JP2000105234A - 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法並びにこれを用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を得
ることができる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法を提供す
る。 【解決手段】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも１種によって、
ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並びに、上記小粒
子化処理されたＨＢｓ抗原に、ペプチジルプロリルシス
−トランスイソメラーゼを反応させる工程からなる小粒
子化ＨＢｓ抗原の調製法であって、上記小粒子化処理す
る工程と上記反応させる工程とは、同時に行う小粒子化
ＨＢｓ抗原の調製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＢｓ抗原を小粒
子化させる際に伴う構造変化を抑えることによって、抗
原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を得ることができ
る小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法、並びに、上記小粒子化
ＨＢｓ抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定
試薬及び免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染時の患
者血清中には、直径４２ｎｍのＤａｎｅ粒子と呼ばれる
二本鎖ＤＮＡウイルスの他に、直径２２ｎｍの小型球状
粒子や同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍの管状粒子が存
在することが知られている。これらＨＢＶには、ＨＢＶ
の外被（ｓｕｒｆａｃｅ）、芯（ｃｏｒｅ）に対応する
表面抗原（ＨＢｓ抗原）、核抗原（ＨＢｃ抗原）等が存
在する。

【０００３】このような各抗原に対する抗体の検出は、
臨床診断上重要である。特に、ＨＢｓ抗体は、ＨＢＶに
対する感染防御抗体であるので、過去にＨＢＶの感染が
あり既に排除されている場合やＨＢＶワクチン接種後で
ある場合に血中に検出される。従って、ＨＢｓ抗体が陽
性であることは、ＨＢＶに対して抵抗性があり、再感染
のおそれがないことを示すものである。

【０００４】血中のＨＢｓ抗体の定量的測定法として
は、通常、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が用いら
れ、例えば、酵素標識したＨＢｓ抗原を使用する酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）、ＨＢｓ抗原を血球やラテックス等
の不溶性担体に担持させた血球凝集法やラテックス凝集
法等が挙げられる。

【０００５】ＥＩＡをワンステップサンドイッチ法で行
う場合、例えば、精製したＨＢｓ抗原をビーズやマイク
ロタイタープレートのウェル内壁等の不溶性担体に予め
固定化しておき、これにＨＢｓ抗体を含有する検体及び
酵素標識したＨＢｓ抗原を含有する溶液を加えて免疫反
応させて固定化ＨＢｓ抗原−ＨＢｓ抗体−酵素標識ＨＢ
ｓ抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素発
色基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出する
ことにより、検体中のＨＢｓ抗体を定量することができ
る。

【０００６】ＥＩＡに使用する酵素標識抗原を調製する
際には、通常、二価性架橋剤を用いるが、抗原と酵素が
ともに分子量の大きい場合には、それらを反応させるに
際して、両者の濃度を上げる必要がある。しかし、ＨＢ
ｓ抗原は、分子量３００万〜４００万という巨大分子で
あり、酵素との結合が可能な濃度に抗原を溶解させるた
めには界面活性剤を多量に使用する必要がある。しか
し、このような条件下では多くの酵素が失活してしまう
ため、酵素標識が困難であった。

【０００７】また、血球凝集法やラテックス凝集法は、
精製したＨＢｓ抗原をラテックスや血球等に担持させ、
これをＨＢｓ抗体含有検体と混合して抗原抗体反応させ
て、ラテックスや血球が抗体により架橋・凝集され、こ
の凝集を検出することにより検体中のＨＢｓ抗体を定量
することができる。

【０００８】ラテックスや血球に担持させる抗原量は、
多ければ多いほど反応性が増加し、試薬の感度が向上す
る。しかしながら、ＨＢｓ抗原は、上述のように巨大分
子であるために、担体（ラテックスや血球）の表面積当
たりの担持量が少なくなり、充分な試薬感度を得ること
が困難であった。

【０００９】特開平６−１３８１２３号公報には、ＨＢ
ｓ抗原を還元剤を用いてＨＢｓ抗原のジスルフィド結合
を開裂し、分子量が５０万〜１００万の小粒子化したＨ
Ｂｓ抗原を調製し、これを用いて酵素標識体を調製する
方法が開示されている。しかしながら、このような方法
で得られたＨＢｓ抗原は、抗原活性の低下が認められて
おり、酵素標識抗原の調製やラテックスや血球等への担
持に用いるのには適したものではなかった。従って、抗
原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原の調製方法が望ま
れていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、抗原活性を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を得るこ
とができる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法、並びに、上記
小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法により得られた小粒子化Ｈ
Ｂｓ抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試
薬及び免疫測定方法を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、界面活性剤、
還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される
少なくとも１種によって、ＨＢｓ抗原を小粒子化処理す
る工程、並びに、上記小粒子化処理されたＨＢｓ抗原
に、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼを
反応させる工程からなる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法で
あって、上記小粒子化処理する工程と上記反応させる工
程とは、同時に行う小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法であ
る。

【００１２】上記ＨＢｓ抗原は、タンパク質、糖質及び
脂質から構成され、構成するタンパク質が多くのジスル
フィド結合（−ＳＳ−結合）を有していることが知られ
ている。上記ＨＢｓ抗原を小粒子化処理するためには、
（１）還元剤を用いてジスルフィド結合を開裂させる、
（２）界面活性剤を用いて脂質を除去する、及び／又
は、（３）タンパク質変性剤を用いて高次構造をほぐす
ことが有効であるが、いずれの小粒子化処理方法におい
ても、タンパク質の構造変化が生じ、ＨＢｓ抗原の抗原
活性が損なわれるが、本発明は、上記小粒子化処理した
ＨＢｓ抗原にペプチジルプロリルシス−トランスイソメ
ラーゼ（以下、「ＰＰＩアーゼ」ともいう。）を反応さ
せることにより、小粒子化処理したＨＢｓ抗原の抗体結
合部位の構造変化を抑制させて、抗原活性を保持した小
粒子化ＨＢｓ抗原を調製するものである。

【００１３】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法は、
界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群よ
り選択される少なくとも１種によって、ＨＢｓ抗原を小
粒子化処理する工程を含む。本明細書中において、小粒
子化ＨＢｓ抗原とは、ＨＢｓ抗原を、界面活性剤、還元
剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される少な
くとも１種で処理することによって得られる、低分子量
化したＨＢｓ抗原を意味する。

【００１４】上記界面活性剤は、脂質を除去可能なもの
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−
［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、オクチルグルコ
シド（ＯＧ）、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊｉ）、ポリオキシエ
チレンｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル（Ｓｐａｎ）、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等が挙げられる。上記界面活
性剤の使用濃度は、処理するＨＢｓ抗原濃度によって異
なるが、０．０１〜１０００ｍＭの範囲であることが好
ましい。

【００１５】上記還元剤は、タンパク質のジスルフィド
結合を解離させるものであれば特に限定されず、例え
ば、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチル
アミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスルトール、
水素化ホウ素ナトリウム、モノチオリン酸等が挙げられ
る。上記還元剤の使用濃度としては、処理するＨＢｓ抗
原の濃度によって異なるが、通常は溶液中の濃度が０．
０１〜２０％となるように用いることができる。

【００１６】上記タンパク質変性剤は、タンパク質の高
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。上記タン
パク質変成剤の使用濃度は、処理するＨＢｓ抗原濃度に
よって異なるが、０．１〜８Ｍの範囲が好ましい。上記
還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤は、それぞれ
単独で用いてもよく、又は、混合して用いてもよい。

【００１７】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法は、
上記小粒子化処理されたＨＢｓ抗原に、ＰＰＩアーゼを
反応させる工程を含む。本発明は、上記小粒子化処理さ
れたＨＢｓ抗原にＰＰＩアーゼを反応させる工程を含む
ことによって、ＰＰＩアーゼのタンパク質折り畳み作用
により、小粒子化処理したＨＢｓ抗原の抗体結合部位の
構造変化を抑制させて、抗原活性を保持した小粒子化Ｈ
Ｂｓ抗原を調製するものである。

【００１８】本発明で用いるＰＰＩアーゼとは、プロリ
ン残基のＮ末端側ペプチド結合の回転を促進する作用を
有する酵素である。タンパク質中の構成アミノ酸である
プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合は、自由に回転で
きず、自発的なシス−トランス異性化が起こりにくい。
その結果、構造変化が生じた際にタンパク質鎖の正常構
造への変換は、そのようなプロリンのシス−トランス異
性化反応等が律速となり、自発的な再生が阻害される。
この異性化反応を促進させるＰＰＩアーゼは、タンパク
質の高次構造の再生を促進し、変性タンパク質を再生さ
せることができる酵素である。

【００１９】上記ＰＰＩアーゼを、ＨＢｓ小粒子化用の
各種処理剤を含んだ溶液に存在させることにより、小粒
子化処理によりダメージを受けたＨＢｓ抗原の立体構造
を安定化させたり、構造変化をすばやく修復することに
より、抗原活性の低下を防ぐことができる。

【００２０】本発明で用いられるＰＰＩアーゼとして
は、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ：免疫抑
制剤であるサイクロスポリンＡへの結合タンパク質）タ
イプ及びＦＫＢＰ（免疫抑制剤であるＦＫ５０６への結
合タンパク質）タイプのうち、少なくとも１種以上のＰ
ＰＩアーゼを用いることができる。

【００２１】上記ＰＰＩアーゼは、真核生物、真正細菌
若しくは古細菌から調製したもの、又は、真核生物、真
正細菌若しくは古細菌から調製したＤＮＡから発現され
たものを用いることができる。

【００２２】上記真核生物由来のＰＰＩアーゼとしては
特に限定されず、例えば、ブタ由来の１９ＫＰＰＩアー
ゼ、ショウジョウバエ由来のｎｉｎａＡ産物、トマトや
トウモロコシ等の高等植物由来のシクロフィリン（Ｃｙ
ｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、アカパンカビ由来のシクロフィ
リン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、Ｎｃ−ＦＫＢＰ、酵
母由来のシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、
ＣＲＧタンパク質、Ｓｃ−ＦＫＢＰ等が挙げられる。ま
た、例えば、シグマ社から市販されているシクロフィリ
ン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）タイプのＰＰＩアーゼ
（子牛胸腺由来）やＦＫＢＰタイプのＰＰＩアーゼ（ヒ
ト由来）等が手軽に入手できる。

【００２３】上記真正細菌由来のＰＰＩアーゼとしては
特に限定されず、例えば、大腸菌由来のＰＰＩアーゼ−
α、ＰＰＩアーゼ−β等が挙げられる（タンパク質核酸
酵素Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．１１（１９９１））。

【００２４】上記古細菌としては、例えば、スルホロバ
ス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルホロコッカス
（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロディクテ
ィム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、サーモフィラス
（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプロテウス（Ｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、ピロバキュラム（Ｐｙ
ｒｏｂａｃｕｌｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属、メサノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、メサノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙ
ｒｕｓ）属、メサノサーマス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒ
ｍｕｓ）属、アーキアブロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏ
ｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、メサノプラナス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎ
ｕｓ）属、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒ
ｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシア（Ｍｅｔｈａｎｏｓａ
ｒｃｉｎａ）属由来のものが使用できる。上記古細菌の
中でも、特に、メタノコッカス属古細菌から調製したも
の、又は、メタノコッカス属古細菌から調製したＤＮＡ
から発現されたものが好ましい。

【００２５】上記メタノコッカス属菌とは、海洋性古細
菌のメタン生成菌に属し、水素、二酸化炭素及びギ酸か
らメタンを生成することを特徴とする球状菌群である。
上記メタノコッカス属菌は、その至適生育温度から中温
菌と高温菌に分類され、高温菌にはメタノコッカス・ヤ
ンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓ
ｃｈｉｉ：最適温度８５℃）、メタノコッカス・サーモ
リソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ：ＡＴＣＣ３５
０９７、最適温度６５℃）の２種がある。最適温度が２
０〜４０℃である中温菌には、メタノコッカス・ボルタ
エ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓｖｏｌｔａｅ：ＡＴＣ
Ｃ３３２７３）、メタノコッカス・デルタエ（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｄｅｌｔａｅ：ＡＴＣＣ３５２９
４）、メタノコッカス・フリシュス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｕｕｓ ｆｒｉｓｉｕｓ：ＡＴＣＣ４３３４０）、
メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ
ｃｕｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ：ＡＴＣＣ４３００
０）、メタノコッカス・バンニエリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｕｕｓ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ：ＡＴＣＣ３５０８
９）等が挙げられる。

【００２６】上記メタノコッカス属菌は、大腸菌のよう
に７〜８種類のＰＰＩアーゼを有しそれぞれが複雑に作
用しあうといったものでなく、ＰＰＩアーゼを１又は２
種類しか有さないため、タンパク質に対する汎用性は高
い。本発明で用いられるＰＰＩアーゼは、上記メタノコ
ッカス属細菌から直接精製して得ることもできるが、こ
れらの生物のＰＰＩアーゼをコードするＤＮＡ塩基配列
をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育の速い生物に
組み込んで調製することが、大量に生産できるので好ま
しい。

【００２７】上記ＰＰＩアーゼを直接精製して得る方法
としては特に限定されず、例えば、以下の方法によって
得ることができる。上記細菌を、例えば、海水ベース培
地（酵母エキス２ｇ、バクトトリプトン２ｇ、酢酸ナト
リウム１ｇ、ＰＩＰＥＳ１．７ｇ、ＤＡＢビタミン溶液
１０ｍＬ／Ｌ海水ｐＨ６．８）中で培養し、嫌気条件及
び水素／炭酸ガス（４：１）の混合ガスの通気下で３７
℃で一昼夜培養し菌体を回収する。回収した菌体を２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁することにより
細胞を浸透圧ショックにより破砕し、上清を遠心分離に
より回収した後、疎水クロマトグラフィー（Ｂｕｔｙｌ
ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム：ファルマシア社製等）、ゲ
ル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ
１２ＨＲカラム：ファルマシア社製等）、陰イオン交換
カラムクロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ：ファルマシア
社製）によりＰＰＩアーゼ活性画分を回収することがで
きる。

【００２８】上記得られた画分は、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって、単一画分であることを確
認することができる。上記精製において、ＰＰＩアーゼ
活性は、α−キモトリプシン反応とのカップリングアッ
セイ法により確認することができる。例えば、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．８）中、配列表の配列番号１のペプ
チド（最終濃度１７μＭ）を基質として、サンプルをセ
ルに注入した後、２５℃でインキュベートし、キモトリ
プシン溶液を添加することにより反応を開始する。終始
攪拌下、ｐＮＡの遊離による３９０ｎｍの吸収増加をモ
ニターすることにより酵素活性を測定することができ
る。上記配列表の配列番号１のペプチドは、商品名「Ｎ
−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉ
ｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ」（シグマ社製）の市販品を入手
可能である。

【００２９】上記メタノコッカス属細菌から調製したＤ
ＮＡから発現させる手法としては、「新生物化学実験の
手引き」（化学同人社）等に記載された遺伝子実験プロ
トコール等の常法を応用することができる。

【００３０】上記メタノコッカス属細菌のＰＰＩアーゼ
のＤＮＡ配列、酵素確認法等は、例えば、特開平１０−
９１号公報、特願平９−２３５９９９号に記載されてお
り、それを利用することができる。例えば、適当な制限
酵素サイトを含むようにその一部の塩基配列を合成して
ＰＣＲ用プライマーを作製する。次いで、メタノコッカ
ス属細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによって
増幅させる。ＰＣＲ産物から得られるＰＰＩアーゼ遺伝
子を適当な耐性マーカーを含むプラスミドベクターに挿
入し、得られたプラスミドで大腸菌や酵母等の生育の速
い生物を形質転換する。形質転換体を培養し、培養菌体
より疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー等の常法に従って精製し、ＰＰＩアーゼを得るこ
とができる。

【００３１】上記ゲノムＤＮＡとしては、特願平９−３
５０６２３号記載の方法に従って調製することができ
る。例えば、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス
ＤＳＭ２０９５株を使用する場合、６５℃、嫌気条
件、Ｈ₂ ／ＣＯ₂ （４：１）混合ガスの通気（２００ｍ
Ｌ／分）条件下で上記菌株を培養し、菌体１．０ｇを１
０ｍＬのＴＮＥ緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ）に
懸濁し、温度を５０℃とした後、これに０．０５ｍＬの
プロテイナーゼＫ溶液 (２０ｍｇ／ｍＬ) を添加し、４
時間振盪培養を行った。この培養液にフェノール処理、
クロロホルム処理を行った後、０．０５ｍＬのＲＮａｓ
ｅ Ａ溶液 (０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１
時間放置した。放置後の溶液に再び１ｍＬの１０％ＳＤ
Ｓ溶液、０．０５ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液 (２０ｍ
ｇ／ｍＬ）を添加し、再度５０℃で７０分放置した。更
に、これにフェノール処理、クロロホルム処理を行った
後（このときの溶液量は１０ｍＬ）、１ｍＬの３Ｍ酢酸
ナトリウム溶液 (ｐＨ５．２）、２５ｍＬのエタノール
を添加し、−２０℃で２時間放置した。放置後の溶液を
高速遠心機で遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を３ｍ
Ｌの７０％エタノール溶液で洗浄し、遠心エバポレータ
ーで乾固させた後、ＴＮＥ緩衝液０．５ｍＬに溶解し
た。この操作により約２ｍｇのゲノムＤＮＡを得ること
ができる。

【００３２】上記メタノコッカス属の中で、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）か
ら得られたＰＰＩアーゼは、熱安定性に優れており、９
０℃及び１００℃といった高温条件下で放置しても失活
しにくい。これまで市販されているＰＰＩアーゼは、６
５℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で用いる
ことはできなかった。しかしながら、上記メタノコッカ
ス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）から
得られたＰＰＩアーゼは、３７〜６５℃といった中温だ
けでなく、８０〜９０℃といった高温条件下でも使用可
能である。更に、これらの耐熱性ＰＰＩアーゼの特徴
は、その活性が長期にわたって保存されるという点であ
る。

【００３３】上記メタノコッカス・サーモリソトロフィ
カス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｍｏｌｉｔｈ
ｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来のＰＰＩアーゼは、他のＰ
ＰＩアーゼが有するペプチジルプロリンシスートランス
異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳み作用だけでな
く、シャペロニン様のタンパク質の不可逆的凝集抑制作
用も併せ持つため、ＨＢｓ抗原を安定化する効果が大き
い。

【００３４】上記メタノコッカス属の中温菌の中で、特
に、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）から得られるＰＰＩアーゼは、
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉ
ｃｕｓ）のＰＰＩアーゼと同様に、ペプチジルプロリル
シス−トランス異性化作用及びポソペプチド鎖の折り畳
み作用だけでなく、シャペロニン様のタンパク質の不可
逆的凝集抑制作用も併せ持つため、ＨＢｓ抗原を安定化
する効果が大きい。

【００３５】上記メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）は、中温菌である
ため、同菌由来のＰＰＩアーゼは４〜４０℃の広い範囲
でＨＢｓ抗原を安定化する効果がある。

【００３６】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法にお
いて、ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程と、上記小粒
子化処理されたＨＢｓ抗原にＰＰＩアーゼを反応させる
工程とは、同時に行う。上記小粒子化処理する工程と上
記反応させる工程とを同時に行う方法としては特に限定
されず、例えば、（１）ＨＢｓ抗原を希釈した溶液（以
下、「ＨＢｓ抗原希釈液」ともいう）、ＰＰＩアーゼ溶
液、並びに、還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤
からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤を溶
解した溶液（以下、「小粒子化用液」ともいう）を同時
に混合する方法、（２）ＨＢｓ抗原希釈液とＰＰＩアー
ゼ溶液の混合液に、小粒子化用液を添加する方法等が挙
げられる。上記いずれの方法によっても、抗原活性を有
した小粒子化ＨＢｓ抗原を得ることができる。

【００３７】上記ＰＰＩアーゼの使用濃度としては特に
限定されず、例えば、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの範
囲が挙げられる。上記ＨＢｓ抗原の処理濃度としては特
に限定されず、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬが通常用い
られる。上記反応温度及び時間としては特に限定され
ず、例えば、４〜８０℃、１〜４８時間の範囲等が挙げ
られる。

【００３８】上記ＨＢｓ抗原を予め希釈しておく希釈液
としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸
緩衝液等が挙げられる。上記希釈液のイオン強度として
は、ＨＢｓ抗原を希釈するのに好適なものであれば特に
限定されないが、ＮａＣｌを０．０５〜１Ｍとなるよう
にしたものが好ましい。上記希釈液のｐＨは特に限定さ
れないが、４．５〜９．０の範囲が好ましい。

【００３９】上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変
性剤からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤
を溶解させておく緩衝液、並びに、上記ＰＰＩアーゼを
溶解させる液としては特に限定されず、上記ＨＢｓ抗原
の希釈液で例示したもの等が挙げられる。

【００４０】本発明２は、界面活性剤、還元剤及びタン
パク質変性剤からなる群より選択される少なくとも１種
によって、ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並び
に、上記小粒子化処理されたＨＢｓ抗原に、ＰＰＩアー
ゼを反応させる工程からなる小粒子化ＨＢｓ抗原の調製
法であって、上記反応させる工程は、上記小粒子化処理
する工程を行った後に行う小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法
である。

【００４１】本発明２は、小粒子化処理する工程を行っ
た後に、小粒子化処理されたＨＢｓ抗原にＰＰＩアーゼ
を反応させる工程を行うことによって、ＰＰＩアーゼの
タンパク質折り畳み作用により、ＨＢｓ抗原中の変化し
た抗体結合部位の構造の再構成を行わせしめ、抗原活性
を保持した小粒子化ＨＢｓ抗原を調製するものである。

【００４２】本発明２の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法に
おいて、小粒子化処理する工程を行った後、反応させる
工程を行う方法としては特に限定されず、例えば、ＨＢ
ｓ抗原希釈液と小粒子化用液を混合、反応させた後、Ｐ
ＰＩアーゼ溶液を添加する方法等が挙げられる。上記方
法によって、抗原活性を有した小粒子化ＨＢｓ抗原を得
ることができる。

【００４３】本発明１及び本発明２において、上記ＰＰ
Ｉアーゼは、溶液状態だけではなく、不溶性担体に固定
化してバイオリアクターとして用いることができる。上
記不溶性担体としては、通常の酵素固定化用担体であれ
ば特に限定されず、例えば、セルロース、アガロース、
デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリマ
ー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、イオン交換樹
脂、ビニルポリマー、ガラスビーズ、セラミック、光架
橋性樹脂、ポリウレタン等が挙げられる。上記不溶性担
体としては、また、セルロースやアガロースを臭化シア
ンで活性化した担体や、ビニルポリマーに官能基を導入
した担体が、タンパク質の結合用担体として市販されて
おり、それらを用いることもできる。

【００４４】上記ＰＰＩアーゼと不溶性担体との結合法
は、タンパク質の固定等に用いられているものであれば
特に限定されず、例えば、共有結合法、物理的吸着法、
イオン結合法、架橋法、包括格子型法、マイクロカプセ
ル格子型法等が挙げられる。上記ＰＰＩアーゼの不溶性
担体への吸着量は特に限定されないが、担体１ｃｍ³ 当
たりタンパク量として０．１〜１０００ｍｇが望まし
い。

【００４５】上記ＰＰＩアーゼ結合担体を用いたＨＢｓ
小粒子化抗原への作用方法としては特に限定されず、例
えば、（１）ＰＰＩアーゼ結合担体、ＨＢｓ抗原希釈液
及び小粒子化処理用液を混合、反応させた後に、遠心分
離操作等によりＰＰＩアーゼ結合担体を沈殿させて、上
清に含まれる小粒子化ＨＢｓ抗原を回収する方法、又
は、ＰＰＩアーゼ結合担体と小粒子化操作終了後のＨＢ
ｓ抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を混合、反応さ
せた後に、上記と同様にして小粒子化ＨＢｓ抗原を回収
する方法、（２）ＰＰＩアーゼ結合担体をカラムに充填
し、これにＨＢｓ抗原希釈液及び小粒子化処理用液を展
開、反応させた後に溶出される小粒子化ＨＢｓ抗原を回
収する方法、又は、ＰＰＩアーゼ結合担体をカラムに充
填し、これに小粒子化操作終了後のＨＢｓ抗原希釈液−
小粒子化処理用液混合液を展開・反応させた後に溶出さ
れる小粒子化ＨＢｓ抗原を回収する方法、（３）ＰＰＩ
アーゼ結合膜とＨＢｓ抗原希釈液及び小粒子化処理用液
を混合、反応させて小粒子化ＨＢｓ抗原を回収する方
法、又は、ＰＰＩアーゼ結合膜と小粒子化処理操作終了
後のＨＢｓ抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を混
合、反応させて小粒子化ＨＢｓ抗原を回収する方法等が
挙げられる。上記ＰＰＩアーゼ固定化担体は繰り返し使
用が可能である。

【００４６】本発明１及び本発明２の小粒子化ＨＢｓ抗
原の調製法により得られた小粒子化ＨＢｓ抗原は、酵素
標識することによって、免疫測定試薬を製造することが
できる。上記酵素標識の方法としては、二架性架橋剤を
用いた直接架橋法、及び、ビオチン−アビジン架橋法を
用いた標識アビジン−ビオチン法が挙げられる。

【００４７】上記直接架橋法としては、二架性架橋剤を
精製水又はジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）に溶解
し、小粒子化ＨＢｓ抗原を緩衝液を用いて適当量希釈し
た液に、モル比で５〜１００倍程度になるように添加
し、一定温度で１〜２４時間程度インキュベーションす
る。この反応液を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
を行い、未反応の二架性架橋剤を除去して、官能基を導
入した標識ＨＢｓ抗原を得ることができる。次いで、上
記官能基を導入した標識ＨＢｓ抗原に、酵素を適当量溶
解した液を添加して反応を行い、酵素標識ＨＢｓ抗原液
を調製することができる。反応終了後に、ゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーを行い、未反応酵素や未反応ＨＢ
ｓ抗原を除去して、酵素標識ＨＢｓ抗原を回収すること
ができる。

【００４８】上記二架性架橋剤としては、ホモ架橋剤及
びヘテロ架橋剤が挙げられる。上記ホモ架橋剤として
は、例えば、エチレングリコール−ｏ，ｏ−ビススクシ
ニミジルサクシナト）、４，４′−ジチオビス１−アザ
イドベンゼン等が挙げられる。上記ヘテロ架橋剤として
は、例えば、スクシニニミジル トランス４−Ｎ−マレ
イミジルメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレイト
（ＳＭＣＣ）、Ｎ−４−マレイミドブチリロキシイスク
シニミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−６−マレイミドカプロイロ
キッシスクシニミド（ＥＭＣＳ）、及び、それらのスル
ホン化試薬等が挙げられる。

【００４９】上記酵素標識に用いる酵素としては特に限
定されず、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下
ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の
通常ＥＩＡに用いられる酵素が好適である。

【００５０】上記二架性架橋剤を用いる場合、上記酵素
標識に用いる酵素がアミノ基とチオール基の両方を有す
る場合とアミノ基だけを有する場合があるので、架橋剤
との組み合わせに留意する。例えば、上記酵素標識に用
いる酵素がＰＯＤの場合アミノ基のみを有するのでヘテ
ロ架橋剤を用い、上記酵素標識に用いる酵素がβ−ガラ
クトシダーゼの場合はアミノ基とチオール基の両方を有
しているので、ヘテロ、ホモ架橋剤のいずれも用いるこ
とができる。

【００５１】上記標識アビジン−ビオチン法では、小粒
子化ＨＢｓ抗原を好適な緩衝液を用いて適当量希釈した
ＨＢｓ抗原液に、ビオチン試薬を精製水又はＤＭＳＯに
溶解した液を、モル比でＨＢｓ抗原の１０〜１００倍程
度になるように添加し、２５℃付近で４〜１８時間程度
インキュベーションする。この液を、ゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーを用いて、遊離のビオチン試薬を除去
し、ビオチン標識ＨＢｓ抗原を得ることができる。

【００５２】次いで、上記調製したビオチン標識ＨＢｓ
抗原とアビジン／ストレプトアビジン標識酵素とを、３
７℃で３０分〜２時間程度反応させた後、ゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーにより、未標識のビオチン標識Ｈ
Ｂｓ抗原とアビジン／ストレプトアビジンを除去して、
酵素標識ＨＢｓ抗原を回収することができる。

【００５３】上記小粒子化ＨＢｓ抗原をビオチン化する
ビオチン化試薬には、Ｎ−スクシニミジル Ｄ−ビオチ
ン、スルホスクシニミジル Ｄ−ビオチン、スルホスク
シニミジルＮ−Ｎ−Ｄ−ビオチニル−６−アミノヘキサ
ノイル−６−アミノヘキサネイト等のリジン残基のε−
アミノ基等の遊離のアミノ基と結合する活性エステルタ
イプ；Ｎ′−［２−Ｎ−マレイミドエチル−Ｎ−ピペラ
ジリル Ｄ−ビオチナミド ハイドロクロライド、６−
Ｎ−２−Ｎマレイミドエチル−Ｎ−ピペラジニルアミド
ヘキシ Ｄ−ビオチナミド ハイドロクロライド等の
システイン残基等のチオール基と結合するマレイミドタ
イプが挙げられる。

【００５４】上記標識に用いる酵素としては、上記直接
架橋法で例示したもの等が挙げられる。上記アビジン／
ストレプトアビジン標識酵素は、上記酵素をアビジン／
ストレプトアビジンで標識したものを調製することもで
きるが、アビジン／ストレプトアビジン標識酵素は市販
されており入手が容易であるのでこれらを用いてもよ
い。

【００５５】本発明１及び本発明２の小粒子化ＨＢｓ抗
原の調製法により得られた小粒子化ＨＢｓ抗原は、ま
た、不溶性担体に担持させることによって、免疫測定試
薬を製造することができる。

【００５６】上記不溶性担体としては、疎水性の表面を
有する不活性担体、及び、部分的に疎水性表面を有する
不活性担体が挙げられ、例えば、ラテックス、プラスチ
ックビーズ、プラスチックプレート等の合成高分子化合
物からなるもの；シリカ等の無機材料からなるもの；タ
ンニン酸処理した赤血球；ニトロセルロース等の高分子
膜等が挙げられる。

【００５７】上記不溶性担体の表面には、化学結合を目
的とする種々の官能基が存在してもよく、また、アビジ
ン−ビオチン等の親和性を利用して物質を固定化するた
めのスペーサー等を有していてもよい。

【００５８】上記不溶性担体として、工業的に安定した
品質で大量生産しうるラテックス；プラスチックビー
ズ、プラスチックプレート等のプラスチック成型品が好
ましい。特に、検査の全自動化処理による検査時間の短
縮及び省力化が可能なこと等から、ラテックスがより好
ましい。上記ラテックスとしては、ポリスチレン系、合
成ゴム系等特に限定されないが、好ましくはポリスチレ
ン系のものである。上記ラテックスの平均粒径は０．０
５μｍ〜２．０μｍのものが好ましく、より好ましく
は、０．１μｍ〜０．５μｍのものである。

【００５９】上記不溶性担体への担持方法としては、例
えば、本発明１又は本発明２によって得られた小粒子化
ＨＢｓ抗原を好適な緩衝液で希釈し、これをＨＢｓ抗原
液とする。上記ＨＢｓ抗原液と上記不溶性担体とを、ｐ
Ｈ４．５〜９．０の水性媒体中で接触させ、所定時間イ
ンキュベートすることによりＨＢｓ抗原を担体に固定化
することができる。上記小粒子化ＨＢｓ抗原を担持させ
た不溶性担体を保存する液、及び、抗原抗体反応の反応
液として使用する水性媒体としては特に限定されず、例
えば、上記小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法においてＨＢｓ
抗原の希釈緩衝液としては例示したもの等の一般に用い
られている緩衝液が好ましい。

【００６０】上記酵素標識した小粒子化ＨＢｓ抗原、及
び、上記不溶性担体に担持させた小粒子化ＨＢｓ抗原
は、免疫測定試薬として使用した場合、高感度な免疫測
定法を行うことができる。例えば、ワンステップサンド
イッチ法によるＥＩＡに使用する場合には、上記小粒子
化ＨＢｓ抗原を担持した不溶性担体に、検体及び上記酵
素標識した小粒子化ＨＢｓ抗原を加え、一定時間免疫反
応させる。洗浄後、酵素発色基質を加え、酵素反応によ
り生じる生成物を検出し、同時に処理したＨＢｓ抗体濃
度既知の標準溶液から得られる標準曲線と比較すること
によって、検体中のＨＢｓ抗体の量を測定することがで
きる。また、上記不溶性担体に担持させた小粒子化ＨＢ
ｓ抗原は、ラテックス凝集法や血球凝集法等による免疫
測定方法にも好適に使用することができ、その操作方法
としては、例えば、上記不溶性担体に担持させた小粒子
化ＨＢｓ抗原と検体とを混合して、免疫凝集反応後、こ
の凝集を検出することにより、検体中のＨＢｓ抗体の量
を測定することができる。

【００６１】

【実施例】以下に本発明の実施例を掲げて更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。

【００６２】参考例では、遺伝子組み換え技術によるＰ
ＰＩアーゼの調製を記載した（参考例１ではメタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス由来ＰＰＩアーゼ、参考
例２ではメタノコッカス・ボルタエ由来のＰＰＩアー
ゼ）。実施例１〜４では、参考例で得られたＰＰＩアー
ゼを用いた小粒子化ＨＢｓ抗原の調製方法を記載した
（実施例１〜３では、メタノコッカス・サーモリソトロ
フィカス由来のＰＰＩアーゼ、実施例４ではメタノコッ
カス・ボルタエ由来のＰＰＩアーゼを使用した）。実施
例５及び６では、実施例１及び２で調製した小粒子化Ｈ
Ｂｓ抗原を用いた酵素標識抗原の調製、及び、それを用
いた免疫測定方法を記載した。比較例１では、小粒子化
処理していない精製ＨＢｓ抗原を、比較例２では、ＰＰ
Ｉアーゼを用いないで調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を、
それぞれ用いて実施例５と同様の酵素標識抗原の調製、
及び、それを用いた免疫測定方法を記載した。実施例７
及び８では、実施例３及び４で調製した小粒子化ＨＢｓ
抗原を用いたラテックス試薬の調製、及び、それを用い
た免疫測定方法を記載した。比較例３では、小粒子化処
理していない精製ＨＢｓ抗原を、比較例４ではＰＰＩア
ーゼを用いないで調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を、それ
ぞれ用いて実施例７と同様のラテックス試薬の調製、及
び、それを用いた免疫測定方法を記載した。

【００６３】参考例１ ＰＰＩアーゼ（メタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 メタノコッカス・サーモリソトロフィカスのＰＰＩアー
ゼをコードする遺伝子の断片を、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５６２２として寄託さ
れているプラスミドｐＵＦＫＣ１を鋳型とし、配列番号
２のフォワードプライマー及び配列番号３のリバースプ
ライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅させた。上記配
列番号２に示した配列の５′末端から３〜８番目の塩基
配列は、ＮｃｏＩの認識部位である。また、上記配列番
号３に示した配列の５′末端から３〜８番目の塩基配列
は、ＢａｍＨＩの認識部位である。上記プライマーを用
いるＰＣＲ法によって増幅、回収された断片を、Ｂａｍ
ＨＩ及びＮｃｏＩで消化後、同様の制限酵素処理が施さ
れた発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ストラティジェン社
製）にライゲーションした。その後、これをＢＬ２１
（ＤＥ３）株（ストラティジェン社製）にトランスフォ
ーメーションし、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む
ＬＢ培地プレート（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５
ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ（ｐＨ７．０））にて培養
後、コロニーをピックアップし、グリセロールストック
とした。

【００６４】（２）組み換え大腸菌からのＰＰＩアーゼ
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地２００ｍ
Ｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ
３）株（組み換え大腸菌）一白金耳を接種し、３７℃で
１６時間予備培養した。この培養液をＬＢ培地６リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社
製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−３０℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁さ
せ、超音波処理にて菌体破砕した。遠心分離にて上清を
採取し、３０分間、８０℃の水浴中にて加熱処理を行
い、夾雑タンパク質を変性凝集させ、遠心分離にて除去
した。更に、上清に硫酸アンモニウム（和光純薬工業社
製）を８０％飽和となるように添加し塩析を行った。３
０分後に遠心分離にて採取した沈殿部を、１．８Ｍの硫
酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）に溶解した。

【００６５】この溶液を、Ａ液：１．８Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で
平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷカラム
（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）（東ソー社製）に供し、５
分後からＢ液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）の
６０分間直線グラジエントにてＰＰＩアーゼを溶出し
た。ＰＰＩアーゼは硫酸アンモニウム０．５Ｍ濃度付近
で溶出される画分に現れた。本画分を透析により脱塩
し、以下の実施例及び比較例に使用した。

【００６６】参考例２ ＰＰＩアーゼ（メタノコッカス
・ボルタエ由来）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 特願平９−３５０６２３号記載の方法に従って調製した
メタノコッカス・ボルタエのゲノムＤＮＡを鋳型とし
て、配列表の配列番号４及び配列番号５のプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣ
Ｒ産物をｐＴ７ ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ社）にライゲーションした後、それを大腸菌ＪＭ１
０９にトランスフォーメーションし、１００μｇ／ｍＬ
のアンピシリンが含有されたＬＢ培地プレートにて一昼
夜３７℃で培養し、ＰＣＲ産物のライブラリーを作製し
た。これをＨｙｂｏｎｄｏ−Ｎ⁺ メンブラン（アマシャ
ム社）に転写した。特開平１０−９１号公報に記載され
たＰＰＩアーゼ遺伝子スクリーニングに用いられたジゴ
キシゲニン標識遺伝子をプローブとしてＤＩＧ−ＤＮＡ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム
社）を用いてＭ．ｖｏｌｔａｅ由来ＰＰＩアーゼ遺伝子
をスクリーニングした。得られた陽性クローンからプラ
スミドを回収し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって挿入
配列を切り出し、電気泳動によって回収した。

【００６７】これを、同様の制限酵素処理が施された発
現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ストラティジェン社製）に
ライゲーションした。その後、これをＢＬ２１（ＤＥ
３）株（ストラティジェン社製）にトランスフォーメー
ションし、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培
地プレートにて培養後、コロニーをピックアップし、グ
リセロールストックとした。

【００６８】（２）組み換え大腸菌からのＰＰＩアーゼ
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地２００ｍ
Ｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ
３）株（組み換え大腸菌）一白金耳を接種し、３７℃で
１６時間予備培養した。この培養液をＬＢ培地６リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社
製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−３０℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁さ
せ、超音波処理にて菌体破砕した。遠心分離にて上清を
採取し、硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製）を８０
％飽和となるように添加し塩析を行った。３０分後に遠
心分離にて採取した沈殿部を１．８Ｍの硫酸アンモニウ
ムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶
解した。

【００６９】この液を高速液体クロマトグラフィーを用
いてＰＰＩアーゼの分離、精製を行い、酵素を含む溶出
液を透析により脱塩して、以下の実施例に使用した。

【００７０】実施例１ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製
（１） （１）試薬及び材料 ＨＢｓ抗原：ヒト陽性血清より精製した。精製方法は、
塩化セシウム溶液及びショ糖溶液による密度勾配法によ
り小型球状粒子抗原を回収し、更にゲル濾過法により精
製した。得られたＨＢｓ抗原を、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌを用い
て２ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、これをＨＢｓ抗原
液とした。 小粒子化用液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌに、２％オクチルグルコ
シド（同仁化学社製）及び１０ｍＭジチオスレイトール
（和光純薬社製）となるようにそれぞれ添加して、これ
を小粒子化用液とした。 ＰＰＩアーゼ溶液：参考例１で調製したメタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来のＰＰＩアーゼを１．５
ｍｇ／ｍＬとなるように、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）で希釈してこれをＰＰＩアーゼ溶液
とした。 管理血清：日水製薬社、Ｌ−コンセーラＮ「ニッスイ」
を融解して用いた。 ＨＢｓ抗原量測定用キット：ヘキストジャパン社製、エ
ンザイグノストＨＢｓＡｇ モノクローナルを用いた。

【００７１】（２）小粒子化方法 ＨＢｓ抗原溶液２．５ｍＬ、小粒子化用液７．５ｍＬ、
ＰＰＩアーゼ溶液５ｍＬを同時に混合し、２５℃にて２
時間インキュベーションした。インキュベーション終了
後に透析処理を行い、小粒子化剤等を除去した。抗原含
有液の小量を用いて、抗原性をＨＢｓ抗原測定キットを
用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同
等の抗原活性を保持していることを確認した。

【００７２】（３）分子量の測定 この操作で得られた小粒子化ＨＢｓ抗原の分子量分布を
調べるために高速液体クロマトグラフィーによる解析を
行った。高速液体クロマトグラフィーは島津社製ＨＰＬ
Ｃ−１０Ａシステムを、カラムは東ソー社製のゲル濾過
クロマト用カラムＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷ_XLを用
い、溶離液として５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）＋０．１Ｍ ＮａＣｌにオクチルグルコシド
０．２％添加した液を用いた。検出は２８０ｎｍの吸光
度を測定することにより行い、また分子量標準物質とし
て東ソー社製のＴＳＫ標準ポリエチレンオキシドを用い
て較正曲線を作製し、これをもとに分子量分布を求め
た。その結果、分子量分布４０〜６０万付近にピークが
認められた。

【００７３】実施例２ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製
（２） （１）試薬及び材料 小粒子化用液及びＰＰＩアーゼ溶液として下記のものを
使用したこと以外は、実施例１と同様のものを使用し
た。 小粒子化用液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌに、１％オクチルグルコ
シド（同仁化学社製）、１０ｍＭジチオスレイトール
（和光純薬社製）、８Ｍグアニジン塩酸塩（和光純薬社
製）となるようにそれぞれ添加して、これを小粒子化用
液とした。 ＰＰＩアーゼ溶液：参考例１で調製したメタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来のＰＰＩアーゼを５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に０．０５ｍ
ｇ／ｍＬとなるように希釈し、これをＰＰＩアーゼ溶液
とした。

【００７４】（２）小粒子化方法 ＨＢｓ抗原溶液２．５ｍＬ及び小粒子化用液７．５ｍＬ
を混合し、３０℃にて１時間インキュベーションした。
この液全量をＰＰＩアーゼ溶液９０ｍＬに添加、混合
し、２５℃で２時間インキュベーションを行った。イン
キュベート終了後に、セントリプレップ１０を用いて遠
心濃縮を行い、全量を１０ｍＬまで濃縮し、更に、透析
処理により小粒子化剤等を除去した。抗原含有液の少量
をとり、その抗原性をＨＢｓ抗原測定キットを用いて測
定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原
活性を保持していることを確認した。

【００７５】（３）分子量の測定 実施例１と同様に行った。その結果、分子量分布２０〜
４０万付近にピークが認められた。

【００７６】実施例３ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製
（３） （１）試薬及び材料 小粒子化用液として下記のものを使用し、ＰＰＩアーゼ
溶液の代わりに下記方法によって調製したＰＰＩアーゼ
固定化担体を使用したこと以外は、実施例１と同様のも
のを使用した。 小粒子化用液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）＋０．２Ｍ ＮａＣｌに８Ｍ尿素（和光純薬社
製）、１０ｍＭジチオエリスリトール（和光純薬社
製）、１．６％ＭＥＧＡ９（同仁化学社製）となるよう
に、それぞれ添加して、これを小粒子化用液とした。

【００７７】ＰＰＩアーゼ固定化担体の調製：参考例１
で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由
来のＰＰＩアーゼを用いて行った。不溶性担体としてＣ
ＮＢｒ−活性型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂゲル（ファルマ
シア社製）を用いた。このゲル１ｇを秤量し、１ｍＭＨ
Ｃｌで洗浄、膨潤させた。０．５ＭＮａＣｌを含む０．
１Ｍ、ｐＨ８．３のＮａＨＣＯ₃ 溶液１０ｍＬにＰＰＩ
アーゼ３５ｍｇを溶解させたタンパク溶液と膨潤させた
ゲルを混合し、室温にて２時間振盪した。上清液を除い
た後、０．２Ｍグリシン（ｐＨ８．０）を１０ｍＬ加
え、室温にて２時間振盪した。この反応で過剰の活性基
をブロッキングした。次に、０．５ＭＮａＣｌを含む
０．１Ｍ、ｐＨ８．３のＮａＨＣＯ₃ 溶液２０ｍＬで洗
浄した後、０．５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ、ｐＨ４の
酢酸緩衝液２０ｍＬで洗浄した。再び、０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１Ｍ、ｐＨ８．３のＮａＨＣＯ₃ 溶液２０
ｍＬで洗浄し、このゲルをＰＰＩアーゼ結合担体として
以下の実験に用いた，。

【００７８】（２）小粒子化方法 ＨＢｓ抗原溶液２．５ｍＬと小粒子化用液７．５ｍＬを
混合し、３０℃にて１時間インキュベーションした。こ
の液を、ＰＰＩアーゼ結合担体ゲル５ｍＬを４５ｍＬの
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸
濁させたスラリーに添加、混合し２５℃にて４時間イン
キュベーションを行った。反応終了後、同液を１０００
０ｒｐｍ、２０分間遠心分離操作を行い、上清液を回収
し、透析を行って小粒子化剤等を除去した。抗原含有液
の抗原性をＨＢｓ抗原測定キットを用いて測定した結
果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原活性を保
持していることを確認した。

【００７９】（３）分子量の測定 実施例１と同様にして行った結果、約４０〜６０万のと
ころにメインピークが出現した。

【００８０】実施例４ 小粒子化ＨＢｓ抗原の調製
（４） （１）試薬及び材料 実施例２において、ＰＰＩアーゼとして参考例１で調製
したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来のＰ
ＰＩアーゼを使用する代わりに、参考例２で調製したメ
タノコッカス・ボルタエ由来のＰＰＩアーゼを使用した
こと以外は、実施例２と同様のものを使用した。

【００８１】（２）小粒子化方法 実施例２と同様にして小粒子化を行った。小粒子化処理
後、抗原含有液の少量をとり、その抗原性をＨＢｓ抗原
測定キットを用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗
原液とほぼ同等の抗原活性を保持していることを確認し
た。

【００８２】（３）分子量の測定 実施例１と同様に行った。その結果、分子量分布３０〜
５０万付近にピークが認められた。

【００８３】実施例５ ＨＢｓ抗原標識酵素を用いたＨ
Ｂｓ抗体試薬測定 （１）ＨＢｓ抗原標識酵素の調製 実施例１で得た小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた。１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液＋０．１ＭＮａＣｌ液を用い
て、小粒子化ＨＢｓ抗原が５００μｇ／ｍＬとなるよう
に希釈し、精製水で溶解したＮ−４−マレイミドブチリ
ロキシスルホサクシニミド ナトリウム塩３．８ｍｇ／
ｍＬを５μＬ加え、２０℃で６０分間インキュベーショ
ンした。反応後にセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア社製）を担体（カラムサイズ：１６×３００ｍｍ）と
したゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、マレイ
ミド化した小粒子化ＨＢｓ抗原を得た。。

【００８４】このマレイミドした化小粒子化ＨＢｓ抗原
液（２００μｇ）に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭＥＤＴＡ）に溶解
したβ−ガラクトシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社
製：ＥＩＡグレード）５００μｇを混合し、３０℃で３
０分間インキュベーションした。反応後に、６０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭＥＤＴ
Ａ、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．１％ＢＳＡ、０．１％ナト
リウムアジド）０．１ｍＬを加えた。反応後に、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、０．１ＭＮａＣ
ｌ）で平衡に達したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラ
ム（カラムサイズ：１２×１５０ｍｍ）にアプライし、
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、Ｎ
ａＣｌを０．１〜０．５Ｍとしたグラジエントをかけ、
溶出するβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を
調製した。

【００８５】（２）ＨＢｓ抗原の固定化 実施例１で得た精製ＨＢｓ抗原を、０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製し、ヌン
ク−イムノモジュールマキシソープＦ１６ブラック（ヌ
ンク社製）に１００μＬ／ウエルにて分注し、室温で２
時間静置した。このプレートを生理食塩水で洗浄し、
０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１５ＭＮ
ａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）を３００μＬ／ウエルにて分注し、室温で１時間ブ
ロックした。再び生理食塩水で洗浄し、１％β−シクロ
デキストリン、０．５％ＢＳＡ、０．１５ＭＮａＣｌ、
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を３
００μＬ／ウエルにて分注し、室温で３０分間コーティ
ングした。次いで、コーティング液を除去し、室温で真
空乾燥させた。

【００８６】（３）ＨＢｓ抗体の測定 上記（２）項で調製したＨＢｓ抗原プレートのウェル
に、（１）で得たβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗原
液を５Ｕ／ｍＬに調製したコンジュゲート液５００μＬ
を加え、３７℃で５分間プレ加温した。検体５０μＬを
加え、３７℃で８分間振盪しながらインキュベーション
した。次いで、生理食塩水で５回洗浄し、よく水分を除
去した後、蛍光基質を用いた酵素活性測定を行った。即
ち、予め３７℃に加温しておいた基質溶液（４５０μＭ
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガククトシド、
７５ｍＭＮａＣｌ、０．０４％ＭｇＣ１₂ 、０．０５％
ＢＳＡ、３％エチレングリコール）１００μＬを各ウエ
ルに添加し、３０℃で９０分間インキュベートした。
０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．３）１
５０μＬを加えて酵素反応を停止し、励起波長３６０ｎ
ｍ、測定波長４５０ｎｍで蛍光強度を測定した。

【００８７】（４）標準ＨＢｓ抗体液 ＨＢｓ抗体を０、１２．５、２５、５０、１００ｍＩＵ
／ｍＬ濃度で含むヒト血清を標準品として使用した。上
記（３）項の測定法に従って、測定値を求め、検量線を
作成した。得られた結果を表１及び図１に示す。

【００８８】実施例６ ＨＢｓ抗原標識酵素を用いたＨ
Ｂｓ抗体試薬測定 （１）ＨＢｓ抗原標識酵素の調製 実施例２で得た小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた。１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液＋０．１ＭＮａＣｌ液を用い
て、抗原５００μｇ／ｍＬに希釈し、ＤＭＳＯで溶解し
たＮ−スクシニミジルＤ−ビオチン３．４ｍｇ／ｍＬを
５μＬ加え、３０℃で２０分間インキュベーションし
た。反応後に、セファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマ
シア社製）を担体（カラムサイズ：１６×３００ｍｍ）
としたゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、ビオ
チン化した小粒子化ＨＢｓ抗原を得た。このビオチン化
小粒子化ＨＢｓ抗原液（２５０μｇ）にβ−ガラクトシ
ダーゼ標識ストレプトアビジン（ベーリンガマンハイム
社製：５００Ｕ）を混合し、３７℃で１時間インキュベ
ーションした。反応後に凝集体形成を防ぐことを目的と
して、未反応のビオチン結合部位をブロックするためｄ
−ビオチン２ｍｇを加えて、更に３０分間インキュベー
ションした。反応後に、セントリプレップ−１０（アミ
コン社製）で濃縮し１．５ｍＬとして、セファクリルＳ
−４００ＨＲ（ファルマシア社製）を担体（カラムサイ
ズ：１６×３００ｍｍ）としたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーを行い、β−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗
原複合体を調製した。

【００８９】ＨＢｓ抗原の固定化、ＨＢｓ抗体の測定、
及び、標準ＨＢｓ抗体液の調製と測定は、実施例５と同
様に行った。得られた結果を表１及び図１に示す。

【００９０】比較例１ β−ガラクトシダーゼ標識する抗原として、実施例１で
調製した小粒子化ＨＢｓ抗原の代わりに小粒子化処理し
ていない精製ＨＢｓ抗原を用いたこと以外は、実施例５
と同様に行った。得られた結果を表１及び図１に示す。

【００９１】比較例２ β−ガラクトシダーゼ標識する抗原を、実施例１におい
てＰＰＩアーゼ溶液の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液を
添加して調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を用いたこと以外
は、実施例５と同様に行った。得られた結果を表１及び
図１に示す。

【００９２】

【表１】

【００９３】実施例７ ＨＢｓ抗体測定用ラテックス試
薬の調製（１） （１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス試薬の調製 実施例３で得られた小粒子化ＨＢｓ抗原を５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて２．０ｍｇ
／ｍＬに希釈し、７．５ｍＬに平均粒径０．３μｍのポ
リスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水
化学工業社製）１ｍＬと３６ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液＋０．１ＭＮａＣｌ）を添加し、３０℃にて６０分間
攪拌した。次いで、この液にウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を１重量％含有するリン酸−食塩緩衝液（０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ＭＮａＣｌ、以
下ＰＢＳともいう）を添加し、３０℃にて６０分間攪拌
した後、４℃にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分
離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。得
られた沈殿物にＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳを１０
ｍＬ添加し、ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機に
て分散処理を行い、固形分０．１％（Ｗ／Ｖ）のＨＢｓ
抗原感作ラテックス液を調製した。

【００９４】（２）検体希釈液の調製 平均分子量５００，０００のポリエチレングリコール
（以下、ＰＥＧともいう：和光純薬社製）を、ＢＳＡを
１重量％含有するＰＢＳに、０．９重量％の濃度となる
ように溶解した。

【００９５】（３）ＨＢｓ抗体測定試薬 本実施例のＨＢｓ抗体測定試薬は、上記（１）項のＨＢ
ｓ抗原感作ラテックスからなる第１試薬と、上記（２）
項のＰＥＧ溶液からなる第２試薬とから構成される２液
系の試薬である。

【００９６】（４）標準ＨＢｓ抗体液 ＨＢｓ抗体を０、３００、６００、１２００、１８００
ｍＩＵ／ｍＬ濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。

【００９７】（５）測定方法 検体２０μＬと上記（２）項の検体希釈液１２０μＬを
混合し、３７℃で適時保持した後、上記（１）項のＨＢ
ｓ抗原感作ラテックス液１２０μＬを添加攪拌した。こ
の後、１分後及び５分後の波長７５０ｎｍでの吸光度を
測定し、この差を吸光度変化量（△Ａｂｓ）とした。測
定は日立自動分析７１５０形を使用した。標準ＨＢｓ抗
体液を測定して、検量線を作成した。得られた結果を表
２及び図２に示す。

【００９８】実施例８ ＨＢｓ抗体測定用ラテックス試
薬の調製（２） 実施例４で得られた小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた以外
は、実施例７と同様にしてＨＢｓ抗体測定用のラテック
ス試薬を調製し、検量線を作成した。得られた結果を表
２及び図２に示す。

【００９９】比較例３ ラテックスに感作する抗原を、実施例１で調製した小粒
子化ＨＢｓ抗原の代わりに小粒子化処理していない精製
ＨＢｓ抗原を用いた以外は実施例７と同様に行った。得
られた結果を表２及び図２に示す。

【０１００】比較例４ ラテックスに感作する抗原を、実施例１においてＰＰＩ
アーゼ溶液のかわりに５０ｍＭリン酸緩衝液を添加して
調製した小粒子化ＨＢｓ抗原を用いた以外は実施例７と
同様に行った。得られた結果を表２及び図２に示す。

【０１０１】

【表２】

【０１０２】

【発明の効果】本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法
は、上述の構成よりなるので、活性を保持した小粒子化
ＨＢｓ抗原を得ることが可能となった。また、それを用
いることにより、高感度な免疫測定法を行うことができ
る酵素標識抗原試薬やラテックス凝集試薬を得ることが
可能となった。

【０１０３】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：1 他の情報：Xaa=Ｎ末端がＮ−スクシニル基（Ｎ−ｓｕ
ｃ）で修飾されたアラニン 存在位置：3 他の情報：Xaa=Ala 又はLeu 存在位置：4 他の情報：Xaa=Ｃ末端がｐＮＡ（ｐ−ニトロアニリド）
で修飾されたフェニルアラニン 配列 Xaa Ala Xaa Xaa 1

【０１０４】 配列番号：２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 GGCCATGGTA GATAAAGGAG TTAAAATAA 29

【０１０５】 配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCTT ATTCGACAAC TTCAATAATT 30

【０１０６】 配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 GSCCNWTGGB GATAANGCHA TCCGNCCGC 29

【０１０７】 配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 ATGNCSTCCA TCCGYATGCG ATGCNGGTCW 30

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例５及び６並びに比較例１及び２における
抗ＨＢｓ抗体の抗体量と蛍光強度との関係を示すグラフ
である。縦軸は蛍光強度、横軸は抗ＨＢｓ抗体の抗体量
を示す単位（ｍＩＵ／ｍＬ）である。

【図２】実施例７及び８並びに比較例３及び４における
抗ＨＢｓ抗体の抗体量と吸光度変化量との関係を示すグ
ラフである。縦軸は吸光度変化量、横軸は抗ＨＢｓ抗体
の抗体量を示す単位（ｍＩＵ／ｍＬ）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古谷 昌弘 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 高橋 英之 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
   剤からなる群より選択される少なくとも１種によって、
   ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並びに、前記小粒
   子化処理されたＨＢｓ抗原に、ペプチジルプロリルシス
   −トランスイソメラーゼを反応させる工程からなる小粒
   子化ＨＢｓ抗原の調製法であって、前記小粒子化処理す
   る工程と前記反応させる工程とは、同時に行うことを特
   徴とする小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法。
2. 【請求項２】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
   剤からなる群より選択される少なくとも１種によって、
   ＨＢｓ抗原を小粒子化処理する工程、並びに、前記小粒
   子化処理されたＨＢｓ抗原に、ペプチジルプロリルシス
   −トランスイソメラーゼを反応させる工程からなる小粒
   子化ＨＢｓ抗原の調製法であって、前記反応させる工程
   は、前記小粒子化処理する工程を行った後に行うことを
   特徴とする小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法。
3. 【請求項３】 ペプチジルプロリルシス−トランスイソ
   メラーゼは、不溶性担体に結合されたものである請求項
   １又は２記載の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法。
4. 【請求項４】 ペプチジルプロリルシス−トランスイソ
   メラーゼは、古細菌から調製したもの、又は、古細菌か
   ら調製したＤＮＡから発現されたものである請求項１、
   ２又は３記載の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法。
5. 【請求項５】 古細菌は、メタノコッカス属に属する菌
   である請求項４記載の小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法。
6. 【請求項６】 メタノコッカス属に属する菌は、メタノ
   コッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
   ｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
   ｓ）又はメタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
   ｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）である請求項５記載の小粒
   子化ＨＢｓ抗原の調製法。
7. 【請求項７】 請求項１、２、３、４、５又は６記載の
   小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法により得られた小粒子化Ｈ
   Ｂｓ抗原を、酵素標識してなることを特徴とする免疫測
   定試薬の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項１、２、３、４、５又は６記載の
   小粒子化ＨＢｓ抗原の調製法により得られた小粒子化Ｈ
   Ｂｓ抗原を、不溶性担体に担持させてなることを特徴と
   する免疫測定試薬の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項７又は８記載の免疫測定試薬の製
   造方法により製造されてなることを特徴とする免疫測定
   試薬。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の免疫測定試薬を用いる
    ことを特徴とする免疫測定方法。