もしれない。これは、報告されるＴＳＨ結果が免疫検定
の下限値の誤差によって歪曲されてはならないことを要
求する。
【０００２】ＴＳＨの場合、検定は世代で分類され、１
〜２μIU/mlで２０％又はそれより良好な全ＣＶの検定
が第一世代ＴＳＨ検定と呼ばれる。検定が２０％の誤差
で測定することができる分析対象物の最低レベルが検定
の機能感度と呼ばれる。０．１〜０．２μIU/mlの機能
感度のＴＳＨ検定が第二世代と呼ばれ、相応に、０．０
１〜０．０２μIU/mlの機能感度のＴＳＨ検定が第三世
代と呼ばれる。現時点で、ＴＳＨに関しては、第三世代
免疫検定が技術水準とみなされている。
〜２μIU/mlで２０％又はそれより良好な全ＣＶの検定
が第一世代ＴＳＨ検定と呼ばれる。検定が２０％の誤差
で測定することができる分析対象物の最低レベルが検定
の機能感度と呼ばれる。０．１〜０．２μIU/mlの機能
感度のＴＳＨ検定が第二世代と呼ばれ、相応に、０．０
１〜０．０２μIU/mlの機能感度のＴＳＨ検定が第三世
代と呼ばれる。現時点で、ＴＳＨに関しては、第三世代
免疫検定が技術水準とみなされている。
【０００３】ＴＳＨのような分析対象物を検出するため
に一般に利用される有効な方法は、分析対象物分子上の
１種のエピトープに対して特異性である第一の抗体と、
その分析対象物上の別のエピトープに対する、酵素又は
信号を発することができる他のラベルで標識された第二
の抗体の使用を伴う。これが、２種の抗体と抗原とのサ
ンドイッチ複合体の形成を可能にする。第一の抗体は、
固体支持体に直接取り付けることもできるし、それ自体
が免疫反応体を介して固体支持体に結合されるハプテン
ラベル、たとえばフルオレセイン誘導体を介して結合さ
せることもできる。このような検定の感度は、多様な要
因、たとえば使用される抗体の親和力及び第二の抗体と
の結合によって発される信号の量によって決まる。この
ような検定の感度を増すために可能な一つの方法は、酵
素と第二の抗体との高分子結合体を使用する方法であ
る。１個の分析対象物分子によるそのような結合体の結
合が、従来の方法で調製される酵素結合体よりもはるか
に強い信号を発生させる。理由は、形成される免疫複合
体の中にいくつかの信号生成性酵素分子が存在するから
である。この手法の問題点は、結合体の高分子性が、検
定される体液サンプル（たとえば血清）中の他の非分析
対象成分に対する、患者固有の血清中の標的抗原の過小
回収を生じさせる実質的に増大した結合活性につながり
かねないという発見にある。
に一般に利用される有効な方法は、分析対象物分子上の
１種のエピトープに対して特異性である第一の抗体と、
その分析対象物上の別のエピトープに対する、酵素又は
信号を発することができる他のラベルで標識された第二
の抗体の使用を伴う。これが、２種の抗体と抗原とのサ
ンドイッチ複合体の形成を可能にする。第一の抗体は、
固体支持体に直接取り付けることもできるし、それ自体
が免疫反応体を介して固体支持体に結合されるハプテン
ラベル、たとえばフルオレセイン誘導体を介して結合さ
せることもできる。このような検定の感度は、多様な要
因、たとえば使用される抗体の親和力及び第二の抗体と
の結合によって発される信号の量によって決まる。この
ような検定の感度を増すために可能な一つの方法は、酵
素と第二の抗体との高分子結合体を使用する方法であ
る。１個の分析対象物分子によるそのような結合体の結
合が、従来の方法で調製される酵素結合体よりもはるか
に強い信号を発生させる。理由は、形成される免疫複合
体の中にいくつかの信号生成性酵素分子が存在するから
である。この手法の問題点は、結合体の高分子性が、検
定される体液サンプル（たとえば血清）中の他の非分析
対象成分に対する、患者固有の血清中の標的抗原の過小
回収を生じさせる実質的に増大した結合活性につながり
かねないという発見にある。
【０００４】サンドイッチ免疫検定法は、捕捉抗体と検
出抗体とを橋渡しするか、抗体の一方をブロックして、
偽って高められた又は低められた結果を出させてしまう
干渉性物質（たとえば異好性因子、補体、ヒト抗マウス
抗体）によって潜在的に影響を受ける。上述した高度に
重合した読み出し（read-out）結合体を使用して感度を
高める手法の場合、「過小回収」とも呼ばれる、偽って
低められた結果が多くの患者サンプルで観察されること
があるが、通常、精製された分析対象物を含有する緩衝
溶液中では遭遇されない。高分子酵素−抗体結合体を使
用するこのような検定で記される過小回収は、１種又は
数種の血清成分が結合体と結合し、それによって分析対
象物との相互作用を複雑化にするか、検定基質の代謝回
転を下げることによって引き起こされると考えられてい
る。未知の干渉体を含有する所与のサンプルの場合、過
小回収の程度は、読み出しに使用される酵素−抗体結合
体の重合度に比例すると思われる。
出抗体とを橋渡しするか、抗体の一方をブロックして、
偽って高められた又は低められた結果を出させてしまう
干渉性物質（たとえば異好性因子、補体、ヒト抗マウス
抗体）によって潜在的に影響を受ける。上述した高度に
重合した読み出し（read-out）結合体を使用して感度を
高める手法の場合、「過小回収」とも呼ばれる、偽って
低められた結果が多くの患者サンプルで観察されること
があるが、通常、精製された分析対象物を含有する緩衝
溶液中では遭遇されない。高分子酵素−抗体結合体を使
用するこのような検定で記される過小回収は、１種又は
数種の血清成分が結合体と結合し、それによって分析対
象物との相互作用を複雑化にするか、検定基質の代謝回
転を下げることによって引き起こされると考えられてい
る。未知の干渉体を含有する所与のサンプルの場合、過
小回収の程度は、読み出しに使用される酵素−抗体結合
体の重合度に比例すると思われる。
【０００５】米国特許第４，９１４，０４０号明細書に
は、血清中の干渉体、たとえばリウマチ因子及び抗Ｆｃ
免疫グロブリン、たとえばＩｇＭが、非特異性結合反応
により、免疫学的サンドイッチ検定における誤回収を引
き起こす現象が記載されている。この問題は、検定に使
用される特異性抗体の一方又は両方としてＦａｂ及びＦ
（ａｂ′)2フラグメントを使用して、ＩｇＧのＦC部分
に対する干渉体が特異性免疫試薬上でそれらのポイント
を失うようにすることによって扱うことができる。しか
し、この引用例は、試薬中の抗体のフラグメントの使用
にもかかわらず、ある種のヒト血清免疫検定では干渉が
起こり続けると記載している。この特許に記載されてい
る干渉と戦うための手法は、生物学的流体を導出した種
とは異なる動物種から得られる免疫成分を試験サンプル
の約０．１〜約５０μg/mlの濃度で含有する、測定され
る成分とは結合しない架橋免疫凝集体を検定に含める手
法である。この系の好ましい実施態様では、免疫凝集体
は、第二の高分子、たとえば水溶性タンパク質に架橋し
た非特異性ＩｇＧを含む。
は、血清中の干渉体、たとえばリウマチ因子及び抗Ｆｃ
免疫グロブリン、たとえばＩｇＭが、非特異性結合反応
により、免疫学的サンドイッチ検定における誤回収を引
き起こす現象が記載されている。この問題は、検定に使
用される特異性抗体の一方又は両方としてＦａｂ及びＦ
（ａｂ′)2フラグメントを使用して、ＩｇＧのＦC部分
に対する干渉体が特異性免疫試薬上でそれらのポイント
を失うようにすることによって扱うことができる。しか
し、この引用例は、試薬中の抗体のフラグメントの使用
にもかかわらず、ある種のヒト血清免疫検定では干渉が
起こり続けると記載している。この特許に記載されてい
る干渉と戦うための手法は、生物学的流体を導出した種
とは異なる動物種から得られる免疫成分を試験サンプル
の約０．１〜約５０μg/mlの濃度で含有する、測定され
る成分とは結合しない架橋免疫凝集体を検定に含める手
法である。この系の好ましい実施態様では、免疫凝集体
は、第二の高分子、たとえば水溶性タンパク質に架橋し
た非特異性ＩｇＧを含む。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、分析対象物と
特異的に結合する少なくとも２種の免疫反応体（ここ
で、免疫反応体の一方が酵素で標識されており、第二の
抗体と酵素とで構成される結合体が、ポリマー又はオリ
ゴマーである）とサンプルとを接触させる工程を含む、
生物学的流体の試験サンプル中の分析対象物を測定する
ための方法に対する改良である。改良は、前記免疫反応
体を標識するために使用される前記酵素と、異なる水溶
性タンパク質又は非タンパク質系の天然、合成もしくは
半合成ポリマーもしくはオリゴマーとの第三の結合体を
検定に導入することを含む。この第三の結合体、すなわ
ちスカベンジャ結合体はポリマーでなければならず、サ
イズ排除クロマトグラフィーが、ＡＬＰ−ＩｇＧポリマ
ーの場合で５，０００kDを超える所要分子量を示唆す
る。これが、未知の干渉体と、第二の抗体及び読み出し
に使用される酵素からなる酵素結合体との相互作用を減
らすために検定配合物に加えられる。スカベンジャ結合
体の効果は、第二の抗体との結合体中でのその存在と同
様な態様で組み込まれた酵素の存在をもたらす。したが
って、潜在的に干渉する物質を求めての、スカベンジャ
結合体と読み出し結合体との効果的な競合が達成され
る。読み出し酵素によって構成されるポリマーだけが限
られた程度の有効性を示し、効果的なスカベンジャ結合
体の第二の成分のみからなるポリマー（たとえばウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシγ−グロブリン（ＢＧ
Ｇ）又はカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ））又は米国特
許第４，９１４，０４０号明細書に記載されているよう
なスカベンジャの第二の成分とそれ自体のフラグメント
からなるコポリマーは、完全に無効である。酵素と別の
高分子成分とで構成される高分子量ヘテロ結合体が、検
定の回収に対する干渉体の影響を減らすのに最高の能力
を示すことが確認された。
特異的に結合する少なくとも２種の免疫反応体（ここ
で、免疫反応体の一方が酵素で標識されており、第二の
抗体と酵素とで構成される結合体が、ポリマー又はオリ
ゴマーである）とサンプルとを接触させる工程を含む、
生物学的流体の試験サンプル中の分析対象物を測定する
ための方法に対する改良である。改良は、前記免疫反応
体を標識するために使用される前記酵素と、異なる水溶
性タンパク質又は非タンパク質系の天然、合成もしくは
半合成ポリマーもしくはオリゴマーとの第三の結合体を
検定に導入することを含む。この第三の結合体、すなわ
ちスカベンジャ結合体はポリマーでなければならず、サ
イズ排除クロマトグラフィーが、ＡＬＰ−ＩｇＧポリマ
ーの場合で５，０００kDを超える所要分子量を示唆す
る。これが、未知の干渉体と、第二の抗体及び読み出し
に使用される酵素からなる酵素結合体との相互作用を減
らすために検定配合物に加えられる。スカベンジャ結合
体の効果は、第二の抗体との結合体中でのその存在と同
様な態様で組み込まれた酵素の存在をもたらす。したが
って、潜在的に干渉する物質を求めての、スカベンジャ
結合体と読み出し結合体との効果的な競合が達成され
る。読み出し酵素によって構成されるポリマーだけが限
られた程度の有効性を示し、効果的なスカベンジャ結合
体の第二の成分のみからなるポリマー（たとえばウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシγ−グロブリン（ＢＧ
Ｇ）又はカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ））又は米国特
許第４，９１４，０４０号明細書に記載されているよう
なスカベンジャの第二の成分とそれ自体のフラグメント
からなるコポリマーは、完全に無効である。酵素と別の
高分子成分とで構成される高分子量ヘテロ結合体が、検
定の回収に対する干渉体の影響を減らすのに最高の能力
を示すことが確認された。
【０００７】本発明の方法は、疑わしい疾病状態を正確
に診断するために正確な量を測定しなければならない分
析対象物の定量的検出に特に適している。たとえば、Ｔ
ＳＨが、この改良された検定技術を適用するのに自然な
選択であるが、他の分析対象物、たとえばトロポニン、
ＰＳＡ及びインスリンもまた、体液サンプル中の濃度を
測定するための本検定技術の使用に十分に適当である。
に診断するために正確な量を測定しなければならない分
析対象物の定量的検出に特に適している。たとえば、Ｔ
ＳＨが、この改良された検定技術を適用するのに自然な
選択であるが、他の分析対象物、たとえばトロポニン、
ＰＳＡ及びインスリンもまた、体液サンプル中の濃度を
測定するための本検定技術の使用に十分に適当である。
【０００８】先に述べたように、分析対象物と反応し、
酵素の基質と接触すると検出可能な信号を発するために
酵素標識される免疫反応体は、免疫反応体と酵素との相
互作用によって生成されるポリマー又はオリゴマーの形
態にある。ポリマー又はオリゴマーの形成は、検定系に
導入される干渉抑制性結合体と同じか、それと関連する
方法で達成される。オリゴマーは分析対象物の回収を高
めるように作用するが、分析対象物との最大の相互作用
及び分析対象物の捕捉ならびに酵素の基質と接触したと
きの信号の増強を保証するためには、コロイド溶液を形
成する高分子量ポリマーが好ましい。典型的には、酵素
はアルカリ性ホスファターゼであるが、所望により、他
の酵素、たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ及び
グルコースオキシダーゼを使用することもできる。
酵素の基質と接触すると検出可能な信号を発するために
酵素標識される免疫反応体は、免疫反応体と酵素との相
互作用によって生成されるポリマー又はオリゴマーの形
態にある。ポリマー又はオリゴマーの形成は、検定系に
導入される干渉抑制性結合体と同じか、それと関連する
方法で達成される。オリゴマーは分析対象物の回収を高
めるように作用するが、分析対象物との最大の相互作用
及び分析対象物の捕捉ならびに酵素の基質と接触したと
きの信号の増強を保証するためには、コロイド溶液を形
成する高分子量ポリマーが好ましい。典型的には、酵素
はアルカリ性ホスファターゼであるが、所望により、他
の酵素、たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ及び
グルコースオキシダーゼを使用することもできる。
【０００９】免疫反応体を標識するために使用される同
じ酵素と、水溶性タンパク質（免疫反応体とは異なる）
又は非タンパク質系の天然、合成もしくは半合成ポリマ
ーもしくはオリゴマーとのポリマー結合体は、ホモ又は
ヘテロ二官能性又は多官能性架橋剤を使用する化学架橋
によって調製するか、熱凝集によって調製しうる。架橋
剤の選択は、第二の高分子の種類（天然か合成か）には
依存せず、その表面にある反応性基の性質に依存する。
以下の架橋剤はすべてアミノ基に対するものであるが、
他の基、たとえばカルボン酸、ヒドロキシル基又はアル
デヒドが可能な架橋サイトであり、異なる架橋剤を要す
るであろう。化学架橋の場合、一般に架橋剤が必要であ
るが、結合体には組み込まれない、タンパク質を活性化
するために使用されるいわゆるゼロ長架橋剤（zero-len
gth crosslinker）を用いることもできる。熱誘導架橋
の場合、架橋剤は要らない。調製は、架橋剤、たとえば
Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベ
ンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４〔Ｎ−マ
レイミドメチル〕−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＳＭＣＣ）、２−イミノチオラン（２ＩＴ）、グ
ルタルアルデヒド（ＧＡ）、ビス（スルホ−スクシンイ
ミジル）スベレート（ＢＳ３）又はそれらの組み合わせ
の存在で実施する。架橋剤は、通常、化学量論的過剰
（５〜１００倍）で使用し、架橋させるタンパク質の混
合物に加えるか、本明細書の例IIIのような他工程カッ
プリング法を使用するのならば、別個のタンパク質溶液
に加える。
じ酵素と、水溶性タンパク質（免疫反応体とは異なる）
又は非タンパク質系の天然、合成もしくは半合成ポリマ
ーもしくはオリゴマーとのポリマー結合体は、ホモ又は
ヘテロ二官能性又は多官能性架橋剤を使用する化学架橋
によって調製するか、熱凝集によって調製しうる。架橋
剤の選択は、第二の高分子の種類（天然か合成か）には
依存せず、その表面にある反応性基の性質に依存する。
以下の架橋剤はすべてアミノ基に対するものであるが、
他の基、たとえばカルボン酸、ヒドロキシル基又はアル
デヒドが可能な架橋サイトであり、異なる架橋剤を要す
るであろう。化学架橋の場合、一般に架橋剤が必要であ
るが、結合体には組み込まれない、タンパク質を活性化
するために使用されるいわゆるゼロ長架橋剤（zero-len
gth crosslinker）を用いることもできる。熱誘導架橋
の場合、架橋剤は要らない。調製は、架橋剤、たとえば
Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベ
ンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４〔Ｎ−マ
レイミドメチル〕−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＳＭＣＣ）、２−イミノチオラン（２ＩＴ）、グ
ルタルアルデヒド（ＧＡ）、ビス（スルホ−スクシンイ
ミジル）スベレート（ＢＳ３）又はそれらの組み合わせ
の存在で実施する。架橋剤は、通常、化学量論的過剰
（５〜１００倍）で使用し、架橋させるタンパク質の混
合物に加えるか、本明細書の例IIIのような他工程カッ
プリング法を使用するのならば、別個のタンパク質溶液
に加える。
【００１０】結合体を形成するために使用することがで
きる水溶性タンパク質の例は、血清アルブミン、特にウ
シ血清アルブミン、免疫グロブリン、たとえばウシγ−
グロブリン（ＢＧＧ）、ヤギＩｇＧもしくはマウス抗
体、カサガイヘモシアニン、オボアルブミン及びカゼイ
ンである。それらを酵素と反応させて高分子結合体を形
成すると、求められる分析対象物の過小回収を生じさせ
る、当該タイプの検定における干渉を減らすか、なくす
のに適当な物質が得られる。本発明の高分子結合体がど
のようにして検定成分と相互作用して分析対象物の過小
回収を減らす、又は防ぐかに関して特定の理論又は機能
によって拘束されることを望まないが、本発明の高分子
結合体は、同じ相互作用機構、たとえばファンデルワー
ルス力、疎水性相互作用及び水素結合を使用することに
より、生物学的サンプル中に存在する干渉体を求めて、
第二の抗体を組み込む酵素結合体と競合すると考えられ
る。ブロッカのポリマー性が干渉化合物との相互作用の
結合活性を増大させる。可溶性タンパク質に加えて、適
切な官能化を可能にする反応性基を有する他の物質を使
用して、酵素との結合体を形成することもできる。たと
えば、非タンパク質系の天然、合成又は半合成ポリマー
又はオリゴマーをタンパク質に代えて使用することがで
きる。そのような物質の例は、一般には３〜２５０kDの
範囲の分子量を有するポリリシン、ポリアスパラギン及
びデキストランである。
きる水溶性タンパク質の例は、血清アルブミン、特にウ
シ血清アルブミン、免疫グロブリン、たとえばウシγ−
グロブリン（ＢＧＧ）、ヤギＩｇＧもしくはマウス抗
体、カサガイヘモシアニン、オボアルブミン及びカゼイ
ンである。それらを酵素と反応させて高分子結合体を形
成すると、求められる分析対象物の過小回収を生じさせ
る、当該タイプの検定における干渉を減らすか、なくす
のに適当な物質が得られる。本発明の高分子結合体がど
のようにして検定成分と相互作用して分析対象物の過小
回収を減らす、又は防ぐかに関して特定の理論又は機能
によって拘束されることを望まないが、本発明の高分子
結合体は、同じ相互作用機構、たとえばファンデルワー
ルス力、疎水性相互作用及び水素結合を使用することに
より、生物学的サンプル中に存在する干渉体を求めて、
第二の抗体を組み込む酵素結合体と競合すると考えられ
る。ブロッカのポリマー性が干渉化合物との相互作用の
結合活性を増大させる。可溶性タンパク質に加えて、適
切な官能化を可能にする反応性基を有する他の物質を使
用して、酵素との結合体を形成することもできる。たと
えば、非タンパク質系の天然、合成又は半合成ポリマー
又はオリゴマーをタンパク質に代えて使用することがで
きる。そのような物質の例は、一般には３〜２５０kDの
範囲の分子量を有するポリリシン、ポリアスパラギン及
びデキストランである。
【００１１】酵素含有スカベンジャ結合体は、通常、熱
及び／又は酵素阻害剤、たとえば銀、鉛又は銅の塩で処
理するか、極端なpH条件に暴露して酵素を不活性化し、
それにより、結合体中の酵素から生じる偽陽性の結果を
回避させる。結合体は、約５０〜７５０μg/ml、通常は
少なくとも１５０μg/mlの結合体濃度を提供するのに十
分な量で他の検定試薬と合わせる。
及び／又は酵素阻害剤、たとえば銀、鉛又は銅の塩で処
理するか、極端なpH条件に暴露して酵素を不活性化し、
それにより、結合体中の酵素から生じる偽陽性の結果を
回避させる。結合体は、約５０〜７５０μg/ml、通常は
少なくとも１５０μg/mlの結合体濃度を提供するのに十
分な量で他の検定試薬と合わせる。
【００１２】
【実施例】以下の例により、本発明を実施する方法をさ
らに説明する。
らに説明する。
【００１３】例Ｉ ホモ二官能性架橋剤を使用するスカベンジャ結合体の調
製１ ウシγ−グロブリン（１００mg）及びアルカリ性ホスフ
ァターゼ（１２０mg）を別々にＰＢＳ緩衝液（５０mM
Ｎａ2ＨＰＯ4、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．４）に移
し、Amicon社のCentricon限外ろ過装置を使用して約５
０mg/mlに濃縮した。溶液の濃度は、２８０nmでのＵＶ
吸収を使用して分光光度計によって測定した。タンパク
質の吸収計数は、アルカリ性ホスファターゼの場合でＥ
1% 280＝１０、ＢＧＧの場合でＥ1% 280＝１３．６と推定
された。適量の溶液を１．１：１のタンパク質比（ＢＧ
Ｇ：ＡＬＰ、重量比）で混合した。
製１ ウシγ−グロブリン（１００mg）及びアルカリ性ホスフ
ァターゼ（１２０mg）を別々にＰＢＳ緩衝液（５０mM
Ｎａ2ＨＰＯ4、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．４）に移
し、Amicon社のCentricon限外ろ過装置を使用して約５
０mg/mlに濃縮した。溶液の濃度は、２８０nmでのＵＶ
吸収を使用して分光光度計によって測定した。タンパク
質の吸収計数は、アルカリ性ホスファターゼの場合でＥ
1% 280＝１０、ＢＧＧの場合でＥ1% 280＝１３．６と推定
された。適量の溶液を１．１：１のタンパク質比（ＢＧ
Ｇ：ＡＬＰ、重量比）で混合した。
【００１４】１０倍過剰モルのビス（スルホスクシンイ
ミジル）スベレート（ＢＳ３、Pierce）の１０mM水溶液
を架橋剤としてタンパク質混合物に加えた。この添加の
直後、さらなるＰＢＳ緩衝液で希釈することによって混
合物の全タンパク質濃度を４０mg/mlに調節した。混合
物を２５℃で９０分間インキュベートした後、４℃で夜
どおし貯蔵した。２０倍過剰モルのグリシンをＢＳ３に
加えることによって反応を終了させた。得られたコロイ
ド溶液は、得られた結合体の高い分子量のせいでひどく
濁っていた。調製物は、免疫検定におけるブロッカとし
て、そのままの状態で使用することもできるし、例Ｖ及
びVIに記載のように検定のバックグラウンドを減らすた
めにスカベンジャ結合体のアルカリ性ホスファターゼ活
性を下げた後で使用することもできる。
ミジル）スベレート（ＢＳ３、Pierce）の１０mM水溶液
を架橋剤としてタンパク質混合物に加えた。この添加の
直後、さらなるＰＢＳ緩衝液で希釈することによって混
合物の全タンパク質濃度を４０mg/mlに調節した。混合
物を２５℃で９０分間インキュベートした後、４℃で夜
どおし貯蔵した。２０倍過剰モルのグリシンをＢＳ３に
加えることによって反応を終了させた。得られたコロイ
ド溶液は、得られた結合体の高い分子量のせいでひどく
濁っていた。調製物は、免疫検定におけるブロッカとし
て、そのままの状態で使用することもできるし、例Ｖ及
びVIに記載のように検定のバックグラウンドを減らすた
めにスカベンジャ結合体のアルカリ性ホスファターゼ活
性を下げた後で使用することもできる。
【００１５】例II ホモ二官能性架橋剤を使用するスカベンジャ結合体の調
製２ ウシγ−グロブリン（１００mg）及びアルカリ性ホスフ
ァターゼ（１２０mg）を別々にＰＢＳ緩衝液（５０mM
Ｎａ2ＨＰＯ4、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．４）に移
し、Amicon社のCentricon限外ろ過装置を使用して約５
０mg/mlに濃縮した。得られた溶液の濃度は、２８０nm
での溶液のＵＶ吸収を使用して分光光度計によって測定
した。適量の溶液を１．１：１のタンパク質比（ＢＧ
Ｇ：ＡＬＰ、重量比）で混合した。
製２ ウシγ−グロブリン（１００mg）及びアルカリ性ホスフ
ァターゼ（１２０mg）を別々にＰＢＳ緩衝液（５０mM
Ｎａ2ＨＰＯ4、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．４）に移
し、Amicon社のCentricon限外ろ過装置を使用して約５
０mg/mlに濃縮した。得られた溶液の濃度は、２８０nm
での溶液のＵＶ吸収を使用して分光光度計によって測定
した。適量の溶液を１．１：１のタンパク質比（ＢＧ
Ｇ：ＡＬＰ、重量比）で混合した。
【００１６】２５倍過剰モルのグルタルアルデヒド（Ｇ
Ａ）の２５mM水溶液をタンパク質混合物に加え、その直
後、ＰＢＳ緩衝液で希釈することによって溶液のタンパ
ク質濃度を４０mg/mlに調節した。混合物を２５℃で９
０分間インキュベートし、４℃で夜どおし貯蔵した後、
２０倍過剰モルのグリシンをＧＡに加えることによって
反応を終了させた。この処理は、得られた結合体の高い
分子量のせいでひどく濁ったコロイド溶液を提供した。
結合体は、免疫検定におけるブロッカとして、そのまま
の状態で使用することもできるし、例Ｖ及びVIに記載の
ように検定のバックグラウンドを減らすためにスカベン
ジャ結合体のアルカリ性ホスファターゼ活性を下げた後
で使用することもできる。
Ａ）の２５mM水溶液をタンパク質混合物に加え、その直
後、ＰＢＳ緩衝液で希釈することによって溶液のタンパ
ク質濃度を４０mg/mlに調節した。混合物を２５℃で９
０分間インキュベートし、４℃で夜どおし貯蔵した後、
２０倍過剰モルのグリシンをＧＡに加えることによって
反応を終了させた。この処理は、得られた結合体の高い
分子量のせいでひどく濁ったコロイド溶液を提供した。
結合体は、免疫検定におけるブロッカとして、そのまま
の状態で使用することもできるし、例Ｖ及びVIに記載の
ように検定のバックグラウンドを減らすためにスカベン
ジャ結合体のアルカリ性ホスファターゼ活性を下げた後
で使用することもできる。
【００１７】例III ヘテロ二官能性架橋剤を使用するスカベンジャ結合体の
調製 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００mgをＴＳＥ８５緩
衝液（１００mMトリエタノールアミン、１００mM塩化ナ
トリウム、１mM ＥＤＴＡ、pH８．５）に溶解させた。A
micon社のCentricon限外ろ過装置を使用してアルカリ性
ホスファターゼ（ＡＬＰ）２００mgをＴＳＥ７３緩衝液
（１００mMトリエタノールアミン、１００mM塩化ナトリ
ウム、pH７．３）に緩衝液交換した。両溶液を５０mg/m
lのタンパク質濃度に調節した。
調製 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００mgをＴＳＥ８５緩
衝液（１００mMトリエタノールアミン、１００mM塩化ナ
トリウム、１mM ＥＤＴＡ、pH８．５）に溶解させた。A
micon社のCentricon限外ろ過装置を使用してアルカリ性
ホスファターゼ（ＡＬＰ）２００mgをＴＳＥ７３緩衝液
（１００mMトリエタノールアミン、１００mM塩化ナトリ
ウム、pH７．３）に緩衝液交換した。両溶液を５０mg/m
lのタンパク質濃度に調節した。
【００１８】２５倍過剰モルのＴＳＥ８５緩衝液中２−
イミノチオラン（２ＩＴ、Pierce）の２０mM溶液をＢＳ
Ａ溶液に加え、２５℃で１０分間インキュベートした。
２５倍過剰モルのＤＭＳＯ中スクシンイミジル−４−
（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ、Pierce）の２０mM溶液をアルカリ性
ホスファターゼ溶液に加えた。各架橋剤（２ＩＴ及びＳ
ＭＣＣ）に１００倍過剰の１Ｍグリシンの水溶液を加え
ることにより、１０分後にはＢＳＡの活性化反応を、ま
た２０分後にはアルカリ性ホスファターゼの活性化反応
を、それぞれ終了させた。活性化した両タンパク質をSe
phadex 25カラム（Pharmacia）で精製した。活性化した
両タンパク質に関し、カラムの空隙画分を収集し、４０
mg/mlに濃縮した。濃縮中、両溶液の緩衝液をＴＳＥ７
３（１００mMトリエタノールアミン、１００mM塩化ナト
リウム、１mM ＥＤＴＡ、pH７．３）に変更した。濃縮
及び緩衝液交換にはAmicon社の攪拌セルを使用した。タ
ンパク質濃度は上記のように測定した。
イミノチオラン（２ＩＴ、Pierce）の２０mM溶液をＢＳ
Ａ溶液に加え、２５℃で１０分間インキュベートした。
２５倍過剰モルのＤＭＳＯ中スクシンイミジル−４−
（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ、Pierce）の２０mM溶液をアルカリ性
ホスファターゼ溶液に加えた。各架橋剤（２ＩＴ及びＳ
ＭＣＣ）に１００倍過剰の１Ｍグリシンの水溶液を加え
ることにより、１０分後にはＢＳＡの活性化反応を、ま
た２０分後にはアルカリ性ホスファターゼの活性化反応
を、それぞれ終了させた。活性化した両タンパク質をSe
phadex 25カラム（Pharmacia）で精製した。活性化した
両タンパク質に関し、カラムの空隙画分を収集し、４０
mg/mlに濃縮した。濃縮中、両溶液の緩衝液をＴＳＥ７
３（１００mMトリエタノールアミン、１００mM塩化ナト
リウム、１mM ＥＤＴＡ、pH７．３）に変更した。濃縮
及び緩衝液交換にはAmicon社の攪拌セルを使用した。タ
ンパク質濃度は上記のように測定した。
【００１９】濃縮した後、磁気攪拌棒上で攪拌しながら
タンパク質を混合した。室温で攪拌しながら３時間、反
応を実施した後、冷蔵装置（２〜８℃）に移して夜どお
し貯蔵した。反応中、ＡＬＰ−ＢＳＡヘテロポリマーの
形成のせいで混合物はひどく濁った。
タンパク質を混合した。室温で攪拌しながら３時間、反
応を実施した後、冷蔵装置（２〜８℃）に移して夜どお
し貯蔵した。反応中、ＡＬＰ−ＢＳＡヘテロポリマーの
形成のせいで混合物はひどく濁った。
【００２０】結合体は、免疫検定におけるブロッカとし
て、そのままの状態で使用することもできるし、例Ｖ及
びVIに記載のように検定のバックグラウンドを減らすた
めにスカベンジャ結合体のアルカリ性ホスファターゼ活
性を下げた後で使用することもできる。
て、そのままの状態で使用することもできるし、例Ｖ及
びVIに記載のように検定のバックグラウンドを減らすた
めにスカベンジャ結合体のアルカリ性ホスファターゼ活
性を下げた後で使用することもできる。
【００２１】例IV 熱凝集によるスカベンジャ結合体の調製 Amicon社の攪拌セルを使用してアルカリ性ホスファター
ゼ１００mg及びＢＧＧ５０mgをＰＢＳ７４（５０mMリン
酸二水素ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．
４）に緩衝液交換した。両溶液の濃度を５mg/mlに調節
した。タンパク質を２：１の重量比で混合し、水槽で７
５℃に加熱した。溶液の内部温度が７５℃に達した後、
この混合物を同温度で３０分間維持した。水槽からフラ
スコを取り出し、溶液を室温まで冷ました。反応中、Ａ
ＬＰ−ＢＧＧヘテロポリマーの形成のせいで混合物はひ
どく濁った。この手法によって得られたスカベンジャ結
合体の酵素活性は最小限であったため、通常、酵素のさ
らなる不活性化の必要性はないであろう。
ゼ１００mg及びＢＧＧ５０mgをＰＢＳ７４（５０mMリン
酸二水素ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．
４）に緩衝液交換した。両溶液の濃度を５mg/mlに調節
した。タンパク質を２：１の重量比で混合し、水槽で７
５℃に加熱した。溶液の内部温度が７５℃に達した後、
この混合物を同温度で３０分間維持した。水槽からフラ
スコを取り出し、溶液を室温まで冷ました。反応中、Ａ
ＬＰ−ＢＧＧヘテロポリマーの形成のせいで混合物はひ
どく濁った。この手法によって得られたスカベンジャ結
合体の酵素活性は最小限であったため、通常、酵素のさ
らなる不活性化の必要性はないであろう。
【００２２】例Ｖ スカベンジャ結合体の酸熱不活性化 例Ｉ〜IIIで得られたスカベンジャ結合体溶液を、１M酢
酸ナトリウム溶液pH４．５で１０mg/mlの最終濃度まで
希釈した。溶液を水槽（６５℃）の中で槽の温度に達す
るまで温め、この温度でさらに３０分間維持した。溶液
を室温まで冷まし、pH８．８のＴＲＩＳ〔トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン〕の２M溶液の滴下によっ
てpHを７．０に調節した。この手順が、ＡＬＰの酵素活
性をほぼ完全に除去した。
酸ナトリウム溶液pH４．５で１０mg/mlの最終濃度まで
希釈した。溶液を水槽（６５℃）の中で槽の温度に達す
るまで温め、この温度でさらに３０分間維持した。溶液
を室温まで冷まし、pH８．８のＴＲＩＳ〔トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン〕の２M溶液の滴下によっ
てpHを７．０に調節した。この手順が、ＡＬＰの酵素活
性をほぼ完全に除去した。
【００２３】例VI スカベンジャ結合体のアルカリ熱不活性化 例Ｉ〜IVで調製したタンパク質結合体を１M ＮａＨＣＯ
3緩衝液（pH９．０）で１０mg/mlの最終濃度まで希釈
し、水槽中で６５℃まで温め、その中でさらに３０分間
維持した。溶液を室温まで冷まし、酢酸ナトリウムの
１．８M溶液（pH４．９）の滴下によってpHを７．０に
調節した。この手順が、結合体のアルカリ性ホスファタ
ーゼ成分の基本的に完全な不活性化をもたらした。
3緩衝液（pH９．０）で１０mg/mlの最終濃度まで希釈
し、水槽中で６５℃まで温め、その中でさらに３０分間
維持した。溶液を室温まで冷まし、酢酸ナトリウムの
１．８M溶液（pH４．９）の滴下によってpHを７．０に
調節した。この手順が、結合体のアルカリ性ホスファタ
ーゼ成分の基本的に完全な不活性化をもたらした。
【００２４】例VII 読み出しのための第二のポリマー抗体結合体の調製 ＴＳＭＺ７３緩衝液（１００mMトリエタノールアミン、
１００mM塩化ナトリウム、１mM塩化マグネシウム、０．
１mM塩化亜鉛、pH７．３）を使用して高級（ハイグレー
ド）アルカリ性ホスファターゼ１００mgをタンパク質濃
度１２mg/mlに調節した。マウスモノクロナール抗ＴＳ
Ｈ抗体５０mgをＴＳＥ８５緩衝液（１００mMトリエタノ
ールアミン、１００mM塩化ナトリウム、１mM ＥＤＴ
Ａ、pH８．５）に緩衝液交換した。ＩｇＧ濃度を４０mg
/mlにセットし、２８０nmでの溶液の吸光度によって測
定し、１３．６の吸光係数を使用した。
１００mM塩化ナトリウム、１mM塩化マグネシウム、０．
１mM塩化亜鉛、pH７．３）を使用して高級（ハイグレー
ド）アルカリ性ホスファターゼ１００mgをタンパク質濃
度１２mg/mlに調節した。マウスモノクロナール抗ＴＳ
Ｈ抗体５０mgをＴＳＥ８５緩衝液（１００mMトリエタノ
ールアミン、１００mM塩化ナトリウム、１mM ＥＤＴ
Ａ、pH８．５）に緩衝液交換した。ＩｇＧ濃度を４０mg
/mlにセットし、２８０nmでの溶液の吸光度によって測
定し、１３．６の吸光係数を使用した。
【００２５】２５倍過剰モルのＴＳＥ８５中２−イミノ
チオラン（２ＩＴ、Pierce）の１００mM溶液を濃縮Ｉｇ
Ｇ溶液に加え、２５℃で１０分間インキュベートした。
３５倍過剰モルのＤＭＳＯ中Ｎ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ、Pi
erce）の２０mM溶液をアルカリ性ホスファターゼ溶液に
加えた。各架橋剤（２ＩＴ及びＳＩＡＢ）に１０倍過剰
の１Ｍグリシン水溶液を加えることにより、１０分後に
はＩｇＧ溶液の活性化反応を、また２０分後にはアルカ
リ性ホスファターゼ溶液の活性化反応を、それぞれ終了
させた。活性化した両タンパク質をSephadex G-25カラ
ム（Pharmacia）で精製した。活性化した両タンパク質
に関し、カラムの空隙画分を収集し、２５mg/mlに濃縮
した。濃縮中、両溶液の緩衝液をＴＳＥ８３（１００mM
トリエタノールアミン、１００mM塩化ナトリウム、１mM
ＥＤＴＡ、pH８．３）に変更した。濃縮及び緩衝液交
換にはAmicon社の攪拌セルを使用した。タンパク質濃度
は上記のように測定した。
チオラン（２ＩＴ、Pierce）の１００mM溶液を濃縮Ｉｇ
Ｇ溶液に加え、２５℃で１０分間インキュベートした。
３５倍過剰モルのＤＭＳＯ中Ｎ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ、Pi
erce）の２０mM溶液をアルカリ性ホスファターゼ溶液に
加えた。各架橋剤（２ＩＴ及びＳＩＡＢ）に１０倍過剰
の１Ｍグリシン水溶液を加えることにより、１０分後に
はＩｇＧ溶液の活性化反応を、また２０分後にはアルカ
リ性ホスファターゼ溶液の活性化反応を、それぞれ終了
させた。活性化した両タンパク質をSephadex G-25カラ
ム（Pharmacia）で精製した。活性化した両タンパク質
に関し、カラムの空隙画分を収集し、２５mg/mlに濃縮
した。濃縮中、両溶液の緩衝液をＴＳＥ８３（１００mM
トリエタノールアミン、１００mM塩化ナトリウム、１mM
ＥＤＴＡ、pH８．３）に変更した。濃縮及び緩衝液交
換にはAmicon社の攪拌セルを使用した。タンパク質濃度
は上記のように測定した。
【００２６】濃縮した後、磁気攪拌棒上で攪拌しながら
タンパク質を混合した。室温で攪拌しながら３時間、反
応を実施した後、冷蔵装置（２〜８℃）に移して夜どお
し貯蔵した。反応中、ＩｇＧ−ＡＬＰヘテロ結合体の形
成のせいで混合物は濁った。
タンパク質を混合した。室温で攪拌しながら３時間、反
応を実施した後、冷蔵装置（２〜８℃）に移して夜どお
し貯蔵した。反応中、ＩｇＧ−ＡＬＰヘテロ結合体の形
成のせいで混合物は濁った。
【００２７】Pharmacia社のＦＰＬＣ機器を使用して、
形成した生成物をSuperose 6カラムで精製した。結合体
の溶離プロフィールは、結合体の有意部分がカラムの空
隙中に溶離しており、未反応物質はほとんど残されてい
ないことを示した。ＴＳＨ免疫検定を実施するため、未
反応出発原料を除くすべての画分を選択した。
形成した生成物をSuperose 6カラムで精製した。結合体
の溶離プロフィールは、結合体の有意部分がカラムの空
隙中に溶離しており、未反応物質はほとんど残されてい
ないことを示した。ＴＳＨ免疫検定を実施するため、未
反応出発原料を除くすべての画分を選択した。
【００２８】例VIII スカベンジャ結合体の応用 例VIIで記載したポリマー標識結合体を用いて第三世代
ＴＳＨ免疫検定を設計した。捕捉抗体は、抗フルオレセ
イン抗体を介して磁性粒子に結合することができるフル
オレセインイソチオシアネート標識抗ＴＳＨ Ｆ（ａ
ｂ′)2フラグメントから製造した。検定試薬に加えられ
る血清サンプル中のＴＳＨの存在によって形成された免
疫複合体を磁性粒子によって沈殿させた。オリゴマーア
ルカリ性ホスファターゼ結合体は２４mg/lの濃度で使用
し、フルオレセイン化Ｆ（ａｂ′)2は２mg/lの濃度で使
用した。検定は、Bayer社のImmuno 1（登録商標）シス
テムで実施した。
ＴＳＨ免疫検定を設計した。捕捉抗体は、抗フルオレセ
イン抗体を介して磁性粒子に結合することができるフル
オレセインイソチオシアネート標識抗ＴＳＨ Ｆ（ａ
ｂ′)2フラグメントから製造した。検定試薬に加えられ
る血清サンプル中のＴＳＨの存在によって形成された免
疫複合体を磁性粒子によって沈殿させた。オリゴマーア
ルカリ性ホスファターゼ結合体は２４mg/lの濃度で使用
し、フルオレセイン化Ｆ（ａｂ′)2は２mg/lの濃度で使
用した。検定は、Bayer社のImmuno 1（登録商標）シス
テムで実施した。
【００２９】この設計で、検定は、無作為に収集した血
清サンプルの１０％超に関して過小回収を示した。以下
の表１では、分析対象物検出に対するスカベンジャ結合
体（３００mg/l）の効果を、スカベンジャ結合体を含ま
ない試薬とで比較した。
清サンプルの１０％超に関して過小回収を示した。以下
の表１では、分析対象物検出に対するスカベンジャ結合
体（３００mg/l）の効果を、スカベンジャ結合体を含ま
ない試薬とで比較した。
【００３０】
【表１】
【００３１】３０２の血液銀行サンプルの無作為選択に
おいて、スカベンジャ有り及び無しでの検定の、第二の
ＴＳＨ法に対する相関が、表２に記載する以下の結果を
出した。
おいて、スカベンジャ有り及び無しでの検定の、第二の
ＴＳＨ法に対する相関が、表２に記載する以下の結果を
出した。
【００３２】
【表２】
【００３３】表２から、スカベンジャ結合体の付加が、
３００のサンプルの無作為選択において平均回収の６％
の改善をもたらすと判断することができる。これは主と
して低いアウトライナを除くことによって達成される。
相関における分散の減少は、０．９８から０．９９への
ｒ2の増大によって反映される。
３００のサンプルの無作為選択において平均回収の６％
の改善をもたらすと判断することができる。これは主と
して低いアウトライナを除くことによって達成される。
相関における分散の減少は、０．９８から０．９９への
ｒ2の増大によって反映される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アレクサンダー・ベレンキー アメリカ合衆国、ペンシルベニア州、 18940、ホランド、パドック・ウェイ 25 (72)発明者 ヘンリー・ミンディシノ アメリカ合衆国、ニューニューヨーク州、 10950、モンロー、バーネット・ロード・ イースト 21 (72)発明者 シルビア・カルウォウスカ アメリカ合衆国、ニューヨーク州、10522、 ドッブス・フェリー、パリセード・ストリ ート 123 (72)発明者 リチャード・バウアー アメリカ合衆国、コネチカット州、06813、 ダンベリー、ピー・オー・ボックス 3814
Claims (20)
- 【請求項１】 分析対象物と特異的に結合する少なくと
も２種の免疫反応体（ここで、免疫反応体の一方は、酵
素で標識されており、免疫反応体と酵素とのポリマー又
はオリゴマーの形態にある）とサンプルとを接触させる
工程を含む、生物学的流体のサンプル中の分析対象物を
測定するための方法において、 該生物学的流体のサンプルを、該免疫反応体を標識する
ために使用される該酵素と、異なる水溶性タンパク質又
は非タンパク質系の天然、合成もしくは半合成ポリマー
もしくはオリゴマーとの架橋ポリマー結合体と合わせる
工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 酵素が、アルカリ性ホスファターゼ、セ
イヨウワサビペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダ
ーゼである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 酵素が、アルカリ性ホスファターゼであ
る、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 結合体が、酵素と、別の水溶性タンパク
質とで構成されている、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 結合体が、酵素と、血清アルブミン、免
疫グロブリン又はカサガイヘモシアニンとで構成されて
いる、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 免疫グロブリンが、ウシγ−グロブリ
ン、ヤギＩｇＧ又はマウス抗体である、請求項５記載の
方法。 - 【請求項７】 分析対象物が、甲状腺刺激ホルモン、前
立腺特異性抗原又はインスリンである、請求項１記載の
方法。 - 【請求項８】 分析対象物が、甲状腺刺激ホルモンであ
る、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 生物学的流体中の結合体の濃度が、５０
〜７５０μg/mlである、請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 生物学的流体中の結合体の濃度が、１
００μg/mlを超える、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 生物学的流体が、哺乳動物の血清、血
漿、尿、唾液又は髄液である、請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 生物学的流体中の分析対象物の免疫検
定法において、 分析対象物を、分析対象物の第一のエピトープに対して
特異性である第一の抗体又はそのフラグメントを介して
固体支持体に結合させ、分析対象物の第二のエピトープ
に対して特異性である酵素標識された抗体の第一のポリ
マー又はオリゴマー結合体によって検出し、該酵素と、
異なる水溶性タンパク質又は非タンパク質系の天然、合
成もしくは半合成ポリマーもしくはオリゴマーとで構成
されている第二の結合体を免疫検定に含めることを特徴
とする免疫検定法。 - 【請求項１３】 第一の結合体が、該酵素と該抗体との
高分子結合体である、請求項１２記載の免疫検定法。 - 【請求項１４】 第一の結合体中の該酵素が、アルカリ
性ホスファターゼであり、該第二の結合体が、アルカリ
性ホスファターゼと、血清アルブミン又は免疫グロブリ
ンとで構成されている、請求項１２記載の免疫検定法。 - 【請求項１５】 免疫グロブリンが、ウシγ−グロブリ
ンである、請求項１４記載の免疫検定法。 - 【請求項１６】 分析対象物を、第一の抗体上のハプテ
ンラベルと、固体支持体に直接結合されたそれに対する
免疫反応体とを介して固体支持体に結合させる、請求項
１２記載の免疫検定法。 - 【請求項１７】 ハプテンラベルが、フルオレセイン又
はその誘導体である、請求項１６記載の免疫検定法。 - 【請求項１８】 ハプテンラベルが、フルオレセインイ
ソチオシアネートである、請求項１７記載の免疫検定
法。 - 【請求項１９】 固体支持体が、磁性粒子である、請求
項１２記載の免疫検定法。 - 【請求項２０】 第二の結合体中の該酵素が、少なくと
も部分的に不活性化されている、請求項１２記載の免疫
検定法。
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