JP7320492B2 - Ｂ型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法 Download PDF

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Description

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原の免疫測定方法に関する。
ＨＢＶに感染すると、患者の血液中にはＨＢＶが検出されるが、やがて、患者の免疫機構によりＨＢＶの増殖が抑制されると、ＨＢＶが陰性となり、抗ＨＢＶ抗体が陽性となる、セロコンバージョンと呼ばれる状態に至ることがしばしばある。しかしながら、セロコンバージョン後にもＨＢＶが増殖を続けてＢ型肝炎が進行する患者が存在することがわかっている。セロコンバージョン後は、血液中のＨＢＶ濃度が低くなるため、通常の免疫測定ではＨＢＶの検出が困難であり、このため、高感度の測定方法が求められている。
ＨＢＶ抗原の高感度検出の方法として、検体を、界面活性剤で前処理する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、さらに高感度な測定方法が望まれる。
また、Ｂ型肝炎ウイルス表面（ＨＢｓ）抗原を高感度に免疫測定する方法として、ＨＢｓ抗原が抗体でサンドイッチされた免疫複合体を選択的に回収して別の磁性ビーズに転移させ、非特異バックグランドを低減させる、いわゆる免疫複合体転移法も知られている（特許文献２）。しかしながら、この方法は、この方法を実施するために設計された特別な装置を必要とし、汎用の免疫測定装置では実施することができない。
一方、免疫測定に用いる標識抗体として、水溶性担体と、複数分子の標識酵素と、複数分子の抗体断片とを結合させたものを用いた方法も知られている（特許文献３、特許文献４）。さらに、デキストランの存在下で、免疫測定を行うことにより、抗原抗体反応を短縮化させる方法も知られている（特許文献５）。しかしながら、これらの公知の方法を、ＨＢＶ抗原の免疫測定に適用した場合でも、さらなる感度向上が望まれる。
特開平11-108932号公報 WO2014/115878 WO2006/070732 特許第3781934号掲載公報 特開昭61-79164号公報
本発明の目的は、汎用の免疫測定装置で実施可能であり、高感度にＨＢＶ抗原を検出することができる、ＨＢＶ抗原の免疫測定方法を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、水溶性高分子の存在下で、試料中のＨＢＶ抗原と、標識酵素－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体とを反応させることにより、高感度にＨＢＶ抗原を検出可能であることを見出し、本願発明を完成した。
すなわち、本願発明は、以下のものを提供する。
(1) 生体から分離された試料中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原のサンドイッチ法による免疫測定方法であって、
重量平均分子量が２万～４００万の水溶性高分子の存在下で、(1)前記試料中のＨＢＶ抗原と、(2) 標識物質と、抗ＨＢＶ抗体又は該抗ＨＢＶ抗体の抗原結合性断片と、水溶性担体との結合体（以下、「標識物質－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体」）とを反応させ、前記ＨＢＶ抗原と結合した前記標識物質－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体を検出することを含む、免疫測定方法。
(2) 前記標識物質が標識酵素であり、前記標識酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びルシフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、(1)に記載の方法。
(3) 前記水溶性担体が、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール（商品名）、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース、キチン、キトサン、β―ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びＤＮＡ、並びにこれらの修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記水溶性高分子が、デキストラン及びアミノデキストラン、並びにこれらの修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、(3)に記載の方法。
(5) 前記ＨＢＶ抗原に特異的に結合する抗体は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原と特異的に結合する抗体である、(1)～(4)のいずれか１項に記載の方法。
(6) 試料中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原を、請求項１に記載の免疫測定方法により免疫測定するキットであって、
重量平均分子量が２万～４００万の水溶性高分子と、標識物質－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体とを含む液を備える、免疫測定キット。
本発明により、汎用の免疫測定装置で実施可能であり、高感度にＨＢＶ抗原を検出することができる、ＨＢＶ抗原の新規な免疫測定方法及びそのためのキットが提供された。本発明の方法によれば、血液中のＨＢＶ抗原を高感度に測定できるため、セロコンバージョン後の予後予測を的確に行うことが可能になる。
＜１．免疫測定方法＞
上記のとおり、本発明の免疫測定方法は、生体から分離された試料中のＨＢＶ抗原の免疫測定方法である。試料としては、ＨＢＶを含有し得る試料であれば特に限定されず、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および各種生検試料等が挙げられる。好ましくは、試料は、血清又は血漿である。これらの試料は、所望により、希釈して免疫測定に供することもできる。また、免疫測定の対象となるＨＢＶ抗原は、ＨＢＶの検出が可能となる抗原であれば特に限定されず、例えば、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）やコア関連抗原（ＨＢｃｒＡｇ）を挙げることができる。
本発明の方法におけるＨＢＶ抗原の免疫測定方法の原理は、サンドイッチ法及び競合法のいずれをも採用することができるが、ＨＢＶ抗原を、ＨＢＶ抗原と特異的に反応する２種の抗体、捕捉抗体と検出抗体とを使用して検出するサンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法としては、２ステップ法であるフォワードサンドイッチ法（捕捉抗体と検体中の抗原、捕捉抗体に結合した抗原と検出抗体との反応を逐次的に行う）、リバースサンドイッチ法（予め検出抗体と検体中の抗原を反応させ、生成した抗原抗体複合物を捕捉抗体と反応させる）、及び１ステップ法（捕捉抗体、検体中の抗原、検出抗体の反応を同時に１ステップで行う）を挙げることができるが、これらのいずれも採用可能である。
より具体的には、例えば、フォワードサンドイッチ法は以下のように行うことができる。まず、マイクロプレートや磁性ビーズなどの不溶性担体に、ＨＢＶ抗原と結合する捕捉抗体を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズにバッファー及び検体を加え、捕捉抗体と検体中のＨＢＶ抗原とを接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＨＢＶ抗原を認識する抗体と標識物質が直接または間接的に結合した検出抗体を添加し、捕捉された抗原に検出抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体－抗原－検出抗体を含む免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった検出抗体を洗浄液で洗浄した後、所定の方法で残存する検出抗体の標識物質を検出する。例えば、標識物質が酵素である場合は、酵素に対応する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
本明細書において捕捉抗体とは、検体中のＨＢＶ抗原を捕捉する抗体を示すが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、不溶性担体に固相化される固相抗体である。捕捉抗体としては、ＨＢＶ抗原と反応する抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片をいずれも使用できる。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
通常、免疫測定における検出抗体としては、該標的抗原と特異的に反応する抗体と、標識物質との結合体（標識抗体）が広く用いられている。本発明の免疫測定方法では、このような、通常の免疫測定における標識抗体の機能を果たすものとして、標識物質と、抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片と、水溶性担体との結合体（標識物質－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体、以下、便宜的に「高分子標識体」と呼ぶことがある）が用いられる。以下、これについて説明する。
高分子標識体中の水溶性担体としては、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール（商品名）、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース（例えば、ヘミセルロースやリグリン等）、キチン、キトサン、β―ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びＤＮＡ、並びにこれらの修飾体（例えば、DEAE Dextranやデキストラン硫酸ナトリウム等）を挙げることができる。これらのうち、デキストラン及びアミノデキストラン並びにこれらの修飾体が好ましく、特にデキストランが好ましい。
水溶性担体の重量平均分子量は、特に限定されないが、免疫測定の感度の観点及び水溶性であるという観点から、６千～４００万が好ましく、特に２万～１５万が好ましい。
高分子標識体中の標識物質（標識として機能する物質）としては、公知の免疫測定において用いられている標識物質であればいずれも用いることができ、例えば、酵素、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質、ビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ＦＩＴＣなどの低分子量標識物質、低分子量のペプチド、レクチンなどを用いることができる。特に、簡便かつ安定性のある試験を可能とすることから、酵素の使用が好ましい。酵素の好ましい例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びルシフェラーゼを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。以下、標識物質の代表例としての酵素(以下「標識酵素」とも称する)を用いた実施形態を示すが、標識物質を酵素に限定するものではない。
高分子標識体中の抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片としては、ＨＢＶ抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片であれば特に限定されない。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。抗原結合性断片としては、測定対象となるＨＢＶと抗原抗体反応する断片であれば特に限定されず、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片やＦ（ａｂ’）２断片等を挙げることができる。これらの抗原結合性断片は、抗体を２－メルカプトエチルアミンのような還元剤や、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素で処理する、周知の方法により容易に調製することができる。本発明では、検出感度の観点から、抗体断片を用いることが好ましく、特にＦａｂ’断片が好ましい。
高分子標識体中の、標識酵素、抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片及び水溶性担体の三者の比率は、検出感度を向上させるために、水溶性担体１分子に結合する標識酵素及び抗体又はその抗原結合性断片の分子数ができるだけ多くなるように設定することが好ましく、水溶性担体を１００重量部とした場合、標識酵素が好ましくは２００重量部～２０００重量部、さらに好ましくは、４００重量部～１２００重量部程度、抗体又は抗原結合性断片が好ましくは７００重量部～１４００重量部、さらに好ましくは、１０００重量部～１３００重量部程度である。
上記三者は、共有結合で結合していることが好ましい。例えば、下記実施例に具体的に記載するように、先ず、水溶性担体を過ヨウ素酸ナトリウムのような酸化剤で酸化してアルデヒド基を生成させ、これをクロロヒドラジンと反応させてヒドラジン化し、一方、標識酵素を過ヨウ素酸ナトリウムのような酸化剤で酸化してその糖鎖にアルデヒド基を生成させる。このアルデヒド基と水溶性担体のヒドラジン残基とを反応させてヒドラゾンを形成して結合し、次いで、得られた水溶性担体－標識酵素結合体を、EMCS（Ｎ－ε－レイミドカプロイル－オキシスルフォサクシミドエステル）のようなタンパク質カップリング剤で処理し、これを抗体又はその断片と反応させ、標識酵素と抗体又はその断片とを共有結合させることにより、三者を共有結合させることができる。この方法によれば、２分子以上の水溶性担体が標識酵素を介して結合したものに、抗体又はその断片が結合したものが得られる。
もっとも、三者を共有結合させる方法は、上記方法に限定されるものではない。例えば、アミノ基（標識酵素や抗体又はその断片のアミノ基や、水溶性担体に導入したアミノ基）にチオール基を導入し、一方、他の物質のアミノ基にマレイミド基やピリジルジスルフィド基を導入して反応させる方法等の周知の他の方法を採用することもできる。チオール基の導入は、例えば、Ｓ－アセチルメチルカプト無水コハク酸やＮ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート等の市販の試薬を用いて行うことができ、アミノ基へのマレイミド基の導入は、例えば、Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドやＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）スクシンイミド等の市販の試薬を用いて行うことができる。ピリジルジスルフィド基の導入は、例えば、N -Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDP)やN -{6-[3-(2-Pyridyldithio)propionamido]hexanoyloxy}sulfosuccinimide, sodium salt(Sulfo-AC5-SPDP)等の市販の試薬を用いて行うことができる。
これらの反応に供する標識酵素、抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片及び水溶性担体の比率は、上記した好ましい三者の比率が達成されるように適宜選択される。反応に供する三者の比率は、水溶性担体を１００重量部とした場合、標識酵素が好ましくは２００重量部～２０００重量部、さらに好ましくは、４００重量部～１２００重量部程度、抗体又は抗原結合性断片が好ましくは７００重量部～１４００重量部、さらに好ましくは、１０００重量部～１３００重量部程度である。
免疫測定時における反応液中の高分子標識体の終濃度は、特に限定されないが、免疫測定の感度の観点から、標識酵素の重量で０．１～１０μｇ／ｍＬが好ましく、特に０．５～５．０μｇ／ｍＬ、さらに１．０～３．０μｇ／ｍＬが好ましい。
本発明の免疫測定方法において、ＨＢＶ抗原と高分子標識体との反応は、水溶性高分子の存在下で行う。すなわち、水溶性高分子と高分子標識体とが共存する条件下で免疫反応を行う。前記水溶性高分子としては、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール（商品名）、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース（例えば、ヘミセルロースやリグリン等）、キチン、キトサン、β―ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びＤＮＡ、並びにこれらの修飾体（例えば、DEAE Dextranやデキストラン硫酸ナトリウム等）を挙げることができる。これらのうち、デキストラン及びアミノデキストラン並びにこれらの修飾体が好ましく、特にデキストランが好ましい。
水溶性高分子の重量平均分子量は、特に限定されないが、免疫測定の感度の観点及び水溶性であるという観点から、２万～４００万が好ましく、特に７０万～３００万、さらには１００万～２５０万が好ましい。
免疫測定における抗原抗体反応の反応液中の、水溶性高分子の終濃度は、特に限定されないが、免疫測定の感度の観点から、０．０１～１０．０重量％が好ましく、特に０．１～５．０重量％、さらには０．５～３．０重量％が好ましい。なお、以下の記述において、濃度を示す％は、特に断りがない限り、重量％を意味する。
本発明の免疫測定方法におけるＨＢＶ抗原と高分子標識体との反応は、水溶性高分子に加え、両イオン性界面活性剤の存在下で行われることが好ましい。両イオン性界面活性剤をさらに反応系に加えることで、バックグラウンドを低下させることが可能となる。好ましい両イオン性界面活性剤としては、(i)分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両イオン性界面活性剤や、(ii) 分子内にステロイド骨格と第四級アンモニウムとを有する両イオン性界面活性剤を挙げることができる。(i)の両イオン性界面活性剤の好ましい例としては、C10APS(N-デシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート)、C12APS(N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート)、C14APS(N-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート)、C16APS(N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルフォネート)等を挙げることができる。(ii)の両イオン性界面活性剤の好ましい例としては、CHAPS(3-[(3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルフォネート)やCHAPSO(3-[(3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]-1-ヒドロキシプロパンスルフォネート)等を挙げることができる。これらのうち、特に (1)分子内に炭素数１０以上のアルキル基と第四級アンモニウムとを有する両イオン性界面活性剤が好ましい。
免疫測定時における反応液中の両イオン性界面活性剤の終濃度（界面活性剤を複数種類含む場合にはその合計終濃度）は、特に限定されないが、０．１～１０％が好ましく、特に１．０～７．０％、さらには２．０～５．０％が好ましい。
本発明の免疫測定方法は、上記した水溶性高分子と上記した高分子標識体とを共存させて免疫測定を行うこと以外は、標識抗体を用いる通常のサンドイッチ免疫測定方法と同様に行うことができる。例えば、磁性ビーズ等の固相担体に抗ＨＢＶ抗体（捕捉抗体）を固相化したものと、ＨＢＶ抗原を含む試料とを反応させて試料中のＨＢＶ抗原を固相に結合させ、次いで、洗浄後、これに上記水溶性高分子と上記高分子標識体を含む液を添加して反応させ、洗浄後、固相に結合した標識酵素を定量することにより、免疫測定を行うことができる。各抗原抗体反応（捕捉抗体と試料中のＨＢＶ抗原との反応、及び固相に結合したＨＢＶ抗原と高分子標識体との反応）は、通常のサンドイッチ法と同様でよく、例えば、室温～３７℃、好ましくは３７℃で、３分～１２０分程度、好ましくは、５分～１０分程度行うことができるが、これらの条件に限定されるものではない。
固相に結合した標識酵素の定量は、用いた標識酵素の種類に応じて、常法により行うことができる。例えば、標識酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合、基質としてＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を用い、ＡＭＰＰＤの分解時に放出される波長４６３ｎｍに極大吸収を有する光の発光量を計測することにより、固相に結合した標識酵素を定量することができる。これらは常法であり、これを実施するための試薬や自動測定装置が市販されているので、市販品を用いて容易に行うことができる。
生体から分離された試料は、そのまま、又は所望により希釈後、上記免疫測定に供することができるが、これに先立ち、試料を前処理に付してもよい。前処理を行うことで、検体中に存在する検体由来の抗ＨＢＶ抗体の影響を低減し、ＨＢＶ抗原をより精度よく測定することが可能となる。ここで、前処理は、試料を前処理液で処理することにより行うことができる。前処理液としては、(1)陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤から成る群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、及び／又は(2) 酸性化剤、アルカリ化剤及び蛋白変性剤から成る群より選ばれる少なくとも１種を含む。前処理液は、上記(1)と(2)を両方含んでいてもよいし、いずれか一方だけ含んでいてもよい。
前記前処理試薬に界面活性剤が含まれる場合、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれも使用可能であるが、特に陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオキシコール酸などを好適に使用でき、特にＳＤＳを好適に使用できる。
前処理試薬に含まれる主要な界面活性剤を陰イオン性界面活性剤とする場合、前処理後に、反応系に持ち込まれる陰イオン性界面活性剤の影響を軽減するために、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を単独または複数含む中和液を添加してもよい。
前記前処理試薬に含まれる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤に代えて、陽イオン性界面活性剤を使用することもできる。陽イオン性界面活性剤としては、特に炭素数１０個以上の一本鎖アルキル基と、第３級アミンまたは第４級アンモニウム塩を同分子中に有している陽イオン性界面活性剤が好ましい。このような界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃ１６ＴＡＣ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。陽イオン性界面活性剤の添加量は、検体との混和時の濃度で０．１％以上１５％以下が好ましく、さらに、０．５％～１０％が好ましい。
陽イオン性界面活性剤に加えて、さらに、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の他の界面活性剤が含まれていてもよい。他の界面活性剤の添加により、さらに高感度にＨＢＶ抗原を検出することが可能となる。
前処理液が酸性化剤を含む場合、酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸、クエン酸等を好適に使用できる。酸性化剤を使用する場合、前処理液の酸の規定度は、前処理時の濃度として、０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。酸の規定度を０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。
前処理液がアルカリ化剤を含む場合、アルカリ化剤としては、特に限定されるものではないが、酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化マグネシウム等を挙げることができる。アルカリ化剤を使用する場合、前処理液のアルカリの規定度は、前処理時の濃度として、０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。アルカリ化剤の規定度を０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。
前処理試薬には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で０．１Ｍ以上が好ましく、さらに０．５Ｍ以上４Ｍ未満が好ましい。また、前処理試薬には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、またはこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理試薬には、ＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれていてもよい。
前処理試薬には、必要に応じて、還元剤が含まれていてもよい。還元剤としては、タンパク質のＳ-Ｓ結合を切断するために通常使用されるものをいずれも使用可能であり、特に限定はされない。例えば、２－（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール等の既存の還元剤をいずれも使用可能である。
前記前処理工程において混和する検体と前処理試薬の体積比は、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１とすることが好ましい。前処理工程は、生体試料と前処理試薬を混和した後、さらに加熱をしてもよい。特に、前処理試薬に界面活性剤を使用する場合には、その効果を高めるために加熱をすることが好ましい。前処理工程における温度は、９５℃以下、特に２０～９０℃、さらに、２０～８０℃、２５～７０℃、２５～６０℃、３０～５０℃、または３５～４５℃とすることができる。前処理工程は、より高温条件下で加熱すれば、より短時間での処理が可能となるが、一方で、室温条件下でも実施可能であり、この場合、反応時間は長くなるが、高温加熱用のデバイスを必要としない、という利点がある。前処理工程の反応時間の上限は特に存在しないが、通常６０分以下、特に３０分以下でよい。
下記実施例で具体的に示されるように、本発明の免疫測定方法によれば、標識抗体（抗体を１分子の標識酵素で標識したもの）を用い、水溶性高分子の非存在下で行う従来の免疫測定方法に比べて、ＨＢＶ抗原の検出感度が高い。また、下記実施例で具体的に示されるように、市販の汎用の自動免疫測定装置をそのまま用いて実施することができる。
＜２．免疫測定キット＞
本発明の免疫測定キットは、構成試薬として、少なくとも、上記した高分子標識体及び上記した水溶性高分子とを含む標識体液を備える。本発明の免疫測定キットは、前記標識体液を備えることと、試料中のＨＢＶ抗原の免疫測定が可能な構成であること以外は特に限定されず、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、イムノクロマト等の通常の免疫測定で備えるべき構成を備えることができる。例えば、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）の場合は、捕捉抗体を固相化した磁性ビーズを含む磁性粒子液、洗浄液及び酵素基質液とを備えることができる。本発明の免疫測定キットは、さらに、必要に応じて、試料の前処理を行うための前処理液を備えていてもよい。
前記標識体液における高分子標識体の濃度は(標識酵素、抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片及び水溶性担体を含む)、特に限定されないが、免疫測定の感度の観点から、標識酵素の重量で０．１～１０μｇ／ｍＬが好ましく、特に０．５～５．０μｇ／ｍＬ、さらに１．０～３．０μｇ／ｍＬが好ましい。また、前記標識体液における水溶性高分子の濃度は、０．０１～１０．０％が好ましく、特に０．１～５．０％、さらには０．５～３．０％が好ましい。前記標識体には、さらに両イオン性界面活性剤が含まれることが好ましい。標識体液中の両イオン性界面活性剤の濃度は、０．１～１０％が好ましく、特に１．０～７．０％、さらには２．０～５．０％が好ましい。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜実施例１ デキストラン－酵素結合体の調製＞
（１）ヒドラジン化デキストランの調製
６００μＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に３０．０ｍｇのデキストラン７０Ｋ（ＴＣＩ社製）を添加し、２５℃の暗所で３０分間撹拌して、溶解させた。次いで、１５０ｍＭ ＮａＩＯ４を４００μＬ添加して、２５℃の暗所で３０分間撹拌した。ＰＤ－１０カラム（ＧＥ社製商品名、セファデックスG-25（商品名）充填カラム）を用いて、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）でバッファー交換を行い、２．５ｍＬの溶液を得た。０．６３ｇのＮＨ２ＮＨ２ＨＣｌを添加し、２５℃の暗所で６０分間撹拌した。１０ｍｇのＤＭＡＢ（ジメチルアミンボラン）を加え、さらに２５℃の暗所で６０分間撹拌した。ＣＥ５０ｋ（分子量５万のセルロースエステル）透析膜を用いてイオン交換水４Ｌによる透析を暗所で２時間行った後、４℃で一晩静置した。ＰＤ－１０カラム（商品名）を用いて、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）でバッファー交換を行い、２．５ｍＬの溶液を得た。濃度を２．５ｍｇ／ｍＬに調整し、ヒドラジン化デキストラン溶液を得た。
（２）デキストラン－酵素結合体の調製
１０ｍｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ－５０、オリエンタル酵母社製）１０ｍＬについて、ＰＤ－１０カラム（商品名）を用いて、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）でバッファー交換を行い、３．５１ｍｇ／ｍＬの溶液１３ｍＬを調製した。１８ｍＭ ＮａＩＯ４を８．７５ｍＬ添加して、２５℃の暗所で３０分間撹拌した。ＰＤ－１０カラム（商品名）を用いて、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）でバッファー交換を行い、０．５ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。（１）で調製した２．５ｍｇ／ｍＬヒドラジン化デキストランを、ヒドラジン化デキストランとＡＬＰ－５０のモル比が１：４となるように添加し、２５℃の暗所で１６時間撹拌した。ＤＭＡＢを２１ｍｇ添加し、２５℃の暗所で６０分間撹拌した。次いで、１．５Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ９．０）を２．５ｍＬ添加し、２５℃の暗所で２時間撹拌した。遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ５０ｋ）を用いて２．０ｍＬまで濃縮し、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いたゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）を行い、３．０ｍｇ／ｍＬのデキストラン－酵素結合体溶液１．０ｍＬを得た。
＜実施例２ デキストラン－酵素－抗体結合体の調製＞
（１）Ｆａｂ’の調製
常法に従って調製した３種のマウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（抗体Ａ、Ｂ及びＣ）、及び１種のマウス抗ＨＢｃｒＡｇモノクローナル抗体（抗体ｃ）をそれぞれ１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で抗体溶液を調製した。２－メルカプトエチルアミン溶液をそれぞれの抗体溶液に添加し、３７℃で反応させた。ＰＤ－１０カラムを用いて１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．３）でバッファー交換を行い、溶液を回収した。１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．３）で濃度を調整した。ＨＢｓＡｇ（配列番号１）上の抗体Ａ、Ｂ及びＣのエピトープ配列は、表１－１に示すとおりである。また、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）（配列番号２）上の抗体ｃのエピトープ配列は表１－２に示すとおりである。
Figure 0007320492000001
Figure 0007320492000002
（２）デキストラン－酵素－Sulfo-EMCSの調製
実施例１で調製したデキストラン－酵素結合体（３．０ｍｇ／ｍＬ）５．５ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬの Sulfo-EMCS（Ｎ－ε－マレイミドカプロイル－オキシスルフォサクシミドエステル）溶液（１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．３）で溶解）６８２μＬを添加し、２５℃の暗所で６０分間撹拌した。遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ５０ｋ）を用いて１．０ｍＬまで濃縮した後、ＰＤ－１０カラム（商品名）を用いて１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．３）でバッファー交換を行った。４．５ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍＬのデキストラン－酵素－Sulfo-EMCS溶液を得た。
（３）カップリング
（２）で調製したデキストラン－酵素－Sulfo-EMCS溶液に、（１）で調製したＦａｂ’溶液を、デキストラン－酵素－Sulfo-EMCSとＦａｂ’のモル比が１：４．５となるように２５℃の暗所で６０分間撹拌した。この際、抗ＨＢｓＡｇ抗体については、Ｆａｂ’中の各抗体のモル比が抗体Ａ：抗体Ｂ：抗体Ｃ＝１：１：２となるように混合して使用した。また、抗ＨＢｃｒＡｇ抗体については、抗体ｃのＦａｂ’を単独で使用した。２００ｍＭの３－メルカプト－１，２－プロパンジオール溶液を１／１００体積分添加し、２５℃の暗所で６０分間撹拌した。ＰＤ－１０カラム（商品名）を用いて１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．３）でバッファー交換を行った。２００ｍＭの２－ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）溶液を１／１００体積分添加し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ５０ｋ）を用いて３．０ｍＬまで濃縮し、そのうち２．０ｍＬをゲル濾過カラムに（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（商品名））に供し、溶出バッファー（０．１Ｍ ＭＥＳ、０．０５％ ＣＨＡＰＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、０．０９％ ＮａＮ３（ｐＨ６．８））で溶出した。ＢＳＡを終濃度３．３％となるように添加した後、０．４５μｍ孔フィルターでろ過し、２００μｇ／ｍＬのデキストラン－酵素－抗体（Ｆａｂ）結合体（高分子標識体）溶液７４ｍＬを得た。
＜実施例３ Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出＞
常法に従って調製した２種のマウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（抗体Ｄ及びＥ（エピトープ配列は表１に示す通り））を３：１となるように混合し、常法に従って磁性ビーズに固相化し、粒子希釈液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、２％ ＢＳＡ（ｐＨ７．２））に０．０７％となるように加え、磁性粒子液を調製した。３種のマウス抗ＨＢｓＡｇ抗体（抗体Ａ、Ｂ、及びＣ）をモル比１：１：２で混合した後、常法に従ってアルカリフォスファターゼ標識し、得られた標識抗体（以下、「単分子標識体」とも称する）を標識体希釈液（５０ｍＭ ＭＥＳ、６％ ＢＳＡ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、４．０％ Ｃ１４ＡＰＳ（ｐＨ６．８））で１．５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、単分子標識体液を調製した。併せて、実施例２で調製した高分子標識体を標識体希釈液で１．５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、高分子標識体液を調製した。単分子標識体液、高分子標識体液には、それぞれデキストラン２０００ｋ(シグマ社製、重量平均分子量２００万)を、０％、０．５％、１．０％、１．５％となるように添加した。なお、単分子標識体を用いた方法は、比較例であり、また、デキストランの添加量が０％（無添加）の方法も比較例である。
ＨＢｓＡｇ陰性血清検体３検体（１，２，３）及びＨＢｓＡｇ陽性血清検体３検体（Ｌ、Ｍ、Ｈ）各１００μＬを、前処理液（陰イオン性界面活性剤と還元剤を含む）２００μＬと混和し、８０℃で５分間撹拌（１０００ｒｐｍ）しながら加熱した。上記検体に併せて、ルミパルスＨＢｓＡｇ－ＨＱ標準液(富士レビオ社製)についても同様の処理を行った。
ＨＢｓＡｇの測定は、ルミパルスプレストＩＩ(富士レビオ社製)を用いて行った。前処理後の検体１００μＬを検体希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３．２％ ＣＨＡＰＳ、２．３％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、ｐＨ７．２）５０μＬと混合した。次いで、磁性粒子液５０μＬと混和し、３７℃で８分間反応させた。磁性ビーズを集磁し、ルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で５回洗浄した。各種標識体液をそれぞれ５０μＬ添加し、３７℃で８分間反応させた。磁性ビーズを集磁し、５回洗浄した後、ＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含むルミパルス基質液（富士レビオ社製）を５０μＬ添加し、３７℃で４分間反応させた。ＡＭＰＰＤが磁性ビーズに結合したアルカリフォスファターゼの触媒作用により分解されることで放出される波長４６３ｎｍに極大吸収を有する光の発光量を計測した。測定結果は、基質の発光強度（カウント）で出力した。各条件における測定結果を表２に示す。なお、表示の結果は、二重測定の平均値を示したものである。
Figure 0007320492000003
表２に示す通り、単分子標識体を使用した場合、標識体液にデキストランを1.5％添加した際の陽性検体におけるカウントの上昇は１１２～１１７％程度までに止まったのに対し、高分子標識体を使用した場合、陽性検体におけるカウントの上昇は１９６～２６２％となった。一方で、陰性検体においては、デキストランの添加によるカウントの上昇は１３６～１３８％に抑えられ、全体的にＳ／Ｎ比が顕著に上昇することが示された。
＜実施例４ Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原（ＨＢｃｒＡｇ）の検出＞
常法に従って調製した３種のマウス抗ＨＢｃｒＡｇモノクローナル抗体（抗体ａ，ｂ，ｄ）をモル比２：１：４となるように混合し、常法に従って磁性ビーズに固相化し、粒子希釈液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、２％ スクロース、８％ ＢＳＡ（ｐＨ７．５））に０．０６％となるように加え、磁性粒子液を調製した。１種のマウス抗ＨＢｃｒＡｇ抗体（抗体ｃ）を、常法に従ってアルカリフォスファターゼ標識し、得られた標識抗体（以下、「単分子標識体」とも称する）を標識体希釈液（２０ｍＭ ＭＥＳ、３％ ＢＳＡ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．４％ Ｎ－ラウロイル硫酸ナトリウム、０．２％ Ｃ１４ＡＰＳ（ｐＨ７．５））で１．０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、単分子標識体液を調製した。併せて、実施例２で調製した抗体ｃの高分子標識体を標識体希釈液で１．０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、高分子標識体液を調製した。単分子標識体液、高分子標識体液には、それぞれデキストラン２０００ｋ(シグマ社製、重量平均分子量２００万)を、０％、０．７５％、１．０％、１．５％となるように添加した。なお、単分子標識体を用いた方法は、比較例であり、また、デキストランの添加量が０％（無添加）の方法も比較例である。
ＨＢｃｒＡｇの測定は、ルミパルスＬ２４００(富士レビオ社製)を用いて行った。ＨＢｃｒＡｇ陰性血清検体３検体（４，５，６）と、２種のＨＢｃｒＡｇ陽性血清検体（７，８）をそれぞれ陰性血清で１×１０５、１×１０６、１×１０７倍に希釈した検体、それぞれ３０μＬを、前処理液（０．７１Ｍ 尿素、０．２２Ｎ ＨＣｌ、３．９ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４．３ｍＭ ＤＥＡＥＴ）９０μＬと混和し、３７℃で６．５分間加温した。次いで、中和液（０．７Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ、１０％ Ｎ－ラウロイル硫酸ナトリウム（ｐＨ１０））を３０μＬ加えて混和し、３７℃で２０秒間加温した。上記検体に併せて、ルミパルスＨＢｃｒＡｇ標準液(富士レビオ社製)中の、ＨＢｃｒＡｇ濃度０、５、２５０ｋＵ／ｍＬの標準液についても同様の処理を行った。
前処理後の検体１５０μＬを磁性粒子液５０μＬと混和し、３７℃で８分間反応させた。磁性ビーズを集磁し、ルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で５回洗浄した後、各種標識体液をそれぞれ５０μＬ添加し、３７℃で８分間反応させた。磁性ビーズを集磁し、ルミパルス洗浄液で５回洗浄した後、ＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含むルミパルス基質液（富士レビオ社製）を５０μＬ添加し、３７℃で４分間反応させた。ＡＭＰＰＤが磁性ビーズに結合したアルカリフォスファターゼの触媒作用により分解されることで放出される波長４６３ｎｍに極大吸収を有する光の発光量を計測した。測定結果は、基質の発光強度（カウント）で出力した。各条件における測定結果を表３に示す。
Figure 0007320492000004
表３に示す通り、単分子標識体を使用した場合、標識体液にデキストランを１．５％添加した際の陽性検体におけるカウントの上昇は１０３～１１９％程度までに止まったのに対し、高分子標識体を使用した場合、陽性検体におけるカウントの上昇は１５０～２２０％となった。

Claims (6)

  1. 生体から分離された試料中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原のサンドイッチ法による免疫測定方法であって、
    重量平均分子量が２万～４００万の水溶性高分子の存在下で、
    (1)前記試料中のＨＢＶ抗原と、
    (2) 標識物質と、抗ＨＢＶ抗体又は該抗ＨＢＶ抗体の抗原結合性断片と、水溶性担体との結合体（以下、「標識物質－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体」）と
    を反応させ、前記ＨＢＶ抗原と結合した前記標識物質－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体を検出することを含む、免疫測定方法。
  2. 前記標識物質が標識酵素であり、前記標識酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びルシフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記水溶性担体が、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール（商品名）、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース、キチン、キトサン、β―ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びＤＮＡ、並びにこれらの修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記水溶性高分子が、デキストラン及びアミノデキストラン、並びにこれらの修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＨＢＶ抗原に特異的に結合する抗体は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原と特異的に結合する抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 試料中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原を、請求項１に記載の免疫測定方法により免疫測定するキットであって、
    重量平均分子量が２万～４００万の水溶性高分子と、標識物質－抗ＨＢＶ抗体又はその抗原結合性断片－水溶性担体結合体とを含む液を備える、キット。
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