JP2000105233A - 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法並びにこれを用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を得
ることができる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法を提供す
る。 【解決手段】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも１種によって、
ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並びに、上記小粒
子化処理されたＨＢｓ抗原に、分子シャペロンを反応さ
せる工程からなる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法であっ
て、上記小粒子化処理する工程と上記反応させる工程と
は、同時に行う小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＢｓ抗原を小粒
子化させる際に伴う構造変化を抑えることによって、抗
原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を得ることができ
る小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法、並びに、上記小粒子化
ＨＢｓ抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定
試薬及び免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染時の患
者血清中には、直径４２ｎｍのＤａｎｅ粒子と呼ばれる
二本鎖ＤＮＡウイルスの他に、直径２２ｎｍの小型球状
粒子や同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍの管状粒子が存
在することが知られている。これらＨＢＶには、ＨＢＶ
の外被（ｓｕｒｆａｃｅ）、芯（ｃｏｒｅ）に対応する
表面抗原（ＨＢｓ抗原）、核抗原（ＨＢｃ抗原）等が存
在する。

【０００３】このような各抗原に対する抗体の検出は、
臨床診断上重要である。特に、ＨＢｓ抗体は、ＨＢＶに
対する感染防御抗体であるので、過去にＨＢＶの感染が
あり既に排除されている場合やＨＢＶワクチン接種後で
ある場合に血中に検出される。従って、ＨＢｓ抗体が陽
性であることは、ＨＢＶに対して抵抗性があり、再感染
のおそれがないことを示すものである。

【０００４】血中のＨＢｓ抗体の定量的測定法として
は、通常、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が用いら
れ、例えば、酵素標識したＨＢｓ抗原を使用する酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）、ＨＢｓ抗原を血球やラテックス等
の不溶性担体に担持させた血球凝集法やラテックス凝集
法等が挙げられる。

【０００５】ＥＩＡをワンステップサンドイッチ法で行
う場合、例えば、精製したＨＢｓ抗原をビーズやマイク
ロタイタープレートのウェル内壁等の不溶性担体に予め
固定化しておき、これにＨＢｓ抗体を含有する検体及び
酵素標識したＨＢｓ抗原を含有する溶液を加えて免疫反
応させて固定化ＨＢｓ抗原−ＨＢｓ抗体−酵素標識ＨＢ
ｓ抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素発
色基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出する
ことにより、検体中のＨＢｓ抗体を定量することができ
る。

【０００６】ＥＩＡに使用する酵素標識抗原を調製する
際には、通常、二価性架橋剤を用いるが、抗原と酵素が
ともに分子量の大きい場合には、それらを反応させるに
際して、両者の濃度を上げる必要がある。しかし、ＨＢ
ｓ抗原は、分子量３００万〜４００万という巨大分子で
あり、酵素との結合が可能な濃度に抗原を溶解させるた
めには界面活性剤を多量に使用する必要がある。しか
し、このような条件下では多くの酵素が失活してしまう
ため、酵素標識が困難であった。

【０００７】また、血球凝集法やラテックス凝集法は、
精製したＨＢｓ抗原をラテックスや血球等に担持させ、
これをＨＢｓ抗体含有検体と混合して抗原抗体反応させ
て、ラテックスや血球が抗体により架橋・凝集され、こ
の凝集を検出することにより検体中のＨＢｓ抗体を定量
することができる。

【０００８】ラテックスや血球に担持させる抗原量は、
多ければ多いほど反応性が増加し、試薬の感度が向上す
る。しかしながら、ＨＢｓ抗原は、上述のように巨大分
子であるために、担体（ラテックスや血球）の表面積当
たりの担持量が少なくなり、充分な試薬感度を得ること
が困難であった。

【０００９】特開平６−１３８１２３号公報には、ＨＢ
ｓ抗原を還元剤を用いてＨＢｓ抗原のジスルフィド結合
を開裂し、分子量が５０万〜１００万の小粒子化したＨ
Ｂｓ抗原を調製し、これを用いて酵素標識体を調製する
方法が開示されている。しかしながら、このような方法
で得られたＨＢｓ抗原は、抗原活性の低下が認められて
おり、酵素標識抗原の調製やラテックスや血球等への担
持に用いるのには適したものではなかった。従って、抗
原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原の調製方法が望ま
れていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、抗原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を得るこ
とができる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法、並びに、上記
小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法により得られた小粒子化Ｈ
Ｂｓ抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試
薬及び免疫測定方法を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、界面活性剤、
還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される
少なくとも１種によって、ＨＢｓ抗原を小粒子化処理す
る工程、並びに、上記小粒子化処理されたＨＢｓ抗原
に、分子シャペロンを反応させる工程からなる小粒子化
ＨＢｓ抗原の調製法であって、上記小粒子化処理する工
程と上記反応させる工程とは、同時に行う小粒子化ＨＢ
ｓ抗原の調製法である。

【００１２】上記ＨＢｓ抗原は、タンパク質、糖質及び
脂質から構成され、構成するタンパク質が多くのジスル
フィド結合（−ＳＳ−結合）を有していることが知られ
ている。上記ＨＢｓ抗原を小粒子化処理するためには、
（１）還元剤を用いてジスルフィド結合を開裂させる、
（２）界面活性剤を用いて脂質を除去する、及び／又
は、（３）タンパク質変性剤を用いて高次構造をほぐす
ことが有効であるが、いずれの小粒子化処理方法におい
ても、タンパク質の構造変化が生じ、ＨＢｓ抗原の抗原
活性が損なわれるが、本発明は、上記小粒子化処理した
ＨＢｓ抗原に分子シャペロンを反応させることにより、
小粒子化処理したＨＢｓ抗原の抗体結合部位の構造変化
を抑制させて、抗原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原
を調製するものである。

【００１３】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法は、
界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群よ
り選択される少なくとも１種によって、ＨＢｓ抗原を小
粒子化処理する工程を含む。本明細書中において、小粒
子化ＨＢｓ抗原とは、ＨＢｓ抗原を、界面活性剤、還元
剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される少な
くとも１種で処理することによって得られる、低分子量
化したＨＢｓ抗原を意味する。

【００１４】上記界面活性剤は、脂質を除去可能なもの
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−
［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、オクチルグルコ
シド（ＯＧ）、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊｉ）、ポリオキシエ
チレンｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル（Ｓｐａｎ）、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等が挙げられる。上記界面活
性剤の使用濃度は、処理するＨＢｓ抗原濃度によって異
なるが、０．０１〜１０００ｍＭの範囲であることが好
ましい。

【００１５】上記還元剤は、タンパク質のジスルフィド
結合を解離させるものであれば特に限定されず、例え
ば、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチル
アミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスルトール、
水素化ホウ素ナトリウム、モノチオリン酸等が挙げられ
る。上記還元剤の使用濃度としては、処理するＨＢｓ抗
原の濃度によって異なるが、通常は溶液中の濃度が０．
０１〜２０％となるように用いることができる。

【００１６】上記タンパク質変性剤は、タンパク質の高
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。上記タン
パク質変成剤の使用濃度は、処理するＨＢｓ抗原濃度に
よって異なるが、０．１〜８Ｍの範囲が好ましい。上記
還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤は、それぞれ
単独で用いてもよく、又は、混合して用いてもよい。

【００１７】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法は、
上記小粒子化処理されたＨＢｓ抗原に、分子シャペロン
を反応させる工程を含む。本発明は、上記小粒子化処理
されたＨＢｓ抗原に分子シャペロンを反応させる工程を
含むことによって、分子シャペロンのタンパク質折り畳
み作用により、小粒子化処理したＨＢｓ抗原の立体構造
を安定化させたり、構造変化をすばやく修復させて、抗
原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を調製するもので
ある。

【００１８】本発明で用いる分子シャペロンは、熱ショ
ックタンパク質の一種であり、細胞が温度変化等の様々
な環境ストレスにさらされた際に生産されるものであ
る。上記分子シャペロンは、原核生物、真核生物を問わ
ず広く存在しており、特に大陽菌から生産される分子シ
ャペロンとして、ＧｒｏＥが良く知られている。

【００１９】上記ＧｒｏＥは、タンパク質の種類を問わ
ず、ＡＴＰ存在下、非特異的にタンパク質の立体構造形
成に関与することが明らかにされている。例えば、上記
ＧｒｏＥの構成体であるＧｒｏＥＬは、７個のサブユニ
ットが環状に連なったドーナツ型構造が２段に重なっ
た、合計１４サブユニットからなる特徴的な構造を有し
ている。ＧｒｏＥＬはドーナツ構造の凹部に変性タンパ
ク質を捕捉し、ＡＴＰ等のヌクレオチドの消費と補助因
子であるＧｒｏＥＳの結合を伴って、効率的に正しい立
体構造のタンパク質へと折り畳むことが知られている。

【００２０】上記分子シャペロンは、真核生物、真正細
菌若しくは古細菌から調製したもの、又は、真核生物、
真正細菌若しくは古細菌から調製したＤＮＡから発現さ
れたものを用いることができる。

【００２１】上記真核生物由来の分子シャペロンとして
は特に限定されず、例えば、酵母のＳｓａｌ−４ｐ、Ｓ
ｓｃｌｐ、Ｋａｒ２ｐＢｉｐ、Ｇｒｐ７８；ほ乳類のｈ
ｓｃ７０、ＨＳＰ５８、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ９０；カビ
類のＨＳＰ６０；植物由来のｒｕｂｉｓｃｏ ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ等が挙げられる。上記真正細菌
由来の分子シャペロンとしては特に限定されず、例え
ば、大腸菌のＧｒｏＥ、ＤｎａＫ、ＳｅｃＢ等が挙げら
れる。

【００２２】上記分子シャペロンとしては、古細菌から
調製したもの、又は、古細菌から調製したＤＮＡから発
現されたものが好ましい。上記古細菌由来の分子シャペ
ロンのうち、ＨＳＰ６０に属する分子シャペロンは、大
陽菌のＧｒｏＥＬと同様の作用を有するが、ＧｒｏＥＳ
に相当する補助因子なしで同様の作用を示すことがわか
っている。従って、古細菌由来の分子シャペロンを大量
に得ようとする場合、補助因子の調製の手間が操作が省
ける分、作業性に優れる。

【００２３】上記古細菌としては、例えば、スルホロバ
ス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルホロコッカス
（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロディクテ
ィム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、サーモフィラス
（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプロテウス（Ｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、ピロバキュラム（Ｐｙ
ｒｏｂａｃｕｌｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属、メサノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、メサノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙ
ｒｕｓ）属、メサノサーマス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒ
ｍｕｓ）属、アーキアブロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏ
ｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、メサノプラナス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎ
ｕｓ）属、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒ
ｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシア（Ｍｅｔｈａｎｏｓａ
ｒｃｉｎａ）属由来のものが使用できる。上記古細菌の
中でも、特に、メタノコッカス属古細菌から調製したも
の、又は、メタノコッカス属古細菌から調製したＤＮＡ
から発現されたものが好ましい。

【００２４】上記メタノコッカス属菌とは、海洋性古細
菌のメタン生成菌に属し、水素、二酸化炭素及びギ酸か
らメタンを生成することを特徴とする球状菌群である。
上記メタノコッカス属菌は、大腸菌のように７〜８種類
の分子シャペロンを有しそれぞれが複雑に作用しあうと
いったものでなく、分子シャペロンを１又は２種類しか
有さないため、タンパク質に対する汎用性は高い。

【００２５】上記メタノコッカス属菌は、その至適生育
温度から中温菌と高温菌に分類され、高温菌にはメタノ
コッカス・ヤンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ：最適温度８５℃）、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｕｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ：
ＡＴＣＣ３５０９７、最適温度６５℃）の２種がある。
最適温度が２０〜４０℃である中温菌には、メタノコッ
カス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓｖｏｌｔ
ａｅ：ＡＴＣＣ３３２７３）、メタノコッカス・デルタ
エ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｄｅｌｔａｅ：ＡＴ
ＣＣ３５２９４）、メタノコッカス・フリシュス（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｆｒｉｓｉｕｓ：ＡＴＣＣ４
３３４０）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔ
ｈａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ：ＡＴ
ＣＣ４３０００）、メタノコッカス・バンニエリ（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ：ＡＴＣ
Ｃ３５０８９）等が挙げられる。

【００２６】上記メタノコッカス属の中で、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）か
ら得られた分子シャペロンは、熱安定性に優れており、
９０℃及び１００℃といった高温条件下で放置しても失
活しにくい。これまで市販されている分子シャペロン
は、６５℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で
用いることはできなかった。しかしながら、上記メタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
ｓ）から得られた分子シャペロンは、３７〜６５℃とい
った中温だけでなく、８０〜９０℃といった高温条件下
でも使用可能である。更に、これらの耐熱性分子シャペ
ロンの特徴は、その活性が長期にわたって保存されると
いう点である。

【００２７】上記メタノコッカス属の中温菌の中で、特
に、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）から得られる分子シャペロン
は、４〜４０℃の広い範囲でＨＢｓ抗原を安定化する効
果がある。

【００２８】本発明で用いられる分子シャペロンは、上
記メタノコッカス属細菌から直接精製して得ることもで
きるが、これらの生物の分子シャペロンをコードするＤ
ＮＡ塩基配列をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育
の速い生物に組み込んで調製することが、大量に生産で
きるので好ましい。具体的な手法としては、「新生物化
学実験の手引き」（化学同人社）等に記載された遺伝子
実験プロトコール等の常法を応用することで充分であ
る。

【００２９】上記分子シャペロンを真核生物、真正細菌
又は古細菌から直接調製する方法としては、真核生物、
真正細菌又は古細菌を適当な培地及び培養条件下で培養
し、培養した菌体を破砕後、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー等の従来公知の精製方法
によって得る方法が挙げられる。

【００３０】上記分子シャペロンの確認方法としては、
分子シャペロンはＡＴＰアーゼ活性を有するので、Ｌａ
ｎｚｅｔｔａ Ｐ．Ａ著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、
１００号、９５〜９７頁記載のＡＴＰアーゼ活性測定法
を用いることにより行うことができる。

【００３１】上記ＤＮＡ塩基配列としては、例えば、メ
タノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉ
ｃｕｓ）由来シャペロニンについては、配列表の配列番
号４として記載した。

【００３２】具体的には、上記古細菌としてメタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）
を用いて、このシャペロニンを得る方法としては次の方
法が採用できる。即ち、工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ―１６４３８として寄託さ
れているプラスミドｐＥＴＴＳＩは、メタノコッカス・
サーモリソトロフィカスのシャペロニンをコードする遺
伝子を含むプラスミドであるが、これを鋳型とし、適当
な制限酵素サイトを含むプライマーを用い、常法に従っ
てＰＣＲ法によって増幅させる。ＰＣＲ産物から得られ
る遺伝子の断片を、耐性マーカーを含むプラスミドに挿
入し、組み換えプラスミドで大腸菌や酵母等を形質転換
する。この形質転換体を培養し、培養菌体を破砕後、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー
等の従来公知の精製方法によって、メタノコッカス・サ
ーモリソトロフィカスのシャペロニンを得ることができ
る。

【００３３】上記分子シャペロンは、サブユニット１４
〜１６個がドーナツ型２段構造を形成したオリゴマーと
して反応を起こす。即ち、オリゴマー体に変性タンパク
質が結合して折り畳み反応の結果、タンパク質が正常な
構造に戻り、その後オリゴマー体分子シャペロンから遊
離する。

【００３４】上記オリゴマー構造体を形成、維持させた
り、活性を発現させるには、通常、溶液中に塩化マグネ
シウム及びＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、並びに、硫
酸アンモニウム及び塩化カリウムが必要である。特に、
ＡＴＰは、分子シャペロンとタンパク質が解離する際に
不可欠な因子である。

【００３５】上記塩化マグネシウム及びＡＴＰ並びに硫
酸アンモニウム及び塩化カリウムの反応液中における濃
度としては特に限定されず、例えば、塩化マグネシウム
は１０〜２００ｍＭ、硫酸アンモニウム及び塩化カリウ
ムは１００〜５００ｍＭ、ＡＴＰは０．５〜１０ｍＭの
範囲が好ましい。

【００３６】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法にお
いて、ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程と、上記小粒
子化処理されたＨＢｓ抗原に分子シャペロンを反応させ
る工程とは、同時に行う。

【００３７】上記小粒子化処理する工程と上記反応させ
る工程とを同時に行う方法としては特に限定されず、例
えば、ＨＢｓ抗原を希釈した溶液（以下、「ＨＢｓ抗原
希釈液」ともいう）、並びに、還元剤、界面活性剤及び
タンパク質変性剤からなる群より選択される少なくとも
１種の処理剤を溶解した溶液（以下、「小粒子化用液」
ともいう）を混合した液に、分子シャペロンを添加して
反応させることができる。上記方法によって、抗原活性
を有した小粒子化ＨＢｓ抗原を得ることができる。

【００３８】上記分子シャペロンの使用濃度としては、
モル比で、ＨＢｓ抗原の０．０１〜２００倍、好ましく
は１〜２０倍程度である。上記ＨＢｓ抗原の処理濃度と
しては特に限定されず、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬが
通常用いられる。上記反応温度及び時間としては特に限
定されず、例えば、４〜６０℃、３０分〜４８時間の範
囲等が挙げられる。

【００３９】上記ＨＢｓ抗原を予め希釈しておく希釈液
としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸
緩衝液等が挙げられる。上記希釈液のイオン強度として
は、ＨＢｓ抗原を希釈するのに好適なものであれば特に
限定されないが、ＮａＣｌを０．０５〜１Ｍとなるよう
にしたものが好ましい。上記希釈液のｐＨは特に限定さ
れないが、４．５〜９．０の範囲が好ましい。

【００４０】上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変
性剤からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤
を溶解させておく緩衝液としては特に限定されず、上記
ＨＢｓ抗原の希釈液で例示したもの等が挙げられる。

【００４１】本発明２は、界面活性剤、還元剤及びタン
パク質変性剤からなる群より選択される少なくとも１種
によって、ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並び
に、上記小粒子化処理されたＨＢｓ抗原に、分子シャペ
ロンを反応させる工程からなる小粒子化ＨＢｓ抗原の調
製法であって、上記反応させる工程は、上記小粒子化処
理する工程を行った後に行う小粒子化ＨＢｓ抗原の調製
法である。

【００４２】本発明２は、小粒子化処理する工程を行っ
た後に、小粒子化処理されたＨＢｓ抗原に分子シャペロ
ンを反応させる工程を行うことによって、分子シャペロ
ンのタンパク質折り畳み作用により、ＨＢｓ抗原中の変
化した抗体結合部位の構造の再構成を行わせしめ、抗原
活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を調製するものであ
る。

【００４３】本発明２の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法に
おいて、小粒子化処理する工程を行った後、反応させる
工程を行う方法としては特に限定されず、例えば、ＨＢ
ｓ抗原希釈液と小粒子化用液を混合、反応させた後、分
子シャペロンを添加する方法等が挙げられる。上記小粒
子化処理の温度及び時間としては、例えば、１０〜６０
℃、１〜１０時間の範囲等が挙げられる。上記分子シャ
ペロンの反応における温度及び時間としては特に限定さ
れず、例えば、４〜５０℃、３０分〜４８時間の範囲等
が挙げられる。

【００４４】本発明１及び本発明２において、上記分子
シャペロンは、溶液状態だけではなく、不溶性担体に固
定化してバイオリアクターとして用いることができる。
上記不溶性担体としては、通常の酵素固定化用担体であ
れば特に限定されず、例えば、セルロース、アガロー
ス、デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリ
マー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、イオン交換
樹脂、ビニルポリマー、ガラスビーズ、セラミック、光
架橋性樹脂、ポリウレタン等が挙げられる。上記不溶性
担体としては、また、セルロースやアガロースを臭化シ
アンで活性化した担体や、ビニルポリマーに官能基を導
入した担体が、タンパク質の結合用担体として市販され
ており、それらを用いることもできる。

【００４５】上記分子シャペロンと不溶性担体との結合
法は、タンパク質の固定等に用いられているものであれ
ば特に限定されず、例えば、共有結合法、物理的吸着
法、イオン結合法、架橋法、包括格子型法、マイクロカ
プセル格子型法等が挙げられる。上記分子シャペロン
は、ヒスチジン６残基又はグルタチオントランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）等の融合タンパク質として発現させれ
ば、市販のアフィニティ担体との結合を行うことができ
るため、容易に分子シャペロン結合担体を得ることがで
きる。上記分子シャペロンの不溶性担体への吸着量は特
に限定されないが、担体１ｃｍ ³ 当たりタンパク量とし
て０．１〜１０００ｍｇが望ましい。

【００４６】上記分子シャペロン結合担体を用いたＨＢ
ｓ小粒子化抗原への作用方法としては特に限定されず、
例えば、分子シャペロン結合担体を塩化マグネシウム及
びＡＴＰ並びに塩化カリウム及び硫酸アンモニウムを適
当量溶解させた緩衝液に懸濁させた後、 （１）分子シャペロン結合担体懸濁液、ＨＢｓ抗原希釈
液及び小粒子化処理用液を混合、反応させた後に、遠心
分離操作等により分子シャペロン結合担体を沈殿させ
て、上清に含まれる小粒子化ＨＢｓ抗原を回収する方
法、又は、分子シャペロン結合担体と小粒子化操作終了
後のＨＢｓ抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を混
合、反応させた後に、上記と同様にして小粒子化ＨＢｓ
抗原を回収する方法、

【００４７】（２）分子シャペロン結合担体懸濁液をカ
ラムに充填し、これにＨＢｓ抗原希釈液及び小粒子化処
理用液を展開、反応させた後に溶出される小粒子化ＨＢ
ｓ抗原を回収する方法、又は、分子シャペロン結合担体
をカラムに充填し、これに小粒子化操作終了後のＨＢｓ
抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を展開・反応させ
た後に溶出される小粒子化ＨＢｓ抗原を回収する方法、

【００４８】（３）分子シャペロン結合膜とＨＢｓ抗原
希釈液及び小粒子化処理用液を混合、反応させて小粒子
化ＨＢｓ抗原を回収する方法、又は、分子シャペロン結
合膜と小粒子化処理操作終了後のＨＢｓ抗原希釈液−小
粒子化処理用液混合液を混合、反応させて小粒子化ＨＢ
ｓ抗原を回収する方法等が挙げられる。上記分子シャペ
ロン固定化担体は繰り返し使用が可能である。

【００４９】本発明１及び本発明２の小粒子化ＨＢｓ抗
原の調製法により得られた小粒子化ＨＢｓ抗原は、酵素
標識することによって、免疫測定試薬を製造することが
できる。

【００５０】上記酵素標識の方法としては、二架性架橋
剤を用いた直接架橋法、及び、ビオチン−アビジン架橋
法を用いた標識アビジン−ビオチン法が挙げられる。上
記直接架橋法としては、二架性架橋剤を精製水又はジメ
チルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）に溶解し、小粒子化Ｈ
Ｂｓ抗原を緩衝液を用いて適当量希釈した液に、モル比
で５〜１００倍程度になるように添加し、一定温度で１
〜２４時間程度インキュベーションする。この反応液
を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、未反応
の二架性架橋剤を除去して、官能基を導入した標識ＨＢ
ｓ抗原を得ることができる。

【００５１】次いで、上記官能基を導入した標識ＨＢｓ
抗原に、酵素を適当量溶解した液を添加して反応を行
い、酵素標識ＨＢｓ抗原液を調製することができる。反
応終了後に、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行
い、未反応酵素や未反応ＨＢｓ抗原を除去して、酵素標
識ＨＢｓ抗原を回収することができる。

【００５２】上記二架性架橋剤としては、ホモ架橋剤及
びヘテロ架橋剤が挙げられる。上記ホモ架橋剤として
は、例えば、エチレングリコール−ｏ，ｏ−ビススクシ
ニミジルサクシナト、４，４′−ジチオビス１−アザイ
ドベンゼン等が挙げられる。上記ヘテロ架橋剤として
は、例えば、スクシニニミジル トランス４−Ｎ−マレ
イミジルメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレイト
（ＳＭＣＣ）、Ｎ−４−マレイミドブチリロキシイスク
シニミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−６−マレイミドカプロイロ
キッシスクシニミド（ＥＭＣＳ）、及び、それらのスル
ホン化試薬等が挙げられる。

【００５３】上記酵素標識に用いる酵素としては特に限
定されず、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下
ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の
通常ＥＩＡに用いられる酵素が好適である。

【００５４】上記二架性架橋剤を用いる場合、上記酵素
標識に用いる酵素がアミノ基とチオール基の両方を有す
る場合とアミノ基だけを有する場合があるので、架橋剤
との組み合わせに留意する。例えば、上記酵素標識に用
いる酵素がＰＯＤの場合アミノ基のみを有するのでヘテ
ロ架橋剤を用い、上記酵素標識に用いる酵素がβ−ガラ
クトシダーゼの場合はアミノ基とチオール基の両方を有
しているので、ヘテロ、ホモ架橋剤のいずれも用いるこ
とができる。

【００５５】上記標識アビジン−ビオチン法では、小粒
子化ＨＢｓ抗原を好適な緩衝液を用いて適当量希釈した
ＨＢｓ抗原液に、ビオチン試薬を精製水又はＤＭＳＯに
溶解した液を、モル比でＨＢｓ抗原の１０〜１００倍程
度になるように添加し、２５℃付近で４〜１８時間程度
インキュベーションする。この液を、ゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーを用いて、遊離のビオチン試薬を除去
し、ビオチン標識ＨＢｓ抗原を得ることができる。

【００５６】次いで、上記調製したビオチン標識ＨＢｓ
抗原とアビジン／ストレプトアビジン標識酵素とを、３
７℃で３０分〜２時間程度反応させた後、ゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーにより、未標識のビオチン標識Ｈ
Ｂｓ抗原とアビジン／ストレプトアビジンを除去して、
酵素標識ＨＢｓ抗原を回収することができる。

【００５７】上記小粒子化ＨＢｓ抗原をビオチン化する
ビオチン化試薬には、Ｎ−スクシニミジル Ｄ−ビオチ
ン、スルホスクシニミジル Ｄ−ビオチン、スルホスク
シニミジルＮ−Ｎ−Ｄ−ビオチニル−６−アミノヘキサ
ノイル−６−アミノヘキサネイト等のリジン残基のε−
アミノ基等の遊離のアミノ基と結合する活性エステルタ
イプ；Ｎ′−［２−Ｎ−マレイミドエチル−Ｎ−ピペラ
ジリル Ｄ−ビオチナミド ハイドロクロライド、６−
Ｎ−２−Ｎマレイミドエチル−Ｎ−ピペラジニルアミド
ヘキシ Ｄ−ビオチナミド ハイドロクロライド等の
システイン残基等のチオール基と結合するマレイミドタ
イプが挙げられる。

【００５８】上記標識に用いる酵素としては、上記直接
架橋法で例示したもの等が挙げられる。上記アビジン／
ストレプトアビジン標識酵素は、上記酵素をアビジン／
ストレプトアビジンで標識したものを調製することもで
きるが、アビジン／ストレプトアビジン標識酵素は市販
されており入手が容易であるのでこれらを用いてもよ
い。

【００５９】本発明１及び本発明２の小粒子化ＨＢｓ抗
原の調製法により得られた小粒子化ＨＢｓ抗原は、ま
た、不溶性担体に担持させることによって、免疫測定試
薬を製造することができる。

【００６０】上記不溶性担体としては、疎水性の表面を
有する不活性担体、及び、部分的に疎水性表面を有する
不活性担体が挙げられ、例えば、ラテックス、プラスチ
ックビーズ、プラスチックプレート等の合成高分子化合
物からなるもの；シリカ等の無機材料からなるもの；タ
ンニン酸処理した赤血球；ニトロセルロース等の高分子
膜等が挙げられる。

【００６１】上記不溶性担体の表面には、化学結合を目
的とする種々の官能基が存在してもよく、また、アビジ
ン−ビオチン等の親和性を利用して物質を固定化するた
めのスペーサー等を有していてもよい。

【００６２】上記不溶性担体として、工業的に安定した
品質で大量生産しうるラテックス；プラスチックビー
ズ、プラスチックプレート等のプラスチック成型品が好
ましい。特に、検査の全自動化処理による検査時間の短
縮及び省力化が可能なこと等から、ラテックスがより好
ましい。上記ラテックスとしては、ポリスチレン系、合
成ゴム系等特に限定されないが、好ましくはポリスチレ
ン系のものである。上記ラテックスの平均粒径は０．０
５μｍ〜２．０μｍのものが好ましく、より好ましく
は、０．１μｍ〜０．５μｍのものである。

【００６３】上記不溶性担体への担持方法としては、例
えば、本発明１又は本発明２によって得られた小粒子化
ＨＢｓ抗原を好適な緩衝液で希釈し、これをＨＢｓ抗原
液とする。上記ＨＢｓ抗原液と上記不溶性担体とを、ｐ
Ｈ４．５〜９．０の水性媒体中で接触させ、所定時間イ
ンキュベートすることによりＨＢｓ抗原を担体に固定化
することができる。上記小粒子化ＨＢｓ抗原を担持させ
た不溶性担体を保存する液、及び、抗原抗体反応の反応
液として使用する水性媒体としては特に限定されず、例
えば、上記小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法においてＨＢｓ
抗原の希釈緩衝液としては例示したもの等の一般に用い
られている緩衝液が好ましい。

【００６４】上記酵素標識した小粒子化ＨＢｓ抗原、及
び、上記不溶性担体に担持させた小粒子化ＨＢｓ抗原
は、免疫測定試薬として使用した場合、高感度な免疫測
定法を行うことができる。例えば、ワンステップサンド
イッチ法によるＥＩＡに使用する場合には、上記小粒子
化ＨＢｓ抗原を担持した不溶性担体に、検体及び上記酵
素標識した小粒子化ＨＢｓ抗原を加え、一定時間免疫反
応させる。洗浄後、酵素発色基質を加え、酵素反応によ
り生じる生成物を検出し、同時に処理したＨＢｓ抗体濃
度既知の標準溶液から得られる標準曲線と比較すること
によって、検体中のＨＢｓ抗体の量を測定することがで
きる。また、上記不溶性担体に担持させた小粒子化ＨＢ
ｓ抗原は、ラテックス凝集法や血球凝集法等による免疫
測定方法にも好適に使用することができ、その操作方法
としては、例えば、上記不溶性担体に担持させた小粒子
化ＨＢｓ抗原と検体とを混合して、免疫凝集反応後、こ
の凝集を検出することにより、検体中のＨＢｓ抗体の量
を測定することができる。

【００６５】

【実施例】以下に本発明の実施例を掲げて更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。参考例１に、メタノコッカス属古細菌由来分子シ
ャペロンの調製方法の一例を記載したがこれに限定され
るものではなく、他の分子シャペロンも同様の方法にて
調製することができる。

【００６６】参考例１では、メタノコッカス・サーモリ
ソトロフィカス由来分子シャペロンの遺伝子組み換え技
術による調製法を記載した。参考例２では、同分子シャ
ペロンの固定化担体の調製法を記載した。実施例１〜４
では、分子シャペロンを用いた小粒子化ＨＢｓ抗原の調
製方法を記載した（実施例１〜３では、メタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来の分子シャペロン、実施
例４ではメタノコッカス・ボルタエ由来の分子シャペロ
ンを使用した）。実施例５及び６では、実施例１及び２
で調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた酵素標識抗原の
調製、及び、それを用いた免疫測定方法を記載した。比
較例１では、小粒子化処理していない精製ＨＢｓ抗原
を、比較例２では、分子シャペロンを用いないで調製し
た小粒子化ＨＢｓ抗原を、それぞれ用いて実施例５と同
様の酵素標識抗原の調製、及び、それを用いた免疫測定
方法を記載した。実施例７及び８では、実施例３及び４
で調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を用いたラテックス試薬
の調製、及び、それを用いた免疫測定方法を記載した。
比較例３では、小粒子化処理していない精製ＨＢｓ抗原
を、比較例４では分子シャペロンを用いないで調製した
小粒子化ＨＢｓ抗原を、それぞれ用いて実施例７と同様
のラテックス試薬の調製、及び、それを用いた免疫測定
方法を記載した。

【００６７】参考例１ 分子シャペロン（メタノコッカ
ス・サーモリソトロフィカス由来）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 メタノコッカス・サーモリソトロフィカスの分子シャペ
ロンをコードする遺伝子の断片を、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６４３８として寄託
されているプラスミドｐＵＴＴＳ１を鋳型とし、配列番
号１のフォワードプライマー及び配列番号２のリバース
プライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅させた。上記
プライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅、回収された
断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩで消化後、同様の制限
酵素処理が施された発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（スト
ラティジェン社製）にライゲーションした。その後、こ
れをＢＬ２１（ＤＥ３）株（ストラティジェン社製）に
トランスフォーメーションし、アンピシリン１００μｇ
／ｍＬを含むＬＢ培地プレート（トリプトン１０ｇ、酵
母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ（ｐＨ７．０））
にて培養後、コロニーをピックアップし、グリセロール
ストックとした。

【００６８】（２）組み換え大腸菌からの分子シャペロ
ン調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地２００ｍ
Ｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ
３）株（組み換え大腸菌）一白金耳を接種し、３７℃で
１６時間予備培養した。この培養液をＬＢ培地６リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社
製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−３０℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
５、５ｍＭＭｇＣｌ₂ ）に懸濁させ、超音波破砕処理し
た。遠心分離にて上清を採取し、９０分間、６５℃の水
浴中にて加熱処理を行い、夾雑タンパク質を変性凝集さ
せ、遠心分離にて除去した。更に、上清に硫酸アンモニ
ウム（和光純薬工業社製）を８０％飽和となるように添
加し、沈殿物を１．８Ｍの硫酸アンモニウムを含有する
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した。

【００６９】この溶液を、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ
−５ＰＷカラムによる疎水クロマトグラフィーにより精
製した。分子シャペロンに相当するサイズのタンパク質
が存在するフラクションを回収し、２５ｍＭＨＥＰＥＳ
（ｐＨ６．８）−ＫＯＨ、５％グリセロール緩衝液で透
析した。透析内液を、ＴＳＫ−Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−
５ＰＷカラムによる陰イオンクロマトグラフィーにより
精製した。分子シャペロンに相当するサイズのタンパク
質が存在するフラクションを回収した後、これを限外濾
過によって濃縮し、濃縮液をＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００
ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過（流速：０．５ｍＬ／
分、展開液：２５ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ６．
８）、２５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５％グリセロール）により
精製し、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来
分子シャペロンを含むフラクションを得た。

【００７０】なお、分子シャペロンの分子量は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおいて約６０ＫＤａであり、この分子量を
有する画分をトレースすることにより確認した。また、
分子シャペロンは、ＡＴＰアーゼ活性を有するので、Ｌ
ａｎｚｅｔｔａ Ｐ．Ａ著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、１００号、９５〜９７頁記載のＡＴＰアーゼ活性測
定法を用いることにより評価した。

【００７１】本フラクションに塩化マグネシウム、ＡＴ
Ｐ及び硫酸アンモニウムをそれぞれ５０ｍＭ、２ｍＭ及
び３００ｍＭとなるように添加し、３０℃にて５時間イ
ンキュベーションした。この溶液を再びゲル濾過に供
し、分子シャペロンの１６量体フラクションを得た。こ
の画分を以下の実施例に供した。

【００７２】実施例１ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製 （１）試薬及び材料 ＨＢｓ抗原：ヒト陽性血漿より精製した。精製方法は、
塩化セシウム溶液及びショ糖溶液による密度勾配法によ
り小型球状粒子抗原を回収し、更にゲル濾過法により精
製した。得られたＨＢｓ抗原を、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌを用い
て２ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、これをＨＢｓ抗原
液とした。小粒子化用液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌに、２％オク
チルグルコシド（同仁化学社製）及び１０ｍＭジチオス
レイトール（和光純薬社製）となるようにそれぞれ添加
して、これを小粒子化用液とした。分子シャペロン溶
液：塩化マグネシウムを７５ｍＭ、ＡＴＰを３ｍＭ及び
塩化カリウムを４５０ｍＭとなるように添加した５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に、参考例１
で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由
来の分子シャペロンを３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し
たものを分子シャペロン溶液とした。 管理血清：日水製薬社製、Ｌ−コンセーラＮ「ニッス
イ」を融解して用いた。ＨＢｓ抗原量測定用キット：ヘ
キストジャパン社製、エンザイグノストＨＢｓＡｇモノ
クローナルを用いた。

【００７３】（２）小粒子化方法 ＨＢｓ抗原溶液２．５ｍＬ、小粒子化用液７．５ｍＬ、
分子シャペロン溶液１０ｍＬを同時に混合し、２５℃に
て２時間インキュベーションした。インキュベーション
終了後に透析処理を行い、小粒子化剤等を除去した。抗
原含有液の小量を用いて、抗原性をＨＢｓ抗原測定キッ
トを用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほ
ぼ同等の抗原活性を保持していることを確認した。

【００７４】（３）分子量の測定 この操作で得られた小粒子化ＨＢｓ抗原の分子量分布を
調べるために高速液体クロマトグラフィーによる解析を
行った。高速液体クロマトグラフィーは島津社製ＨＰＬ
Ｃ−１０Ａシステムを、カラムは東ソー社製のゲル濾過
クロマト用カラムＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷ_XLを用
い、溶離液として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）＋０．１Ｍ ＮａＣｌにオクチルグルコシド
０．２％添加した液を用いた。検出は２８０ｎｍの吸光
度を測定することにより行い、また分子量標準物質とし
て東ソー社製のＴＳＫ標準ポリエチレンオキシドを用い
て較正曲線を作製し、これをもとに分子量分布を求め
た。その結果、分子量分布３０〜６０万付近に小粒子化
ＨＢｓ抗原と推定されるピークが認められた。

【００７５】実施例２ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製 （１）試薬及び材料 小粒子化用液及び分子シャペロン溶液として下記のもの
を使用したこと以外は、実施例１と同様のものを使用し
た。小粒子化用液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌに、１％オクチル
グルコシド（同仁化学社製）、１０ｍＭジチオスレイト
ール（和光純薬社製）、８Ｍグアニジン塩酸塩（和光純
薬社製）となるようにそれぞれ添加して、これを小粒子
化用液とした。分子シャペロン溶液：塩化マグネシウム
５０ｍＭ、ＡＴＰ２ｍＭ及び塩化カリウム３００ｍＭと
なるように添加した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）に、参考例１で調製したメタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来の分子シャペロンを０．
５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを分子シャペロ
ン溶液とした。

【００７６】（２）小粒子化方法 ＨＢｓ抗原溶液２．５ｍＬ及び小粒子化用液７．５ｍＬ
を混合し、３０℃にて１時間インキュベーションした。
この液全量を分子シャペロン溶液９０ｍＬに添加、混合
し、２５℃で２時間インキュベーションを行った。イン
キュベート終了後に、セントリプレップ１０を用いて遠
心濃縮を行い、全量を１０ｍＬまで濃縮し、更に、透析
処理により小粒子化剤等を除去した。抗原含有液の少量
をとり、その抗原性をＨＢｓ抗原測定キットを用いて測
定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原
活性を保持していることを確認した。

【００７７】（３）分子量の測定 実施例１と同様に行った。その結果、分子量分布２０〜
４０万付近にピークが認められた。

【００７８】参考例２ 分子シャペロン固定化担体の調
製 参考例１で用いた配列表の配列番号２のリバースプライ
マーの代わりに配列表の配列番号３のプライマーを用
い、分子シャペロンペプチド鎖のＣ末端側にヒスチジン
６残基を導入した。参考例１と同様の方法で調製したＨ
ｉｓ（６）−分子シャペロンモノマー１．０ｍｇを、Ｎ
ｉ²⁺をキレート担持させたＨｉ−ＴｒａｐＣｈｅｌａｔ
ｉｎｇゲル１ｇ（ファルマシア社製）の２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて吸着固定させた。
一方、参考例１で得られた分子シャペロン１６量体溶液
に、ＥＤＴＡを１０ｍＭとなるように添加し３時間反応
させることにより得た分子シャペロンモノマー（タンパ
ク質量として２０ｍｇ）を、上記で得られたＨｉｓ
（６）−分子シャペロンモノマーが吸着されたＨｉ−Ｔ
ｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇゲル１ｇに添加し、更に、
塩化マグネシウム、ＡＴＰ及び硫酸アンモニウムをそれ
ぞれ５０ｍＭ、２ｍＭ及び３００ｍＭとなるように添加
して、３０℃にて５時間インキュベーションした。得ら
れた分子シャペロンオリゴマー結合担体を以下の実施例
に用いた。

【００７９】実施例３ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製 （１）試薬及び材料 実施例１の小粒子化用液及び分子シャペロン溶液の代わ
りに下記のものを使用したこと以外は、実施例１と同様
のものを使用した。小粒子化用液：５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌに、
８Ｍ尿素（和光純薬社製）、１０ｍＭジチオエリスリト
ール（和光純薬社製）、１．６％ＭＥＧＡ９（同仁化学
社製）となるようにそれぞれ添加して、これを小粒子化
用液とした。分子シャペロン溶液：参考例２で調製した
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来の分子シ
ャペロンオリゴマー結合担体を用いた。塩化マグネシウ
ム５０ｍＭ、ＡＴＰ２ｍＭ及び塩化カリウム３００ｍＭ
となるように添加した１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．５）４５ｍＬに、分子シャペロン結合担体
ゲル５ｍＬを加え懸濁したスラリーを調製した。

【００８０】（２）小粒子化方法 ＨＢｓ抗原溶液２．５ｍＬと小粒子化用液７．５ｍＬを
混合し、３０℃にて１時間インキュベーションした。こ
の液を、分子シャペロン結合担体ゲル５ｍＬを４５ｍＬ
の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に
懸濁させたスラリーに添加、混合し２５℃にて４時間イ
ンキュベーションを行った。反応終了後、同液を１００
００ｒｐｍ、２０分間遠心分離操作を行い、上清液を回
収し、透析を行って小粒子化剤等を除去した。抗原含有
液の抗原性をＨＢｓ抗原測定キットを用いて測定した結
果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原活性を保
持していることを確認した。

【００８１】（３）分子量の測定 実施例１と同様にして行った結果、約５０〜８０万のと
ころにメインピークが出現した。

【００８２】実施例４ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製 （１）試薬及び材料 分子シャペロン溶液として下記のものを使用したこと以
外は、実施例２と同様のものを使用した。分子シャペロ
ン溶液：参考例１と同様にして調製したメタノコッカス
・ボルタエ由来の分子シャペロンを用いた。同分子シャ
ペロンを、塩化マグネシウム７５ｍＭ、ＡＴＰ３ｍＭ及
び塩化カリウム４５０ｍＭとなるように添加した５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に、０．２ｍ
ｇ／ｍＬとなるように希釈したものを分子シャペロン溶
液とした。

【００８３】（２）小粒子化方法 実施例２と同様にして小粒子化を行った。小粒子化処理
後、抗原含有液の少量をとり、その抗原性をＨＢｓ抗原
測定キットを用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗
原液とほぼ同等の抗原活性を保持していることを確認し
た。

【００８４】（３）分子量の測定 実施例１と同様に行った。その結果、分子量分布３０〜
５０万付近にピークが認められた。

【００８５】実施例５ ＨＢｓ抗原標識酵素を用いたＨ
Ｂｓ抗体試薬測定 （１）ＨＢｓ抗原標識酵素の調製 実施例１で得た小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた。１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液＋０．１ＭＮａＣｌ液を用い
て、小粒子化ＨＢｓ抗原が５００μｇ／ｍＬとなるよう
に希釈し、精製水で溶解したＮ−４−マレイミドブチリ
ロキシスルホサクシニミド ナトリウム塩３．８ｍｇ／
ｍＬを５μＬ加え、２０℃で６０分間インキュベーショ
ンした。反応後にセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア社製）を担体（カラムサイズ：１６×３００ｍｍ）と
したゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、マレイ
ミド化した小粒子化ＨＢｓ抗原を得た。

【００８６】このマレイミド化した小粒子化ＨＢｓ抗原
液（２００μｇ）に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭＥＤＴＡ）に溶解
したβ−ガラクトシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社
製：ＥＩＡグレード）５００μｇを混合し、３０℃で３
０分間インキュベーションした。反応後に、６０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭＥＤＴ
Ａ、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．１％ＢＳＡ、０．１％ナト
リウムアジド）０．１ｍＬを加えた。反応後に、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、０．１ＭＮａＣ
ｌ）で平衡に達したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラ
ム（カラムサイズ：１２×１５０ｍｍ）にアプライし、
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、Ｎ
ａＣｌを０．１〜０．５Ｍとしたグラジエントをかけ、
溶出するβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を
調製した。

【００８７】（２）ＨＢｓ抗原の固定化 実施例１で得た精製ＨＢｓ抗原を、０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製し、ヌン
ク−イムノモジュールマキシソープＦ１６ブラック（ヌ
ンク社製）に１００μＬ／ウエルにて分注し、室温で２
時間静置した。このプレートを生理食塩水で洗浄し、
０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１５ＭＮ
ａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）を３００μＬ／ウエルにて分注し、室温で１時間ブ
ロックした。再び生理食塩水で洗浄し、１％β−シクロ
デキストリン、０．５％ＢＳＡ、０．１５ＭＮａＣｌ、
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３
００μＬ／ウエルにて分注し、室温で３０分間コーティ
ングした。次いで、コーティング液を除去し、室温で真
空乾燥させた。

【００８８】（３）ＨＢｓ抗体の測定 上記（２）項で調製したＨＢｓ抗原プレートのウェル
に、（１）で得たβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗原
液を５Ｕ／ｍＬに調製したコンジュゲート液５００μＬ
を加え、３７℃で５分間プレ加温した。検体５０μＬを
加え、３７℃で８分間振盪しながらインキュベーション
した。次いで、生理食塩水で５回洗浄し、よく水分を除
去した後、蛍光基質を用いた酵素活性測定を行った。即
ち、予め３７℃に加温しておいた基質溶液（４５０μＭ
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガククトシド、
７５ｍＭＮａＣｌ、０．０４％ＭｇＣ１₂ 、０．０５％
ＢＳＡ、３％エチレングリコール）１００μＬを各ウエ
ルに添加し、３０℃で９０分間インキュベートした。
０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．３）１
５０μＬを加えて酵素反応を停止し、励起波長３６０ｎ
ｍ、測定波長４５０ｎｍで蛍光強度を測定した。

【００８９】（４）標準ＨＢｓ抗体液 ＨＢｓ抗体を０、１２．５、２５、５０、１００ｍＩＵ
／ｍＬ濃度で含むヒト血清を標準品として使用した。上
記（３）項の測定法に従って、測定値を求め、検量線を
作成した。得られた結果を表１及び図１に示す。

【００９０】実施例６ ＨＢｓ抗原標識酵素を用いたＨ
Ｂｓ抗体試薬測定 （１）ＨＢｓ抗原標識酵素の調製 実施例２で得た小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた。１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液＋０．１ＭＮａＣｌ液を用い
て、抗原５００μｇ／ｍＬに希釈し、ＤＭＳＯで溶解し
たＮ−スクシニミジルＤ−ビオチン３．４ｍｇ／ｍＬを
５μＬ加え、３０℃で２０分間インキュベーションし
た。反応後に、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマ
シア社製）を担体（カラムサイズ：１６×３００ｍｍ）
としたゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、ビオ
チン化した小粒子化ＨＢｓ抗原を得た。このビオチン化
小粒子化ＨＢｓ抗原液（２５０μｇ）にβ−ガラクトシ
ダーゼ標識ストレプトアビジン（ベーリンガマンハイム
社製：５００Ｕ）を混合し、３７℃で１時間インキュベ
ーションした。反応後に凝集体形成を防ぐことを目的と
して、未反応のビオチン結合部位をブロックするためｄ
−ビオチン２ｍｇを加えて、更に３０分間インキュベー
ションした。反応後に、セントリプレップ−１０（アミ
コン社製）で濃縮し１．５ｍＬとして、セファクリルＳ
−４００ＨＲ（ファルマシア社製）を担体（カラムサイ
ズ：１６×３００ｍｍ）としたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーを行い、β−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗
原複合体を調製した。

【００９１】ＨＢｓ抗原の固定化、ＨＢｓ抗体の測定、
及び、標準ＨＢｓ抗体液の調製と測定は、実施例５と同
様に行った。得られた結果を表１及び図１に示す。

【００９２】比較例１ β−ガラクトシダーゼ標識する抗原として、実施例１で
調製した小粒子化ＨＢｓ抗原の代わりに小粒子化処理し
ていない精製ＨＢｓ抗原を用いたこと以外は、実施例５
と同様に行った。得られた結果を表１及び図１に示す。

【００９３】比較例２ β−ガラクトシダーゼ標識する抗原を、実施例１におい
て分子シャペロン溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液
を添加して調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を用いたこと以
外は、実施例５と同様に行った。得られた結果を表１及
び図１に示す。

【００９４】

【表１】

【００９５】実施例７ ＨＢｓ抗体測定用ラテックス試
薬の調製（１） （１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス試薬の調製 実施例３で得られた小粒子化ＨＢｓ抗原を５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて２．０ｍｇ
／ｍＬに希釈し、７．５ｍＬに平均粒径０．３μｍのポ
リスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水
化学工業社製）１ｍＬと３６ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液＋０．１ＭＮａＣｌ）を添加し、３０℃にて６０分間
攪拌した。次いで、この液にウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を１重量％含有するリン酸−食塩緩衝液（０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ＭＮａＣｌ、以
下ＰＢＳともいう）を添加し、３０℃にて６０分間攪拌
した後、４℃にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分
離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。得
られた沈殿物にＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳを１０
ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機に
て分散処理を行い、固形分０．１％（Ｗ／Ｖ）のＨＢｓ
抗原感作ラテックス液を調製した。

【００９６】（２）検体希釈液の調製 平均分子量５００，０００のポリエチレングリコール
（以下、ＰＥＧともいう：和光純薬社製）を、ＢＳＡを
１重量％含有するＰＢＳに、０．９重量％の濃度となる
ように溶解した。

【００９７】（３）ＨＢｓ抗体測定試薬 本実施例のＨＢｓ抗体測定試薬は、上記（１）項のＨＢ
ｓ抗原感作ラテックスからなる第１試薬と、上記（２）
項のＰＥＧ溶液からなる第２試薬とから構成される２液
系の試薬である。

【００９８】（４）標準ＨＢｓ抗体液 ＨＢｓ抗体を０、３００、６００、１２００、１８００
ｍＩＵ／ｍＬ濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。

【００９９】（５）測定方法 検体２０μＬと上記（２）項の検体希釈液１２０μＬを
混合し、３７℃で適時保持した後、上記（１）項のＨＢ
ｓ抗原感作ラテックス液１２０μＬを添加攪拌した。こ
の後、１分後及び５分後の波長７５０ｎｍでの吸光度を
測定し、この差を吸光度変化量（△Ａｂｓ）とした。測
定は日立自動分析７１５０形を使用した。標準ＨＢｓ抗
体液を測定して、検量線を作成した。得られた結果を表
２及び図２に示す。

【０１００】実施例８ ＨＢｓ抗体測定用ラテックス試
薬の調製（２） 実施例４で得られた小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた以外
は、実施例７と同様にしてＨＢｓ抗体測定用のラテック
ス試薬を調製し、検量線を作成した。得られた結果を表
２及び図２に示す。

【０１０１】比較例３ ラテックスに感作する抗原を、実施例１で調製した小粒
子化ＨＢｓ抗原の代わりに小粒子化処理していない精製
ＨＢｓ抗原を用いた以外は実施例７と同様に行った。得
られた結果を表２及び図２に示す。

【０１０２】比較例４ ラテックスに感作する抗原を、実施例１において分子シ
ャペロン溶液のかわりに５０ｍＭリン酸緩衝液を添加し
て調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた以外は実施例７
と同様に行った。得られた結果を表２及び図２に示す。

【０１０３】

【表２】

【０１０４】

【発明の効果】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法
は、上述の構成よりなるので、活性を保持した小粒子化
ＨＢｓ抗原を得ることが可能となった。また、それを用
いることにより、高感度な免疫測定法を行うことができ
る酵素標識抗原試薬やラテックス凝集試薬を得ることが
可能となった。

【０１０５】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 GGCCATGGCA GCTAACCAGC CA 22

【０１０６】 配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCTT ACATCATTCC GCCCATAC 28

【０１０７】 配列番号：３ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCTT AATGGTGATG GTGATGGTGC ATCATTCCGC CCATAC 46

【０１０８】 配列番号：４ 配列の長さ：１６８０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物種：メタノコッカス・サーモリソトロフィカス 株名：ＤＳＭ２０９５株 配列 TCTAATACAC TTATAAAAAA GGGGTGAAAT C ATG GCA GCT AAC CAG CCA GTA 52 Met Ala Ala Asn Gln Pro Val 1 5 GTA GTA TTA CCT GAA AAC GTA AAA AGA TTT ATG GGA AGA GAT GCT CAA 100 Val Val Leu Pro Glu Asn Val Lys Arg Phe Met Gly Arg Asp Ala Gln 10 15 20 AGA ATG AAC ATC TTA GCA GGA AGA ATT ATC GGT GAG ACA GTA AGA TCC 148 Arg Met Asn Ile Leu Ala Gly Arg Ile Ile Gly Glu Thr Val Arg Ser 25 30 35 ACA TTA GGT CCA AAG GGA ATG GAC AAA ATG TTA GTA GAT GAT TTA GGT 196 Thr Leu Gly Pro Lys Gly Met Asp Lys Met Leu Val Asp Asp Leu Gly 40 45 50 55 GAC ATT GTT GTT ACA AAT GAC GGT GTT ACA ATC TTA AAA GAA ATG AGT 244 Asp Ile Val Val Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Leu Lys Glu Met Ser 60 65 70 GTA GAA CAC CCA GCA GCT AAA ATG TTA ATT GAA GTT GCA AAA ACA CAA 292 Val Glu His Pro Ala Ala Lys Met Leu Ile Glu Val Ala Lys Thr Gln 75 80 85 GAA AAA GAA GTT GGA GAC GGT ACA ACA ACA GCT GTT GTT ATC GCT GGT 340 Glu Lys Glu Val Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Val Val Ile Ala Gly 90 95 100 GAA TTA TTA AGA AAA GCT GAG GAA TTG TTA GAC CAA AAC GTA CAC CCA 388 Glu Leu Leu Arg Lys Ala Glu Glu Leu Leu Asp Gln Lys Val His Pro 105 110 115 ACA ATT GTT ATT AAA GGT TAC CAG TTA GCA GTT CAA AAA GCA CAA GAA 436 Thr Ile Val Ile Lys Gly Thr Gln Leu Ala Val Gln Lys Ala Gln Glu 120 125 130 135 GTA TTA AAA GAA ATA GCA ATG GAT GTA AAA GCA GAC GAT AAA GAA ATA 484 Val Leu Lys Glu Ile Ala Met Asp Val Lys Ala Asp Asp Lys Glu Ile 140 145 150 TTA CAC AAA ATA GCA ATG ACC TCA ATT ACT GGA AAA GGT GCA GAA AAA 532 Leu His Lys Ile Ala Met Thr Ser Ile Thr Gly Lys Gly Ala Glu Lys 155 160 165 GCT AAA GAA AAA TTG GGA GAA ATG ATC GTT GAA GCT GTT ACT GCA GTT 580 Ala Lys Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile Val Glu Ala Val Thr Ala Val 170 175 180 GTA GAC GAA AGT GGA AAA GTT GAC AAA GAT TTA ATA AAA ATC GAG AAG 628 Val Asp Glu Ser Gly Lys Val Asp Lys Asp Leu Ile Lys Ile Glu Lys 185 190 195 AAA GAA GGA GCT TCA GTT GAC GAA ACC GAA TTA ATC AAT GGT GTA TTA 676 Lys Glu Gly Ala Ser Val Asp Glu Thr Glu Leu Ile Asn Gly Val Leu 200 205 210 215 ATA GAC AAA GAA AGA GTA AGC CCA CAA ATG CCT AAG AAG ATA GAA AAC 724 Ile Asp Lys Glu Arg Val Ser Pro Gln Met Pro Lys Lys Ile Glu Asn 220 225 230 GCA AAG ATC GCA TTA TTG AAC TGC CCA ATC GAA GTT AAA GAA ACA GAA 772 Ala Lys Ile Ala Leu Leu Asn Cys Pro Ile Glu Val Lys Glu Tha Glu 235 240 245 ACA GAT GCA GAA ATT AGA ATC ACA GAT CCT ACA AAA TTA ATG GAA TTC 820 Thr Asp Ala Glu Ile Arg Ile Thr Asp Pro Thr Lys Leu Met Glu Phe 250 255 260 ATT GAA CAA GAA GAA AAA ATG TTA AAA GAT ATG GTA GAT ACC ATA AAA 868 Ile Glu Gln Glu Glu Lys Met Leu Lys Asp Met Val Asp Thr Ile Lys 265 270 275 GCT TCA GGA GCA AAC GTT TTA TTC TGC CAA AAA GGT ATC GAT GAC TTA 916 Ala Gln His Tyr Asn Val Leu Phe Cys Gln Lys Gly Ile Asp Asp Leu 280 285 290 295 GCA CAA CAC TAC TTA GCA AAA GAA GGA ATC CTT GCA GTA AGA AGA GTC 964 Ala Gln His Tyr Leu Ala Lys Glu Glu Ile Leu Ala Val Arg Arg Val 300 305 310 AAA AAA TCA GAC ATG GAA AAA TTA TCA AAA GCT ACT GGA GCT AAC GTA 1012 Lys Lys Ser Asp Met glu Lys Leu Ser Lys Ala Thr Gly Ala Asn Val 315 320 325 GTA ACA AAC ATC AAA GAC TTA AAA GCT GAA GAT TTA GGG GAA GCA GGA 1060 Val Thr Asn Ile Lys Asp Leu Lys Ala Glu Asp Leu Gly Glu Ala Gly 330 335 340 ATT GTA GAA GAA AGA AAA ATT GCT GGA GAC GCA ATG ATC TTC GTT GAA 1108 Ile Val Glu Glu Arg Lys Ile Ala Gly Asp Ala Met Ile Phe Val Glu 345 350 355 GAA TGC AAA CAT CCA AAA GCA GTA ACA ATG TTA ATA AGA GGT ACA ACA 1156 Glu Cys Lys His Pro Lys Ala Val Thr Met Leu Ile Arg Gly Thr Thr 360 365 370 375 GAA CAC GTA ATT GAA GAA GTA GCA AGA GCT GTA GAT GAT GCT ATT GGA 1204 Glu His Val Ile Glu Glu Val Ala Arg Ala Val Asp Asp Ala Ile Gly 380 385 390 GTT GTA GCA TGT ACC ATC GAA GAC GGT AAG ATC GTT GCA GGT GGT GGA 1252 Val Val Ala Cys Thr Ile Glu Asp Gly Lys Ile Val Ala Gly Gly Gly 395 400 405 GCT GCA GAG ATA GAA TTA GCA ATG AAA TTA AGA GAC TAC GCT GAA GGA 1300 Ala Ala Glu Ile Glu Leu Ala Met Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Glu Gly 410 415 420 GTA AGT GGA AGA GAA CAA TTG GCA GTT AGA GCA TTT GCA GAT GCT TTA 1348 Val Ser Gly Arg Glu Gln Leu Ala Val Arg Ala Phe Ala Asp Ala Leu 425 430 435 GAA GTA GTT CCA AGA ACA TTA GCA GAA AAC GCA GGT TTA GAT GCA ATT 1396 Glu Val Val Pro Arg Thr Leu Ala Glu Asn Ala Gly Leu Asp Ala Ile 440 445 450 455 GAA ATG CTC GTT AAA TTA AGA GCT AAA CAT GCA GAA GGA AAT AAC GCA 1444 Glu Met Leu Val Lys Leu Arg Ala Lys His Ala Glu Gly Asn Asn Ala 460 465 470 TAC TAT GGG TTA AAC GTC TTC ACA GGC GAT GTT GAA AAC ATG ACT GAA 1492 Tyr Tyr Gly Leu Asn Val Phe Thr Gly Asp Val Glu Asn Met Thr Glu 475 480 485 AAC GGA GTA GTT GAA CCA TTA AGA GTT AAA ACT CAA GCT ATA CAA TCA 1540 Asn Gly Val Val Glu Pro Leu Arg Val Lys Thr Gln Ala Ile Gln Ser 490 495 500 GCT ACA GAA GCT ACA GAA ATG TTA TTA AGA ATA GAC GAT GTA ATC GCT 1588 Ala Thr Glu Ala Thr Glu Met Leu Leu Arg Ile Asp Asp Val Ile Ala 505 510 515 GCA GAA AAA TTA AGC GGC GGA TCT GGC GGA GAC ATG GGA GAC ATG GGC 1636 Ala Glu Lys Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Met Gly Asp Met Gly 520 525 530 535 GGA ATG GGA GGT ATG GGC GGA ATG ATG TAATTCCCCC TACGTCC 1680 Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met 540

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例５及び６並びに比較例１及び２における
抗ＨＢｓ抗体の抗体量と蛍光強度との関係を示すグラフ
である。縦軸は蛍光強度、横軸は抗ＨＢｓ抗体の抗体量
を示す単位（ｍＩＵ／ｍＬ）である。

【図２】実施例７及び８並びに比較例３及び４における
抗ＨＢｓ抗体の抗体量と吸光度変化量との関係を示すグ
ラフである。縦軸は吸光度変化量、横軸は抗ＨＢｓ抗体
の抗体量を示す単位（ｍＩＵ／ｍＬ）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古谷 昌弘 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 高橋 英之 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
   剤からなる群より選択される少なくとも１種によって、
   ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並びに、前記小粒
   子化処理されたＨＢｓ抗原に、分子シャペロンを反応さ
   せる工程からなる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法であっ
   て、前記小粒子化処理する工程と前記反応させる工程と
   は、同時に行うことを特徴とする小粒子化ＨＢｓ抗原の
   調製法。
2. 【請求項２】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
   剤からなる群より選択される少なくとも１種によって、
   ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並びに、前記小粒
   子化処理されたＨＢｓ抗原に、分子シャペロンを反応さ
   せる工程からなる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法であっ
   て、前記反応させる工程は、前記小粒子化処理する工程
   を行った後に行うことを特徴とする小粒子化ＨＢｓ抗原
   の調製法。
3. 【請求項３】 分子シャペロンは、不溶性担体に結合さ
   れたものである請求項１又は２記載の小粒子化ＨＢｓ抗
   原の調製法。
4. 【請求項４】 分子シャペロンは、古細菌から調製した
   もの、又は、古細菌から調製したＤＮＡから発現された
   ものである請求項１、２又は３記載の小粒子化ＨＢｓ抗
   原の調製法。
5. 【請求項５】 古細菌は、メタノコッカス属に属する菌
   である請求項４記載の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法。
6. 【請求項６】 メタノコッカス属に属する菌は、メタノ
   コッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
   ｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
   ｓ）又はメタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
   ｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）である請求項５記載の小粒
   子化ＨＢｓ抗原の調製法。
7. 【請求項７】 請求項１、２、３、４、５又は６記載の
   小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法により得られた小粒子化Ｈ
   Ｂｓ抗原を、酵素標識することを特徴とする免疫測定試
   薬の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項１、２、３、４、５又は６記載の
   小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法により得られた小粒子化Ｈ
   Ｂｓ抗原を、不溶性担体に担持させることを特徴とする
   免疫測定試薬の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項７又は８記載の免疫測定試薬の製
   造方法により製造されてなることを特徴とする免疫測定
   試薬。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の免疫測定試薬を用いる
    ことを特徴とする免疫測定方法。